NL1017592C2

NL1017592C2 - Mengsel van micro-organismen, bedoeld voor het fixeren van stikstof uit de lucht en het verhogen van de oplosbaarheid van fosforverbindingen in water, en de bereiding ervan.

Info

Publication number: NL1017592C2
Application number: NL1017592A
Authority: NL
Inventors: Arpsd Pollsk
Original assignee: Arpsd Pollsk
Priority date: 2000-03-16
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2001-12-05
Also published as: FR2806420B1; NL1017592A1; FR2806420A1; SK3862000A3

Description

Mengsel van micro-organismen, bedoeld voor het fixeren van stikstof uit de lucht en het verhogen van de oplosbaarheid van fosforverbindingen in water, en de bereiding ervan.

5 Technisch gebied

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze ter bereiding van een mengsel van micro-organismen, bedoeld voor het fixeren van stikstof uit de lucht en het verhogen van de oplosbaarheid van onoplosbare fosforverbindingen aanwezig in de bodem. 10 De uitvinding heeft eveneens betrekking op het desbetreffende mengsel.

De uitvinding is belangrijk uit milieubeschermingsoogpunt, dankzij een metabio-sewerking van de micro-organismen.

Stand der techniek 15

Tijdens de laatste decennia heeft de landbouw vooral stikstof bevattende kunstmest toegepast. Aldus zijn grote oogsten bereikt.

Als deze kunstmest niet is gecombineerd met natuurlijke mest, heeft de uitvoerige toepassing ervan de bodem zuur gemaakt en is het microbiële leven onderdrukt; de bo-20 dem is zeer compact geworden en de omstandigheden van water en lucht van de bodem zijn verslechterd.

Bovendien zijn schadelijke nitraten in het grondwater binnengedrongen. De waterstroom die krachtige regenbuien vergezelt, heeft gegranuleerde kunstmest vervoerd naar beekjes en de nitraten zijn dan ook in de rivieren binnengedrongen.

25 Door het toepassen van grote hoeveelheden stikstof bevattende kunstmest per keer hebben de planten - vooral de tuinplanten - een overmatige hoeveelheid nitraten gekregen, die op negatieve wijze het biologisch organisme aantasten en schadelijke effecten veroorzaken, vooral aan zuigelingen en kleine kinderen, daar zij methemoglo-binemie in het bloed veroorzaken, dat dodelijk kan zijn.

30 Begonnen is met het controleren van het nitraatgehalte, vooral in groenten, en de bovengrens ervan is vastgesteld. Maar het is erg moeilijk constant het nitraatgehalte van alle groenten te controleren.

to 17592-1 2

Hierom is in praktijk het kunnen fixeren van stikstof uit de lucht met behulp van bacteriën steeds actueler geworden. Het verhogen van de prijs van stikstof bevattende kunstmest, als gevolg van de verhoging van de energiekosten, waarvan de productie van stikstof bevattende kunstmest een grootgebruiker is, vermindert deze behoefte. Na 5 het ontdekken van het fixeren van stikstof uit de lucht door bacteriën zijn pogingen gericht op het gebruik van stikstof uit de lucht op landbouwkundig gebied versterkt^ vooral tijdens de laatste jaren.

Bekend is dat stikstof uit de lucht gefixeerd kan worden met bacteriën van de familie Rhizobium. die op de wortels van planten zoals bonen, soja, klaver, knollen 10 vormen die stikstof uit de lucht fixeren. Maar deze fixatie van stikstof is beperkt tot planten van de vlinderbloemenfamilie.

Ook zijn werkwijzen bekend ter bereiding van mengsels die micro-organismen gebruiken voor het behandelen van de bodem. De Russische octrooiaanvrage 2.072.756 vermeldt bijvoorbeeld het weer in kweek toepassen van een beschadigde grond door 15 extractie van steenkool. In hoofdzaak bestaat deze werkwijze uit een mechanische behandeling van grond en het uitzaaien van korrels die geïnoculeerd zijn met micro-organismen, waaraan desgewenst, indien noodzakelijk, in het geval van een zeer zure grond, een ander micro-organisme wordt toegevoegd. Deze werkwijze lost noch het probleem van de bereiding van het mengsel door een gebruikelijke fermentatie, noch 20 die van het aldus gevormde mengsel op.

