CZ302158B6

CZ302158B6 - Postup pro urcení fylogenetické príbuznosti organismu, zejména rostlin

Info

Publication number: CZ302158B6
Application number: CZ20070450A
Authority: CZ
Inventors: Marková@Michaela
Original assignee: Biofyzikální ústav AV CR, v. v. i.
Priority date: 2007-07-04
Filing date: 2007-07-04
Publication date: 2010-11-18
Also published as: CZ2007450A3

Abstract

Rešení popisuje postup pro urcování fylogenetické príbuznosti organismu, zejména rostlin, pomocí metody genomové in situ hybridizace (GISH), jehož podstatou je, že kombinuje metodu genomové in situ hybridizace (GISH), provedenou na chromozomech hybrida, se zavedeným systémem vnitrní kontroly v podobe mezidruhových hybridu s metodou statistické analýzy. Pro GISH se nejprve pripraví fluorescencne znacená sonda z genomové DNA testovaného druhu a hybridizuje se k preparátu, nacež se preparát digitálne sejme a jeho obraz se uloží do pocítace, kde se softwarove zmerí integrované fluorescence jednotlivých chromozomu, a to jednak integrovaná fluorescence podbarvovací barvy, která odpovídá obsahu DNA, a dále integrovaná fluorescence sondy, pricemž intenzita signálu je mírou homologie DNA. Dále se provede metoda GISH s jedním z rodicovských druhu hybrida a v dalším kroku rozdelení studovaných chromozomu na dve skupiny dle príslušnosti k rodicum. Poté se sectou jednotlivé integrované fluorescence tak, abychom získali hodnoty celkové integrované fluorescence pro provedení výpoctu následovaného statistickou analýzou. Nejprve korelujeme intenzitu celkové integrované fluorescence sondy chromozomu rodice a intenzitu celkové integrované fluorescence podbarvení chromozomu rodice u každého rodice zvlášt, tzn. že podelíme obsah intenzity celkové integrované fluorescence sondy chromozomu rodice obsahem intenzity celkové integrované fluorescence podbarvení chromozomu rodice v tomto poradí, pricemž tímto výpoctem získáme císlo, odpovídající jednotce signálu na jednotku obsahu DNA. Dalším krokem je pak zjištení pomeru techto dvou císel tedy rodic 1 ku rodic 2.

Description

Postup pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti molekulární systematiky a cytogenetiky, zejména postupu pro určování fylogenetické příbuznosti organismů, zvláště rostlin, za použití metody genomové in šitu hybridizace (GISH).

io

Dosavadní stav techniky

Molekulární systematika rostlin založená na porovnání DNA sekvencí genů je v současnosti omezena malým počtem sekvenovaných genů a také tím, že jen málo druhů bylo osekvenováno.

Při fylogenetické analýze je běžnou komplikací fakt, že za použití různých algoritmů je možno generovat různé fylogenetické stromy, přičemž topologie stromů, délka větví a stupeň věrohodnosti jednotlivých větvení ťylogenetického stromu (bootstrap value) se mohou vjednotlivých variantách lišit. Omezený počet dostupných sekvenaČních dat komplikuje nalezení správné varianty fylogenetického stromu. V těchto případech je pak výhodné použít nezávislou kontrolní metodu (např. srovnání morfologických znaků), nicméně i tato kontrola může dávat odlišné výsledky. Nevýhodou této metody tedy je zejména zvýšená možnost generování různých ťylogenetických stromů pro totožné druhy.

Rutinní laboratorní technikou používanou v oblasti molekulární systematiky rostlin je metoda

FISH (fluorescenční in šitu hybridizace), která má mnoho variant a široké využití. U varianty této metody, nazvané GISH (genomová in šitu hybridizace) se jako sonda používá celková genomová DNA určitého druhu. Tato metoda se u rostlinných mezidruhových kříženců doposud používá zejména k rozlišení rodičovských genomů, detekci crossingoverů, a také se tímto způsobem hledají neznámé rodičovské druhy kulturních plodin. Nevýhodou fluorescenční in šitu hybridizace je, že každý jednotlivý preparát je originál s vlastní hladinou pozadí. Stejně tak sonda není naznačena vždy stejně intenzivně, liší se také kvalita cytogenetických objektů, stupeň kondenzace chromozomů a další parametry.

Pro celistvé porovnání genomů přichází v úvahu také metoda nazývaná „dot blot“ nebo „slot blot“ následovaná hybridizací. Nevýhodou této metody je však mj. skutečnost, že není možno porovnávat intenzitu hybridizačních signálů sond spolu s jejich rozmístěním a provést tak konkrétní lokalizaci oblastí homologie v genomu.

