CZ305852B6 - Způsob purifikace proteinů pomocí kationtových surfaktantů - Google Patents

Abstract

Způsob purifikace cílového proteinu ze směsi obsahující cílový protein a kontaminující protein zahrnující kroky vystavení směsi takovému účinnému množství kationtového surfaktantu, že je kontaminující protein přednostně precipitován, a krok opětovného získání cílového proteinu.

Description

Způsob purifikace proteinů pomocí kationtových surfaktantů

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti purifikace proteinů pomocí surfaktantů.

Dosavadní stav techniky

Produkce biologických makromolekul, zejména proteinů, často zahrnuje kroky zlepšující čistotu založené na fyzikálních a fyzikálně-chemických vlastnostech. Obtížnosti provázející takovéto procesní kroky zahrnují mimo jiné stanovení podmínek, které umožňují oddělení rozpustných a nerozpustných molekul, relativně nízkou výtěžnost požadované molekuly po čisticím kroku, ztrátu biologické aktivity během procesu a senzitivitu proteinu k podmínkám procesního kroku, jako je pH.

Surfaktanty byly využívány při zpracovávání biologických makromolekul. Kationtové surfaktanty jsou odlišitelnou podtřídou surfaktantů a zahrnují amfipatické amonné sloučeniny. Amfipatické amonné sloučeniny zahrnují kvartémí amonné sloučeniny obecného vzorce QN⁺ a primární amonné sloučeniny s parafínovým řetězcem obecného vzorce RNH?. Oba typy primárních amonných sloučenin zahrnují amonné surfaktanty s dlouhým řetězcem, u kterých výhodně tvoří dlouhý alifatický řetězec alespoň šest uhlíkových atomů (Scott (1960) Methods Biochem. Anal. 8:145 -197). Kvartémí amonné surfaktanty s dlouhým řetězcem jsou známy svojí interakcí s biologickými makromolekulami. Tyto kvartémí amonné sloučeniny s dlouhým řetězcem mají na dusíku alespoň jeden substituent, který je tvořen lineárním alkylovým řetězcem s 6 až 20 uhlíkovými atomy. Nejlépe známými reprezentanty této třídy jsou benzalkoniové soli (chloridy a bromidy), hexadecylpyridinium-chlorid, dechaliniumacetát, cetyl(dimethyl)amonium-bromid (CTAB) a hexadecylpyridinium-chlorid (CPCI) a benzethonium-chlorid. Kvartémí amonné surfaktanty zahrnují soli, jako jsou cetylpyridiniové soli, např. cetylpyridinium-chlorid (CPC), stearamid(methyl)pyridiniové soli, laurylpyridiniové soli, cetylchinoliniové soli, soli methylesteru kyseliny laurylaminopropionové, kovové soli kyseliny laurylaminopropionové, lauryl(dimethyl)betain, stearyl(dimethyl)betain, lauryl(dihydroxyethyl)betain a benzethoniové soli. Alkylpyridiniové soli zahrnují stearyl(trimethyl)amoniové soli, alkyl(dimethylbenzyl)amonium-chlorid a dichlorbenzyl(dimethylalkyl)amonium-chlorid.

Známá použití kationtových surfaktantů pro purifikaci biologických makromolekul zahrnují 1) solubilizaci agregátů včetně proteinových agregátů; 2) eluci biologických makromolekul navázaných na chromatografické koloně a 3) precipitaci polyaniontů, jako je kyselina hyaluronová (HA), nukleové kyseliny a heparin (a molekul, které koprecipitují s polyanionty).

Kationtové surfaktanty byly používány pro solubilizaci proteinových agregátů. Otta a Bertini ((1975) Acta Physiol. Latinoam. 25:451 - 457) ukázali, že aktivní urikasa může být solubilizována zjatemích peroxizómů hlodavců pomocí kvartémího amonného surfaktantů, Hyaminu 2389. Je zjištěno, že výsledkem zvýšení koncentrace amonného surfaktantů je zvýšení rozpustnosti jak urikasy (podle enzymatické aktivity), tak i všech proteinů bez toho, že by se zvýšilo relativní množství proteinu urikasy vzhledem k množství všech proteinů. Jinými slovy nebyla zde žádná selektivní solubilizace proteinu urikasy vzhledem ke všem proteinům a po solubilizaci pomocí kationtového surfaktantů protein urikasy netvořil vyšší procento ze všech proteinů. V tomto procesu evidentně není zvýšena čistota urikasy vzhledem k obsahu všech proteinů jako výsledek solubilizace kvartémím amonným surfaktantem.

V další studii Truscoe ((1967) Enzymologia 33:1 19-32) zkoumal sadu kationtových, aniontových a neutrálních detergentů z hlediska jejich účinnosti na extrakci urátoxidasy (urikasy) z prášku z hovězích ledvin. Zatímco u neutrálních a aniontových detergentů bylo zjištěno, že zvyšují

- 1 CZ 305852 B6 rozpustnou aktivitu urátoxidasy, u kationtových detergentů, např. kvartémích amonných solí, bylo zjištěno snižování celkové enzymatické aktivity se zvyšující se koncentrací. Autoři shrnuli, že kationtové detergenty nebyly vhodné pro purifikaci urátoxidasy z hovězích ledvin.

Solubilizace rekombinantních proteinů, prasečího růstového hormonu, methionylovaného prasečího růstového hormonu, proteinu viru infekční burzitidy, fúzního proteinu s B-galaktosidasou z inkluzních tělísek nebo buněk E. coli pomocí kationtových surfaktantů je popsáno v Patentu US 4 797 474, Patentu US 4 992 531, Patentu US 4 966 963 a Patentu US 5 008 377. Solubilizace za alkalických podmínek je dokončena pomocí kvartémích amonných sloučenin včetně cetyl(trimethyl)amonium-chloridu, směsi n-alkyl(dimethylbenzyl)amonium-chloridu, CPC, N,Ndimethyl-A-[2-[2-[4-( 1,1,3,3-tetramethylbutyl)fenoxy]ethoxy]ethyl]benzenmethanamoniumchloridu, tetradecyl-(trimethyl)amonium-bromidu, dodecyl(trimethyl)amonium-bromidu, cetyl(trimethyl)amonium-bromidu. Tyto publikace uvádějí, že po každém solubilizačním procesu jsou roztoky centrifugovány a ve všech případech je pozorována malá nebo žádná peleta. Toto pozorování naznačuje, že většina nebo všechny proteiny jsou solubilizovány bez ohledu na selektivitu solubilizace cílového proteinu. Čistota vyizolovaných proteinů není uvedena. Patent US 5 929 231, uvedený zde jako celek coby odkaz, popisuje desintegraci granulí a agregátů obsahujících škrob pomocí cetylpyridinium-chloridu (CPC). Dřívější použití se týkají použití kationtových surfaktantů pro obecnou nespecifickou solubilizaci konkrétních biologických makromolekul. Tyto metody dřívějšího použití nepopisují zvyšování čistoty požadovaného cílového proteinu vzhledem k celkovému proteinu pomocí kationtového surfaktantů.

Kationtové surfaktanty byly také používány pro eluci biologických makromolekul adsorbovaných na kationtové výměnné pryskyřice nebo adjuvans obsahujících hliník (Antonopoulos, et al. (1961) Biochim. Biophys. Acta 54:213 - 226; Embery (1976) J. Biol. Buccale 4:229-236 a Rinella, et al. (1998) J. Colloid Interface Sci. 197:48 - 56. Patent US 4 169 764 popisuje eluci urokinasy z karboxymethylcelulosových kolon pomocí širokého spektra roztoků kationtových surfaktantů. Autoři zjistili výhodné použití tetra substituovaných amonných solí, u kterých je jedna alkylová skupina vyšší alkylovou skupinou s až 20 uhlíkovými atomy a ostatní jsou nižší alkylové skupiny s až 6 uhlíkovými atomy. Použití takovýchto kationtových surfaktantů umožňuje uvolnění biologických makromolekul z jejich vazby na pevnou matrix.

Naopak impregnace filtrů, jako jsou ty tvořené nylonem, kationtovými surfaktanty umožňuje imobilizaci polysacharidů nebo nukleových kyselin (Maccari a Volpi (2002) Electrophoresis 23:3270- 3277; Benitz, et al. (1990) Patent US 4 945 086; Macfarlane (1991) Patent US 5 010 183. Tento jev je zřejmě způsoben interakcemi mezi kationtovým surfaktantem a polyaniontem, které umožňují precipitaci polyaniontu.

Je dobře známo, že amfipatické amonné sloučeniny, které zahrnují kvartémí amonné sloučeniny obecného vzorce QN⁺ a primární amonné sloučeniny s parafínovým řetězcem obecného vzorce RNIff, mohou za definovaných podmínek precipitovat polyanionty (shrnuto v Scott (1955) Biochim. Biophys. Acta 18:428-429; Scott (1960) Methods Biochem. Anal. 8:145 - 197; Laurent, et al., (1960) Biochim. Biophys. Acta 42:476 - 485; Scott (1961) Biochem. J. 81:418 - 424; Pearce a Mathieson (1967) Can. J. Biochemistry 45:1565 - 1576; Lee (1973) Fukushima J. Med. Sci. 19:33 - 39; Balazs, (1979) Patent US 4 141 973; Takemoto, et al., (1982) Patent US 4 312 979; Rosenberg (1981) Patent US 4 301 153; Takemoto, et al., (1984) Patent US 4 425 431; d'Hinterland, et al., (1984) Patent US 4 460 575; Kozma, et al. (2000) Mol. Cell. Biochem. 203:103 - 112). Tato precipitace je závislá na precipitačních látkách s vysokou hustotou polyaniontového náboje a vysokou molekulovou hmotností (Saito (1955) Kolloid-Z 143:66. Přítomnost solí může s precipitaci polyaniontů indukovanou kationtovými surfaktanty interferovat nebojí zabránit.

