CZ300840B6

CZ300840B6 - Zpusob výroby prostredku s obsahem fytochemické slouceniny a prostredek

Info

Publication number: CZ300840B6
Application number: CZ20003583A
Authority: CZ
Inventors: A. Zeligs@Michael; C. Jacobs@Irwin
Original assignee: Bioresponse, L. L. C.
Priority date: 1998-04-01
Filing date: 1999-04-01
Publication date: 2009-08-26
Also published as: DK1067913T3; EP1067913A4; AU3377299A; AU763358B2; CA2326653A1; NZ507637A; EP1067913A1; US6086915A; CA2326653C; WO1999049851A1; CZ20003583A3; EP1067913B1; PT1067913E

Abstract

Zpusob výroby prostredku s obsahem fytochemické slouceniny, pri které se a) zahreje jedna nebo vetší pocet solubilizacních emulgacních látek ze skupiny esteru polyethylenglykolu se sukcinátem vitamínu E, polyvinylpyrrolidonu, polyoxyethylenstearátu, cholátu sodného, deoxycholátu nebo taurocholátu sodného, b) k produktu z kroku a) se pridá rozpouštedlo a smácedlo typu fosfolipidu za vzniku roztoku; c) v roztoku ze stupne b) se rozpustí jedna nebo více hydrofobních fytochemických látek ze skupiny indolu a flavonoidu; d) k roztoku ze stupne c) se pridá roztok obsahující zapouzdrující látku, zvolenou ze skupiny škrob a želatina; e) roztok pripravený ve stupni d) se mísí za vzniku mikrodisperze s velikostí cástic 5 .mi.m nebo nižší; a f) výsledná smes se suší rozprašováním za vzniku pevného prostredku s obsahem hydrofobní fytochemické látky, prostredek pripravitelný tímto zpusobem a jeho použití pro výrobu léciva.

Description

(57) Anotace:

Způsob výroby prostředku s obsahem fytochemické sloučeniny, při které se a) zahřeje jedna nebovétší počet solubilizačních emulgačních látek ze skupiny esteru póly ethy lengly kolu se sukcinátem vitaminu £, polyvinylpytTolidonu, póly oxy ethy lenstearátu, cholátu sodného, deoxycholálu nebo taurocholátu sodného, b) k produktu z kroku a) se přidá rozpouštědlo a smáčedlo typu fosfolipidu za vzniku roztoku; c) v roztoku ze stupni b) se rozpust! jedna nebo více hydrofobních fytochemických látek ze skupiny indolů a (lavonoidů; d) k roztoku ze stupné c) se přidá roztok obsahující zapouzdřující látku, zvolenou ze skupiny 3crob a Želatina; e) roztok připravený ve stupni d) se míd za vzniku nikrodisperze s velikosti částic 5 μιη nebo nižSÍ; a i) výsledná smés se suš! rozprašováním za vzniku pevného prostředku s obsahem hydrofobní fytochemické látky, prostředek přepravitelný tímto způsobem a jeho použiti pro výrobu léčiva

Způsob výroby prostředku s obsahem fytochemické sloučeniny a prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby prostředku s obsahem fytochemických sloučenin k dosažení příznivějšího metabolismu steroidních hormonů. Skupinou fytochemických látek, použitelných pro účely vynálezu jsou zejména indolové alkaloidní fytochemické látky a flavonoidní fytochemické látky. Popisuje se příprava prostředků s obsahem těchto látek, které zlepšuji vstřebávání ío nerozpustných látek z potravy a tím mohou příznivě ovlivnit účinnost steroidních enzymů typu cytochromu P450. Toto zlepšené vstřebávání nesnadno rozpustných látek zvětšuje příznivé vlivy na steroidní metabolismus.

Dosavadní stav techniky

Skupina enzymů typu cytochromu P450, CYP, indukovatelná v celé řadě buněk je schopna metabolizovat ve vodě nesnadno rozpustné hormony, léčivé látky a řadu chemických látek. Úroveň koncentrace steroidních hormonů u jednotlivce tedy odráží aktivitu enzymů CYP. Enzy20 my CYP se účastní biosyntézy steroidních látek a jejich aktivace a přeměny na metabolity, které jsou ve vodě lépe rozpustné. Některé enzymy CYP hrají v biochemii důležitou úlohu, zejména jsou zodpovědné za metabolismus steroidních látek a příbuzných sloučenin rostlinného původu. To znamená, že příjem některých fytochemických látek z rostlin v potravě a některých příbuzných syntetických chemických látek může ovlivnit metabolismus steroidních hormonů, ovlivňo25 váný enzymy CYP. Indukce nebo inhibice účinnosti těchto enzymů může mít zásadní, vliv na účinnost steroidních hormonů vzhledem k tomu, že je nyní známo, že biologická účinnost dané steroidní látky většinou spočívá v jejich specifických metabo litech, jejich relativní koncentraci a biologickém poločasu, jak je možno nalézt v souhrnné publikaci Michnovicz a Bradlow, Dietary Cytochrome P-450 Modifiers In The Control OF Estrogen Metabolisme kapitola 23, Food jo Phytochemicals For Cancer Prevention 1, Huang a další, eds. American Chemical Society, 1994. Steroidní hormony a riziko onemocnění

Estrogen nebo 17-beta-estradiol je steroidní hormon, který má zásadní důležitost při rozmnožo35 vání, růstu, vývoji a metabolismu každého jedince. Jde o důležitou látku pro zdraví mužů i žen. Změny v účinnosti estrogenů, které počínají ve středním věku, jsou spojeny se Širokým spektrem chorobných stavů. Metabolismus estrogenů závisí na celé řadě enzymů CYP, zvláště na CYP 1A1, převážně se vyskytujícím v játrech a CYP 1A2 a 1 Bl, které se nacházejí v mléčné žláze, děloze, vajeěnících a také v pokožce. Úroveň indukce CYP 1A1,1A2 a 1B1 se mění podle stavu dalších hormonů, například hormonů štítné žlázy, v závislosti na výživě, například na indolových fytochemických látkách a na působení toxinů z vnějšího prostředí, například na působení tabákového kouře a pesticidů. Poměry klíčových metabolitů estrogenů odrážejí stupeň indukce specifickými hydroxylačními enzymy CYP estrogenů. Mimo to řídí aromatáza ze skupiny enzymů CYP koncentraci estrogenů uvnitř buněk tím, že řídí přeměnu androgenů, androstendionů a testoste45 ronů na estrogen. Aromatáza CYP je zvláště důležitá v tukové tkáni nebo ve specializované pojivové tkáni, označované jako stroma.

Zjišťování důležitosti specifických metabolitů estrogenů bylo zahájeno přibližně v roce 1970 a bylo popsáno, že množství 160H-estronu u mužů i žen stoupá v případě systemického lupus erythematosus podle publikace Lahita a další, Alterations of Estrogen Metabolism in Systemic Lupus Eiythematosus, Arthritis and Rheumatism, sv. 22, ě. 11, 1979. Podle další studie, provedené v roce 1982 je možno prokázat podobný vzestup 160H-estronu u nemocných se zhoubným nádorem mléčné žlázy podle publikace Schneider a další, Abnormal Oxidative Metabolism of Estradiol in Women with Breast Cancer, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 79, s. 3047-3051, 1982.

Totéž pozorování bylo později rozšířeno na zhoubné nádory dělohy podle publikace Fishman a další, íncreased Estrogen-16-Hydroxy lase Activity in Women with Breast and Endometrial Cancer, Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 20, č. 48, s. 1077-81, 1984.

