CZ302599A3

CZ302599A3 - Způsob přípravy směsi mikroorganismů na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloučenin fosforu a na rozklad potravinářského olejového sedimentu a uvedená směs

Info

Publication number: CZ302599A3
Application number: CZ19993025A
Authority: CZ
Inventors: Arpád Pollák
Original assignee: Arpád Pollák
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2000-01-12
Also published as: SK279941B6; WO1998037038A3; SK25097A3; DE19880157B4; HUP0002253A3; HU225130B1; CZ299601B6; DE19880157D2; WO1998037038A2; AU6129698A; HUP0002253A2

Description

Způsob přípravy směsi mikroorganismů na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloučenin fosforu a na rozklad potravinářského olejového sedimentu a uvedená směs.

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy směsi mikroorganismů na bakteriální vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti ve vodě nerozpustného fosforu obsaženého v půdě a na bakteriální rozklad nezpracovatelného kalu v oleji vznikajícího při výrobě jedlých olejů a uvedené směsi. Vynález je významný z hlediska ochrany životního prostředí pomocí působení metabiózy mikroorganismů.

Dosavadní stav techniky

V několika posledních desetiletích se v zemědělské výrobě používala převážně dusíkatá umělá hnojivá. Dosahovaly se tím velké výnosy úrod. Stálé používání umělých hnojiv, pokud to nebylo ve spojení s použitím chlévského hnojivá, způsobilo, že se půda vlivem velkého množství chemikálií stala kyselá a mikrobiální život v půdě byl potlačen, půda se zhutňovala, zhoršily se vodní a vzdušné podmínky půdy. Kromě toho do spodních vod pronikal škodlivý dusičnan. Při velkých deštích vodní proud odplavil granulované umělé hnojivo do potoků a takto se dusičnan dostával i do vodních toků. Jednorázovým dávkováním velkého množství dusíkatého umělého hnojivá rostliny, zejména zahradní rostliny, přijímaly nadměrné množství dusičnanu, který negativně působí na biologický organismus, zejména zvlášť škodlivě působí dusičnan na kojence a malé děti, protože v krvi vyvolává methemoglobinémii, která může být i smrtelná. Proto se zavedlo sledování obsahu dusičnanů zejména v zelenině a určila se jejich přípustná hranice. Avšak v praxi se velmi těžko uskutečňuje stálá kontrola obsahu dusičnanů v žádoucím širokém rozsahu.

• · · · • · • · · · · · ···· • · · · · · · · · ·· ·

-z• ····· · · ··· ··· ·· ·· ·· ··

Proto se dostává stále více do popředí praktická možnost bakteriálního vázání dusíku ze vzduchu. Podpůrně působí i problém zvyšování cen dusíkatých umělých hnojiv v návaznosti na zvyšování cen energií z důvodu, že výroba dusíkatých umělých hnojiv vyžaduje velké množství energie. Po objevení bakteriálního vázání vzdušného dusíku se zvyšuje úsilí o využití dusíku ze vzduchu ve velkém rozsahu v půdním hospodářství v zemědělské praxi, zejména v posledním období.

Známé je vázání dusíku bakteriemi rodu Rhizóbium, které na kořenech vikokvětých rostlin např. fažole, sója, jetele vytvářejí hlízy, které vážou dusík ze vzduchu. Toto vázání dusíku je však ohraničené jen pro oblast vikokvětých^ ^motýlokvětýclrj’ rostlin.

Dále jsou známé způsoby přípravy směsí, které využívají mikroorganismy k úpravě půd, např. v ruském patentovém spise č. 2072756 se uvádí způsob rekultivace půdy poškozené těžbou uhlí. Jeho podstata spočívá v mechanické úpravě půdy následným zasetím semen, která jsou naočkována mikroorganismem, nebo v případě potřeby se při velmi kyselé půdě dodatečně přidává další mikroorganismus. Tento vynález neřeší způsob přípravy směsi společnou fermentaci a ani směs takto vytvořenou.