Navíc mohou být polyanionty diferenciálně precipitovány z roztoků obsahujících proteinové kontaminace za podmínek alkalického pH. V těchto případech budou proteiny, které nejsou chemicky navázány na polyanionty, zůstávat v roztoku, zatímco polyanionty a další molekuly navázané

-2CZ 305852 B6 na polyanionty se budou srážet. Například precipitace polyaniontů, jako jsou polysacharidy a nukleové kyseliny, je doprovázena koprecipitací molekul, jako jsou proteoglykany a proteiny interagující s polyanionty (Blumberg a Ogston (1958) Biochem. J. 68:183 · 188; Matsumura, et al., (1963) Biochim. Biophys. Acta 69: 574 - 576; Serafini-Fracassini, et al. (1967) Biochem. J. 105:569 - 575; Smith, et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:11 046 - 11 051; Fuks a Vlodavsky (1994) Patent US 5 362 641; Hascall a Heinegard (1974) J. Biol. Chem. 249:4232-4241, 4242-4249 a 4250-4256; Heinegard a Hascall (1974) Arch. Biochem. Biophys. 165:427-441; Moreno, et al. (1988) Patent US 4 753 796; Lee, et al. (1992) J. Cell Biol. 116:545 - 557; Varelas, et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 321:21 -30.

Izoelektrický bod (neboli pí) proteinu je pH, při kterém má protein stejný počet kladných a záporných nábojů. Za podmínek, kdy má roztok hodnoty pH blízko (speciálně nižší) izoelektrického bodu proteinu, mohou proteiny vytvářet stabilní soli se silnými kyselými polyanionty, jako je heparin. Za podmínek, které podporují precipitaci takovýchto polyaniontů, se proteiny v komplexu s polyanionty srážejí také (LB Jaques (1943) Biochem. J. 37:189 - 195; AS Jones (1953) Biochim. Biophys. Acta 10:607 - 612; JE Scott (1955) Chem a Ind 168 - 169; Patent US 3 931 399 (Bohn, et al., 1976) a Patent US 4 297 344 (Schwinn, et al., 1981).

Patent US 4 421 650, Patent US 5 633 227 a Smith, et al. ((1984) J. Biol. Chem. 259:11 046-11 051 popisují purifikaci polyaniontů pomocí postupného působení kationtového surfaktantu a síranu amonného (který umožňuje disociaci komplexů polyaniont-kationtový surfaktant) a následné oddělení pomocí chromatografie založené na hydrofobních interakcích. Evropské patentové zveřejnění EP 055 188, uvedené zde jako celek coby odkaz, popisuje separaci RTX toxinu z lipopolysacharidu pomocí kationtového surfaktantu. Není zde však uvedena hmotová bilance v množství lipopolysacharidu, který je kvantifikován testy aktivity endotoxinu. Byla popsána neutralizace aktivity endotoxinu pomocí silně interagujících kationtových sloučenin (Cooper JF (1990) J Parenter Sci Technol 44:13 - 5). Proto je v EP 055 188 nedostatečná aktivita endotoxinu v precipitátu po působení zvyšujícího se množství kationtového surfaktantu pravděpodobně důsledkem neutralizace aktivity tvorbou komplexu surfaktant-lipopolysacharid.

Výše uvedené způsoby vyžadují intermediámí polyanionty, pevnou oporu nebo agregáty obsahující proteiny se selektivní rozpustností kationtovými surfaktanty pro umožnění purifikace rozpustných proteinů pomocí kationtového surfaktantu. Dřívější použití tak neposkytuje způsob purifikace cílového proteinu kontaktem proteinu s kationtovým surfaktantem v množství účinném pro přednostní precipitaci proteinů jiných, než je cílový protein, tj. kontaminujících proteinů, zejména pokud je toto kontaktování prováděno za nepřítomnosti intermediámích polyaniontů, pevné opory nebo agregátů proteinů. Často odborník v oboru používá směsi rozpustných proteinů a nemá jednoduché a účinné postupy pro purifikaci požadovaného proteinu. Nový, zde popsaný způsob purifikace proteinů umožňuje účinnou purifikaci cílových proteinů pomocí kationtových surfaktantů pro přednostní precipitaci proteinů jiných, než je cílový protein. Výhodně je takováto precipitace kontaminujících proteinů přímá a nezávisí na přítomnosti polyaniontů, pevné opory nebo agregátů obsahujících kontaminující proteiny a další molekuly.

Podstata vynálezu

Předmět vynálezu poskytuje způsob purifikace cílového proteinu ze směsi obsahující cílový protein a kontaminující protein. Tedy předmětem vynálezu je poskytnutí způsob purifikace cílového proteinu, kdy se

a) získá roztok obsahující směs rozpuštěného cílového proteinu a jednoho nebo více rozpuštěných kontaminujících proteinů a alkalický pufr, kdy cílový protein má izoelektrický bod větší než 7 a je pozitivně nabitý při alkalickém pH a jeden nebo více kontaminujících proteinů má polyaniontový náboj;

-3 CZ 305852 B6

b) kontaktuje roztok obsahující směs rozpuštěného cílového proteinu a jednoho nebo více rozpuštěných kontaminujících proteinů s jedním nebo více kationtovými surfaktanty v množství, které je účinné pro selektivní precipitaci jednoho nebo více kontaminujících proteinů, kdy jeden nebo více kationtových surfaktantů je amfipatická amonná sloučenina vybrána ze skupiny sestávající se z kvartémích amonných sloučenin obecného vzorce QN⁺; primárních amonných sloučenin s parafínovým řetězcem obecného vzorce RNH₃ ⁺; a jejich solí, přičemž zvýšení podílu proteinů zbývajících v roztoku je dán cílovým proteinem; a opět získá rozpuštěný cílový protein.

Podle dalšího aspektu vynálezu, je zde poskytnut způsob zvýšení procentického podílu proteinu z roztoku proteinů, který obsahuje kroky:

a. získání roztoku mnoha proteinů, kde proteiny v roztoku obsahují cílový protein, jeden nebo více kontaminujících proteinů a alkalický pufr, a kdy cílový protein tvoří první hmotnostní procento všech proteinů v roztoku, kdy cílový protein má izoelektrický bod větší než 7 a je pozitivně nabitý při alkalickém pH a jeden nebo více kontaminujících proteinů má polyaniontový náboj; a

b. kontaktování roztoku s jedním nebo více kationtovými surfaktanty v množství, které účinné v selektivní precipitaci kontaminujících proteinů, kdy jeden nebo více kationtových surfaktantů je amfipatická amonná sloučenina vybrána ze skupiny sestávající se z kvartémích amonných sloučenin obecného vzorce QN ; primárních amonných sloučenin s parafínovým řetězcem obecného vzorce RNHý ; a jejich solí;

přičemž cílový protein v roztoku z kroku b. tvoří druhé hmotnostní procento všech proteinů a toto druhé procento je větší než první procento.

Objasnění výkresů

OBR. 1 ukazuje účinky koncentrace CPC na aktivitu a čistotu urikasy.

Koncentrace proteinu (A) a enzymatická aktivita (B) savčí urikasy z rozpuštěných inkluzních tělísek E. coli jsou měřeny po uvedeném působení CPC a oddělení centrifugací. Specifická aktivita (C) každého izolátu je vypočítána jako poměr těchto hodnot (aktivita/koncentrace proteinu).

OBR. 2 ukazuje chromatografickou analýzu HPLC s dělením podle velikosti molekul nečištěné savčí urikasy připravené z inkluzních tělísek a po působení 0,075% CPC.

Jsou analyzovány profily HPLC s dělením podle velikosti molekul u A. solubilizovaných inkluzních tělísek E. coli bez působení CPC a B. supematantu po precipitaci pomocí CPC (0,075%) a filtraci. Plochy každého vrcholu a procento celkové plochy jsou shrnuty v přiložených tabulkách.

OBR. 3 ukazuje SDS-PAGE (15% gel) analýzu urikasy po působení CPC.

Vzorky obsahující urikasu jsou připraveny, jak je popsáno v příkladu 1. Vzorky z různých kroků procesu jsou naneseny v alikvotech následovně: Sloupec 1 - rozpuštěná IB; Sloupec 2 - supernatant po působení CPC; Sloupec 3 - peleta po působení CPC.

OBR. 4 ukazuje chromatografickou analýzu HPLC s dělením podle velikosti molekul nečištěné scFv protilátky po působení 0,02% CPC.

