CZ299601B6

CZ299601B6 - Zpusob prípravy smesi mikroorganismu na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloucenin fosforu a na rozklad potravinárského olejového sedimentu

Info

Publication number: CZ299601B6
Application number: CZ0302599A
Authority: CZ
Inventors: Pollák@Arpád
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2008-09-17
Also published as: CZ302599A3; SK279941B6; AU6129698A; DE19880157D2; DE19880157B4; HUP0002253A3; HUP0002253A2; SK25097A3; WO1998037038A3; HU225130B1; WO1998037038A2

Abstract

Vynález se týká zpusobu prípravy smesi na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloucenin fosforu a na rozklad potravinárského olejového sedimentu. Podle tohoto vynálezu spolecnou kultivací alespon dvou kmenu mikroorganismu v živné pude bez dusíku s obsahem sloucenin fosforu se množí bakteriální kmeny Azobacter croococcum CCM 4642 a Azospirillium brasiliense CCM 4644 po dobu 22 hodin pri teplote 28 .degree.C, potom se k nim pridá bateriální kmen Bacillus megatherium CCM 4643 a kmen Pseudomonas putida CCM 4641 a potom se spolecne kultivují 44 až 46 hodin pri teplote 28 .degree.C pri provzdušnování 0,6 litru vzduchu na litr živnépudy.

Description

Způsob přípravy směsi mikroorganismů na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloučenin fosforu a na rozklad potravinářského olejového sedimentu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy směsi mikroorganismů na bakteriální vázání dusíku ze vzduchu. na zvyšování rozpustnosti ve vodě nerozpustného fosforu obsaženého v půdě a na bakteriální rozklad nezpracovatelného kalu v oleji vznikajícího při výrobě jedlých olejů a uvedené směsi.

Vynález je významný z hlediska ochrany životního prostředí pomocí působení metabiózy mikroorganismů.

Dosavadní stav techniky

V několika posledních desetiletích se v zemědělské výrobě používala převážně dusíkatá umělá hnojivá. Dosahovaly se tím velké výnosy úrod. Stálé používání umělých hnoj i v. pokud to nebylo ve spojení s použitím chlévskcho hnojivá, způsobilo, že se půda vlivem velkého množství chemikálií stala kyselá a mikrobiální život v půdě byl potlačen, půda se zhulňovala. zhoršily se vodní a vzdušné podmínky půdy. Kromě toho do spodních vod pronikal škodlivý dusičnan. Při velkých deštích vodní proud odplavil granulované umělé hnojivo do potoků a takto se dusičnan dostával i do vodních toků. Jednorázovým dávkováním velkého množství dusíkatého umělého hnojivá rostliny, zejména zahradní rostliny, přijímaly nadměme množství dusičnanu, který negativně působí na biologický organismus, zejména zvlášť škodlivě působí dusičnan na kojence a male děti, protože v krvi vyvolává methemoglobinémii, která může být i smrtelná. Proto se zavedlo sledování obsahu dusičnanů zejména v zelenině a určila se jejich přípustná hranice. Avšak v praxi se velmi těžko uskutečňuje stálá kontrola obsahu dusičnanů v žádoucím širokém rozsahu.

Proto se dostává stále více do popředí praktická možnost bakteriálního vázání dusíku ze vzduchu, jo Podpůrně působí i problém zvyšování cen dusíkatých umělých hnoj i v v návaznosti na zvyšování cen energií z důvodu, že výroba dusíkatých umělých hnojiv vyžaduje velké množství energie. Po objevení bakteriálního vázání vzdušného dusíku se zvyšuje úsilí o využití dusíku zc vzduchu ve velkém rozsahu v půdním hospodářství v zemědělské praxi, zejména v posledním období.

Známé je vázání dusíku bakteriemi rodu Rhizóbium. které na kořenech vikokvětých rostlin např. fazole, sója, jetele vytvářejí hlízy, které vážou dusík ze vzduchu, foto vázání dusíku je však ohraničené jen pro oblast vikokvětých (motýlokvětých) rostlin.