De hierna genoemde artikelen, die betrekking hebben op het onderhavige probleem, beschrijven bepaalde werkwijzen voor het toepassen van micro-organismen. Men kan bijvoorbeeld Chemical Abstracts, Vol. 124, nr. 2, Columbus Ohio, US, nr. 147.114 noemen, waarin een werkwijze wordt beschreven voor het biologisch verwij-25 deren van koolwaterstoffen van olie in de vorm van een benzinemengsel, petroleum en smeerolies aanwezig in de grond. In hoofdzaak betreft het een regeneratie van grondwater en afvalwater. Een ander artikel, gepubliceerd in Compendex Engineering Information, US. Biol. Wastes, 1987, geeft informatie over de invloed van het niet-symbiotisch fixeren van stikstof door organische afvalstoffen, onder toepassing van 30 micro-organismen. De genoemde artikelen beantwoorden noch de vraag verbonden met de bereiding van het mengsel van micro-organismen, noch met het gemengde product.

Een ander concept bekend uit HU nr. 207.751 doet gedeeltelijk het toepassen van stikstof en fosfor bevattende anorganische meststoffen teniet, maar beantwoordt niet de 3 vraag van de terugloop van kalium. Een ander nadeel van dit mengsel is dat de effecten ervan thermisch beperkt zijn tot een temperatuur van 28°C. Dit mengsel is dan ook alleen werkzaam tijdens een korte periode in het voorjaar.

De internationale octrooiaanvrage WO 96/34840 beschrijft de toepassing van 5 nieuwe bacteriestammen, die stikstof fixeren met een zeer hoge weerstand tegen alkali, en de transformatie van twee bacteriën in het milieu dat toevoegstoffen en micro-ele-menten bevat. Dit mengsel bezit het nadeel dat de toepassing ervan sterk beperkt is* vooral met grondsoorten die een hoge pH bezitten.

Het Amerikaanse octrooischrift 4.952.229 beschrijft de toepassing van bepaalde 10 grondbacteriën en bacteriën die stikstof fixeren met het toevoegen van micro-elemen-ten, bijvoorbeeld in de vorm van een chelaat en verschillende mineralen. Het doel van dit octrooischrift is een toevoegsel en een werkwijze voor het verbeteren van de vruchtbaarheid en de kwaliteit van planten, toegepast op de grond of op de bladeren van planten. Het toevoegsel bevat specifieke micro-organismen en een organisch zuur, 15 zoals humuszuur, fulminezuur en ulvinezuur. Het is mogelijk minerale oligo-elemen-ten, vochtstabilisatoren toe te voegen. In hoofdzaak betreft het een vaststelling van de keuze van toevoegsels en de wijze van toepassen van de toevoegsels op verschillende plantensoorten. Het genoemde octrooischrift omvat niet de bereidingswijze (productie) van het mengsel van micro-organismen met behulp van een gebruikelijke fermentatie 20 van micro-organismen, zonder mineralen of micro-elementen die stikstof bevatten en noemt niet de belangrijke bacteriestam Bacillus megatherium. Een nadeel is dat de uitvinding de toepassing vraagt van een groot aantal mineralen en micro-elementen.

Samenvatting van de uitvinding 25

De hierboven genoemde nadelen zijn in sterke mate teniet gedaan door de hierna beschreven uitvinding, die tot doel heeft een mengsel te bereiden dat de bodem vruchtbaar maakt, het verrijkt met stikstof uit de lucht en tegelijkertijd onoplosbaar fosfor in de bodem omzet in oplosbaar fosfor.

30 De uitvinding is gebaseerd op de verrassende ontdekking dat de gebruikelijke fermentatie van micro-organismen, zonder inbreng van mineralen en micro-elementen die stikstof bevatten, dit mengsel wordt gevormd onder bepaalde omstandigheden en, na aanbrengen op de grond, voor de planten het fixeren van stikstof uit de lucht garan- 1017592' 4 deert en tegelijkertijd onoplosbaar fosfor omzet in oplosbaar fosfor, dit met één enkele toepassing. Het mengsel is werkzaam tot 36-38°C, en produceert dan ook zijn effecten gedurende de gehele groeiperiode van planten.