Jsou analyzovány profily HPLC s dělením podle velikosti molekul u A. referenční standardní scFv protilátky BTG-271, B. rozpuštěných inkluzních tělísek a C. supematantu po opětovném

-4CZ 305852 B6 konformačním sbalení a precipitaci pomocí CPC (0,02%) a filtraci. Plochy každého vrcholu a procento celkové plochy jsou shrnuty v přiložených tabulkách.

OBR. 5 ukazuje SDS-PAGE (15% gel) analýzu scFv protilátky po působení CPC.

Vzorky obsahující scFv protilátky z různých kroků procesu a standardy jsou uvedeny v následujícím pořadí: Sloupec 1 - standardy molekulové hmotnosti; Sloupec 2 - rozpuštěná IB; Sloupec 3 - znovu sbalený protein; Sloupec 4 - CPC peleta; Sloupec 5 - supernatant po působení CPC.

OBR. 6 ukazuje HPLC gelovou filtrační chromatografií interferonu beta před a po působení CPC.

A. Před působením CPC

B. Po působení CPC.

Na kolonu bylo naneseno 200 μΙ roztoku 0,1 mg/ml interferonu beta.

Detailní popis vynálezu

Proteiny jsou amfolyty, které mají jak kladné, tak i záporné náboje. Na čistý náboj proteinu mají dopad pH roztoku a nabité molekuly, které interagují s tímto proteinem. Mezi proteiny může docházet k silným interakcím, pokud je čistý náboj proteinu neutrální (izoelektrický bod). Pokud je pH roztoku nižší, než je izoelektrický bod proteinu, má protein čistý kladný náboj a mezi kationtovými molekulami, včetně dalších proteinů, může docházet k elektrostatickému odpuzování.

Předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu purifikace solubilizovaného cílového proteinu z roztoku obsahujícího směs cílového proteinu a kontaminujících proteinů zahrnující kontaktování solubilizované směsi s účinným množstvím kationtového surfaktantu a opětovné získání cílového proteinu. Kationtové surfaktanty jsou povrchově aktivní molekuly s pozitivním nábojem. Obecně mají tyto sloučeniny alespoň jednu nepolární alifatickou skupinu. Výhodně má cílový protein izoelektrický bod větší než 7. V konkrétním provedení je pH roztoku přibližně stejné, jako je izoelektrický bod cílového proteinu. Ve výhodném provedení je pH roztoku nižší než izoelektrický bod cílového proteinu. V konkrétním provedení, kdy je pH roztoku vyšší než izoelektrický bod cílového proteinu, je pH roztoku v rozmezí 1 až 2 jednotek pH od izoelektrického bodu cílového proteinu. V konkrétním provedení, kdy je pH roztoku vyšší než izoelektrický bod cílového proteinu, je pH roztoku v rozmezí do 1 jednotky pH od izoelektrického bodu cílového proteinu.

V konkrétním provedení jsou kontaminující protein nebo proteiny přednostně precipitovány, což zvyšuje proporci proteinů reprezentovaných cílovým proteinem zůstávajících v roztoku. Pokud vyjdeme například z roztoku cílového proteinu a kontaminujícího proteinu, kde cílový protein tvoří 20 % celkového proteinu v roztoku, lze purifikovat cílový protein pomocí poskytnutých způsobů, aby bylo dosaženo roztoku, kde cílový protein tvoří 30 % nebo více, 40 % nebo více, 50 % nebo více, 60 % nebo více, 70 % nebo více, 80 % nebo více, 90 % nebo více, 95 % nebo více z celkového proteinu zůstávajícího v roztoku.

Jak je zde používáno, termín „přednostně precipitovat“ znamená, že protein nebo skupina proteinů se sráží větší měrou než další protein nebo skupina proteinů. Například v případě směsi cílového proteinu a kontaminujících proteinů jsou kontaminující proteiny přednostně precipitovány vzhledem k cílovému proteinu, pokud dojde kvysrážení 20 % nebo více kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 20 % cílového proteinu. Výhodně je vysráženo vysoké procento kontaminujících proteinů, zatímco cílového proteinu je vysráženo nízké procento. Ve výhodných provedeních dojde k vysrážení 30 % nebo více kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 30 % cílového proteinu; dojde k vysrážení 40 % nebo více kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 40 % cílového proteinu; dojde k vysrážení 50 % nebo více kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 50 % cílového proteinu;

-5CZ 305852 B6 dojde k vysrážení 60 % nebo více kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 60 % cílového proteinu; dojde k vysrážení 70 % nebo více kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 70 % cílového proteinu; dojde k vysrážení 80 % nebo více kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 80 % cílového proteinu; dojde k vysrážení 90 % nebo více 5 kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 90 % cílového proteinu; dojde k vysrážení 95 % nebo více kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 95 % cílového proteinu. Výhodně dojde k vysrážení pouze malého procenta cílového proteinu. Například je vysráženo méně než 60 %, méně než 50 %, méně než 40 %, méně než 30 %, méně než 20 %, méně než 10 %, méně než 5 % nebo méně než 1 % cílového proteinu.

V konkrétním provedení je celkové množství proteinu v roztoku (cílový protein plus kontaminující protein) před provedením purifikačního způsobu vynálezu od 0,1 do 10 mg/ml. V konkrétních provedeních je celkové množství proteinu v roztoku před provedením purifikačního způsobu vynálezu od 0,1 do 3 mg/ml, od 0,3 do 2 mg/ml, od 0,5 do 2 mg/ml, od 0,5 do 1 mg/ml, od 1 do 15 2 mg/ml nebo přibližně 1 mg/ml.

V konkrétních provedeních je přednostní precipitace kontaminujících proteinů přímá a nezávisí nebo v podstatě nezávisí na přítomnosti polyaniontů. V jiném provedení je přednostní precipitace kontaminujících proteinů přímá a nezávisí nebo v podstatě nezávisí na přítomnosti pevné opory. 20 V jiném provedení přednostní precipitace kontaminujících proteinů nezávisí nebo v podstatě nezávisí na přítomnosti agregátů mezi kontaminujícími proteiny a dalšími molekulami. Přednostní precipitace kontaminujících proteinů nezávisí nebo v podstatě nezávisí na nějaké složce (např. polyaniontech, pevné opoře nebo agregátech kontaminujících proteinů a dalších molekul), pokud například odstranění této složky neovlivní, respektive v podstatě neovlivní přednostní precipitaci 25 kontaminujícího proteinu. Příkladem nepodstatného účinku odstranění složky bude, že kontaminující proteiny budou přednostně precipitovány v přítomnosti i v nepřítomnosti této složky. Dalším příkladem bude, že kontaminující proteiny budou přednostně precipitovány ve stejné míře v přítomnosti i v nepřítomnosti této složky. Výhodně je stejné nebo v podstatě stejné množství kontaminujících proteinů vysráženo v nepřítomnosti nebo v podstatě v nepřítomnosti této složky, 30 jako při její přítomnosti.

V dalším provedení je způsob proveden za nepřítomnosti polyaniontů nebo za nepřítomnosti podstatného množství polyaniontů. V dalším provedení je způsob proveden za nepřítomnosti pevné opory nebo za nepřítomnosti podstatné pevné opory. V dalším provedení je způsob proveden za 35 nepřítomnosti agregátů mezi kontaminujícími proteiny a dalšími molekulami nebo za nepřítomnosti podstatného množství agregátů mezi kontaminujícími proteiny a dalšími molekulami. Výhodně je způsob proveden za nepřítomnosti nebo za nepřítomnosti podstatného množství dvou nebo třech členů skupiny sestávající se z polyaniontů, pevné opory a agregátů mezi kontaminujícími proteiny a dalšími molekulami.

Jakmile je způsob tohoto vynálezu jednou popsán, je rutinní záležitostí pro odborníka v oboru vybrat pro použití konkrétní surfaktant a podmínky, např. pH, teplotu, obsah solí, koncentraci kationtového surfaktantu, celkovou koncentraci proteinu, za kterých je tento způsob proveden se zvýšenou účinností purifikace konkrétního cílového proteinu. Například mohou být porovnány 45 purifikace provedené při různých hodnotách pH a koncentrací surfaktantu, aby byly zjištěny optimální purifikační podmínky. Příklady tohoto postupu jsou poskytnuty níže v části příklady. V konkrétním provedení je pH roztoku vybráno tak, že je tak vysoké, jak je to možné, aby nedošlo k podstatnému snížení množství opětovně získaného cílového proteinu.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu pro stanovení podmínek, které umožňují účinnou purifikaci cílových proteinů na bázi jejich rozpustnosti, jak je ovlivněna kationtovými surfaktanty.

- 6 CZ 305852 B6

Účinné množství kationtového surfaktantu je množství surfaktantu, které způsobí přednostní precipitaci kontaminujících proteinů. V konkrétních provedeních vysráží účinné množství surfaktantu 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % nebo 99 % kontaminujících proteinů.

V provedení vynálezu je kationtový surfaktant přidáván v koncentraci od 0,001 do 5,0 %, výhodně je kationtový surfaktant přidáván v koncentraci od 0,01 do 0,5 % a ještě výhodněji je kationtový surfaktant přidáván v koncentraci od 0,03 do 0,2 %. V konkrétních provedeních je kationtový surfaktant přidáván v koncentraci 0,01 až 0,1 %, 0,01 až 0,075 %, 0,01 až 0,05 % nebo 0,01 až 0,03 %.