Dále jsou známé způsoby přípravy směsí, které využívají mikroorganismy k úpravě půd, např. v ruském patentovém spise RU 2072756 se uvádí způsob rekultivace pudy poškozené těžbou uhlí. Jeho podstata spočívá v mechanické úpravě půdy následným zasetím semen, která jsou naočkována mikroorganismem, nebo v případě potřeby se při velmi kyselé půdě dodatečně přidává další mikroorganismus. Tento vynález neřeší způsob přípravy směsi společnou fermentaci a ani směs takto vytvořenou.

V dalších publikovaných článcích týkajících se zkoumané problematiky jsou popsané některé způsoby aplikací mikroorganismů jako např. Chemical Abstract. vol. 124. no. 2. Columbus Ohio. US, c. 147114 je popsán způsob biologického odstraňování ropného uhlovodíku ve formě směsi benzínu, nafty a mazacích olejů obsažených ve vodě. V podstatě se jedná o regeneraci podzem50 nich a odpadních vod. Další článek v Compendex Engineering Information.US. Biol Wastes 1987, publikuje informaci o vlivu nesymbiotíckého vázání dusíku v návaznosti na organické odpady s použitím mikroorganismu. Citované prameny neřeší způsob přípravy směsi mikroorganismů a ani takto vyrobenou směs.

Další známé řešení dle patentu HU 207751 částečně odstraňuje aplikaci anorganických dusíkatých a fosforových průmyslových hnoj i v do půdy, ale neřeší návrat draslíku. Další nevýhodou této směsi jc, že její účinky jsou tepelně omezené do teploty 28 °C. proto tato směs působí jen v krátkém jarním období.

Vc zveřejněné patentové přihlášce WO 96/34840 je popsáno a nárokováno použití nových kmenů bakterií, které vážou dusík se zvýšenou odolností proti alkáliím a směs dvou bakterií ve vodném prostředí s obsahem přísad a mikroprvkú.

in Nevýhodou této směsi je, žc její použití je velmi omezené zejména na půdv s vvsokým obsahem pHV patentu US 4 952 229 je popsáno použití určitých půdních bakterií a bakterií vážících dusík s přídavky mikroprvkú např. ve formě chelátu a různých minerálů. Předmětem vynálezu je přísada i? a metoda na zlepšení úrodnosti a kvality rostlin pro použití v půdě nebo na listech rostlin. Přísada obsahuje specifické mikroorganismy a organickou kyselinu, jakou jc kyselina humnová, fulvinová a kyselina ulvinová. mohou být přidány stopové minerály a stabilizátor vlhkosti. V podstatě sc jedná o určení způsobu výběru přísad a způsobu aplikace přísad na různé rostlinné druhy. Uvedený vynález nezahrnuje způsob přípravy (výroby) směsi mikroorganismu společnou fermentaci mikroorganismů bez minerálu nebo mikroprvkú s obsahem dusíku, přičemž neobsahuje v žádné aplikaci důležitý bakteriální kmen Bacillus megatherium. Nevýhodou je, že vynález vyžaduje použití velkého množství minerálů a mikroprvkú.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nevýhody do značné míry odstraňuje dále popsaný vynález, jehož cílem je připravit takovou směs, která zúrodňuje půdu, obohacuje ji o dusík ze vzduchu a současně přemění nerozpustný fosfor v půdě na rozpustnou formu fosforu a umožní zužitkování a likvidaci potrávilo nářského olejového sedimentu, který jako odpad při výrobě potravinářského oleje poškozuje životní prostředí, na kvalitní hnojivo pro výživu rostlin. Vynález je založený na neočekávaném poznatku při společné fermentaci mikroorganismů, bez obsahu minerálů a mikroprvkú s obsahem dusíku, kdy za určitých konkrétně stanovených podmínek dochází k vytvoření směsi, která po aplikaci v půdním systému, zabezpečí pro rostliny současně vázání dusíku ze vzduchu a současně upraví nerozpustný fosfor na rozpustný, přičemž zabezpečí rozklad potravinářského olejového sedimentu, a to jednou aplikací, přičemž tato směs aktivně působí v širokém rozsahu teplot prostředí a to až do 36 °C až 38 °C, což znamená, že působí v celém vegetačním období.