V dalších publikovaných článcích týkajících se zkoumané problematiky jsou popsané některé způsoby aplikací mikroorganismů jako např. Chemical Abstract, vol. 124, no. 2, Columbus Ohio, US , no. 147114 je popsán způsob biologického odstraňování ropného uhlovodíku ve formě směsi benzínu, nafty a mazacích olejů obsažených ve vodě. V podstatě se jedná o regeneraci podzemních a odpadních vod. Další článek vCompendex Engineering Information,US, Biol Wastes 1987, publikuje informaci o vlivu nesymbiotického vázání dusíku v návaznosti na organické odpady s použitím mikroorganismu. Citované prameny neřeší způsob přípravy směsi mikroorganismů a ani takto vyrobenou směs.

Další známé řešení dle patentu HU č.207751 částečně odstraňuje aplikaci anorganických dusíkatých a fosforových průmyslových hnojiv do půdy, ale neřeší návrat draslíku. Další nevýhodou této směsi je, že její účinky jsou tepelně omezené do teploty 28^”C, proto tato směs působí jen v krátkém jarním období.

Ve zveřejněné patentové přihlášce WO 96/34840 je popsáno a nárokováno použití nových kmenů bakterií, které vážou dusík se zvýšenou odolností proti alkáliím a směs dvou bakterií ve vodném prostředí s obsahem přísad a mikroprvkú.

• · • · · · · · ·· ·· ·· ··· · · · · ·

Nevýhodou této směsi je, že její použití je velmi omezené zejména na půdy s vysokým obsahem pH.

V patentu USA No. 4, 952,229 je popsáno použití určitých půdních bakterií a bakterií vážících dusík s přídavky mikroprvků např. ve formě chelátu a různých minerálů. Předmětem vynálezu je přísada a metoda na zlepšení úrodnosti a kvality rostlin pro použití v půdě nebo na listech rostlin. Přísada obsahuje specifické mikroorganismy a organickou kyselinu, jakou je kyselina huminová, fulmínová a kyselina ulvinová, mohou být přidány stopové minerály a stabilizátor vlhkosti. V podstatě se jedná o určení způsobu výběru přísad a způsobu aplikace přísad na různé rostlinné druhy. Uvedený vynález nezahrnuje způsob přípravy (výroby) směsi mikroorganismů společnou fermentací mikroorganismů bez minerálů nebo mikroprvků s obsahem dusíku, přičemž neobsahuje v žádné aplikaci důležitý bakteriální kmen Bacillus megatherium. Nevýhodou je, že vynález vyžaduje použití velkého množství minerálů a mikroprvků.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nevýhody do značné míry odstraňuje dále popsaný vynález, jehož cílem je připravit takovou směs, která zúrodňuje půdu, obohacuje ji o dusík ze vzduchu a současně přemění nerozpustný fosfor v půdě na rozpustnou formu fosforu a umožní zužitkování a likvidaci potravinářského olejového sedimentu, který jako odpad při výrobě potravinářského oleje poškozuje životní prostředí, na kvalitní hnojivo pro výživu rostlin. Vynález je založený na neočekávaném poznatku při společné fermentaci mikroorganismů, bez obsahu minerálů a mikroprvků s obsahem dusíku, kdy za určitých konkrétně stanovených podmínek dochází k vytvoření směsi, která po aplikaci v půdním systému, zabezpečí pro rostliny současně vázání dusíku ze vzduchu a současně upraví nerozpustný fosfor na rozpustný, přičemž zabezpečí rozklad potravinářského olejového sedimentu a to jednou aplikací, přičemž tato směs aktivně působí v širokém rozsahu teplot prostředí a to až do 36^K až 38|° C, což znamená, že působí v celém vegetačním období.