V provedení vynálezu je výše uvedený způsob proveden tak, že kationtovým surfaktantem je amfipatická amonná sloučenina.

Ve výhodném provedení je solubilizovaný cílový protein podroben dalšímu zpracování poté, co byly kontaminující proteiny přednostně odstraněny. Toto další zpracování může zahrnovat další purifikační kroky, testy aktivity nebo koncentrace, dialýzu, chromatografii (např. HPLC, chromatografii s dělením podle velikosti molekul), elektroforézu, dialýzu atd.

Jak je zde používáno, amfipatické amonné sloučeniny zahrnují sloučeniny obecného vzorce QN⁺ nebo RNHj⁺ obsahující jak kationtové, tak i nepolární složky. Q znamená, že dusík je kvartémí amonný iont (kovalentně navázaný na čtyři organické skupiny, které mohou, ale nemusí, být společně propojeny vazbami). Pokud jsou organické skupiny společně propojeny vazbami, pak mohou vytvářet cyklické alifatické nebo aromatické sloučeniny v závislosti na konfiguraci elektronů ve vazbách mezi složkami, které tvoří cyklickou strukturu. Pokud má vybraná amfipatická amonná sloučenina obecný vzorec RNH₃ ⁺, pak je sloučeninou primární amin, kde R je alifatická skupina. Alifatické skupiny jsou organické skupiny s otevřeným řetězcem.

V provedení vynálezu může vybraná amfipatická amonná sloučenina vytvářet sůl s halogenem. Obvykle halogenové soli odkazují na ty, které obsahují fluoridové, chloridové, bromidové a jodidové ionty.

V provedení vynálezu má vybraná amfipatická amonná sloučenina alespoň jeden alifatický řetězec s 6 až 20 uhlíkovými atomy, výhodně má amfipatická amonná sloučenina alespoň jeden alifatický řetězec s 8 až 18 uhlíkovými atomy.

V provedení vynálezu je vybraná amfipatická amonná sloučenina vybrána ze skupiny sestávající se z cetylpyridiniových solí, stearamid(methyl)pyridiniových solí, laurylpyridiniových solí, cetylchinoliniových solí, solí methylesteru kyseliny laurylaminopropionové, kovových solí kyseliny laurylaminopropionové, lauryl(dimethyl)betainu, stearyl(dimethyl)betainu, lauryl(dihydroxyethyl)betainu a benzethoniových solí.

Amfipatické amonné sloučeniny, které mohou být použity, zahrnují mimo jiné hexadecylpyridinium-chlorid, dechalinium-acetát, hexadecylpyridinium-chlorid, cetyl(trimethyl)amonium-chlorid, směs n-alkyl(dimethylbenzyl)amonium-chloridů, cetylpyridinium-chlorid (CPC), N.Ndimethyl-A-[2-[2-[4-( 1,1,3,3,-tetramethylbutyl)-fenoxy]ethoxy]ethyl]benzenmethanamoniumchlorid, alkyl(dimethylbenzyl)amonium-chlorid a dichlorbenzyl(dimethylalkyl)amonium-chlorid, tetradecyl(trimethyl)amonium-bromid, dodecyl(trimethyl)amonium-bromid, cetyl(trimethyl)amonium-bromid, lauryl(dimethyl)betain, stearyl(dimethyl)betain a lauryl(dihydroxyethyl)betain.

V provedení vynálezu je amfipatickou amonnou sloučeninou cetylpyridiniová sůl, jako je cetylpyridinium-chlorid.

V provedení vynálezu směs obsahující požadovaný protein dále obsahuje buněčné složky, jako jsou buněčné složky odvozené z mikroorganizmů, například baktérií, jako je E. coli.

-7CZ 305852 B6

V provedení vynálezu jsou buněčné složky tvořeny jedním nebo více proteiny.

V provedení vynálezu může být cílovým proteinem rekombinantní protein, například enzym.

Způsob vynálezu může být použit pro purifikaci řady proteinů. Tyto proteiny mohou zahrnovat mimo jiné protilátky, urikasu, interferon-beta, inhibitor faktoru X z pijavice, kyselou deoxyribonukleasu 11, elastasu, lysozym, papain, peroxidasu, pankreatickou ribonukleasu, trypsinogen, trypsin, cytochrom c, erabutoxin, enterotoxin Cl ze Stafylococcus aureus a monoaminoxidasu A a další proteiny, které jsou kladně nabity za alkalických podmínek.

V provedení vynálezu může být cílovým proteinem protilátka, receptor, enzym, transportní protein, hormon nebo jejich fragment nebo konjugát, např. konjugát s druhým proteinem nebo chemickou sloučeninou nebo toxinem.

Protilátky zahrnují mimo jiné monoklonální, humanizované, chimérické, jednořetězcové, bispecifické, Fab fragmenty, F(ab')2 fragmenty, fragmenty produkované Fab expresní knihovnou, antiidiotypické (anti-Id) protilátky a fragmenty vážící epitop zjakékoliv výše uvedené protilátky, avšak za podmínky, že je při podmínkách purifikace protilátka kladně nabita.

Pro přípravu monoklonálních protilátek může být použita jakákoliv technika, která zajišťuje produkci molekul protilátky kontinuální kultivací buněčných linií. Ty zahrnují mimo jiné hybridomové techniky podle Kohler a Milstein, (1975, Nature 256, 495 - 497; a Patent US 4 376 110), techniky lidských B-buněčných hybridomů (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72; Cole et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 2026 - 2030) a techniky EBV-hybridomů pro produkci lidských monoklonálních protilátek (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77 - 96).

Takovéto protilátky mohou být použity jako základ pro klonování a tedy pro expresi jednotlivých rekombinantních těžkých a lehkých řetězců. Dva řetězce mohou být rekombinantně exprimovány ve stejné buňce nebo mohou být zkombinovány in vitro po oddělené expresi a purifikaci. Nukleové kyseliny (např. plazmidový vektor) kódující požadovaný těžký nebo lehký řetězec nebo kódující molekulu obsahující požadovanou variabilní doménu těžkého nebo lehkého řetězce mohou být transfekovány do buňky exprimující jiný těžký nebo lehký řetězec protilátky nebo molekulu obsahující těžký nebo lehký řetězec protilátky pro expresi multimemího proteinu. Alternativně mohou být těžké řetězce nebo molekuly obsahující jejich variabilní oblast nebo jejich CDR popřípadě exprimovány a použity bez přítomnosti komplementárního lehkého řetězce nebo variabilní oblasti lehkého řetězce. V dalších provedeních mohou být tyto protilátky a proteiny modifikovány na N- nebo C- konci, např. C-koncovou amidací nebo N-koncovou acetylací.

Chimérická protilátka je molekula, ve které jsou její různé části odvozeny z různých živočišných druhů, jako jsou ty, které mají variabilní oblast odvozenou z myší mAb a konstantní oblast z lidského imunoglobulinu. (Viz např. Cabilly et al., Patent US 4 816 567 a Boss et al., Patent US 5 816 397.) Techniky produkce chimérických protilátek zahrnují štěpení genů myší molekuly protilátky s příslušnou antigenní specifitou spolu s geny lidské molekuly protilátky s vhodnou biologickou aktivitou (viz například Morrison, et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci., 81, 6851 6855; Neuberger, et al., 1984, Nature 312, 604 - 608; Takeda, et al., 1985, Nature 314, 452 454).

Humanizované protilátky jsou molekuly protilátek z jiných druhů, než je člověk, které mají jednu nebo více oblastí určujících komplementaritu (CDR) z jiných druhů, než je člověk, a nosné oblasti z lidské molekuly imunoglobulinu. Techniky pro produkci humanizovaných protilátek jsou popsány například v Queen, Patent US 5 585 089 a Winter, Patent US 5 225 539. Rozsahy nosných oblastí a CDR byly přesně stanoveny (viz Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E. et al., US Department of Health and Human Services (1983).

-8CZ 305852 B6

Jednořetězcové protilátky jsou vytvářeny spojením fragmentů těžkého a lehkého řetězce z oblasti Fv díky aminokyselinovému můstku za vzniku jednořetězcového polypeptidu. Techniky pro produkci jednořetězcových protilátek jsou popsány například v Patentu US 4 946 778; Bird, 1988, Science 242, 423 - 426; Huston, et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879 - 5883 a Ward, et al., 1989, Nature 334, 544 - 546).

Bispecifická protilátka je geneticky vytvořená protilátka, která rozpoznává dva typy cílů, např. 1) specifický epitop a 2) „spouštěcí“ molekulu, např. Fc receptor na myeloidních buňkách. Takovéto bispecifické protilátky mohou být připraveny buď chemickou konjugací, hybridomovými technikami, nebo rekombinantními technikami molekulární biologie.

Fragmenty protilátek zahrnují mimo jiné: F(ab')2 fragmenty, které mohou být produkovány štěpením molekuly protilátky pepsinem, a F(ab') fragmenty, které mohou být produkovány redukcí disulfidických můstků v F(ab')2 fragmentech. Alternativně, mohou být vytvořeny Fab expresní knihovny (Huse, et aL, 1989, Science 246, 1275 - 1281) umožňující rychlou a snadnou identifikaci monoklonálních Fab fragmentů s požadovanou specifitou.