De werkwijze ter bereiding van het mengsel bedoeld voor het fixeren van stikstof 5 volgens de uitvinding berust hoofdzakelijk op het toepassen van bepaalde soorten bacteriën van de familie Azotobacter. die stikstof uit de lucht kunnen fixeren tijdens hun vermenigvuldiging in de grond door tijdens hun levensduur de gesynthetiseerde vormen van stikstof uit de grond, zoals nitraten, nitrieten, ammonium, aminozuren, albu-minen met kleine moleculen weer op te nemen, die het organisch materiaal van de 10 grond fixeren, waaruit de knollen ze absorberen. De aldus gevormde stikstof bevattende materialen worden niet verwijderd door wassen uit de grond en verontreinigen niet het milieu. Het gunstige resultaat is dat, tijdens de groeiperiode van planten, stikstof verschaft wordt aan de planten op continue en harmonieuze wijze.

De . betreffende bacteriestammen zijn Azotobacter croococcum CCM 4642 en 15 Azospirillium brasiliense CCM 4644. Deze bacteriestammen zijn gedeponeerd onder toepassing van het Verdrag van Boedapest onder de hierna genoemde registratienummers, bij de Tsjechische verzameling van micro-organismen van de Universiteit Masaryk, Tvrdého 14, Bmo, Republiek Tsjechië.

De meest gunstige omstandigheden voor het vermenigvuldigen van de bacterie-20 stam Azotobacter croococcum zijn bij 16°C tot 30°C, terwijl de optimale temperatuur voor de bacteriestam Azospirillium brasiliense 24°C tot 38°C is. De grond wordt ge-inoculeerd met deze twee soorten bacteriestammen en zij worden gekweekt in de aarde met een temperatuur van 16'C tijdens de lente en bij 38°C in de zomer. Zo worden de planten dan ook harmonieus voorzien van stikstof.

25 Bovendien is, gezien het uitvoerige gebruik van kunstmest die fosfor bevat, een grote hoeveelheid fosforverbindingen in de grond geaccumuleerd. Dit fosfor is niet oplosbaar in water en als gevolg kan het niet gebruikt worden door planten die fosfor nodig hebben. Het micro-organisme van de stam Bacillus megatherium CCM 4643, die gedeponeerd is onder deze verwijzing bij de hierboven genoemde verzameling, kan, in 30 het kader van zijn energetisch metabolisme deze fosforverbindingen met hoog mole-cuulgewicht die niet oplosbaar zijn in water omzetten in fosforverbindingen die oplosbaar zijn in water en als gevolg de grond voorzien van oplosbare en door planten te gebruiken fosforverbindingen.

1017592 5

Het gevolg van de inoculatie van grond met micro-organismen die stikstof vasthouden en, tegelijkertijd, met micro-organismestammen die onoplosbare fosforverbin-dingen ontleden, is de metabiose, waarbij de fixatiemiddelen van stikstof het noodzakelijke stikstof leveren en het micro-organisme Bacillus megatherium onoplosbare fos-5 forverbindingen omzet in fosforverbindingen die oplosbaar zijn in water. De twee bacteriestammen gebruiken de energie noodzakelijk voor hun juiste groei en hun vermenigvuldiging en, tegelijkertijd, leveren ze stikstof en fosfor aan de planten.

De uitvinding kan op de volgende wijze worden toegepast: De compacte biomassa van de micro-organismen Azospirillium brasiliense. Azotobacter croococcum en 10 Bacillus megatherium, wordt, na te zijn verdund tot een concentratie geschikt voor 10 liter per hectare, verpoederd op de aarde, waarna de grond wordt bewerkt tot zaai-diepte tegelijkertijd met het inoculeren daarvan zodat het mogelijk is kunstmest dat stikstof en fosfor bevat achterwege te laten.

Deze bereiding bevat drie elementen die gebruikt kunnen worden in plaats van 15 kunstmest.