Způsob přípravy směsi na vázání dusíku podle vynálezu, jehož podstata spočívá ve způsobu využití některých druhů bakterií rodu Azotobacter, které jsou schopné vázat dusík ze vzduchu tím, že v průběhu jejich množení v půdě, po dobu jejich životnosti, vydifundují jimi syntetizované formy dusíku do půdy jako dusičnany, dusitany, amonium, aminokyseliny, bílkoviny s malými molekulami, které se vážou na organickou hmotu půdy, odkud je kořeny rostlin vstřebávají. Takto průběžně vznikající dusíkaté látky se nevymývají z půdy a neznečišťují prostředí. Velkou výhodou je, že během vegetačního období je dusík rostlinám dodávaný kontinuálně a harmonicky. Vhodnými druhy jsou bakteriální kmen Azotobacter croococcum CCM 4642 a bakteriální kmen Azospirillium brasiliense CCM 4644. Tyto kmeny bakterií byly uloženy v autentizované České sbírce mikroorganismů, Brno, Tvrdého č. 14 pod výše citovanými čísly. ·

Bakteriální kmen Azotobacter croococcum se nejlépe množí při teplotě od 1 do 30rC, zatímco bakteriální kmen Azospirillium brasiliense má teplotní optimum od

24£C do 38£C. Těmito dvěma druhy kmenů bakterií se naočkuje půda a potom se kultivují v půdě ohřáté v jarním období na 16PC a v létě při teplotě půdy 38F*C. Tímto způsobem se zabezpečuje rostlinám harmonické zásobování dusíkem.

Dále se v půdě v důsledku nadměrného používání umělých hnojiv s obsahem fosforu nashromáždilo velmi mnoho sloučenin fosforu, který je ve vodě nerozpustný, a proto je pro rostliny, vyžadující fosfor, nevyužitelný. Mikroorganismus druhu Bacillus megatherium CCM 4643, který byl uložen v autentizované České sbírce mikroorganismů, Brno, Tvrdého č. 14 pod výše citovaným číslem, je schopný v rámci svého energetického metabolizmu měnit sloučeniny fosforu s velkými molekulami, které jsou ve vodě nerozpustné, na sloučeniny fosforu ve vodě rozpustné, a tím zásobovat půdu pro rostliny využitelnými rozpustnými sloučeninami fosforu.

Naočkováním půdy kmeny mikroorganismů vážících dusík a současným naočkováním půdy kmeny mikroorganismů rozkládajících sloučeniny fosforu vzniká takzvaná metabióza, kde vazače dusíku dodávají potřebný dusík a mikroorganismus Bacillus megatherium přeměňuje nerozpustné sloučeniny fosforu na sloučeniny fosforu ve vodě rozpustné, přičemž oba dva druhy bakterií získávají energii, potřebnou pro vlastní růst a množení a zároveň dodávají dusík a fosfor rostlinám.

Při výrobě jedlých olejů vzniká zejména na konci výroby olejový kal, který se již nedá dále vyčistit, není vhodný na použití v potravinářském průmyslu ani na jiné využití např. v automobilovém průmyslu. Likvidace tohoto olejového kalu nemůže probíhat volně v životním prostředí, proto jsou na jeho likvidaci potřebná neutralizační a čistící zařízení. Proto je výhodné využívat popsanou vlastnost /

·· ····

-rmikroorganismů kmene bakterie Pseudomonas putida CCM 4641, který byl uložen v autentizované České sbírce mikroorganismů, Brno, Tvrdého č. 14 pod výše citovaným číslem. Tyto mikroorganismy svým působením rozkládají olejové sloučeniny s otevřeným uhlovodíkovým řetězcem na glycerín a organické kyseliny.

Olejový kal se smíchá s úrodnou půdou a tato směs se naočkuje kulturami Azotobacter croococcum, Azospirillium brasiliense, Bacillus megatheríum a potom i kulturou Pseudomonas putida, směs se několikrát promíchá, obsah olejového kalu se dva až tři měsíce mineralizuje a rozkládá. Po aplikaci na ornou půdu s velkým množstvím mikrobů představuje výživnou látku s charakteristickými vlastnostmi chlévského hnoje.

Vynález je možné využít tak, že hustá biomasa mikroorganismů Azospirillium brasiliense, Azotobacter croococcum a Bacillus megatherium se po naředění na vhodnou koncentraci v množství deset litrů na hektar, rozprašuje na půdu, potom se půda převrací do hloubky setby, čímž se půda zároveň naočkuje tak, že se může částečně, nebo úplně upustit od používání umělých hnojiv s obsahem dusíku a fosforu.