Při výzkumu chorob dělohy se prokázalo, že existuje korelace zvýšeného poměru estronu 160H a

20H ve tkáni děložního krčku a rozsahu dysplasie tohoto krčku v případě zhoubného bujení v epithelu děložního krčku podle publikace Sepkovic a další, Estrogen Metabolite Ratios and Risk Assessment of Hormone-Related Cancer, Assay Validation and Prediction of Cervical Cancer Risk, Annals of the N. Y. Acad. of Science, sv. 768, s. 312-316, 1995. Důležitost přerušení této cesty metabolismu estrogenu je dále podporováno pozorováním na kultuře lidské ío tkáně mléčné žlázy, a to normální tkáně a tkáně napadené zhoubným bujením, kde rovněž dochází ke vzestupu 16-hydroxylace podle publikace Osbome a další, Upregulation of Estradiol 06 Hydroxylation in Human Breast Tissue: A Potential Biomarker of Breast Cancer Risk, J.C.N.I. 85:23, s. 1917-20, 1993. Buněčná studie buněk zhoubného bujení mléčné žlázy prokázala pravděpodobné spojení chemických látek ze životního prostředí s metabolismem estro15 genu ajeho posunem směrem k vyšší produkci 160H-estronu a nižší produkci 20H~estronu po vystavení těchto buněk působení syntetických pesticidů podle publikace Bradlow a další, Effects of Pesticides on the Ratio of 16/2-Hydroxyestrone: A Biologie Markér of Breast Cancer Risk, Environmental Health Perspectives, 103, Suppl. 7, s. 147-50, 1995.

2« Důležitost metabolismu estrogenu při stanovení chorob, spojených s estrogeny, je plně shrnuta v souhrnné publikaci, která vysvětluje interakci mezi chemickými látkami ze životního prostředí (xenoestrogeny), metabolismem hormonů a postupy, při nichž dochází k poškození DNA, jehož důsledkem je zhoubný nádor mléčné žlázy, jde o publikaci Davis a další, Medical Hypothesis: Bifiinctional Genetic-Hormonal Pathways to Breast Cancer, Environmental Health Perspectives,

105, Suppl. 3, s. 571-576,1997. Závažnost uváděných zjištění podporuje názor, že riziko vzniká jak celkovým kumulativním vystavením tkáně působení estrogenů, tak způsobem metabolismu těchto látek.

Zjištění, že specifické enzymy CYP jsou zodpovědné za produkci 20H-estronu vedlo kpřehodjo nocení výzkumů z let 1970 a dalších, které se týkaly indukce enzymů CYP fytochemickými látkami z potravin, zejména ze zeleniny podle publikace Wattenberg a Loub, Inhibition of

Polycyclic Aromatic Hydrocarbon-Induced Neoplasia by Naturally Occurring Indoles, Cancer Research, 38, 1410-13, 1976. Výzkumy prokázaly, že zelenina, extrakty z rostlin a zvláště fytochemické látky mohou zabránit u živočichů vzniku zhoubných nádorů, vyvolaných karcinogen35 nimi látkami. Autoři prokázali inhibici indukovaného zhoubného nádoru indolovou skupinou fytochemických látek z potravy. Uvedená skupina sloučenin měla společnou plochou molekulovou strukturu, která upravovala účinnost enzymů CYP aktivací příslušného genu přes tak zvaný arylový receptorový systém. Účinnost proti vzniku zhoubného nádoru nebo „chemoprevence“ byla vázána na heterocyklickou kruhovou strukturu. Při dalších výzkumech, týkajících se těchto

-to látek a provedených pod vedením H. Leona Bradlowa na Rockefellerově Univerzitě, bylo prokázáno, že indol-3-karbinol, indol z křťžatých rostlin typu zeleniny je schopen úspěšně posunout metabolismu estrogenu ve směru 20H-estronů, jak bylo shrnuto v publikaci Bradlow a další, Indole-3-Carbinol, A Novel Approach to Breast Cancer Prevention, Annals of the New York Academy of Science, 768: 180-200,1995. V poslední době se uznává, že vlivy ze složek potravy na metabolismus estrogenů jsou důležitým faktorem pro prevenci zhoubných onemocnění. Diindolylmethan jako fytochemická látka, indukuj ící CYP

Bylo prokázáno, že koncentrace CYP 1A1/1A2 v játrech a ve střevech krys a myší se zvyšuje u zvířat, jímž byl v krmivu podáván indol-3-karbÍnol (I3C), jde o indol z křížatých rostlin typu zeleniny. Při doplnění krmivá živočichů i lidí touto látkou je možno prokázat zvýšení 2-hydroxylace estradiolu, které je vyvoláno účinností enzymů CYP 1A1 a 1A2. Další výzkumy prokázaly, že kondenzační produkty, které se z uvedené látky tvoří při průchodu žaludkem mají rovněž modulační účinky na enzymy CYP. Kondenzační produkt, vznikající působením kyseliny,

3,3'-diindolylmethan (DIM) a 2,3-bis[3-indolylmethyI]indol byl prokázán v obsahu žaludku “»

CZ 300840 Bó l hodinu po perorálním podání I3C podle publikace Stresser a další, Mechanisms of Tumor Modulation by Indole-3-Carbinol: Disposition and Excretion in Male Fischer 344 Rats, Drug Metabolism and Disposition, 23:9, s, 965-75, 1995. Při dalších výzkumech bylo prokázáno, že DIM je účinnější než I3C při ovlivnění metabolismu estrogenů, pokusy byly provedeny tak, že

DIM a I3C byly podávány krysám v krmivu a byt měřen metabolismus estrogenů v jatemích mikrosomech podle publikace Jellinck a další, Ah Receptor Binding Properties of Indole Carbinols and Induction of Hepatic Estradiol Hydroxylation, Biochemical Pharmacology, 45:5, s. 1129-36, 1993.

io V poslední době se pri pozorování buněčných kultur prokázalo, že DIM podporuje preventivní apoptosu pri vzniku zhoubného nádoru, to znamená programované uhynutí buněk podle publikace Ge a další, 3,3'-Diindolylmethane induces Apoptosis in Human Cancer Cells, Biochemical and Biophysical Research Communications, 228, s. 153-58, 1996. Polycyklická kruhová struktura DIM, která je podobná struktuře jiných sloučenin, o nichž je známo, že způsobují uvolnění is p-glykoproteinů vázaných na membránu, rovněž zvyšuje účinnost chemoterapie v případě nádorových buněk odolných proti řadě chemických látek podle publikace Chrístensen aLeblanc, Reversal of Multidrug Resistance in Vivo By Dietary Administration ofthe Phytochemicai Indole-3-Carbinol, Cancer Research, 56, s. 574-81, 1996. Souhrnně tato pozorování prokazují, že DIM má indukující účinnost na CYP a současně modulační účinek na funkci buněk a je tedy velmi užitečným doplňkem stravy.

DIM je stálejší než I3C

C se nyní užívá jako doplněk stravy a uvádí se, že tímto způsobem je možno příznivě posunout metabolismus estrogenů ve prospěch tvorby 20H-estronu podle publikace Michnovicz a další, Changes in Levels of Urinaiy Estrogen Metabolites After Oral Indole-3-Carbinol Treatment in Human, Journal of the Nat i Cancer Inst., 89:10, s. 718-23, 1997. Použití této látky pro chemoprevenci zhoubného nádoru mléčné žlázy a pro potlačení respirační infekce papillomavirem podle publikace Coll a další, Treatment of Recurrent Respirátory Papillomatosis with Indole-3jo Carbinol, American Journal of Otolaiyngology, 18:4, s. 283-85, 1997, vyžaduje nejnižší dávku 300 mg denně na osobu podle publikace Wong a další, A Dose-Response Study Of Indole-3Carbinol for Breast Cancer Prevention, 1998. Existují však omezení vzhledem k použití I3C ve stravě vzhledem k tomu, že běží o nestálou látku, která se samovolně urychleně rozkládá působením tepla, světla, zvýšené vlhkosti nebo v kyselém prostředí. Při skladování I3C je možno pro35 kázat úbytek přibližně 50 % původního množství uvedené látky za podmínek, které napodobují uložení po dobu jednoho měsíce (BioResponse New Dietary Ingredietn EDA Filing, srpen 1997). Mimo to dochází u uvedené látky in vivo k nepředvídatelným transformacím. Při průchodu žaludkem se uvedená látka samovolně mění na celou radu kondenzačních produktů, zvláště dímerů a trimerů. Jedním z reakčních produktů je indolokarbazoi, lineární dimer s uzavřeným kruhem, který napodobuje dioxin jak svou strukturou, tak svou biologickou účinností podle publikace Bjeldanes a další, Aromatic Hydrocarbon Responsiveness-Receptor Agonists Generated From Indole-3-Carbinol in Vitro a in vivo: Comparisons with 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-P-Dioxin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, s. 9543-47, 1991. Tato nepředvídatelná tvorba indolokarbazolu v prostředí žaludeční kyseliny způsobuje, že není možno prokázat bez45 pečnost podávání I3C. Nedostatečná stálost při skladování, samovolná reakce s dalšími složkami a nedostatná identifikovatelnost produktů, vytvořených v žaludku značně omezují použitelnost I3C jako doplňku stravy.