Způsob přípravy směsi na vázání dusíku podle vynálezu, jehož podstata spočívá ve způsobu vyu4o žití některých druhů bakterií rodu Azotobacler, které jsou schopné vázat dusík ze vzduchu tím, že v průběhu jejich množení v půdě, po dobu jejich životnosti, vyd i fundují jimi syntetizované formy dusíku do půdy jako dusičnany, dusitany, amonium, aminokyseliny, bílkoviny s malými molekulami, které se vážou na organickou hmotu půdy, odkud je kořeny rostlin vstřebávají. Takto průběžně vznikající dusíkaté látky se nevymývají z půdy a neznečišťují prostředí. Velkou výho45 dou je, že během vegetačního období je dusík rostlinám dodávaný kontinuálně a harmonicky. Vhodnými druhy jsou bakteriální kmen Azotobacler eroococcum CCM 4642 a bakteriální kmen Azospiriflium brusiliense CCM 4644. Tylo kmeny bakterií byly uloženy v autenti/ované České sbírce mikroorganismů. Brno, Tvrdého č. 14 pod výše citovanými čísly.

Bakteriální kmen Azotobacler croococcum se nejlépe množí při teplotě od 16 °C do 30 °C, zatímco bakteriální kmen Azospirillium brasiliense má teplotní optimum od 24°Cdo38°C. Těmito dvěma druhy kmenů bakterií se naočkuje půda a potom se kultivují v půdě ohřáté v jarním období na 16 °C a v létě při teplotě půdy 38 °C. Tímto způsobem se zabezpečuje rostlinám harmonické zásobování dusíkem.

ŇŠ

C7. 299601 Bó

Dále se v půdě v důsledku nadměrného používání umělých hnoj i v s obsahem fosforu nashromáždilo velmi mnoho sloučenin fosforu, který je ve vodě nerozpustný, a proto je pro rostliny, vyžadující fosfor, nevyužitelný. Mikroorganismus druhu Bacillus megatherium CCM 4643, který¹ byl uložen v autentizované České sbírce mikroorganismů. Brno, t vrdého č. 14 pod výše citovaným číslem, je schopný v rámci svého energetického metabolizmu měnit sloučeniny fosforu s velkými molekulami, které jsou ve vodě nerozpustné, na sloučeniny fosforu ve vodě rozpustné, a tím zásobovat půdu pro rostliny využitelnými rozpustnými sloučeninami fosforu.

Naočkováním půdy kmeny mikroorganismů vážících dusík a současným naočkováním půdy in kmeny mikroorganismů rozkládajících sloučeniny fosforu vzniká takzvaná metabióza, kde vazače dusíku dodávají potřebný dusík a mikroorganismus Bacillus megatherium přeměňuje nerozpustné sloučeniny fosforu na sloučeniny fosforu ve vodě rozpustile, přičemž oba dva druhy bakterií získávají energii, potřebnou pro vlastní růst a množení a zároveň dodávají dusík a fosfor rostlinám.

Při výrobě jedlých olejů vzniká zejména na konci výroby olejový kal. který· se již nedá dále vyčistit, není vhodný na použití v potravinářském průmyslu ani na jiné využití např. v automobilovém průmyslu. Likvidace tohoto olejového kalu nemůže probíhat volně v životním prostředí, proto jsou na jeho likvidaci potřebná neutralizační a čistící zařízení. Proto je výhodné využívat popsanou vlastnost mikroorganismů kmene bakterie Pseudomonas putida CCM 4641, který byl uložen v autentizované České sbírce mikroorganismů. Brno, Tvrdého č. 14 pod výše citovaným číslem. Tyto mikroorganismy svým působením rozkládají olejové sloučeniny s otevřeným uhlovodíkovým řetězcem na glycerín a organické kyseliny.