Dále se může k výše uvedeným třem kulturám mikroorganismů přidat ještě další kultura mikroorganismu Pseudomonas putida a směs se používá tak, že se na deset tun půdy přidá 10 litrů vhodně naředěné směsi mikroorganismů a půda se vícekrát promíchá. Touto metodou se může rozložit 500 litrů olejového kalu. Výsledným produktem způsobu podle vynálezu je výživná směs bohatá na mikroorganismy vážící dusík, rozkládající fosfor a olejový sediment. Tento čtyřkomponentový přípravek se může použít jako náhrada za umělá hnojivá.

Podstatou vynálezu je způsob výroby směsi mikroorganismů na vázání dusíku ze vzduchu, zvyšování rozpustnosti nerozpustného fosforu v půdě a mineralizaci kalu z jedlého oleje.

Podle vynálezu se bakteriální kmen Azotobacter croococcum CCM 4642 rozmnožuje na živné půdě, která neobsahuje organický ani anorganický dusík, submerzní fermentaci při teplotě okolo 28^C po dobu 22 hodin, potom se ferment Azobacteru naočkuje IC^ogffc/ 22 hodinového inokula kmene bakterie Pseudomonas putida CCm 4641. Mikroorganismus rodu Azobacter za dobu 22 hodin naprodukuje /

-cdo fermentačního média tolik dusíku, kolik potřebuje mikroorganismus rodu Pseudomas ke svému růstu. V dvojité fermentaci se pokračuje ještě 22 - 24 hodin, při provzdušňování 0,6 litry vzduchu na litr živné půdy, při počtu otáček 120/min a při teplotě 28]^C. Po ukončení kultivace, po uplynutí 44 - 46 hodin, je pH kultivační půdy v rozmezí 7,5 - 8,5 a nárůst 4 - 6 miliard buněk/ml. média kmene Azotobacter croococcum a 150 - 200 milionů buněk /ml. kmene Pseudomonas putida.

Dále se podle vynálezu bakteriální kmen Azospiríllium brasiliense CCM 4644 množí na živné půdě, která neosahuje organický ani anorganický zdroj dusíku, fermentaci při teplotě 2fijFc po dobu 22 hodin, potom se namnožená kultura mikroorganismu Azospiríllium brasiliense naočkuje lof/o-4/ 22 hodinového inokula kmene bakterií Bacillus megatherium CCM 4643, přičemž bakteriální kmen Azospiríllium brasiliense do té doby naprodukuje do živného média tolik dusíku, kolik potřebuje mikroorganismus Bacillus megatherium na svůj růst. V dvojité submerznej fermentaci se pokračuje ještě 22 - 24 hodin při provzdušňování 1 litru vzduchu na 1 litr fermentačního média, při počtu otáček 120/minutu a při teplotě 2^C. Po ukončení fermentace je pH fermentačního média 6,8 -8,5 a nárůst kmene Azospiríllium brasiliense 4 -6 miliard buněk/ml. média a kmene Bacillus megatherium 200 - 300 milionů buněk / ml. média.

Při technické realizaci vynálezu nevzniká žádný vedlejší produkt. Biomasa mikroorganismů se může využívat jako ferment, který se již dále nijak nezpracovává. Voda z umývání fermentů se může dostat do kanalizace, protože výhodně obohacuje vodu řek vzácnými druhy bakterií.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Do baňky se dá 200 ml směsi o složení dihydrogenfosforečnan draselný 0,3 g, chlorid vápenatý 0,2 g, síran horečnatý 0,3 g, síran draselný 0,2 g, chlorid sodný 0,4g , chlorid železitý 0,05 g, uhličitan vápenatý 5,0 g, melasa 30,0 g, kvasný cukr

4

10, O g na 1000 ml živné půdy a po dobu 40 minut se půda sterilizuje při teplotě 125°C, potom se přidá 1 ml roztoku stopových prvků o složení kyselina boritá 5,0 g, molybdenan amonný 6,0 g, jodid draselný 0,5 g, bromid sodný 0,5 g, síran zinečnatý 0,3 g, síran hlinitý 0,3 g na 1000 ml živné půdy. Do obsahu lyofylizované ampulky obou bakteriálních kmenů Azotobacter croococcum a Azospirillium brasiliense se přidá 5 ml sterilizované vody a vytvoří se suspenze, 1,0 mililitrem suspenze se naočkují obě dvě baňky. Naočkované baňky se položí na horizontální vibrační zařízeni a kultivují se při teplotě 2^C a při počtu otáček 160 za minutu po dobu 48 72 hodin, do vytvoření dostatečného nárůstu biomasy. Takto se připraví základní inokulum.