Při studiích DIM se ukázalo, že uvedená látka je při průchodu simulovaným žaludečním prostře50 dím (BioResponse New Dietary Ingredient FDA Filing, srpen 1997) zcela stálá. Nevytváří se žádný indolokarbazoi ani v prostředí žaludeční kyseliny, ani v průběhu skladování. DIM má tedy žádoucí vlastnosti jako látka, indukující enzymy CYP a je stálá. Z tohoto důvodu by bylo zapotřebí mít k dispozici biologicky dostupné prostředky s obsahem uvedené látky a také s obsahem jejich dímerů a trimerů vzhledem k tomu, že hydrofobní látky typu DIM se nesnadno vstřebávají.

Fytochemická látka chrysin vyvolává inhibicí aromatázy CYP

Flavony, analogické indolům v potravě jsou přírodní sloučeniny z rostlin, které mohou ovlivnit účinnost estrogenu a mohou zabránit vzniku pokusných nádorů. 5,7-dihydroxyflavon, chrysin je flavon, který je možno prokázat v extraktech z mučenky Passiflora corerula a také v pylu nebo v propolisu. Tato látka vyvolává inhibicí účinnosti aromatázy CYP v buněčné kultuře a také v bezbunéčných mikrosomech podle publikací Campbell a Kruzer, Flavonoid inhibition of aromatase enzyme activity in human pre-adipocytes, J. Steroid Bíochem. Molec. Biol, 46:3, s. io 381-388 (1993) a Kellis a Vickery, Inhibition of human estrogen synthetase (aromatase) by flavones. Science, 225, s. 1032-1034, 1984. Modulace účinnosti aromatázy je důležitá vzhledem k tomu, že tento enzym CYP řídí přeměnu androgenů na estrogeny v periferní tkáni, například v tukové tkáni. V průběhu stárnutí se stavba organismu mění ve prospěch zvýšeného množství tukové tkáně vzhledem ke svalovině. V důsledku toho dochází ke zvýšené produkci estrogenů z testosteronu a z androgenu nadledvinek, dehydroepiandrosteronu DHEA jak u mužů, tak u žen s pokračujícím věkem. Účinnost flavonů ve stravě proti působeni aromatázy a účinnost podobných isoflavonů je tedy patrně důležitým zdrojem ochrany před onemocněními, vyvolanými nadbytkem estrogenu tím, že se omezuje metabolická přeměna androgenů na estrogeny.

io Přestože byla prokázána značná účinnost chrysinu proti působení aromatázy v bezbunéčných extraktech v buněčné kultuře, uvádí se nízká biologická dostupnost flavonů při perorálním podání jako problém při jejich potenciálním využití jako doplňků stravy podle publikace Kuhnau, The flavonoid. A class of semi-essential food components: their role ín human nutrition, World Rev. Nutr. Diet, 24, s. 117-191, 1976. Při studiích fyzikálně chemických vlastností chrysinu se prokázalo, že tato látka je velmi hydrofobní a její rozpustnost ve vodě je pouze 2,8 x IO^-6 mol/1 podle publikace Masarova a další, Solubilization of chiysin by a non-aromatic amine oxide, Pharmazie, 44, H 12, s. 865-866, 1989. Existuje tedy potřeba mít k dispozici dopiněk s obsahem chiysinu se zlepšenou biologickou dostupností tak, aby bylo možno využít schopnost této látky vyvolat inhibicí aromatázy CYP.

Biologická dostupnost, hydrofobních fytochemíckých látek při perorálním podání je omezena.

Aby bylo možno dosáhnout ochranného účinku fytochemíckých látek, je nutno dosáhnout při perorálním podání dostatečné koncentrace těchto látek ve tkáních. Při vstřebávání musí ve vodě nerozpustné nebo hydrofobní látky, podané ve stravě překonat řadu bariér v průběhu vstřebávání. Jde o odolnost proti emulgací tukovými micelami ve střevě, okamžitý „presystemický“ metabolismus při styku s enterocyty v tenkém střevě a návrat těchto látek do dutiny střevní působením p-glykoproteinů, které vytlačují řadu hydrofobních látek z enterocytů. To znamená, že pomocné látky, které zlepšují emulgací do micel, snižují metabolismus enterocytů a zvyšují příjem uvede40 ných látek do chylomikronů, mohou také zlepšit biologickou dostupnost uvedených hydrofobních látek. Zvýšený přístup těchto látek do proudu lymfý může obejít první průchod játry, kterým procházejí ve vodě rozpustné látky nebo ve vodě rozpustné metabolity.

Při prvním pokusu o laboratorní syntézy DíM v roce 1950 bylo prokázáno, že uvedená látka je ve vodě vysoce nerozpustná podle publikace Leete a Marion, The Hydrogenolysis of 3-Hydroxymethylindole and Other Indole Derivatives with Lithium Aluminum Hydride, Canadian J. of Chemistry, 31:9, s. 775-84, 1953. Na buněčných kulturách bylo prokázáno, že DIM je látkou, účinně indukující enzymy CYP při přímém přidání do kultury jatemích buněk podle publikace Wortelboer a další, EfTects of Indole-3-Carbinol on Biotransformation Enzymes ín the Rat:

In Vivo Changes in Liver and Smáli Intestinal Mucosa in Comparison with Primary Hepatocyte Cuítures, Food Chem. and Toxicology, 30:7, s. 589-99,1992. Avšak v případě, že došlo k podání DIM v krmivu nebo v případě, že tato látka byla vstřikována intraperitoneálně u krys, bylo možno pozorovat značně nižší účinnost. I v případě, že uvedená látka byla podávána v sezamovém oleji, který usnadní vstřebávání, bylo možno pozorovat ztrátu účinnosti pod 5 mg/kg.

Účinek na indukci enzymů bylo možno prokázat až do dávky 0,3 mg/kg v případě intra4 peritoneálního podání podle publikace Ah Receptor Binding Properties of Indole Carbinols and Induction of Hepatic Estradiol Hydroxylation, Biochemical Pharmacology, 45:5, s. 1129 36. 1993. V případě začlenění do krmivá a smísení s krmivém při dalších pokusech nebylo možno ani při použití velkých dávek DIM vyvolat indukci enzymů CYP v epitelu tlustého střeva, avšak pro ve vodě rozpustnou látku I3C bylo možno tuto indukci prokázat podle publikace McDannell and McLean, Differenatial Induction of Mixed-Function Oxidase, MFO, Activity in Rat Liver and Intestine by Diets Containing Processed Cabbage: Correlation with Cabbage Levels of Glucosinolates and Glucosinolate Hydrolysis Products, Food Chem. and Toxicology, 25:5, s. 363-68, 1986. Tyto studie prokázaly, že se DIM nevstřebává ve farmakologicky účinných io dávkách.