V provedení vynálezu je proteinem urikasa.

V dalším provedení vynálezu je urikasou savčí urikasa.

V dalším provedení vynálezu je savčí urikasou variantní savčí urikasa.

V dalším provedení vynálezu je savčí urikasou prasečí urikasa.

V dalším provedení vynálezu je variantní prasečí urikasa pojmenovaná jako PKSAN urikasa.

V dalším provedení vynálezu je proteinem protilátka.

V dalším provedení vynálezu je protilátkou jednořetězcová protilátka.

V dalším provedení vynálezu je proteinem interferon.

V dalším provedení vynálezu je interferonem interferon beta. V konkrétním provedení je interferonem interferon beta lb. Nagola, S. etal., Nature, 284:316(1980); Goeddel, D. V. etal., Nature, 287:411 (1980); Yelverton, E. et al., Nuc. Acid Res., 9:731 (1981); Streuli, M. et al., Proč. Naťl Acad. Sci. (U.S.), 78:2848 (1981); Evropské Pat. Přihlášky 28 033, zveřejněná 6. května 1981, 321 134, zveřejněná 15. července 1981, 34 307, zveřejněná 26. srpna 1981, a Belgický Patent 837 379, vydaný 1. července 1981, popisují různé způsoby produkce interferonu beta využívající techniky rekombinantní DNA. Postupy pro opětovné získání a purifikaci bakteriálně produkovaných IFN jsou popsány v Patentu US 4 450 103; US 4 315 852; US 4 343 735 a US 4 343 736 a v Derynck et al., Nature (1980) 287:193 - 197 a Scandella a Kornberg, Biochemistry, 10:4447 (1971).

V konkrétním provedení je cílovým proteinem faktor Xa z pijavice. Faktor Xa z pijavice může být produkován jakýmkoliv způsobem známým odborníkovi v oboru, jako je způsob popsaný v Patentu US 6 211 341 a Mezinárodním Patentovém Zveřejnění WO94/23 735.

V provedení vynálezu je kontaktování provedeno po dobu mezi přibližně 1 minutou a přibližně 48 hodinami, výhodněji od přibližně 10 minut do přibližně 24 hodin, přibližně 30 minut až přibližně 12 hodin, přibližně 30 minut až přibližně 8 hodin, přibližně 30 minut až přibližně 6 hodin, přibližně 30 minut až přibližně 4 hodiny, přibližně 30 minut až přibližně 2 hodiny, přibližně 30 minut až přibližně 1 hodinu nebo přibližně 1 až přibližně 2 hodiny.

-9CZ 305852 B6

V provedení vynálezu je kontaktování provedeno při teplotě od přibližně 4 °C do přibližně 36 °C; výhodněji od přibližně 4 °C do přibližně 26 °C.

Předmětem vynálezu je také poskytnutí použití kationtového surfaktantu jako jediného agens pro purifikaci proteinu s izoelektrickým bodem vyšším než 7 za alkalických podmínek.

Předmětem vynálezu je také poskytnutí urikasy purifikované za alkalických podmínek ze směsi pomocí přidání cetylpyridinium-chloridu do směsi.

V provedení vynálezu je urikasa získána z bakteriální buňky obsahující DNA kódující urikasu pomocí způsobu zahrnujícího takovou úpravu bakteriální buňky, aby exprimovala tuto DNA a produkovala urikasu, a opětovné získání urikasy.

V provedení vynálezu je urikasa získána z precipitátů z bakteriálních buněk.

Předmětem vynálezu je také poskytnutí purifikované urikasy pro použití při přípravě konjugátu urikasa-polymer.

Vynález také poskytuje purifikovaný protein s izoelektrickým bodem vyšším než 7, který lze získat způsobem zahrnujícím kontaktování směsi obsahující tento protein s účinným množstvím kationtového surfaktantu za takových podmínek, kdy je protein pozitivně nabitý nebo má plochu, která je pozitivně nabita, a opětovné získání proteinu.

Předmětem vynálezu je také poskytnutí použití cetylpyridiniové soli pro purifikaci proteinu s izoelektrickým bodem vyšším než 7.

V provedeních, kdy je směs kontaktována s účinným množstvím kationtového surfaktantu za takových podmínek, kdy je protein pozitivně nabitý, se bude pH lišit podle typu cílového proteinu. Přesto je pH výhodně mezi 7 a 11, výhodná rozmezí jsou od přibližně pH 7 do pH 10, pH 7 až pH 9, pH 8 až pH 11, pH 8 až pH 10 nebo pH 8 až pH 9.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklady, které následují, jsou zde uvedeny pro usnadnění pochopení vynálezu, ale nejsou zamýšleny a neměly by být jakýmkoliv způsobem spojovány s omezováním jeho rozsahu.

Příklad 1

Použití CPC pro purifikaci rekombinantní savčí urikasy

1.1 Pozadí

Urikasa o farmaceutické čistotě nesmí v podstatě obsahovat jiné proteiny, než je urikasa. Savčí urikasa (izoelektrický bod 8,67) produkovaná v E. coli se hromadí intracelulámě v precipitátech podobných organelám známým jako inkluzní tělíska (IB), které mohou být snadno izolovány pro další purifikaci. Na rozdíl od obecného názoru, že IB obsahují poškozený/špatně sbalený exprimovaný protein, obsahují tyto elementy podobné IB správně sbalenou urikasu v precipitované podobě. Expozice urikasových elementů podobných IB alkalickému pH, např. pH přibližně 9 až 11, znovu rozpustí tento precipitovaný protein. Obsah urikasy v so lub i lizo váných elementech podobných IB byl přibližně 40 až 60 % a vyžadoval extenzívní purifikaci, aby byl získán homogenní urikasový přípravek. Zde uvádíme purifikaci urikasy a dalšího proteinu pomocí CPC, které mohou být testovány řadou metod. Například čistota savčí urikasy může být hodnocena stanovením specifické aktivity, počtem proužků, které se objeví po elektroforéze a obarvení SDS- 10CZ 305852 B6

PAGE gelů a počtem a velikostí vrcholků, které se objeví na chromatogramu po HPLC s dělením podle velikosti molekul.

1.2 . MATERIÁLY A METODY

1.2 .1.50 mM NaHCO₃ pufr (pH 10,3)

Tento pufr se připraví rozpuštěním NaHCO₃ na konečnou koncentraci 50mM. pH se upraví na 10,2 až 10,4. V závislosti na výchozím pH může být použita 0,lM HCI nebo IN NaOH.

1.2.2. 10% roztok CPC

10% CPC se připraví rozpuštěním CPC v destilované vodě na konečnou koncentraci 10 g/100 ml.

1.2.3. Exprese rekombinantní prasečí urikasy

Rekombinantní savčí urikasa (urátoxidasa) se exprimuje v E. coli K-12 kmen W3110 F’, jak je popsáno v Mezinárodním Patentovém Zveřejnění WO 00/08 196 patřícím Duke University a US Patentové prozatímní přihlášce 60/095 489, které jsou zde uvedeny jako celky coby odkazy.

1.2.4. Kultivace a sklizeň bakterií produkujících urikasu

Bakterie se kultivují při 37 °C v růstovém médiu obsahujícím kaseinový hydrolyzát, kvasniční extrakt, soli, glukosu a amoniak.

Po kultivaci se bakterie, ve kterých došlo k nahromadění urikasy, sklidí centrifugací a promyjí vodou, aby byl odstraněn zbytek kultivačního média.

1.2.5. Rozrušení buněk a opětovné získání IB

Peleta sklizených buněk se rozsuspenduje v 50mM Tris pufru, pH 8,0 a lOmM EDTA a výsledný objem se upraví na přibližně dvacetinásobek suché hmotnosti buněk (DCW). K rozsuspendované peletě se za promíchávání přidá lysozym o koncentraci 2000 až 3000 jednotek/ml a vše se inkubuje 16 až 20 hodin při 4 až 8 °C.

Buněčný lyzát se podrobí intenzivnímu promíchání a následně se sonikuje. Suspenze se zředí stejným objemem deionizované vody a centrifuguje. Peleta obsahující urikasová inkluzní tělíska se zředí deionizovanou vodou (hmotnost/hmotnost) a centrifuguje, aby byly dále odstraněny nečistoty. Peleta získaná z tohoto posledního promývacího kroku se uschová pro další zpracovávání a supernatant se vyhodí.

1.2.6. Rozpouštění

Peleta inkluzních tělísek (IB) se rozsuspenduje v 50mM NaHCO₃ pufru, pH 10,3 ± 0,1. Suspense se inkubuje při teplotě 25 ± 2 °C po přibližně 0,5 až 2 hodiny, aby mohlo dojít k solubilizaci urikasy z IB.

1.2.7. Působení CPC

10% roztok CPC se za prudkého míchání přidá v alikvotech k homogenizovaným IB (pH 10,3), aby byla získána požadovaná koncentrace CPC. Vzorek se inkubuje 1 až 24 hodin, jak je uvedeno, během nichž se vytvoří precipitující vločky. Vzorek se centriftiguje 15 minut při 12 000 x g. Peleta a supernatant se oddělí a peleta se rozsuspenduje v 50mM NaHCO₃ pufru (pH 10,3) na původní objem. Stanoví se enzymatická aktivita každé frakce a frakce se zakoncentrují a dialyzují, aby byl odstraněn zbývající CPC.