Podstata vynálezu

Účelem vynálezu je vytvořit postup pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin, který by minimalizoval rozdílnosti ve výsledcích při určování fylogenetické příbuznosti organismů, zvláště rostlin doposud běžně používanými metodami. Tohoto účelu je dosaženo a nedostatky doposud běžně používaných metod pro fylogenetické studie do značné míry odstraňuje postup pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin, pomocí metody genomové in šitu hybridizace (GISH) podle tohoto vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin se použije metoda genomové in šitu hybridizace (GISH) se zavedeným systémem vnitřní kontroly v podobě mezidruhových hyb50 ridů, provedená na chromozomech hybrida, kdy se na preparátu vyskytují dva rodičovské druhy chromozomů v poměru 1:1, kombinovaná s metodou statistické analýzy, přičemž se nejprve pro metodu GISH připraví fluorescenčně značená sonda z genomové DNA testovaného, třetího, druhu, která se hybridizuje k preparátu, načež se takto upravený preparát digitálně sejme pomocí fluorescenčního mikroskopu, kamery a software, a takto sejmutý obraz upraveného preparátu se uloží do počítače, kde se pomocí software změří integrované fluorescence jednotlivých chromo-1 CZ 302158 B6 zomů, a to integrovaná fluorescence podbarvovací barvy, odpovídající obsahu DNA a integrovaná fluorescence sondy; následně se pro rozeznání studovaných chromozomů provede metoda GISH s jedním z rodičovských druhů hybrida, které se poté rozdělí na dvě skupiny podle příslušnosti k rodičům, a nato se sečtou jednotlivé integrované fluorescence k získání hodnot celkové integrované fluorescence pro provedení výpočtu, při němž se nejprve koreluje intenzita celkové integrované fluorescence sondy chromozomů rodiče a intenzita celkové integrované fluorescence pod barvení chromozomů rodiče a to u každého z rodičů zvlášť; výpočtem, při němž hodnotu intenzity celkové integrované fluorescence sondy chromozomů rodiče dělíme hodnotou intenzity celkové integrované fluorescence podbarvení chromozomů rodiče, získáme číslo, odpovídající jednotce signálu na jednotku obsahu DNA; dále zjistíme poměr těchto dvou čísel jako poměr rodič 1 ku rodič 2, když výsledné číslo je úměrné stupni homologie DNA testovaných druhů; poté zavedeme veličinu „schopnost rozlišit rodičovské genomy v hybridu“ neboli DA (distinguishing abi lity), jejíž výpočet lze zapsat vzorcem

DA-(IFSR1 / IFPRI )/(IFSR2 / IFPR2), kde

IFSR 1 - značí celkovou integrovanou fluorescenci sondy chromozomů rodiče 1

IFPR I - značí celkovou integrovanou fluorescenci podbarvení chromozomů rodiče 1 IFSR 2 - značí celkovou integrovanou fluorescenci sondy chromozomů rodiče 2 IFPR 2 - značí celkovou integrovanou fluorescenci podbarvení chromozomů rodiče 2.

Pro výhodnou možnost porovnání příbuznosti a jejich velmi přehledné grafické prezentace (některé druhy jsou blízce příbuzné k rodiči 1 a jiné k rodiči 2) k oběma rodičům současně se pak veličina DA vyjádří logaritmickou funkcí logDA, kde hodnoty blízké nule znamenají, že testovaný druh není schopen rozlišit mezi rodičovskými genomy, kladné hodnoty znamenají příbuznost k rodiči 1, a záporné hodnoty pak příbuznost k rodiči 2, přičemž čím je absolutní hodnota logDA větší, tím blíže si druhy v systému stojí.

Výhodou in sítu hybridizace na chromozomech např. proti metodě nazývané „dot blot“ nebo „slot blot“ následované hybridizací je fakt, že je možno porovnávat nejenom intenzitu, ale také rozmístění hybridizačních signálů sond a konkrétní lokalizaci oblastí homologie v genomu. Vícebarevné provedení pak umožňuje přímé porovnání několika sond najednou.