Het belang van de uitvinding berust op de wijze van de productie van het mengsel van micro-organismen bedoeld voor het fixeren van stikstof uit de lucht en het verhogen van de oplosbaarheid van in de grond onoplosbaar fosfor.

Volgens de uitvinding vermenigvuldigt de bacteriestam Azotobacter croococcum 20 CCM 4642 zich in de voedingsgrond, die noch organisch stikstof, noch anorganisch stikstof bevat, door fermentatie bij een temperatuur van ongeveer 28°C gedurende 22 uur, waarna het ferment van Azotobacter geïnoculeerd wordt met 10% inoculum van de bacteriestam Bacillus megatherium CCM 4643 van 22 uur. Gedurende 22 uur produceert het micro-organisme van de Azotobacter-familie in het fermentatiemilieu de hoe-25 veelheid stikstof noodzakelijk voor de groei van het micro-organisme van de Bacillus megatherium-familie. De dubbele fermentatie gaat nog 22-24 uur voort, door beluchten met 0,6 liter lucht per liter voedingsgrond, met een rotatiesnelheid van 120 omw./min en bij een temperatuur van 28*C. Na afloop van de kweek, na 44-46 uur, is de pH van de kweekgrond 6,8 tot 8,5, met een verhoging van 4-6 miljard cellen/ml van het milieu 30 van de stam Azotobacter croococcum en 150-200 miljoen cellen/ml van de stam Bacillus megatherium CCM.

Bovendien vermenigvuldigt, volgens de uitvinding, de bacteriestam Azospirillium brasiliense CCM 4644 zich in de voedingsgrond die noch een organische noch een r101 759 2 6 anorganische stikstofbron bevat, dankzij de fermentatie bij een temperatuur van 28*C gedurende 22 uur, waarna de vermenigvuldigde kweek van het micro-organisme Azospirillium brasiliense wordt geïnoculeerd met 10% inoculum van de bacteriestam Bacillus megatherium CCM 4643 van 22 uur en, tot deze periode, produceert de bacte-5 riestam Azospirillium brasiliense een hoeveelheid stikstof noodzakelijk voor de groei van het micro-organisme Bacillus megatherium. De dubbele fermentatie gaat nog 22-24 uur door met beluchten met 1 liter lucht per liter fermentatiemilieu, bij 120 omw./min en bij een temperatuur van 28°C. Na afloop van de fermentatie is de pH van het fermentatiemilieu 6,8-8,5 en is de groei van de stam Azospirillium brasiliense 4-6 miljard 10 cellen/ml van het milieu en die van de stam Bacillus megatherium is 150-200 miljoen cellen/ml milieu.

Gedurende het uitvoeren van de uitvinding wordt geen enkel secundair product gevormd. De biomassa van de micro-organismen kan worden toegepast als zodanig en behoeft geen andere behandeling. Het waswater van de fermentaties kan worden ge-15 loosd in de afwateringsbuizen, daar zij het rivierwater verrijkt met verschillende soorten zeldzame bacteriën.

Uitvoerinesvoorbeelden van de uitvinding 20 Voorbeeld 1

In een kolf brengt men 200 ml van een mengsel van 0,3 g kaliumdiwaterstoffos-faat, 0,2 g calciumchloride, 0,3 g magnesiumsulfaat, 0,2 g kaliumsulfaat, 0,4 g na-triumchloride, 0,05 g ferrichloride, 5,0 g calciumcarbonaat, 30,0 g melasse, 10,0 g fer-25 menteerbare suiker, per 1000 ml voedingsgrond en, in 40 minuten, wordt de grond gesteriliseerd bij een temperatuur van 125°C, waarna men 1 ml oligo-elementenoplossing toevoegt: 5,0 g boorzuur, 6,0 g ammoniummolybdaat, 0,5 g kaliumjodide, 0,5 g na-triumbromide, 0,3 g zinksulfaat, 0,3 g aluminiumsulfaat, per 1000 ml voedingsgrond.