Olejový kal se smíchá s úrodnou půdou a tato směs se naočkuje kulturami Azotobacter croococcum, Azospirillium brasiliense, Bacillus megatherium a potom i kulturou Pseudomonas putida. směs se několikrát promíchá, obsah olejového kalu se dva až tři měsíce mineralizuje a rozkládá. Po aplikaci na ornou půdu s velkým množstvím mikrobů představuje výživnou látku s charakteristickými vlastnostmi chlévského hnoje.

Vynález je možné využít tak, že hustá biomasa mikroorganismů Azospirillium brasiliense. Azotobacter croococcum a Bacillus megatherium se po naředění na vhodnou koncentraci v množství deset litrů na hektar, rozprašuje na půdu. potom se půda převrací do hloubky setby, čímž sc půda zároveň naočkuje tak, že se může částečně, nebo úplně upustit od používání umč55 lých hnoj i v s obsahem dusíku a fosforu.

Dále se může k výše uvedeným třem kulturám mikroorganismů přidat ještě další kultura mikroorganismu Pseudomonas putida a směs se používá tak, že se na deset tun půdy přidá 10 litrů vhodně naředěné směsi mikroorganismů a půda se vícekrát promíchá. Touto metodou se může rozložit 500 litrů olejového kalu. Výsledným produktem způsobu podle vynálezu je výživná směs bohatá na mikroorganismy vážící dusík, rozkládající fosfor a olejový sediment. Tento čtyřkomponentový přípravek se může použít jako náhrada za umělá hnojivá.

Podstatou vynálezu je způsob výroby směsi mikroorganismů na vázání dusíku ze vzduchu, zvy45 šování rozpustnosti nerozpustného fosforu v půdě a mineralizaci kalu z jedlého oleje.

Podle vynálezu se bakteriální kmen Azotobacler croococcum CCM 4642 rozmnožuje na živne pudě, která neobsahuje organický ani anorganický dusík, subtnerzni fermentaci při teplotě okolo 28 °C po dobu 22 hodin, potom se fermcnl Azobacteru naočkuje 10% 22 hodinového inokula kmene bakterie Pseudomonas putida CCM 4641. Mikroorganismus rodu Azobacter za dobu 22 hodin naprod ukuje do fermentačního média tolik dusíku, kolik potřebuje mikroorganismus rodu Pseudomonas ke svému růstu. V dvojité fermentaci se pokračuje ještě 22 až 24 hodin, při provzdušňování 0,6 litry vzduchu na litr živné půdy, při počtu otáček 120/niin a při teplotě 28 °C. Po ukončení kultivace, po uplynutí 44 až 46 hodin, jc pH kultivační půdy v rozmezí 7,5 až 8,5 a

- a CZ 299601 B6 nárůst 4 až 6 miliard bunčk/ml média kmene Azotobacter croococcum a 150 až 200 milionů buněk/ml kmene Pseudomonas putida.

Dále se podle vynálezu bakteriální kmen Azospirillium brasdien.se CCM 4644 množí na živné půdě. která neosahuje organický ani anorganický zdroj dusíku, fermentaci při teplotě 28 °C po dobu 22 hodin, potom se namnožená kultura mikroorganismu Azospirillium brasiliense naočkuje 10% 22 hodinového inokula kmene bakterií Bacillus megatherium CCM 4643, přičemž bakteriální kmen Azospirillium brasiliense do té doby naprodukuje do živného média tolik dusíku, kolík potřebuje mikroorganismus Bacillus megatherium na svůj růst. V dvojité submerzní fería mentaci se pokračuje ještě 22 až 24 hodin při provzdušňování 1 litru vzduchu na 1 litr ťermentačního média, při poctu otáček 120/minutu a při teplotě 28 °C. Po ukončení fermentace je pil fermentačního média 6.8 až 8,5 a nárůst kmene Azospirillium brasiliense 4 až 6 miliard bunčk/ml.

média a kmene Bacillus megatherium 200 až 500 milionů buněk/ml. média.