Řešení podle tohoto vynálezu je založeno na použití systém interní kontroly v podobě mezidruhových hybridů. Pokud je sledovaný vzorek i kontrola součástí téhož preparátu, hybridizace probíhá u obou ve stejném prostředí a za stejných podmínek. Mnoho parametrů tak lze získat pouhým srovnáním dat. Při přítomnosti dvou typů chromozomů na preparátu, navíc ve stejném poměru, je možno měřit a srovnávat intenzitu fluorescenčního signálu. Způsob výpočtu, díky němuž je možno srovnávat evoluční příbuznost testovaných druhů zavádí také nový termín DA (distinguishing abi lity) neboli rozlišovací schopnost genomů v sondě pri použití na chromozomech mezidruhového hybrida ajeho logaritm izo vanou funkci logDA, která umožňuje současné porovnání příbuznosti testovaného druhu k oběma druhům rodičovským.

Vzhledem k tomu, že metoda GISH je založena na druhově specifických sekvencích DNA, což je typická vlastnost rostlinných genomů, je obecně možné tento systematický přístup používat u rostlin, přičemž lze předpokládat použití i u některých dalších organismů, např. u hub. Metoda GISH je ale nepoužitelná u savců, protože repetitivní sekvence jsou zde chromozomově specifické.

Přehled obrázků na výkrese

Vynález bude dále vysvětlen pomocí obrázků, kde Obr. 1 znázorňuje příbuzenské vztahy mezi některými druhy rodu Silene, Obr. 2 metafázní chromozomy hybrida S. latifolia x S. viscosa

-2CZ 302158 B6 hybridizované sGISH sondami a Obr. 3 schopnost sedmi druhů rodu Silene rozlišit rodičovské chromozomy v hybridu.

Na Obr. 1 jsou tedy znázorněny příbuzenské vztahy mezi některými druhy rodu Silene. Ke kons5 trukci stromu byl použit 1TS1 rDNA. Strom byl vytvořen na základě metody maximální věrohodnosti (maximum likelihood), čísla ukazují stupeň věrohodnosti (bootstrap values) jednotlivých větvení. Z fylogenetického stromu je patrná příbuznost druhů S. zawadskii a 5. viscosa. Výsledky rovněž naznačují, že gynodioecický druh 5. noctiflora by mohl být blízce příbuzný dvoudomým druhům.

io

Na Obr. 2 jsou znázorněny metafázní chromozomy hybrida & latifolia x S viscosa hybridizované s GISH sondami (červeně): a) 5. dioica, celistvý pokryv chromozomů S. latifolia signálem a minimální signál na chromozomech 5. viscosa potvrzují velmi blízkou příbuznost 5. latifolia a S. dioica, b) S. zawadskii, celistvý signál na chromozomech S. viscosa potvrzuje blízkou příbuznost k S. viscosa, c) 5. noctiflora, intenzivnější signál na chromozomech S. latifolia potvrzuje příbuznost k S. latifolia, d) 5. vulgaris, neschopnost rozlišit mezi chromozomy v hybridu naznačuje vzdálenější příbuzenský vztah, e) Saponaria ocymoides, f) 45S rDNA (FISH sonda zeleně, obrázek e) po rehybridizaci), signály celogenomové sondy odpovídají lokalizaci rDNA sondy. Oblasti největší homologie mezi genomy tedy odpovídají především vysoce konzervované rDNA, což potvrzuje pozici Saponaria ocymoides jako vnějšího členu (outgroup). Chromozomy podbarveny DAPI (modrá). Vyznačen chromozom X (původem ze S. latifolia).

Na Obr. 3 je graficky znázorněna schopnost sedmi druhů rodu Silene rozlišit rodičovské chromozomy v hybridu.

Kladné hodnoty značí příbuznost k S. viscosa, záporné příbuznost k,S’. latifolia. Čísla vyjadřují logaritmus poměru fluorescenčních signálů (logDA) - čím větší absolutní hodnota čísla, tím vyšší schopnost rozeznat rodičovskou příslušnost chromozomů a tedy i bližší příbuznost k rodičovskému genomu. Výsledná hodnota byla spočítána z deseti měření integrované fluorescence pro každý uvedený druh. Chybové úsečky znázorňují 95% interval spolehlivostí.