Dále 400ml živné půdy výše uvedeného složení, se vloží do baňky a naočkuje se 3-4 mililitry základního inokulu a kultivuje se na horizontálním vibračním zařízení při teplotě 2Žj°C po dobu 48 hodin. Takto se získá přípravné inokulum.

Dále se 1 000 litrů živné půdy sterilizuje ve fermentátoru při 125°C po dobu 40 minut, po ochlazení se naočkuje 1,6 litry přípravného inokulu. Naočkovaná půda se fermentuje po dobu 22 hodin při teplotě 2£^C za provzdušňování 0,6 litry vzduchu na 1 litr fermentačního média, při počtu otáček 120 za minutu. Takto se získává zobou druhů mikroorganismů provozní inokulum vhodné konzistence. Kzamezení tvorby pěny se přidá odpěňovač v množství 0,2-1,0 litrů/ m³. Hodnota pH živné půdy je v rozsahu 6,8 - 7,0.

Příklad 2

Do baňky se dá 200 ml živné půdy o složení dihydrogenfosforečnan draselný 0,3g, chlorid vápenatý 0,2 g, síran horečnatý 0,3 g, melasa 30,0 g, coorn-steep 0,5g, pepton 0,3 g, uhličitan vápenatý 5,0 g a sterilizuje se po dobu 40 minut při 125j°C.

Do obsahu lyofylizované ampulky obou bakteriálních kmenů Bacillus megatherium a Pseudomonas putida se přidá 5 ml sterilizované vody a vytvoří se suspenze, potom se 1,0 mililitrem suspenze naočkují obě dvě baňky. Naočkované baňky se položí na horizontální vibrační zařízení a kultivují se při teplotě 28°C po dobu 48 hodin při počtu otáček 160 za minutu.

• ·· · ·♦ · · ·· ·· • · · ♦··· ···· · ··· · · ·· · · · · d ········ ···· ··· ·· ·· ·· ·

Dále se 400 ml výše uvedené živné půdy vloží do baňky a naočkuje se 1-2 mililitry základního inokulu a míchá se na horizontálním vibračním zařízení při teplotě 2£^C po dobu 24 - 48 hodin, přičemž se mikroskopickým sledováním zjiš‘tuje vegetativní stav kultury a vznik spor. Tímto postupem se získá přípravné inokulum.

Dále se 1 000 litrů živné půdy sterilizuje ve fermentátoru při 12^°C po dobu 40 minut, po ochlazení se naočkuje 3 kusy přípravného inokulu o obsahu 400ml.

Naočkovaná půda se fermentuje po dobu 22 hodin při teplotě 28°C za provzdušňování 0,6 litry vzduchu na 1 litr živné půdy, při počtu otáček 120 za minutu.

Na zamezení tvorby pěny se přidá odpěňovač v množství 0,2 - 1,0 l/m³. Mikroskopicky se sleduje nárůst kultury tak, aby probíhal jen do vegetativního stavu bez tvorby spor. Hodnota pH živné půdy je v rozsahu 6,8-7,0.

Příklad 3

Ve dvou fermentátorech s celkovým obsahem 10 -12m³, jednotlivého užitečného objemu 5,0 - 6,0 m³, se sterilizuje 4,5 a 4,5 m³ živné půdy bez obsahu dusíku, popsané v příkladu 1 a naočkuje se 10% provozního inokulu s obsahem bakteriálního kmene Azobacter croococcum podle příkladu 2. Potom se kultivuje při teplotě 28^C po dobu 22 hodin za současnéého provzdušňování 0,6 litru vzduchu na litr živné půdy, při počtu otáček 120 za minutu. Potom se frementovaná půda naočkuje ještě 10% kultury mikroorganismů Pseudomonas putida podle příkladu 2 a dále se pokračuje ve dvojité fermentaci ještě 22 - 24 hodin. Po ukončení 44 - 46 hodinové fermentace je pH živné půdy 7,7, - 8,5 a bakteriální kmen Azotobacter croococcum dosáhnul nárůst 4-8 miliard buněk /ml média a kmen Pseudomonas putida 200 - 300 miliónů buněk / ml média.