i? Při technické realizaci vynálezu nevzniká žádný vedlejší produkt. Biomasa mikroorganismů se může využívat jako ferment. který se již dále nijak nezpracovává. Voda z umývání fermentů se může dostat do kanalizace, protože výhodně obohacuje vodu řek vzácnými druhy bakterií.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Do baňky se dá 200 ml směsi o složení d i hydrogenfosforečnan draselný 0.3 g. chlorid vápenatý 0,2 g. síran horečnatý 0,3 g, síran draselný 0,2 g, chlorid sodný 0.4 g. chlorid železitý 0,05 g. uhličitan vápenatý 5,0 g, melasa 30.0 g, kvasný cukr 10,0 g na 1000 ml živné půdy a po dobu 40 minut sc půda sterilizuje při teplotě 125 ^ŮC, potom se přidá I ml roztoku stopových prvků o složení kyselina boritá 5.0 g, molybdenan amonný 6.0 g, jodid draselný 0.5 g. bromid sodný 0.5 g, síran zinečnatý 0,3 g. síran hlinitý 0,3 g na 1000 ml živné půdy. Do obsahu lyofylizované ampulky obou bakteriálních kmenů Azotobacter croococcum a Azospirillium brasiliense se přidá 5 ml sterilizované vody a vytvoří se suspenze, 1.0 mililitrem suspenze se naočkují obě dvě baňky. Naočkované baňky se položí na horizontální vibrační zařízení a kultivují se při teplotě 28 °C a při počtu otáček 160 za minutu po dobu 48 až 72 hodin, do vytvořeni dostatečného nárůstu biomasy.

Takto se připraví základní i noku lum.

Dále 400 ml živne půdy výše uvedeného složení, se vloží do baňky a naočkuje se 3 až 4 mililitry základního inokulu a kultivuje se na horizontálním vibračním zařízení při teplotě 28 °C po dobu 48 hodin. Takto se získá přípravné inokulum.

Dále se 1000 litrů živné půdy sterilizuje ve fermentátoru při 125 °C po dobu 40 minul, po ochlazení se naočkuje 1,6 litry přípravného inokula. Naočkovaná půda se fermentujc po dobu 22 hodin při teplotě 28 °C za provzdušňování 0.6 litry vzduchu na 1 litr fermentační ho média, při počtu otáček 120 za minutu. Takto se získává z obou druhů mikroorganismů provozní inokulum vhod45 né konzistence. K zamezení tvorby pěny se přidá odpěňovač v množství 0.2 až 1,0 litrů/m\ Hodnota pil živné půdy je v rozsahu 6,8 až 7,0,

Příklad 2

Do baňky se dá 200 ml živné půdy o složení dihydrogenfosforečnan draselný 0,3 g, chlorid vápenatý 0,2 g, síran horečnatý 0,3 g, melasa 30,0 g, coorn-steep 0.5 g. pepton 0,3 g, uhličitan vápenatý 5,0 g a sterilizuje se po dobu 40 minut při 125 °C,

-4CZ 299601 B6

Do obsahu lyofylizovanc ampulky obou bakteriálních kmenů Bacillus megatherium a Pseudomonas putidu se přidá 5 ml sterilizované vody a vytvoří se suspenze, potom se 1,0 mililitrem suspenze naočkují obě dvě baňky. Naočkované baňky se položí na horizontální vibrační zařízení a kultivují se při teplotě 28 °C po dobu 48 hodin při počtu otáček 160 za minutu.

Dále se 400 ml výše uvedené živné půdy vloží do baňky a naočkuje se 1 až 2 mililitry základního inokulu a míchá sc na horizontálním vibračním zařízení při teplotě 28 °C po dobu 24 až 48 hodin, přičemž se mikroskopickým sledováním zjišťuje vegetativní stav kultury' a vznik spor. Tímto postupem se získá přípravné inokulum.

Dále se 1000 litrů živné půdy sterilizuje ve fennentátoru při 125 °C po dobu 40 minut, po ochlazení se naočkuje 3 kusy přípravného inokulu o obsahu 400 ml.