Výsledky ukazují, že existuje přesvědčivý „gradient pattemů“, který odpovídá fylogenetické příbuznosti testovaných druhů (obr. 2). Použijeme-li sondu se 100% homologii (tedy rodičovské genomy S. latifolia a S. viscosa), chromozomy jsou celistvě pokryty signálem. Se vzrůstající evoluční vzdáleností druhů se intenzita a charakter signálu mění. Se vzdáleností klesá také schopnost značené DNA testovaného druhu rozlišit mezi chromozomy rodičovských genomu. Blízká příbuznost k rodičovským genomům byla potvrzena u 5. zawadskii (příbuznost se 5. viscosa) a S, diotica (příbuznost se 5. latifolia). Gynodioecický druh 5. noctiflora vykazuje příbuznost k & latifolia, jeho schopnost rozlišení chromozomů v hybridovi, daná poměrem intenzit signálů, je však menší (obr. 3). Vzdálenější druhy (např. 5. vulgaris) nejsou již schopny chromozomy rozlišit. Saponaria ocymoides, zde použitá jako vnější člen (outgroup) ukazuje dle výsledků GISH homologii s oběma rodičovskými genomy téměř jen v rDNA lokusech. Vzhledem k vysoké konzervovanosti rDNA lokusů mezi druhy, potvrzuje pozorovaný GISH „pattem“ robustnost této metody.

Příklad provedení vynálezu:

Postup pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin, podle tohoto vynálezu bude vysvětlen na příkladu provedení u rostlinného druhu rodu silenka, Silene. Silene z čeledi Caryophyllaceae (hvozdíkovité) představuje vědecky významný model pro studium determinace pohlaví a evoluce pohlavních chromozomů. Mechanismus určení pohlaví u dvoudomých druhů sekce Behen je založen na aktivní úloze chromozomu Y, stejně jako u člověka.

-3CZ 302158 B6

Postup podle tohoto vynálezu pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin byl testován na modelové rostlině Silene latifolia a dalších deseti příbuzných druzích.

Pracujeme tedy s mezidruhovým hybridem V latifolia x S. viscosa, který byl připraven opylením samičích květů S. latifolia pylem 5. viscosa.

Pro určení fylogenetické příbuznosti modelové rostliny Silene latifolia nejprve připravíme preparáty s metafázními chromozomy. Použijeme připravené kultury „vlasatých kořenů“. Z kořenových špiček se pomocí enzymů izolují protoplasty, ty se nakapou na skla a usuší proudem vzduchu.

Dále je třeba izolovat DNA z listů daných druhů (rodičovské a testované druhy). DNA se přečistí a fluorescenčně naznačí.

Poté se chromozomové preparáty připraví pro hybrid izace. Postup přípravy pro hybridizaci obsahuje odstranění RNA pomocí enzymu RNázy, odstranění proteinů pomocí enzymu pepsinu, fixaci preparátu ve Farmerově fixáži, odvodnění v alkoholové řadě a posléze usušení.

Dále se připraví sonda pro hybridizaci, která jc směsí naznačené DNA, formám idu, dextransulfátu a SSC. Sonda se pak denaturuje při 75 °C.

Sondu poté aplikujeme na preparát. Na cykleru provedeme řízenou renaturaci za teploty 75 °C 37 °C po 2 minutách. Hybridizujeme při 37 °C přes noc.

Po hybridizaci odmyjeme přebytečnou sondu pri 42 °C v SSC a aplikujeme podbarvovací barvu v montovaném médiu.

Preparát digitálně sejmeme pomocí fluorescenčního mikroskopu, kamery a software, a takto sejmutý obraz upraveného preparátu uložíme do počítače, kde se pomocí software změří integrované fluorescence jednotlivých chromozomů, a to integrovaná fluorescence podbarvovací barvy, odpovídající obsahu DNA a integrovaná fluorescence sondy; následně se pro rozeznání studovaných chromozomů provede metoda GISH s jedním z rodičovských druhů hybrida, které se poté rozdělí na dvě skupiny podle příslušnosti k rodičům, a nato se sečtou jednotlivé integrované fluorescence k získání hodnot celkové integrované fluorescence pro provedení výpočtu, při němž se nejprve koreluje intenzita celkové integrované fluorescence sondy chromozomů rodiče a intenzita celkové integrované fluorescence podbarvení chromozomů rodiče a to u každého z rodičů zvlášť; výpočtem, při němž hodnotu intenzity celkové integrované fluorescence sondy chromozomů rodiče dělíme hodnotou intenzity celkové integrované fluorescence podbarvení chromozomů rodiče, získáme číslo, odpovídající jednotce signálu na jednotku obsahu DNA; dále zjistíme poměr těchto dvou čísel jako poměr rodič 1 ku rodič 2, když výsledné číslo je úměrné stupni homologie DNA testovaných druhů; poté zavedeme veličinu „schopnost rozlišit rodičovské genomy v hybridu“ neboli DA (distinguishing ability), jejíž výpočet lze zapsat vzorcem DA=(IFSR1 /IFPR1)/(IFSR2 / 1FPR2), kde

1FSR 1 - značí celkovou integrovanou fluorescenci sondy chromozomů rodiče 1

IFPR 1 - značí celkovou integrovanou fluorescenci podbarvení chromozomů rodiče 1

IFSR 2 - značí celkovou integrovanou fluorescenci sondy chromozomů rodiče 2

IFPR 2 - značí celkovou integrovanou fluorescenci podbarvení chromozomů rodiče 2.