V případě, že byla sledována biologická dostupnost chrysinu při perorálním podáváni spolu s krmivém, nebylo možno pozorovat na krysích játrech žádné účinky na CYP, přestože byly tyto látky podávány perorálně po dobu dvou týdnů v dávce 300 mg/kg denně. Příjem Tangeretinu, flavonů s lepši rozpustnosti v lipidech byl však spojen s indukcí CYP podle publikace Siess, M. H., Guillermic, M., LeBon, A. M., Suschetet, M., Induction of monooxygenase and transferase activities in rat by dietary administration of flavonoid, Xenobiotica, 19:12, s, 1379-1386, 1989. Je tedy zřejmé, že by bylo zapotřebí vyvinout specifické prostředky jako doplňky stravy s usnadněným vstřebáváním uvedených látek při perorálním podání.

Presystemícký metabolismus látek, podaných ve stravě

Biologická dostupnost celé řady hydrofobních fytochemických látek, může být omezena jejich metabolismem ve vrstvě enterocytů, která vystýlá zažívací soustavu. Tento presystemícký meta25 bolismus zahrnuje skupinu CYP 3A4 enzymů typu cytochrom. Účinnost enzymu CYP 3A4 je vázána na vytlačení hydrofobních sloučenin z enterocytů zpět do průsvitu střeva účinnosti p-glykoproteinů membrán podle publikace Wacher a Bennet, Overlapping Substráte Specificities and Tissue Distribution of Cytochrome P450 3a and P-Glycoprotein: Implications for Drug Delivery and Activity, in Cancer Chemotherapy, Molecular Carcinogenesis, 13, s. 129-34,1995.

Vzhledem k tomu, že esenciální oleje z různých rostlinných zdrojů mají inhibiční účinek na CYP 3A4, bylo vyvinuto společné podávání olejů v emulzi s hydrofobními látkami v systému pro zvýšení příjmu některých účinných látek snížením účinnosti p-glykoproteinů z membrán, jak bylo popsáno v US patentovém spisu 5 665 386. Celá řada látek ve stravě jsou substráty pro enzymy CYP 3A4 a jsou přednostně vytlačovány z buněk působením p-glykoproteinu. Vzhle35 dem ke strukturní příbuznosti s různými účinnými látkami, je pravděpodobné, že příjem látek, jako jsou DIM a chrysin, je rovněž ovlivněn účinností enzymu CYP 3A4 a p-glykoproteinu.

DIM je však patrně zcela jedinečnou látkou, pokud jde o selektivní metabolismus v systému enterocytů a také pokud jde o vytlačování látek zpět do průsvitu střeva. Po podání DIM bylo možno pozorovat inhibicí funkce p-glykoproteinu v buněčné kultuře a také in vivo. To znamená, že DIM snižuje účinnost celého systému pro eliminaci jiných hydrofobních sloučenin podle publikace Christensen a Leblanc, Reversal of Multidrug Resistance in vivo by Dieatry Administration of the Phytochemical Indole-3-Carbinol, Cancer Research, 56, s. 574-81, 1996. Tento účinek má za následek zvýšenou účinnost chemoterapeutických látek u nádorových buněk, které jsou odolné proti působeni celé řady chemických látek. Při použití molekulární sondy bylo možno prokázat přímou interakci DIM s p-glykoproteinem membrány. To znamená, že DIM zřejmě může zvláštním způsobem blokovat vytlačení, jakmile se dostane do enterocytů. To znamená, že při překonání bariéry rozpustnosti a po vstřebání do enterocytů, může DIM stimulovat svůj vlastní další systemický příjem a biologickou dostupnost a také biologickou dostupnost dalších látek, které rovněž podléhají vlivu p-glykoproteinu.

Kromě DIM a esenciálních olejů byly pozorovány ještě další dvě skupiny sloučenin, které mohou ovlivnit biologickou dostupnost s ohledem na CYP 3A4 a na p-glykoproteiny. Prvním faktorem je podávání smáčedel pro ovlivnění membrán a blokování účinnosti p-glykoproteinu změnami interakce mezi lipidy a bílkovinami, na nichž závisí p-glykoprotein. Tyto poznatky byly využity c

tak, že se současně podává smáčedlo a chemoterapeutická látka při léčení nádorů, odolných proti celé řadě chemických látek podle US 5 591 715,

Bylo také prokázáno, že přírodní látky, obsažené v grapefruitové šťávě účinně blokují účinnost

CYP 3A4 a podporují tak vstřebávání různých látek, například chinidinu, cyklosporinu a felodipinu podle publikace Lown a další. Grapefruit Juice Increases Felodipine Oral Availability in Humans by Decreasing Intestinal CYP 3A Protien Expression, Journal of Clinical Investigation, 99:10, 2545-53, 1997. Vzhledem k tomu, že DIM je látka, strukturně příbuzná chinidinu, bylo by výhodné vyvinout prostředek s obsahem DIM, který by využíval grapefruitovou šťávu a ío blokoval účinnost CYP 3A4. Tímto způsobem by bylo možno dále usnadnit vstřebávání DIM a dalších současně podávaných látek, jako flavonů a isoflavonů. Bylo by také výhodné mít k dispozici prostředek, který by současně blokoval účinnost CYP 3A4 a přímo blokoval účinnost p-glykoproteinu. Takový prostředek je možno připravit současným podáváním smáčedel, o nichž je známo, že specificky přerušují účinnost p-glykoproteinů svým účinkem na membránách, jak is bylo popsáno svrchu. Ideálně je takto usnadněné vstřebávání přechodné, dovoluje příjem sloučenin, které jsou cíleně podávány současně s grapefruitovým koncentrátem a smáěedlem. Po podávání takového prostředku se funkce CYP 3A4 v několika hodinách vrátí do normálního stavu a enterocyty pak opět mají svou ochrannou funkci a nevstřebávají další potenciálně toxické hydrofobní sloučeniny. Předběžné farmakokinetické studie účinku grapefruitové šťávy v koncen20 trované formě prokazují, že se vlastnosti enterocytů navrátí na normální hodnotu v průběhu 8 až 12 hodin podle publikace Ameer, B. a Weintraub, R. A., Clinical Pharmacokinetics, 33(2): 10321, 1997.

Nejbližší dosavadní stav

Z toho, co bylo uvedeno, je zřejmá potřeba zlepšit vstřebávání některých hydrofobních látek, z tohoto důvodu byly prováděny pokusy s použitím polyethylenglykolu PEG jako smáěedla, mimo jiné byly připravovány mikrodisperze ke snížení velikosti částic s použitím sušení rozprašováním tak, aby se vytvořily oddělené částice.

První pokusy s PEG byly popsány v US patentovém spisu 4 151 273 (Riegleman a Chiou), v tomto spisu se popisuje spojení nerozpustné látky s požadovaným účinkem s rozpustným PEG jako nosičem pro zlepšení vstřebávání. Obvyklá technologie přípravy takových prostředků spočívala v tom, že byla smísena zahřátá směs PEG nebo polyvinylpyrrolidonu s málo rozpustnou účinnou látkou, načež byla směs zahlazena za vzniku „pevného roztoku“ dispergované účinné látky. Tato pevná směs nebo disperze pak byla mleta nájemný prášek, který byl zpracováván na tablety. Tímto způsobem bylo možno zpracovat různé disperze nebo emulze nerozpustných látek na prostředky, vhodné pro perorální podání. Technologie tvorby jemnějších částic v disperzích byla později popsána pro systémy lipidů a smáčedel v US 4 880 634. Přidávání volných mast40 ných kyselin a fosfolipidů k emulzím pak bylo popsáno v US 5 314 921, účelem byla lepší kompatibilita se střevními micelami. V poslední době jsou popisovány složitější a vícenásobné emulze v jedlých olejích jako variace tohoto postupu, například podle US 5 643 856 a US 5 583 105.