- 11 CZ 305852 B6

1.2.8. Stanovení proteinu

Obsah proteinu v alikvotech opůsobených a neopůsobených vzorků 1B se stanoví pomocí modifikované Bradfordovy metody (Macart a Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122:93 - 101).

1.2.9. Testování urikasy

1.2.9.1. Enzymatická aktivita

Aktivita urikasy se měří UV metodou (Fridovich, I. (1965) The competitive inhibition of uricase by oxonate and by related derivatives of s-triazines. J Biol Chem, 240, 2491 - 2494; modifikovanou přidáním 1 mg/ml BSA). Enzymatická reakční rychlost se stanoví v duplikátech měřením snížení absorbance při 292 nm, které je výsledkem oxidace kyseliny močové na alantoin. Jedna jednotka aktivity je definována jako množství urikasy potřebné pro oxidaci jednoho pmolu kyseliny močové za minutu při 25 °C za specifikovaných podmínek. Účinnost urikasy je vyjádřena v jednotkách aktivity na mg proteinu (U/mg).

Extinkční koeficient 1 mM kyseliny močové při 292 nm v 1 cm optické délce je 12,2. Proto oxidací 1 pmolu kyseliny močové v ml reakční směsi dojde ke snížení absorbance z 12,2 mA₂₉2. Změna absorbance v čase (ΔΑ292 za minutu) se stanoví z lineární části křivky. Aktivita urikasy se pak spočítá následovně:

AA₂92nm (AU/min) x DF x Vrm

Aktivita (U/ml) =-----------------------------------------.

V_sx 12,2

Kde: DF = faktor zředění;

Vrm = celkový objem reakční směsi (v μΐ)

Vs = objem zředěného vzorku použitého v reakční směsi (v μΐ).

1.2.9.2. HPLC analýza pomocí Superdex 200

Množství a relativní procento nativního urikasoveho enzymu, stejně jako možné kontaminace, se kvantifikují podle elučního profilu získaného z HPLC za použití kolony Superdex 200. Duplikáty vzorků urikasového roztoku byly injikovány do kolony. Plochy každého vrcholu a procento z celkové plochy byly automaticky vypočítány a shrnuty v přiložených tabulkách.

1.2.10. SDS-PAGE analýza

Proteiny ve vzorcích obsahujících —20 Lig proteinu/sloupec byly rozděleny na 15% SDS-PAGE gelech. Výsledné gely byly obarveny pomocí Coomassie brilliant blue.

1.3. VÝSLEDKY

Účinky působení CPC (0,005 až 0,075%) (po 1 až 24 hodin) na aktivitu urikasy získanou ze supematantu a její čistota jsou uvedeny v Tabulce I a na OBR 1. Před působením CPC (při pH 10,3) byla koncentrace proteinu 1,95 mg/ml a specifická enzymatická aktivita byla 3,4 až 4,67 U/mg. Výsledky uvedené na OBR. 1B naznačují, že během každé inkubační doby se se zvýšením koncentrace CPC snížila koncentrace proteinu v supematantu. Při méně než 0,04% CPC byl pozorován relativně malý účinek na koncentraci proteinu. CPC v koncentracích 0,04 až 0,075% může snižovat koncentraci proteinu na přibližně 50 % původní koncentrace.

-12CZ 305852 B6

Oproti účinkům CPC na celkovou koncentraci proteinu nebyla aktivita rozpuštěné urikasy signifikantně ovlivněna zvyšující se koncentrací CPC a inkubačním časem (OBR. 1A). Během každé inkubační doby se specifická enzymatická aktivita (OBR. 1C) konzistentně zvyšovala jako funkce koncentrace CPC v rozmezí 0,04 až 0,075%. Toto zvýšení bylo výsledkem specifického odstranění jiných proteinů, než je urikasa. Vzhledem ktomu, že specifická enzymatická aktivita výsledného purifikovaného enzymu byla přibližně 9 U/mg, byla většina kontaminujících proteinů odstraněna precipitací pomocí CPC. Provedené HPLC a SDS-PAGE analýzy pak potvrdily tento závěr.

Tabulka 1. účinek vystavení CPC na specifickou aktivitu a čistotu urikasy

Inkubační doba (hod)	[CPC] (%)	Aktivita urikasy (U/ml)	[Protein] (mg/ml)	Specifická aktivita urikasy (U/mg)
1	0 (celková hodnota)	6,63	1,95	3,4
1	0,005	7,1	1,8	3,9
1	0,01	6,63	1,75	3,7
1	0,02	6,63	1,75	3,7
1	0,04	6,4	1,47	4,35
1	0,06	5,9	0,95	6,2
1	0,075	6,4	0,9	7,1
4	0,005	8,61	1,7	5,06
4	0,01	8,36	1,66	5,04
4	0,02	8,36	1,6	5,04
4	0,04	7,38	1,32	5,59
4	0,06	6,4	0,9	7,1
4	0,075	6,9	0,82	8,4
24	0,005	8,8	1,9	4,66
24	0,01	7,9	1,9	4,14
24	0,02	7,9	1,9	4,14
24	0,04	7,3	1,5	4,9
24	0,06	6,9	0,97	7,1
24	0,075	6,6	0,9	7,4
24	0 (celková hodnota)	9,1	1,95	4,67

1.4. Potvrzení pozitivního vlivu CPC na čistotu urikasy

Izolují se a solubilizují IB obsahující urikasu, jak je popsáno v části 1.3. Vzorky rozpuštěného materiálu se analyzují před působením CPC a po filtraci proteinu precipitovaného CPC.

1.4.1. HPLC analýza jiných proteinů, než je urikasa, po působení 0,075% CPC

HPLC analýza solubilizovaných IB naznačuje, že vrchol urikasy (retenční čas (RT) —25,5 minuty) tvoří přibližně 46 % proteinu v nečištěném vzorku IB (OBR 2A). Po působení CPC se vrchol urikasy zvýšil na přibližně 92 % proteinu (OBR 2B) a byl doprovázen signifikantním snížením kontaminujících molekul, které jsou eluovány mezi RT 15 až 22 min (OBR 2A). Plocha pod urikasovým vrcholem je přibližně 70% vzhledem k vrcholu na obr. 2A. Tyto výsledky proto na

- 13CZ 305852 B6 značují zdvojnásobení čistoty urikasy, které je výsledkem odstranění jiných proteinů, než je urikasa, po působení CPC.

1.4.2. Účinek 0,075% CPC na enzymatickou aktivitu

Výsledky (uvedené v tabulce 2) naznačují, že hmotová bilance aktivity urikasy byla během postupu zachována. Bylo zjištěno, že vystavením CPC došlo k precipitaci 60 % všech proteinů v roztoku. Více než 85 % enzymatické aktivity zůstalo v roztoku, proto odstranění ostatních proteinů umožnilo zvýšení specifické aktivity ve vzniklém supematantu o víc jak 110 %. Jako při většině purifikačních způsobů zůstala část požadované aktivity v peletě. V tomto případě zůstalo v peletě pouze 17,6 % původní aktivity (a byla extrahována pomocí 50mM hydrogenuhličitanu sodného (7 mSi, pH 10,3) pro analytické účely), což je relativně malá část z původního množství.

Tabulka 2. účinek působení CPC na aktivitu urikasy

Vzorek	Celková aktivita (U)	Aktivita (U/ml)	[Protein] (mg/ml)	Specifická aktivita (U/mg)	Získaná aktivita (%)
Před CPC	490	4,9	2	2,46	100
Po působení CPC	418	4,18	0,8	5,2	85,3
Peleta po působení CPC	86	0,8	-	-	17,6

1.4.3. SDS-PAGE analýza po působení 0,075% CPC

Vzorky nečištěné urikasy, před působením CPC, a následné frakce po oddělení rozpustného a nerozpustného materiálu po působení CPC, separaci frakcí centrifugací a rekonstituci pelety získané centrifugací obsahující stejná množství proteinu se analyzují metodikou SDS-PAGE. Výsledky (viz OBR. 3) ukazují přítomnost kontaminujících proteinů před působením CPC. Po působení CPC obsahovala většinu kontaminujících proteinů peleta, zatímco supernatant obsahoval urikasu zobrazenou jako jediný hlavní proteinový proužek.

Příklad 2

Účinek CPC na purifikaci jednořetězcových (scFv) protilátek

2.1. MATERIÁLY A METODY

2.1.1. Pufry

2.1.1.1. Pufr pro rozpuštění inkluzních tělísek

Rozpouštěcí pufr obsahuje 6M močovinu, 50mM Tris, ImM EDTA a 0,lM cystein. pH pufru se titruje na 8,5.

2.1.1.2. Pufr pro konformační sbalení

Pufr pro konformační sbalení obsahuje 1M močovinu, 0,25mM NaCI, ImM EDTA a 0,lM cystein. pH pufru se titruje na 10,0.

- 14CZ 305852 B6

2.1.2. Exprese scFv protilátek v bakteriích

ScFv protilátky (pí 8,9) se exprimují v E. coli transformované vektorem kódujícím scFv obsahující na karboxylovém konci cystein-lysin-alanin-lysin, jak je popsáno v PCT Zveřejnění WO 02/059 264, které je zde uvedeno jako celek coby odkaz.