Naočkovaná půda se fermentuje po dobu 22 hodin při teplotě 28 °C za provzdušňování 0,6 litry vzduchu na 1 litr živné půdy, při počtu otáček 120 za minutu. Na zamezení tvorby pěny se přidá odpěňovač v množství 0,2 až 1,01/m'. Mikroskopicky se sleduje nárůst kultury lak. abv probíhal jen do vegetativního stavu bez tvorby spor, Hodnota pH živné pudy jc v rozsahu 6,8 až 7,0.

Příklad 3

Ve dvou fermentátorecli s celkovým obsahem 10 až 12 nv\ jednotlivého užitečného objemu 5.0 až 6,0 m\ se sterilizuje 4,5 a 4,5 m¹ živné půdy bez obsahu dusíku, popsané v příkladu 1 a naočkuje se 10% provozního inokulu s obsahem bakteriálního kmene Azobacter croococcum podle příkladu 2. Potom se kultivuje pří teplotě 28 °C po dobu 22 hodin za současného provzdušňování 0,6 litru vzduchu na litr živné půdy, při počtu otáček 120 za minutu. Potom se fennentovaná půda naočkuje ještě 10 % kultury mikroorganismů Pseudomonas putida podle příkladu 2 a dále se pokračuje ve dvojité fermentaci ještě 22 až 24 hodin. Po ukončení 44 až 46 hodinové fermentace je pH živné půdy 7,7 až 8,5 a bakteriální kmen Azofobacter croococcum dosáhnul

3(i nárůst 4 až 8 m i 1 iard bun ěk/m I méd ia a kmen Pscudomonas putida 200 až 3 00 m i I i ón ů bu něk/m I média.

Do dvou fermentátorů s užitečným objemem 5,5 až 6,0 n? se vloží 4.5 a 4,5 nv živné půdy bez dusíku popsané v příkladu 1 a naočkuje se 10% provozního inokulu s obsahem bakteriálního kmene AzospirilUum brasiliense podle příkladu 1, kultivace trvá 22 hodin při teplotě 28 °C, při provzdušňování 0,6 litru vzduchu na litr živné půdy, při počtu otáček 120 za minutu. Fermentační médium se potom naočkuje ještě 10% provozního inokulu kultury mikroorganismu Bacillus megatherium podle příkladu I, a dále se pokračuje ve dvojité fermentaci ještě 22 až 24 hodin. Po ukončení fermentace je pH fermentačního media 7,5 až 8,5 a kmen AzospirilUum brasiliense dosáhnul nárůst 4 až 6 miliard buněk/ml media a kmen Bacillus megatherium 200 až 300 miliónů buněk/ml media.

Dále smícháním obou typů fermentů a jejich homogenizací, se získá čtyřsložkový výsledný produkt o složení Azobacter croococcum 2 až 4 miliardy buněk/ml AzospirilUum brasiliense 2 až 4 miliard buněk/ml, Pseudomonas putida 150 až 200 miliónů buněk/ml a Bacillus megatherium 150 až 200 miliónů buněk/ml, přičemž v namnožené biomase je celkem 4.3 miliard buněk/ml až 8,4 miliard buněk/ml živného média a pH je v rozmezích 7,5 až 8.5.

5o Průmyslová využitelnost

Popsaným způsobem dle vynálezu se připraví směs mikroorganismů na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloučenin fosforu ve vodě a na rozklad potravinářského olejového sedimentu, která má využiti v zemědělství.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy směsi mikroorganismů na vázání dusíku zc vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloučenin fosforu a na rozklad potravinářského olejového sedimentu, vyznačující se tím. že společnou kultivací alespoň dvou kmenů mikroorganismů v živné půdě bez dusíku s obsahem sloučenin fosforu se množí bakteriální kmeny Azuhacter eroococcum CCM 4642 a io Azospirittium brasttianse CCM 4644 po dobu 22 hodin při teplotě 28 °C, potom se k nim přidá bakteriální kmen Hacttlus megatherium CCM 4643 a kmen Pseudamanas putida CCM 4641 a potom se společně kultivují 44 až 46 hodin pří teplotě 28 °C při provzdušňování 0,6 litru vzduchu na litr živné půdy.