Tento výpočet provedeme u každého z 10ti měření pro daný druh. Vypočtené hodnoty podrobíme statistické analýze (průměr, medián, směrodatná odchylka a chyba, interval spolehlivosti). Pro porovnání příbuznosti ajejich velmi přehledné grafické prezentace (některé druhy jsou blízce příbuzné k rodiči 1 a jiné k rodiči 2) k oběma rodičům současně pak veličinu DA vyjádříme loga-4CZ 302158 B6 ritmickou funkcí logDA, kde hodnoty blízké nule znamenají, že testovaný druh není schopen rozlišit mezi rodičovskými genomy, kladné hodnoty znamenají příbuznost k rodiči 1, a záporné hodnoty pak příbuznost k rodiči 2, přičemž čím je absolutní hodnota logDA větší, tím blíže si druhy v systému stojí.

Metodu GISH tedy byla jednoznačně rozlišena rodičovská příslušnost chromozomů v hybridu, což umožnilo oba genomy přímo porovnávat. Navržený fylogenetický postup včetně korelací byl úspěšně otestován na sedmi druzích: 5. latifolia, S. viscosa, S. noctiflora, S. dioica, S. zawadski, S. vulgaris, Saponaria ocymoides. Cytogenetická data byla ve všech případech v souladu to s fylogenetickým stromem zkonstruovaným na základě sekvencí ITS (intemal transcribed spacer) ribozomální DNA (rDNA) (obr. 1). Navíc, hodnoty logDA výborně korelují s fylogenetickými vzdálenosti mezi druhy (spočítanými z délek větví tohoto fýlogenetického stromu) s korelačním koeficientem R²=0,98 (maximální možná hodnota je 1) is Pro určení fylogenetické příbuznosti rostlin jsou nejvhodnější preparáty smetafázními chromozomy, lze však rovněž připravit a použít preparáty obsahující chromatin v libovolné fázi buněčného cyklu.

Průmyslová využitelnost:

Využití molekulárně systematických metod pro určení fylogenetické příbuznosti rostlin podle tohoto vynálezu tedy umožňuje celistvé porovnání obou genomů a podstatně omezuje vznik artefaktů daných nevhodným výběrem genu, znaku či sondy.

Vzhledem k možnosti kvantifikace je pomocí tohoto přístupu také možné konstruovat fylogenetické stromy, případně ověřovat robustnost (věrohodnost) stromů již vytvořených jinou metodou.

Průmyslové využití by mohlo být zajímavé např. pro šlechtitelské firmy. Mohla by takto být tes30 tována příbuznost planě rostoucích druhů a tak odhadována jejich případná zemědělská využitelnost.

Komerční využití dat získaných touto metodou by mohlo být zajímavé rovněž pro softwarové firmy, vytvářejí software pro snímání a hodnocení preparátů a pro softwarové firmy, tvořící fylo35 genetické (stromovací) programy. Jak již bylo zmíněno, existuje množství fylogenetických přístupů, algoritmů a studovaných znaků. Zařazení této nezávislé kontroly do analýz by zpřesnilo a zkvalitnilo generované fylogenetické stromy. Softwarové firmy by tedy mohly mít zájem zohlednit toto kritérium přímo ve svých komerčních programech.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

40 1, Postup pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin metodou genomové in šitu hybridizace (GISH), vyznačující se tím, že pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin se použije metoda genomové in šitu hybridizace (GISH) se zavedeným systémem vnitřní kontroly v podobě mezidruhových hybridů, provedená na chromozomech hybrida, kdy se na preparátu vyskytují dva rodičovské druhy chromozomů v poměru 1:1,