Technologie míšení hydrofobních látek s materiály pro tvorbu povlaků byla popsána v US 4 230 687 (Sair a Sair) a tvoří základ pro různé formy stálých mikrodisperzí při mechanickém míšení různých polymemích zapouzdřujících materiálů, jako jsou škroby, gumy nebo proteiny. Tento postup však vyžaduje zahuštěnou směs škrobů tak, aby bylo možno uchovat jednotlivé částice v mikrodisperzí. Tímto způsobem bylo možno dosáhnout lepšího vstřebávání dipyri50 damolu při perorálním podání vytvořením amorftií nekrystalické směsi s polyvinylpyrrolidonem jako emulgátorem s následným sušením této směsi rozprašováním podle US 4 610 875. Postup pro sušení rozprašováním v případě emulze lecithínu, organického oleje a neiontového poloxameru jako smáěedla, byl vyvinut v potravinářském průmyslu pro chuťové látky tak, aby byly stálé při skladování podle US 5 362 425. Zlepšená tvorba Částic pro nerozpustné účinné látky s použitím esterů karboxylových kyselin s PEG byla popsána později. Šlo například o použití PEG

Λ

1000 se sukcinátem vitamínu E, TPGS jako emulgačního činidla a povlakového materiálu, složky byly smíseny před sušením rozprašováním za vzniku částic podle US 5 430 021.

TPGS byl pak podroben dalšímu výzkumu jako rozpustná forma vitamínu E a současně jako prostředek pro tvorbu kapalných emulzi v kombinaci s hydrofobními sloučeninami nebo vitamíny. Postup byl použit pro zvýšení vstřebávání vitamínu D a dalších nesnadno rozpustných látek, například cyklosporinu podle publikace Argao a další, d-alfa-Tocopheryl Polyethylene Glycol-1000 Succinate Enhances the Absorption of Vitamin D in Chronic Cholestatic Liver Disease of Infancy and Childhod, Pediatrie Research, 31:2, 146,1992. TPGS a další estery PEG, io vhodné pro potravinářské účely, se prokázaly jako látky užitečné pro zvýšení vstřebávání esterifikovaného vitamínu E podle US 5 179 122. Další prostředky s obsahem TPGS v kombinaci s neesterifikovaným vitamínem E byly vyvinuty smísením TPGS s látkami, podporujícími sypnost s následným rozprašováním podle US 5 234 695. Při těchto použitích byl TPGS použit jako emulgační činidlo, které zlepšuje vstřebávání ve střevech. Tato fiinkce však není vyhrazena is pouze pro TPGS vzhledem k tomu, že při použití lipidové frakce membrán z kravského mléka bylo možno prokázat zvýšené vstřebávání cyklosporinu do obdobného stupně podle publikace Sáto a další, Enhancement of the intestinal absorption of a cyclosporine derivative by milk fat globule membráně, Bio. Pharm. Bull. 17(11), s. 1526-1528, 1994. V poslední době je vysvětlován mechanismus působení TPGS, kterým tento ester PEG zvyšuje biologickou dostupnost cyklosporinu.

Měření metabolitů cyklosporinu prokázalo, že TPGS neovlivní působení enzymů CYP 3A4, a musí tedy existovat jiný mechanismus, kterým TPGS vyvolává zvýšené vstřebávání některých látek. Předpokládalo se, že tímto mechanismem by mohla být inhibice působeni p-glykoproteinu podle publikace Chang a další, The effect of water-soluble vitamin E on cyclosporine pharmacokinetics in healthy volunteers, Clinical Phannacology & Therapeutics, 59:297-303,1996.

Na základě průkazu, že by bylo možno využít fytochemické látky z potravy k posunu metabolismu estrogenů směrem k příznivějším metabolitům, jako je 20H-estron je zřejmé, že by bylo zapotřebí vyvinout bezpečné a účinné prostředky jako potravinové doplňky. Výhodné fytochemické látky, jako DIM a chrysin jsou totiž vysoce nerozpustné a při perorálním podání je jejich biologická dostupnost fyziologickým mechanismem omezena. Je tedy zřejmé, že by bylo zapotřebí navrhnout takové zpracování uvedených látek, které by pomohlo překonat bariéry při jejich vstřebávání.

Podstata vynálezu

Vynález se týká specifických prostředků s obsahem látek, obsažených v rostlinách jako dietních doplňků a způsobů výroby těchto prostředků. Získané prostředky mají být určeny k udržení nebo dosažení hormonální rovnováhy. Prostředky překonávají nesnadnou rozpustnost a nízkou biologickou dostupnost dietních látek při perorálním podání u člověka nebo jiných živočichů. Byl vyvinut nový způsob zpracování, který dovoluje tvorbu mikrodisperze nerozpustných látek v potravě ve spojení s estery polyethylenglykolu a přírodními smáčedly. Mikrodisperze je zachy45 cena na částice škrobu při sušení rozprašováním. Výsledkem je jemný prášek, jehož každá částice obsahuje mikročástice zpevněné účinné látky v amorfním, nekrystalickém komplexu. Prostředek tímto způsobem stabilizuje účinnou látku a zajistí možnost dlouhodobého skladování a schopnost kombinace s dalšími složkami, užitými jako doplňky potravy. Zejména tyto prostředky zlepšují vstřebávání nerozpustných látek po perorálním podání, takže je jimi možno zajistit při použití nízkých dávek účinné dlouhodobé léčení.

Zvýšené vstřebávání a zvýšená biologická dostupnost uvedených prostředků byla podrobena zkouškám u různých živočichů i u člověka. Bylo prokázáno, že bylo dosaženo podstatného zlepšení ve srovnání s použitím týchž látek v nezpracovaném krystalickém stavu. Při použití uvedených prostředků je tedy možno podávat nesnadno rozpustné živné látky, indukující spéci_ Ί _ fícké enzymy CYP k vyvolání rovnovážného stavu u estrogenu. Prostředky zlepšují vstřebávání některých látek z rostlin, jako je D1M, indolové látky a rostlinný flavon chrysin. Prostředky se prokázaly jako vhodné při úpravě metabolismu estrogenu při perorálním podání u savců. Bylo také prokázáno, že tyto látky vyvolávají bezpečnější metabolismus karcinogenních látek a jsou proto vhodné jako chemopreventivní prostředky.

Vynález bude podrobněji popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.

ío Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 jsou znázorněny změny koncentrace testosteronu a androstendionu v moči při podávání zpracovaného chrysinu ve srovnání s chrysinem bez dalšího zpracování.

Na obr. 2 jsou znázorněny změny koncentrace androsteronu a etiocholanolonu v moči pri podání zpracovaného chrysinu ve srovnání s podáním chrysinu bez dalšího zpracování.

Na obr. 3 jsou znázorněny změny koncentrace testosteronu a androstendionu v moči po podání zpracovaného D1M.

Na obr. 4 jsou znázorněny změny koncentrace androsteronu a etiocholanolanu v moči po podání zpracovaného DIM.

Na obr. 5 jsou znázorněny změny koncentrace metabolitů estrogenu po podání zpracovaného

DIM.

Na obr. 6 je znázorněna koncentrace DIM v plasmě v nanogramech/ml po perorálním podání 1,0 mg/kg DIM ve zpracované formě (Plex) a v krystalické formě (DDIM) u dospělého v různých dnech po dobu 5 hodin.

Na obr. 7 je znázorněna koncentrace DIM v plasmě v nanogramech/ml po perorálním podání dávky 0,5 mg/kg krystalického DIM u tří dospělých jedinců, sledování bylo prováděno 5 hodin.

Na obr. 8 je znázorněna koncentrace DIM v plasmě v nanogramech/ml po perorálním podání dávky 0,5 mg/kg krystalického DIM a sezamového oleje u tří dospělých jedinců, pozorování bylo prováděno 5 hodin.

Na obr, 9 je znázorněna koncentrace DIM v plasmě v nanogramech/ml po perorálním podání dávky 0,5 mg/kg DIM ve zpracované formě u tří dospělých jedinců, pozorování bylo prováděno

5 hodin.

Na obr. 10 je znázorněna koncentrace DIM v plasmě v nanogramech/ml po perorálním podání dávky 0,5 mg/kg DIM ve zpracované formě spolu s grapefuitovou šťávou u tří dospělých jedinců, pozorování trvalo 5 hodin.