Aan de inhoud van een gelyofiliseerde ampul van twee bacteriestammen Azoto-30 bacter croococcum en Azospirillium brasiliense wordt 5 ml gesteriliseerd water toegevoegd en wordt een suspensie verkregen. De twee kolven worden geïnoculeerd met 1,0 ml suspensie. De geïnoculeerde kolven zijn geplaatst op een horizontale schud-inrichting en zijn gekweekt bij een temperatuur van 28°C, bij 160 omw./min, gedurende 1017592 7 48-72 uur, tot een voldoende groei van de biomassa. Op deze wijze wordt het basis-inoculum bereid.

Daarna wordt 400 ml voedingsgrond met de bovengenoemde samenstelling in de kolf gebracht en 3-4 ml basis-inoculum zijn geïnoculeerd en gekweekt op de horizon-5 tale schudinrichting, bij een temperatuur van 28°C, gedurende 48 uur. Aldus wordt het bereidingsinoculum verkregen.

Vervolgens is 1000 liter voedingsgrond gesteriliseerd bij een temperatuur van 125eC gedurende 40 minuten. Na afkoelen wordt de inoculatie uitgevoerd met 1,61 bereidingsinoculum. De geïnoculeerde grond wordt 22 uur bij een temperatuur van 10 28eC en belucht met 0,6 liter lucht per liter fermentatiemilieu, bij 120 omw./min gefermenteerd. Aldus wordt het werk-inoculum met geschikte samenstelling van de twee soorten micro-organismen verkregen. Om de productie van schuim te beperken, wordt 0,2-1,0 1/m3 antischuimmiddel toegevoegd. De pH-waarde van de voedingsgrond is 6,8-7,0. .

15

Voorbeeld 2

In een kolf wordt 200 ml van een mengsel van 0,3 g kaliumdiwaterstoffosfaat, 30,0 g melasse, 0,5 g maïssiroop, 0,3 g pepton, 5,0 g calciumcarbonaat gebracht en het 20 geheel wordt gesteriliseerd bij een temperatuur van 125°C gedurende 40 minuten.

Aan de inhoud van een gelyofiliseerde ampul van de bacteriestam Bacillus megatherium voegt men 5 ml gesteriliseerd water toe voor elke ampul en aldus wordt een suspensie gevormd waarna de twee kolven worden geïnoculeerd met 1,0 ml suspensie. De geïnoculeerde kolven zijn aangebracht op een horizontale schudinrichting en zijn 25 gekweekt bij een temperatuur van 28‘C, gedurende 48 uur bij 160 omw./min.

Vervolgens is 400 ml voedingsgrond in de kolf gebracht en 1-2 ml basis-inoculum zijn geïnoculeerd en gemengd op de horizontale schudinrichting bij een temperatuur van 28 eC, gedurende 24-48 uur en, met behulp van een microscoop zijn de vegeta-tietoestand van de kweek en de vorming van sporen gecontroleerd. Aldus is het berei-30 dingsinoculum verkregen.

Daarna wordt 1000 liter voedingsgrond gesteriliseerd bij een temperatuur van 125’C gedurende 40 minuten. Na afkoelen wordt de inoculatie uitgevoerd met drie be-reidingsinoculumfragmenten met een volume van 400 ml. De geïnoculeerde grond 1017592 8 wordt 22 uur bij een temperatuur van 28 °C onder beluchten met 0,6 liter lucht per liter voedingsgrond bij 120 omw./min gefermenteerd. Om de productie van schuim te be- Λ perken wordt 0,2-1,0 1/m antischuimmiddel toegevoegd. Het groeien van de kweek wordt gevolgd met behulp van een microscoop, zodat de kweek zich ontwikkelt juist 5 tot de vegetatietoestand, zonder vorming van sporen. De pH-waarde van de voedingsgrond is 6,8-7,0.