Do dvou fermentátorů s užitečným objemem 5,5 - 6,0 m³ se vloží 4,5 a 4,5m³živné půdy bez dusíku popsané v příkladu 1 a naočkuje se 10% provozního inokulu s obsahem bakteriálního kmene Azospirillium brasiliense podle příkladu 1, kultivace trvá 22 hodin při teplotě 28j^C, při provzdušňování 0,6 litru vzduchu na litr živné půdy, při počtu otáček 120 za minutu. Fermentační médium se potom naočkuje ještě 10% provozního inokulu kultury mikroorganismu Bacillus megatherium podle

JÍ • · ··φ ·

-Λ příkladu 1, a dále se pokračuje ve dvojité fermentaci ještě 22 - 24 hodin. Po ukončení fermentace je pH fermentačního média 7,5 - 8,5 a kmen Azospirillium brasiliense dosáhnul nárůst 4-6 miliard buněk/ml média a kmen Bacillus megatheríum 200 - 300 miliónů buněk / ml média.

Dále smícháním obou typů fermentů a jejich homogenizací se získá čtyřsložkový výsledný produkt o složení: Azobacter croococcum 2-4 miliardy buněk / ml, Azospirillium brasiliense 2-4 miliard buněk / ml, Pseudomonas putida 150 - 200 miliónů buněk / ml a Bacillus megatheríum 150 - 200 miliónů buněk / ml, přičemž v namnožené biomase je celkem 4,3 miliard buněk / ml až 8,4 miliard buněk / ml živného média a pH je v rozmezích 7,5 - 8,5.

Průmyslová využitelnost

Popsaným způsobem dle vynálezu se připraví směs mikroorganismů na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloučenin fosforu ve vodě a na rozklad potravinářského olejového sedimentu, která má využití v zemědělství.

·· ΒΒΒ· Β Β

-Μfy

ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ

Β ΒΒ Β Β ΒΒ Β ΒΒΒΒ Β ΒΒΒ Β ΒΒ Β

Β ΒΒΒ ΒΒ ΒΒ Β Β Β * Β Β

Β Β Β Β Β Β Β Β

Claims

ΒΒΒΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ ·· PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy směsi mikroorganismů na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloučenin fosforu a na rozklad potravinářského olejového sedimentu vyznačující se tím , že společnou fermentaci alespoň dvou kmenů mikroorganismů v živné půdě bez dusíku s obsahem sloučenin fosforu se množí bakteriální kmeny Azobacter croococcum CCM 4642 a Azospirillium brasiliense CCM 4644 po dobu 22 hodin při teplotě 2Š|°C, potom se k nim přidá bakteriální kmen Bacillus megatherium CCM 4643 a kmen Pseudomonas putida CCM 4641 a potom se společně fermentují 44 až 46 hodin při teplotě 2^C při provzdušňování 0,6 litru vzduchu na litr živné půdy.

2 . Směs nebo prostředek obsahující směs mikroorganismů na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloučenin fosforu a na rozklad potravinářského olejového sedimentu vyznačující se tím, že sestává alespoň ze 2 kmenů mikroorganismů Azobacter croococcum CCM 4642 v množství 2-4 miliardy buněk / ml a Azospirillium brasiliense CCM 4644 v množství 2-4 miliardy buněk / ml v živné půdě bez dusíku a s obsahem sloučenin fosforu a kmenů Bacillus megatherium CCM 4643 v množství 150 - 200 miliónů buněk / ml, přičemž v namnožené biomase je celkem 4,3 miliard buněk /ml až 8,4 miliard buněk / ml živného média a pH je v rozmezí 7,5 -8,5.