2.1.3. Kultivace a sklizeň bakterií produkujících scFv protilátku

Bakteriální buňky obsahující scFv se kultivují v minimálním médiu doplněném L-argininem, konečná koncentrace 0,5 %, při pH 7,2 pět hodin před indukcí. Exprese scFv se indukuje limitací množství glukosy v médiu. Bakteriální buňky obsahující scFv se sklidí z kultury ultrafiltrací.

2.1.4. Rozrušení buněk a opětovné získání inkluzních tělísek

Sklizená buněčná peleta se rozsuspenduje v 50mM Tris pufru, pH 8,0 a lOmM EDTA a výsledný objem se upraví na přibližně dvacetinásobek suché hmotnosti buněk (DCW). K rozsuspendované peletě se za promíchávání přidá lysozym o koncentraci 2000 až 3000 jednotek/ml a vše se inkubuje 16 až 20 hodin při 4 °C.

Buněčný lyzát se podrobí intenzivnímu promíchání a následně se sonikuje. Inkluzní tělíska obsahující scFv protilátku se znovu získají centrifugací při 10 000 x g. Peleta se přibližně šestnáctkrát zředí deionizovanou vodou (hmotnost/hmotnost) a centrifuguje, aby byly dále odstraněny nečistoty. Peleta získaná z tohoto posledního promývacího kroku se uchová pro další zpracování.

2.1.5. Rozpuštění a opětovné konformační sbalení

Peleta obohacená o IB se rozsuspenduje v pufru pro rozpouštění inkluzních tělísek (viz výše), inkubuje se 5 hodin při teplotě místnosti a nechá se opětovně konformačně sbalit in vitro v roztoku založeném na arginu/oxidováném glutathionu. Po sbalení se protein dialyzuje a koncentruje tangenciální průtočnou filtrací proti pufru obsahujícím močovinu/fosfát.

2.1.6. Působení CPC

10% roztok CPC se přidá ke směsi pro konformační sbalení scFv na výslednou koncentraci 0,02 % a po 1 až 2 hodinách inkubace při teplotě místnosti se precipitát odstraní filtrací. Supernatant obsahuje scFv protilátku.

2.2. VÝSLEDKY

2.2.1. Účinek koncentrace CPC na opětovné získání scFv protilátky

Účinky CPC (při pH 7,5 nebo 10) na čistotu a opětovné získání scFv protilátky jsou uvedeny v tabulce 3. Před působením CPC bylo výchozí množství proteinu v IB 73 mg a obsahovalo 15,87 mg scFv protilátky, jak bylo stanoveno HPLC analýzou pomocí Superdex 75. Retenční čas (RT) vrcholů obsahujících scFv protilátku byl přibližně 20,6 minut. Výsledky naznačují, že opětovné získání všech proteinů obecně klesá se zvyšující se koncentrací CPC a opětovné získání scFv protilátky zůstalo >80 %, zatímco koncentrace CPC byla <0,03%. Relativně účinnějšího odstranění kontaminujícího proteinu bylo dosaženo při pH 7,5 vzhledem kpH 10. Purifikace scFv protilátky tak bylo dosaženo působením 0,01 až 0,03% CPC.

- 15CZ 305852 B6

Tabulka 3. Účinek působení CPC na opětovné získání a čistotu scFv protilátky

Zpracování rozpuštěných IB	Celkový protein (mg)	Celková scFv stanovená HPLC (mg)	Purifikační faktor	% opětovného získání scFv stanovené HPLC
Kontrola (před CPC)	73	15,87		100
0,01% CPC (pH 10)	64	15,66	1,13	98,68
0,01%CPC(pH 7,5)	50,76	14,97	1,36	94,33
0,015% CPC (pH 10)	54	14,49	1,23	91,30
0,015% CPC (pH 7,5)	39,96	14,22	1,64	89,60
0,02% CPC (pH 10)	43	13,35	1,43	84,12
0,02% CPC (pH 7,5)	37,8	13,02	1,58	82,04
0,03% CPC (pH 10)	35	11,12	1,46	70,07
0,03% CPC (pH 7,5)	37,8	12,47	1,52	78,58

2.3. POTVRZENÍ POZITIVNÍHO VLIVU CPC NA ČISTOTU scFv PROTILÁTKY

2.3.1. HPLC analýza opětovného získání scFv po působení CPC

HPLC analýza znovu sbaleného proteinu naznačuje, že vrchol obsahující scFv protilátku (retenční čas (RT) -20,6 minut) obsahoval přibližně 22,7 % proteinu z celkového proteinu (OBR. 4B). Chromatogram na OBR 4C naznačuje, že po působení 0,02% CPC obsahoval vrchol obsahující scFv protilátku ze supematantu přibližně 75,9 % celkového injikovaného proteinu, tj. 3,3-násobnou purifikaci. Působení CPC tak odstranilo proteinové nečistoty z roztoků scFv protilátky.

2.3.2. SDS-PAGE analýza opětovného získání scFv po působení CPC

Výsledky (viz OBR. 5) naznačují, že před působením CPC vzorek obsahoval signifikantní množství velkého počtu proteinů. Obdobně po působení CPC obsahovala peleta velký počet proteinů. Naopak supernatant po působení CPC obsahoval jeden hlavní proteinový proužek, scFv protilátku.

Příklad 3

Účinek CPC na purifikaci rekombinantního interferonu-beta

Interferon beta (IFN-beta, pl 8,5 až 8,9) se exprimuje v E. coli známými metodami. Nagola, S. et al., Nature, 284:316 (1980); Goeddel, D. V. et al., Nature, 287:411 (1980); Yelverton, E. et al., Nuc. Acid Res., 9:731 (1981); Streuli, M. et al., Proč. Naťl Acad. Sci. (US), 78:2848 (1981); Evropské Pat. Žádosti 28 033, zveřejněná 6. května 1981; 321 134, zveřejněná 15. července 1981; 34 307, zveřejněná 26. srpna 1981 a Belgický Patent 837 379, vydaný 1. července 1981, popisují různé způsoby produkce interferonu beta využívající techniky rekombinantní DNA. Způsoby pro opětovné získání a čištění bakteriálně produkovaných IFN jsou popsány v Patentu US 4 450 103; US 4 315 852; US 4 343 735 a US 4 343 736 a v Derynck et al., Nature (1980) 287:193 - 197 a Scandella a Kornberg, Biochemistry, 10:4447 (1971). Inkluzní tělíska obsahující IFN-beta se vyizolují a solubilizují.

Výsledný roztok se vystaví působení CPC. Výsledky uvedené na obrázku 6 naznačují podstatný pokles množství kontaminujících proteinů po působení CPC. Aktuální množství IFN-beta (plocha pod vrcholem) se po působení CPC znatelně nezměnilo.

- 16CZ 305852 B6

Tabulka 4 shrnuje účinky působení CPC. Celkový protein (Bradford) poklesl o 40 %, LTV absorbance poklesla o přibližně 40, avšak množství IFN-beta se nezměnilo.

Tabulka 4.

Vzorek a zpracování	Protein (mg/ml)	O.D A280	Obsah IFNb (mg/ml)a	SEC Profil
Kontrola (po sbalení proteinu, bez CPC, 104931)	0,51	1,55	0,069	Vrchol R.T. 13b min tvoří 15 % celkové plochy
Test (po sbalení proteinu a působení 0,05% CPC, 1049-31)	0,3	1,0	0,069	Vrchol R.T. 13b min tvoří 7,34 % celkové plochy

^a Kvantifikováno Vydac C4 kolonou ^b SEC profil obsahoval několik vrcholů. Vrchol, který se eluuje ve 13 min (R.T. 13 min), se io zmenšil po působení CPC a odpovídá oblasti, kde se eluují proteiny s vysokou molekulární hmotností a jejich varianty.

Příklad 4

Účinek CPC na purifíkaci inhibitoru faktoru Xa.

CPC byl použit pro purifíkaci inhibitoru faktoru Xa z pijavice. Inhibitor faktoru Xa z pijavice (FXal, pl 8,4 až 9,1) může být produkován, jak bylo popsáno v Patentu US 6 211 341 a Meziná20 rodním patentovém zveřejnění č. WO94/23 735. Po izolaci inkluzních tělísek (IB) obsahujících FXal se FXal purifikuje z IB v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu 1. Po rozpuštění IB pelety se přípravek inkubuje s 10% roztokem CPC. Následně se směs centrifuguje 15 minut při 12 000 x g. Oddělí se peleta a supernatant. Peleta se rozsuspenduje v 50 mM NaHCOi pufru na původní objem. Peleta a supernatant se odděleně zakoncentrují a dialyzují, aby byl odstraněn 25 zbývající CPC. Obsah a aktivita proteinu byly změřeny a bylo zjištěno, že FXal byl převládající složkou supematantu a v podstatě se nevyskytoval v peletě. Výsledky naznačují, že působení CPC zvýšilo účinnost opětovného získání a zlepšilo čistotu znovu získaného FXal.