Voorbeeld 3 10 In twee fermenteren met een totale inhoud van 10-12 m3, met een werkvolume

Λ <J

van 5,0-6,0 m , wordt 4,5 en 4,5 m voedingsgrond dat geen stikstof bevat beschreven in voorbeeld 1 gesteriliseerd en wordt geïnoculeerd met 10% werk-inoculum dat de bacteriestam Azotobacter croococcum volgens voorbeeld 2 bevat. Daarna wordt het gekweekt bij een temperatuur van 28*C gedurende 22 uur waarbij een gelijktijdige be-15 luchting met 0,6 liter lucht per liter voedingsgrond wordt gegarandeerd bij 120 omw./min. Daarna wordt de gefermenteerde grond geïnoculeerd met 10% van de kweek van het micro-organisme Bacillus megatherium volgens voorbeeld 2 en de dubbele fermentatie wordt nog 22-24 uur voortgezet. Na 44-46 uur fermentatie is de pH van de voedingsgrond 7,7-8,5 en heeft de bacteriestam Azotobacter croococcum een 20 groei bereikt van 4-8 miljard cellen/ml milieu.

In twee fermentatoren met een bedrijfsvolume van 5,5-6,0 m3 wordt 4,5 en 4,5 m3 voedingsgrond zonder stikstof beschreven in voorbeeld 1 gebracht, de massa wordt geïnoculeerd met 10% werk-inoculum met een gehalte van de bacteriestam Azospiril-lium brasiliense zoals beschreven in voorbeeld 1. De kweek duurt 22 uur, bij een tem-25 peratuur van 28°C waarbij beluchten met 0,6 liter lucht per liter voedingsgrond wordt gegarandeerd, bij 120 omw./min. Na afloop van de fermentatie is de pH van het fer-mentatiemilieu 7,5-8,5 en heeft de stam Azospirillium brasiliense een groei bereikt van 4,6 miljard cellen/ml milieu en de stam Bacillus megatherium heeft 150-200 miljoen cellen/ml milieu bereikt.

30 Daarna wordt door mengen en homogeniseren van de beide fermentaties het uit eindelijke product verkregen dat bestaat uit drie elementen: 2-4 miljard cellen/ml Azotobacter croococcum. 2-4 miljard cellen/ml Azospirillium brasiliense. 300-400 miljoen cellen/ml milieu Bacillus megatherium en de vermenigvuldigde biomassa omvat in 1Π 1 75 9 2 9 totaal 4,1 miljard cellen/ml tot 8,2 miljard cellen/ml voedingsmedium, met een pH van 7,5-8,5.

Industriële toepassing 5

Een mengsel van micro-organismen bedoeld voor het fixeren van stikstof uit de lucht, voor het verhogen van de oplosbaarheid van fosforverbindingen in water, is bereid met de werkwijze die boven is beschreven en dit mengsel kan worden toegepast bij de landbouw.

1017592

Claims

1. Werkwijze ter bereiding van een mengsel van micro-organismen bedoeld voor het fixeren van stikstof uit de lucht en het verhogen van de oplosbaarheid van fosfor- 5 verbindingen, met het kenmerk, dat de gemeenschappelijke fermentatie van twee mi-cro-organismestammen ten minste wordt uitgevoerd in een voedingsgrond zonder stik* stof en die fosforverbindingen bevat, waarbij de bacteriestammen Azotobacter croococcum CCM 4642 en Azospirillium brasiliense CCM 4644 gedurende ongeveer 22 uur bij een temperatuur van ongeveer 28°C worden vermenigvuldigd, waarna de 10 bacteriestam Bacillus megatherium CCM 4643 wordt toegevoegd en zij samen gedurende ongeveer 44-46 uur worden gefermenteerd bij een temperatuur van ongeveer 28°C met een beluchting van ongeveer 0,6 liter lucht per liter voedingsgrond.

2. Mengsel van micro-organismen bedoeld voor het fixeren van stikstof uit de 15 lucht en het verhogen van de oplosbaarheid van fosforverbindingen, met het kenmerk, dat het bestaat uit twee micro-organismestammen, 2-4 miljard cellen/ml Azotobacter croococcum CCM 4642 en 2-4 miljard cellen/ml Azospirillium brasiliense CCM 4644 in een voedingsgrond zonder stikstof, die fosforverbindingen bevat, en 300-400 miljoen cellen/ml Bacillus megatherium CCM 4643, waarbij de vermenigvuldigde biomassain 20 totaal 4,25 tot 8,4 miljard cellen/ml voedingsmedium omvat met een pH van 7,5 tot 8,5. ******* t n 1 75 9 2^