45 kombinovaná s metodou statistické analýzy, přičemž se pro metodu GISH připraví fluorescenčně značená sonda z genomové DNA testovaného druhu a provede se hybridizace k preparátu s chromozomy hybrida, a poté se chromozomy podbarví a změří se integrovaná fluorescence jednotlivých chromozomů, a to integrovaná fluorescence podbarvovací barvy, odpovídající obsahu DNA a integrovaná fluorescence sondy, následně se pak pro rozeznání studovaných chromo50 zomů provede metoda GISH s jedním z rodičovských druhů hybrida pro provedení statistické analýzy, při níž se nejprve koreluje intenzita celkové integrované fluorescence sondy chromo-5CZ 302158 B6 zomů rodiče a intenzita celkové integrované fluorescence podbarvení chromozomů rodiče a to u každého z rodičů zvlášť, poté se výpočtem, při němž hodnotu intenzity celkové integrované fluorescence sondy chromozomů rodiče dělíme hodnotou intenzity celkové integrované fluorescence podbarvení chromozomů rodiče získáme číslo, odpovídající jednotce signálu na jednotku obsahu

5 DNA, dále zjistíme poměr těchto dvou čísel jako poměr rodič 1 ku rodič 2, přičemž získané číslo je úměrné stupni homologíe DNA testovaných druhů, dále se podle stanoveného vzorce zavede veličina „schopnost rozlišit rodičovské genomy v hybridu“, neboli DA (distinguishing ability), když výpočet veličiny „schopnost rozlišit rodičovské genomy v hybridu“, neboli DNA (distinguishing ability) lze zapsat vzorcem

DA=(1FSR1 /1FPR1)/(1FSR2 / 1FPR2), kde

IFSR 1 - značí celkovou integrovanou fluorescenci sondy chromozomů rodiče 1 IFPR 1 - značí celkovou integrovanou fluorescenci podbarvení chromozomů rodiče 1

15 IFSR 2 - značí celkovou integrovanou fluorescenci sondy chromozomů rodiče 2

IFPR 2 - značí celkovou integrovanou fluorescenci podbarvení chromozomů rodiče 2.
2. Postup pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin metodou genomové in sítu hybridizace (GISH) podle nároku 1, vyznačující se tím, že při provádění statistické analýzy se po změření integrované fluorescence jednotlivých chromozomů na upraveném

20 preparátu tyto chromozomy rozdělí na dvě skupiny podle příslušnosti k rodičům, nato se pro provedení statistické analýzy sečtou jednotlivé integrované fluorescence k získání alespoň 4 hodnot celkové integrované fluorescence, a po korelaci intenzity celkové integrované fluorescence sondy chromozomů rodičů a intenzity celkové integrované fluorescence podbarvení chromozomů rodičů se výpočtem, při němž hodnotu intenzity celkové integrované fluorescence sondy chromo25 zomů rodiče dělíme hodnotou intenzity celkové integrované fluorescence podbarvení chromozomů rodiče, získá číslo, odpovídající jednotce signálu na jednotku obsahu DNA, dále zjistíme poměr těchto dvou čísel jako poměr rodič 1 ku rodič 2, které je úměrné stupni homologie DNA testovaných druhů, a poté podle vzorce

30 DA-(ÍFSR1 /IFPR1)/(IFSR2 / IFPR2), kde

IFSR 1 - značí celkovou integrovanou fluorescenci sondy chromozomů rodiče 1 IFPR 1 - značí celkovou integrovanou fluorescenci podbarvení chromozomů rodiče 1 IFSR 2 - značí celkovou integrovanou fluorescenci sondy chromozomů rodiče 2

35 IFPR 2 - značí celkovou integrovanou fluorescenci podbarvení chromozomů rodiče 2 zavedeme veličinu „schopnost rozlišit rodičovské genomy v hybridu“ neboli DA (distinguishing ability.
3. Postup pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin podle nároků 1 a 2, vyznačující se t í m , že se upravený preparát digitálně sejme pomocí fluorescenčního

40 mikroskopu, kamery a software a vytvoří se jeho digitálně sejmutý obraz.
4. Postup pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin podle nároku 3, vyznačující se tím, že se digitálně sejmutý obraz upraveného preparátu uloží do počítače, kde se integrovaná fluorescence jednotlivých chromozomů softwarově změří.
5. Postup pro určení fylogenetické příbuznosti organismů, zejména rostlin podle nároků 1 a 2,

45 vyznačující se tím, že pro možnost porovnání obou příbuzností rodičů současně se veličina DA vyjádří logaritmickou funkcí logDA, kde hodnoty blízké nule znamenají, že testovaný druh není schopen rozlišit mezi rodičovskými genomy, kladné hodnoty znamenají příbuznost k rodiči 1, a záporné hodnoty pak příbuznost k rodiči 2, přičemž čím je absolutní hodnota logDA větší, tím blíže si druhy v systému stojí.