Příklad 5

Purifikace karboxypeptidasy B (CPB) pomocí CPC

Identická množství inkluzních tělísek získaných z klonu exprimujícího CPB se solubilizují v 8 M 35 močovině, pH 9,5 (kontrola a test). Produkce CPB je popsána v Mezinárodním patentovém zveřejnění WO96/23 064 a v Patentu 5 948 668. Na testovaný vzorek se nechá působit 0,11% CPC a vzorek se vyčistí filtrací před opětovným konformačním sbalením. Opětovné konformační sbalení kontrolního a testovaného vzorku se provede zředěním roztoků 1:8 pufrem pro opětovné konformační sbalení. Po inkubaci s endoproteinasou přes noc při teplotě místnosti se na DEAE 40 Sepharosovou kolonu nanesou stejná množství kontrolního a testovaného roztoku. Kolona se promyje a aktivní enzym se následně eluuje 60mM chloridem sodným v 20mM Tris pufru s pH 8.

- 17CZ 305852 B6

Tabulka 5.

Krok procesu	Parametr	Zpracování
Kontrola	0,11% CPC
Rozpuštění v 8 M močovině Po vyčištění	Celková A280	960	494
Obsah proteinu (mg)*	490	272
pH	9,5	9,5
Aktivita enzymu (jednotky)	Inaktivní (**)	Inaktivní
Po chromatografií 26,5 mg opětovně sbaleného proteinu (DEAE MP)	Obsah proteinu (mg)*	5,67	8,41
Aktivita enzymu (jednotky)	258	4043
Specifická aktivita (jednotek/mg)	98	481

(*) Stanovení proteinu bylo provedeno metodou podle Bradforda.

(** ) Před opětovným sbalením nebyl protein aktivní.

Výsledky uvedené v tabulce 5 ukazují, že celková OD v materiálu po působení CPC poklesla o 49,5 % a celkový obsah proteinů se snížil o 44,5 %. Zajímavé je, že celková aktivita enzymu znovu získaného ve vzorcích vystavených působení CPC vzrostla o 79 %, což naznačuje, že CPC odstranil složku, která částečně inhibovala vytvoření aktivního enzymu.

Všechny zde citované odkazy jsou zde začleněny coby odkazy jako celky a pro všechny účely ve stejném rozsahu, jako kdyby každé jednotlivé zveřejnění nebo patent nebo patentová přihláška byly specificky a jednotlivě uvedeny, že jsou zde začleněny coby odkazy jako celky pro všechny účely.

Může být provedeno mnoho modifikací a variací předloženého vynálezu bez toho, aby se odchýlily od ducha a předmětu vynálezu, jak bude zřejmé odborníkům v oboru. Zde popsaná specifická provedení jsou předložena pouze jako příklad a vynález má být omezen pouze podmínkami v přičleněných patentových nárocích spolu s celým rozsahem textových ekvivalentů, ke kterým se tyto nároky vztahují.

Průmyslová využitelnost

Vynález poskytuje způsob purifikace solubilizovaného cílového proteinu z roztoku obsahujícího směs cílového proteinu a kontaminujících proteinů zahrnující kontaktování solubilizované směsi s účinným množstvím kationtového surfaktantu a opětovné získání cílového proteinu.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob purifikace cílového proteinu, v y z n a č u j í c í se tím, že se

   a) získá roztok obsahují směs rozpuštěného cílového proteinu a jednoho nebo více rozpuštěných kontaminujících proteinů a alkalický pufr, kdy cílový protein je pozitivně nabitý a má izoelektrický bod větší než 7 při alkalickém pH a jeden nebo více kontaminujících proteinů má polyaniontový náboj;

   b) kontaktuje roztok obsahující směs rozpuštěného cílového proteinu a jednoho nebo více rozpuštěných kontaminujících proteinů s jedním nebo více kationtovými surfaktanty v množství, které je účinné pro selektivní precipitaci jednoho nebo více kontaminujících proteinů, kdy jeden nebo více kationtových surfaktantů je amfipatická amonná sloučenina vybrána ze skupiny sestávající se z kvartémích amonných sloučenin obecného vzorce QN⁺; primárních amonných sloučenin s parafínovým řetězcem obecného vzorce RNH₃ ; a jejich solí, přičemž zvýšení podílu proteinů zbývajících v roztoku je dán cílovým proteinem; a

   c) opět získá rozpuštěný cílový protein.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vy z n a č uj í c í se t í m , že amfipatická amonná sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající se z cetylpyridiniových solí, stearamid(methyl)pyridiniových solí, laurylpyridiniových solí, cetylchinoliniových solí, solí methylesteru kyseliny laurylaminopropionové, kovových solí kyseliny laurylaminopropionové, lauryl(dimethyl)betainu, stearyl(dimethyl)betainu, lauryl(dihydroxyethyl)betainu a benzethoniových solí a dále případně, buď

   i) kdy amfipatická amonná sloučenina je vybrána z hexadecylpyridinium-chloridu, dechalinium-acetátu, hexadecylpyridinium-chloridu, cetyl(trimethyl)amonium-chloridu, směsi n-alkyl(dimethylbenzyl)amonium-chloridu, cetylpyridinium-chloridu, A/ŤV-dimethyl-/V-[2-[2-[4(1,1,3,3,-tetramethylbutyl)fenoxy]-ethoxy]ethyl] benzenmethanamonium-chloridu, alky l(dimethyl-benzyl)amonium-chloridu a dichlorbenzyl(dimethylalkyl)amonium-chloridu, tetradecyl(trimethyl)amonium-bromidu, dodecyl(trimethyl)amonium-bromidu, cetyl(trimethyl)amoniumbromidu, lauryl(dimethyl)betainu, stearyl(dimethyl)betainu a lauryl(dihydroxyethyl)betainu, nebo ii) kdy amfipatickou amonnou sloučeninou je cetylpyridiniová sůl, výhodně/případně halogenidová sůl, výhodně/případně cetylpyridinium-chlorid, kdy amfipatická amonná sloučenina případně má alespoň jeden alifatický řetězec s 6 až 20 uhlíkovými atomy, výhodně/případně s 8 až 18 uhlíkovými atomy.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok dále obsahuje jednu nebo více buněčných složek, výhodně/případně

   i) odvozených z mikroorganizmu, výhodně/případně bakterií, výhodně/případně E. coli, nebo ii) kde jednou nebo více buněčnými složkami jsou jeden nebo více proteinů.
4. 4. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m , že cílovým proteinem je

   i) rekombinantní protein, výhodně/případně enzym, nebo ii) protilátka, výhodně/případně jednořetězcová protilátka, nebo iii) interferon, výhodně/případně interferon-beta, nebo

   - 19CZ 305852 B6 iv) je vybrán ze skupiny sestávající se z protilátky, urikasy, interferonu-beta, inhibitoru faktoru X, kyselé deoxyribonukleasy II, elastasy, lysozymu, papainu, peroxidasy, pankreatické ribonukleasy, trypsinogenu, trypsinu, cytochromu c, erabutoxinu, enterotoxinu Cl ze Stafylococcus aureus, interferonu a monoaminoxidasy A, kdy cílovým proteinem je výhodně urikasa, výhodně/případně savčí urikasa, a výhodně/případně prasečí urikasa.
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jeden nebo více kationtových surfaktantů jsou přidány v koncentraci od 0,001 do 5,0 %, výhodně/případně od 0,01 do 0,5 %, a více výhodně/případně od 0,03 do 0,2 %.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kontaktování probíhá od 5 minut do 48 hodin, výhodně/případně 10 minut do 24 hodin, nebo je prováděno při teplotě 4 až 36 °C, výhodně/případně při 4 až 26 °C.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok, kromě případného stopového množství, neobsahuje

   i) polyanionty, nebo ii) pevnou oporu, nebo iii) agregáty kontaminujících proteinů s dalšími molekulami, nebo iv) polyanionty, pevnou oporu a agregáty kontaminujících proteinů s dalšími molekulami.
8. 8. Způsob podle některého z předchozích nároků laž7, vyznačující se tím, že je kationtovým surfaktantem je cetylpyridiniová sůl, výhodně/případně cetylpyridinium-chlorid.
9. 9. Způsob zvýšení procentického obsahu cílového proteinu v roztoku proteinů, vyznačující se t í m , že obsahuje kroky:

   a. získání roztoku mnoha proteinů, kde proteiny v roztoku obsahují cílový protein, jeden nebo více kontaminujících proteinů a alkalický pufr, a kdy cílový protein tvoří první hmotnostní procento všech proteinů v roztoku, kdy cílový protein má izoelektrický bod větší než 7 a je pozitivně nabitý při alkalickém pH a jeden nebo více kontaminujících proteinů má polyaniontový náboj; a

   b. kontaktování roztoku s jedním nebo více kationtovými surfaktanty v množství, které účinné v selektivní precipitaci kontaminujících proteinů, kdy jeden nebo více kationtových surfaktantů je amfipatická amonná sloučenina vybrána ze skupiny sestávající se zkvartémích amonných sloučenin obecného vzorce QN⁺; primárních amonných sloučenin s parafínovým řetězcem obecného vzorce RNH₃ ⁺; a jejich solí;

   přičemž cílový protein v roztoku z kroku b. tvoří druhé hmotnostní procento všech proteinů a toto druhé procento je větší než první procento.