Podstatu vynálezu tedy tvoří prostředek pro zlepšení vstřebávání vysoce nerozpustných hydrofobních fytochemických látek a jeho použití k dosažení příznivějšího metabolismu steroidních hormonu. Tohoto cíle je možno dosáhnout podáváním prostředků s obsahem látek usnadňujících vstřebávání a vyvolávajících úpravu metabolické účinnosti CYP. Prostředky jsou založeny na rozpouštění účinných látek v příslušném rozpouštědle, na přítomnosti emulgátoru, jako esteru PEG se sukcinátem vitamínu E a fosfolipidů, z uvedených složek se vytvoří mikrodisperze při použití ve vodě rozpustné matrice. Amorfní komplexy mikrodisperze uvedených látek se pak sráží společně s částicemi nosiče za sušení rozprašováním. Tyto prostředky, které obsahují účinné látky ve formě mikročástic podporují vstřebávání po rozpuštění a emulgaci v tenkém střevě člověka nebo jiných živočichů.

Přírodní indoly, například DIM nebo flavonoidy, jako chrysin, jsou příkladem látek z potravy rostlinného původu, které mají zanedbatelnou rozpustnost ve vodě, například 2,5 mikrogramů/ml pro DIM a 0,7 mikrogramů/ml pro chrysin a také minimální rozpustnost v oleji 100 mikros gramů/ml pro DIM a 50 mikrogramů/ml pro chrysin. Dalšími účinnými látkami, které je možno použít v prostředku podle vynálezu jsou lineární triindoly, jako [2—(indol—3—yImethyl)—indol—3 yl]indol-3-ylmethan, cyklické triindoly, jako 5,6,11,12,17,18- hexahydroxycyklononal[l,2-b:4,5-b':7,8-b]:triindol, lineární diindoly, jako l-(3-hydroxymethyl)indolyl-3-indoIylmethan, nebo tectochrysín, chemicky 5-hydroxy-7-methyletherflavon, nepetin, to znamená 5,3',4 -triio hydroxy-6-methoxyflavon, tangeretin, chemicky 5,6,7,8,4'-pentamethoxyflavon, třicetin, chemicky 5,7-dihydroxy-3',4',5'-trimethoxyflavon, tricin, chemicky 5,7,4'-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon, amentoflavon, pinocembrin, chemicky 5,7-dihydroxyflavanon, narigenin, chemicky 5,7,4'-trihydroxyflavanon, biochanin A, genistein, daidzein, med nebo včelí propolis.

i5 Vývoj prostředků se zlepšeným vstřebáváním při perorálním podání je nezbytný pro využití výhody příznivých účinků uvedených látek, které jsou nyní dostupné v syntetické koncentrované formě. Vzhledem jedinečným fyzikálně-chemickým vlastnostem hydrofobních fytochemíckých látek, jako jsou DIM a chrysin, byly vyvinuty nové přístupy, takže bylo možno zlepšit jejich biologickou dostupnost při perorálním podání. Vyvinuté prostředky je možno identifikovat postu20 pem zpracování, který umožňuje redistribuci nerozpustných složek do mikročástic, bohatých na smáčedla. Cílem tohoto zpracování je vytvoření pevné disperze mikročástic v matrici částic škrobu. Tyto Částice Škrobu s průměrem 10 mikrometrů obsahují mikročástice, tvořené amorfní pevnou fází směsi hydrofobních fytochemíckých látek, jako DIM nebo chrysinu se solubilizačním emulgátorem, například esterem polyethylenglykolu 1000 se sukcinátem vitamínu E, směsí esteru polyethylenglykolu se sukcinátem vitamínu E s polyethylenglykolem s molekulovou hmotností 400 až 2000, použít je možno i jiné estery polyethylenglykolu, například estery, vytvořené s mastnými kyselinami, jako kyselinou olejovou nebo stearovou, dále polyvinylpyrrolidony, polyvinylpolypyrrolidony, Poloxamer 188, Tweeny nebo Spaný nebo fosfolipidy.

Způsob zpracování využívá nového přístupu pro snížení velikosti Částic tvorbou optimalizované mikrodisperze ve vodné fázi, tato disperze se pak převede pomocí sušení rozprašováním na volně sypný prášek, který je tvořen ve vodě rozpustnou matricí, obsahující zapouzdřené mikročástice. V průběhu způsobu zpracování je upravována účinnost esterů polyethylenglykolu na zlepšení rozpustnosti pro maximální rozpouštění DIM nebo chrysinu ve směsi rozpouštědel, vhodných pro potravinářské účely, fosfolipidů a TPGS při teplotě 30 až 90 °C.

Vhodným rozpouštědlem může být hexanol, ethanol, butanol, heptanol, 2-methyl-l-pentanol, různá rozpouštědla typu ketonů, přijatelná pro potravinářské účely, jako je methylethylketon, aceton a další rozpouštědla, propylenglykol a některá esterová rozpouštědla, jako ethylacetát.

Fosfolipidy mohou zahrnovat složky lecithinu, například fosfatidylserin, fostatidylinositol a fosfatidylglycerol, fosfolipidy, odvozené od sóji, fosfolipidy tukových membrán mléčného tuku (MFGM), dioleylfosfatidylcholin, fosfatidylglycerol, dioleoylfosfatidylglycerol, dimyristoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin, fosfát idylethanolaminy, fosfatidylseriny, sfingo45 myeliny, polyglycerolestery, nebo ethoxylovaný ricinový olej. Fosfolipid se přidává ke směsi TPGS a rozpouštědla ke snížení velikosti částic dispergované fáze po smísení s vodou. Při vysokém střihovém namáhání této organické fáze dochází bud' k rozpouštění nebo ke vzniku velmi jemné suspenze DIM, chrysinu, jiných fytochemíckých látek nebo směsi fytochemíckých látek se solubilizačním emulgátorem, například TPGS a fosfolipidem.

Poměr složek ve směsi je nutno volit tak, aby stálost emulze byla co nejvyšší. Poměr TPGS k DIM nebo chrysinu by měl být v rozmezí 0,5:1 až 1,5:1, výhodný je poměr 1:1. Obsah škrobu by měl být 25 až 75 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost složek, poměr škrobu a TPGS se s výhodou pohybuje v rozmezí 0,8:1 až 1,5:1. Emulgátory, jako fosfatidylcholin nebo žlučové soli, jako cholát, deoxycholát nebo taurochlorát sodný a podobně, by měly tvořit 1 až

A

CZ 300840 Bó

10% hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost směsi, s výhodou 3 až 5 % hmotnostních. Rozpouštědlo by mělo být použito v hmotnostním poměru 0,5:1 až 5:1 k účinné složce, to znamená k chrysinu nebo DIM.

Získaná „tavenina“ extrahovaných hydrofobních složek se homogenizuje v roztoku škrobu a dalších zapouzdřujících látek v rozpouštědle na bázi vody, použít je možno například modifikovaný škrob, jako prostředek Capsul (National Starch, Inc.), dále methylcelulózu, hydroxypropylmethylcelulózu, hydroxyethylceiulózu, hydroxypropylethylcelulózu, pektin, arabskou gumu, želatinu nebo jinou polymemí matricí, která je rozpustná ve vodě a je vhodná pro sušení rozK) prašováním. V tomto stupni vzniká mikrodisperze, odolná proti spojování jednotlivých částic a uchovávající mikročástice TPGS, fosfolipidu a hydrofobní fytochemické látky, jako DIM nebo chrysinu s velikostí částic 5 mikrometrů nebo s ještě menší velikostí. Ve výhodném provedení je velikost mikročástic 2 mikrometry nebo nižší. Ve velmi výhodném provedení je velikost mikročástic 1 mikrometr nebo nižší. Při sušení rozprašováním dochází k odpaření rozpouštědla a nosič, například TPGS a fostatidylcholin se srážejí za vzniku „mikročástic“ ve větších Částicích Škrobu. Amorfní nekrystalické mikročástice jsou snadněji uvolňovány z částic škrobu po styku s tekutinou ve střevech. Mikročástice jsou kompatibilní a dochází k jejich spojování se střevními micelami obsahujícími fosfolipidy a žlučové soli.

Po sušení rozprašováním se zpevněné mikročástice současně sráženého solubilizačního emulgátoru, fosfolipidu a hydrofobní fytochemické látky získávají ve snadno emulgovatelné formě. Ve střevě dochází v důsledku přítomnosti TPGS k účinnosti typu smáčedla, která usnadni zařazení micel bohatých na fytochemickou látku do lipidových membrán enterocytů. Homogenní spojení fytochemických látek v komplexních mikročásticích s TPGS příznivě ovlivní vstřebávání střev25 ním povrchem. Jak již bylo popsáno svrchu pro diestery PEG a smáčedla ze skupiny Cremophor v publikaci Buckingham a další, Reversal of Multi-drug Resistance in Vitro by Fatty Acid - PEG Diesters, International J. of Cancer, sv. 65, s. 74-79,1996, působení TPGS na membránách může cíleně ovlivnit funkci p-glykoproteinu. TPGS a DIM pravděpodobně mají synergní účinek při inhibici účinku p-glykoproteinu, který brání vstřebávání některých látek a vyvolává vypuzení některých fytochemických látek, jako jsou indoly z enterocytů zpět do průsvitu střeva. Prostředky, připravené svrchu uvedeným způsobem, měly za následek neočekávaně vysokou biologickou dostupnost DIM. K prostředkům tohoto typuje možno přidávat také látky, specifické pro inhibici enzymatického systému CYP 3A4. Takovou složkou může být například koncentrát grapefruitové šťávy nebo sulfophoran z brokolice, o němž již bylo dříve prokázáno, že podporuje vstřebávání substrátů CYP 3A4 inhibici metabolismu sloučenin uvnitř enterocytů.

Neočekávané působení TPGS jako emulgátoru i jako inhibitoru p-glykoproteinu v kombinaci s fytochemickými látkami, které rovněž vyvolávají inhibici p-glykoproteinu a enzymů CYP 3A4 přispělo k možnosti získat prostředek s obsahem smáčedla, který stimuluje příjem uvedených látek synergním účinkem. Každý z prostředků, které budou popsány v příkladové části přihlášky, zvyšuje biologickou dostupnost hydrofobních látek z potravy kombinací tří specifických účinků:

i) příznivější zařazení do střevních micel a průnik do enterocytů působením TPGS a fosfolipidů, ii) inhibice p-glykoproteinu a tím zábrana návratu látek z potravy do průsvitu střeva kombinovaným účinkem TPGS a DIM a iii) inhibice metabolismu přiváděných hydrofobních látek působe45 ním CYP 3A4 činností současně podaného koncentrátu grapefruitové šťávy nebo fytochemické látky, jako suifophoranu nebo DIM. Vstřebané fytochemické látky se tedy dostávají do lymfatického nebo portálního oběhu ve zvýšené koncentraci ve srovnání s podáváním prostředků, připravených bez zpracování na mikročástice TPGS/fosfolipidu a bez současného podávání s inhibitorem CYP 3A4, například s koncentrátem grapefruitové šťávy nebo sulfophorany.

Způsob zpracování, který byl uveden svrchu, je možno aplikovat na čisté syntetické fytochemické látky, jako DIM a chrysin, avšak také na přírodní produkty, jako jsou koncentráty ze sojových bohů, extrakty z kopřivy Urtica dioica a na některé včelí produkty, jako propolis. V každém případě dochází v průběhu postupu k oddělení fytochemických složek rozpustných v lipidech od ve vodě rozpustných složek ve výsledném prostředku. Používá se hexanol, i n

CZ 300840 Bó propylenglykol nebo jiný systém rozpouštědel, takže dojde k oddělení látek, kompatibilních s lipidy v mikročásticích TPGS a fosfolipidů a ve vodě rozpustné látky jsou spojeny se škrobem nebo jiným nosičem tvořícím matrici výsledného prostředku. V případě kopřivy Urtica dioica se například ve vodě rozpustné lipidy, jako kyselina hydroxyoktadekanová, která je účinná proti aromatáze, oddělí do komplexu TPGS/fosfotipid, kdežto ve vodě rozpustnější fotochemické látky se spojují se Škrobovou matricí. Tímto způsobem dochází ke zlepšení biologické dostupnosti hydrofobnějších fytochemických látek.

Propolis a další včelí produkty představují přírodní produkty, v nichž jsou koncentrovány flavony io včetně chrysinu ve směsi pylových částic a rostlinných pryskyřic podle publikace Siess a další,

Flavonoids of Honey and Propolis: Characterization and effects on hepatic drug-metabolizing enzymes and benzo[a]pyrene-DNA binding in rats, J. Agric. Food Chem., 44:8, s. 2297-2301, (996. Vzhledem k tomu, že účinnost na indukci CYP je v případě propolisu vyšší než v případě extraktu flavonoidů z propolisu, byl zpracováván med s obsahem pylu, který je blízce příbuzných ís propolisu, aby bylo možno připravit výhodný prostředek svrchu uvedeného typu. V tomto případě byl přidán další stupeň, který spočíval v mletí a v rozpuštění komplexní směsi v rozpouštědle na bázi propylenglykolu, aby bylo možno dosáhnout zapouzdření mikročástic ve vodě nerozpustných ťlavonových složek spolu s TPGS. Další výhodné složky včetně kyseliny skořicové byly podobným způsobem spojeny s TPGS. Tento přístup je výhodný z toho důvodu, že chrysin nebo další výhodný flavon je možno koncentrovat pomocí včelích produktů z rostlinných zdrojů se známým obsahem flavonů, například ze slunečnic, čímž odpadá nezbytnost předběžného čištění nebo syntézy chrysinu. Prostředky s obsahem DIM a chrysinu měly velmi dobrý účinek při dosahování rovnováhy metabolismu estrogenu vzhledem ke současnému přívodu látek, které indukují CYPIA1/IA2 a současně vyvolávají inhibici aromatázy CYP.

Použití svrchu uvedených složek umožnilo přípravu potravinových doplňků, modifikujících účinnost CYP pro dosažení výhodnějšího metabolismu estrogenu u tří specifických stavů. Jde o zajištění zdravotního stavu prostaty a omezení hromadění estrogenu při stárnutí u mužů, o úpravu metabolismu estrogenu u žen k vyvolání tvorby 20H-estronu a k udržení koncentrace estrogenu a o vyvolání vysokého poměru testosteronu k estrogenu ke zlepšení fyzické kondice u sportovců.

Úprava CYP při stárnutí u mužů

Prostředek pro tento účel kombinuje účinky DIM, chrysinu a přírodního produktu z Urtica dioica na modulaci enzymů CYP k intervenci do hormonálního stavu při stárnutí u mužů, to znamená pří tzv. andropauze. Na rozdíl od tradičního pohledu na stárnutí u mužů jako pochodu, při němž se snižuje množství biologicky dostupného testosteronu by patrně bylo zapotřebí zavést názor, že stárnutí u mužů je provázeno nahromaděním estrogenu pri sníženém vylučování těchto hormonů.

Při použití prostředku podle vynálezu s biologicky dostupným DIM došlo ke zvýšení enzymů CYP, zodpovědných za metabolismus estrogenu na 20H-estron a 2-methoxyestron. Prostředkem s obsahem DIM ve spojení s biologicky dostupným chrysinem je možno snížit jak koncentraci prekurzorového hormonu androstendionu podle publikace Jellinck a další, Influence of indole carbinols and growth hormone on the metabolism of 4-androstenedione by rat liver microsomes,

J. Steroid Biochemistry and Molec. Biol., 46:6, s. 791-798, 1993, působením aromatázy CYP pak dochází k dalšímu snížení koncentrace estrogenu ve tkáních. Přidání extraktů z Urtica dioica doplní účinnost antiaromatázy ve formě kyseliny hydroxyoktadekanové a mimo to doplňuje také ve vodě rozpustnou složku, která specificky brání aktivaci estrogenu globulinem SHBG podle publikace Htyb a další, The efifect of extracts of the roots of the Stinging Nettle (Urtica dioica) on the interaction of SHBG with its receptor on human prostatic membranes. Planta Medica, 61, s. 31-32, 1995. Tyto kombinované účinky na metabolismus steroidů a na receptory snižuje stimulaci prostaty estrogeny, snižuje zvýšení syntézy SHBG působením estrogenu v játrech a zvyšuje množství biologicky dostupného testosteronu.

I

Úprava rovnováhy estrogenu u žen

Byl vyvinut prostředek, specificky určený pro použití u žen s obsahem biologicky dostupného DIM, extraktu Saw Palmetto extraktu ze zeleného čaje a koncentrátu phytoestrogenu, například koncentrátu isoflavonu ze sóji. Na rozdíl od prostředku, určeného pro použití u mužů, tato kombinace fytochemických látek pro úpravu enzymů CYP uchovává a zvyšuje hladinu estrogenů. Indukce enzymů CYP 1AI/1A2 působením DIM rovněž zajistí metabolismus estrogenu bezpečným způsobem na 20H-estron, takže se zvyšuje poměr množství 20H-estronu k 160Hestronu. Působením extraktů ze Saw Palmetto a zeleného čaje, které ještě nebyly používány jako io potravinové doplňky u žen, dochází k blokováni 5-alfareduktázy a tím k zachování koncentrace androstendionu podle publikace Liao S. a Hiipakka R. A., Biochem. Biophys. Res. Comm., 214(3): 833-38, 1995. Androstendion, odvozený přímo od DHEA, je substrátem pro aromatázu CYP a důležitým zdrojem estrogenů u starších žen. Toto nové použití Saw Palmetto u žen bez chrysinu nebo jiného inhibitoru aromatázy uchovává účinnost aromatázy CYP a udržuje estrogeny, odvozené od androgenů jako prekursoru. Použití isoflavonů ze sóji zajistí tvorbu aktivovaných metabolitů, jako jsou Equol, Daidzein a Genistein, které mají převážně estrogenní účinek. Vyšší koncentrace estrogenů a isoflavonů ze sóji podporuje mineralizaci kostní tkáně a zvyšuje produkci SHBG v játrech. SHBG u žen má také ochranný účinek na tkáň mléčné žlázy a dělohy a brání příliš vysoké stimulaci těchto tkání nevázaným estrogenem. Úpravou rovnováhy enzymů CYP takový prostředek zvyšuje bezpečnost substituční terapie (HRT) estrogeny, progesteronem a DHEA. V dalším možném provedení je možno nahradit koncentrát isoflavonu ze sóji koncentrátem lignanů, které produkuji estrogenní metabolity, enterodiol a enterolakton.

Prostředek pro zlepšení fyzické kondice

Prostředek pro zlepšení fyzické kondice a zvýšení množství svalové hmoty u sportovců byl vyvinut na bázi biologicky dostupného DIM, biologicky dostupného chrysinu, extraktu Saw Palmetto a extraktu ze zeleného čaje. Zvýšení poměru testosteronu k estrogenu bylo vyvoláno modulačním účinkem tohoto kombinovaného prostředku na enzymy CYP. Působení chrysinu spolu s extrakty ze Saw Palmetto a ze zeleného čaje zachovává koncentraci androstendionu omezením metabolismu aromatázou CYP a 5-alfareduktázou. Vyšší koncentrace androstendionu má za následek zvýšenou přeměnu této látky na testosteron, zvláště v případě, že se dále dodává DHEA a androstendion. Biologicky dostupný DIM snižuje množství estrogenu v oběhu vzhledem ke zvýšenému metabolismu na 20H-estron a 2-methoxyestron. Spolu sinhibící aromatázy působením chrysinu napomáhá DIM uchovat vylučování LH z hypofyzy vzhledem k tomu, že estrogen a aromatáza vyvolávají inhibici této sekrece. Vyšší koncentrace LH vyvolává u mužů vyšší produkci testosteronu. Touto kombinací látek v prostředku podle vynálezu je tedy možno posunout metabolismus steroidů ve prospěch zvýšeného poměru testosteronu k estrogenům ve svalových buňkách. Aby bylo možno ještě zvýšit modulační účinek na CYP, byl přidán extrakt z Urtica dioica, obsahující kyselinu hydroxyoktadekanovou, která vyvolává inhibici aromatázy.

V kombinaci s tělesným cvičením dochází tímto způsobem k anabolickému účinku a zvýšenému vývoji svalů působením chemických látek z rostlin v prostředku podle vynálezu.

Zvýšení vstřebávání účinných složek

V každém ze svrchu uvedených prostředků je ještě jako přídatná látka obsažen koncentrát grapefruitové šťávy nebo extrakt z křížatých rostlin typu zeleniny s obsahem sulfophoranu k omezení působení CYP 3A4 ve střevě ve smyslu „presystemického metabolismu“ fytochemických složek. Vstřebávání těchto látek je rovněž podporováno přítomností TPGS a DIM. Je také výhodné, podávat uvedené potravinové doplňky spolu s malým množstvím potravy, obsahující tuk. Tímto způsobem je dále podporováno vstřebávání fytochemických látek rozpustných v tucích, zvýšením tvorby chylomikronu v enterocytech. Zvýšená tvorba chylomikronů zvýší průtok do lymfatického oběhu a celkové vstřebávání účinných látek touto cestou, čímž se obejde první průchod těchto látek játry.

Možnost dalšího použití prostředku podle vynálezu u různých chorobných stavů

Použití grapefruitové šťávy, koncentrátu grapefruitové šťávy nebo koncentrovaných grapefruitů jako takových nebo v kombinaci se zkracovaným DIM, je postupem, kterým je možno léčit stavy, spojené s nerovnováhou metabolismu estrogenů, která je charakterizována převahou účinnosti estrogenů nad účinností jiných pohlavních hormonů. Tato nerovnováha může být také charakterizována zvýšením poměru 16-hydroxyestrogenu jako metabolitů k 2-hydroxyestrogenu ve srovnání s hodnotami u normální populace. Tento způsob léčení nerovnováhy v metabolismu estrogenů je vhodný zejména pro stárnutí u mužů, které je charakterizováno hromaděním estroio genů, jde například o předčasnou atherosklerózu podle publikace Phillips GB a další, Association of hyperestrogenemia and coronary heart disease in men in the Framingham cohort, American J. of Medicine 1983; 74. 863-869 a o hypertrofii prostaty podle publikace Gann PH a další, A prospective study of plasma hormone levels, nonhormonal factors, and development ofbenign prostatic hyperplasia, The Prostatě, 1995, 26: 40-49. Uvedený postup je možno využít také při is poruchách imunitního systému u mužů i žen, charakterizovaných nerovnováhou v metabolismu estrogenů, jako je systemický Lupus erythematosus podle publikace Lahita, RG, a další, increased 16-alfa-hydroxylation of estradiol in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1981; 53: 174-178. Postup se týká také poruch, spojených s nerovnováhou estrogenů u žen včetně poruch nálady, například při premenstruálním syndromu PMS, při návratných bolestech mléčné žlázy podle publikace Ashley B, Mastalgia, Lippincotts Primary Care Practice. 1989; 2(2): 189-93, a v případě stavů, spojených s infekcí lidským papilomavirem, zvláště pak u dysplasií děložního krčku podle publikace Sepkovic DW a další, Estrogen Metabolite Ratios and Risk Assessment of Hormone Related Cancers: Assay Validation and Prediction of Cervical Cancer Risk. Annals of the N. Y. Acad. of Science 1995; 768: 312-316 a také v případě návratné respirační papilomatózy podle publikace Auborn K. a další, Estrogen metabolism and laryngeal papillomatosis: A Pilot Study on Dietary Prevention. Anticancer Research, 1998, 18: 4569-4574. Stejným způsobem je možno také bránit některým poruchám, spojeným s nerovnováhou metabolismu estrogenů, zvláště u žen, jako jsou fibrocystické změny mléčné žlázy, zhoubné nádory mléčné žlázy podle publikace Bradlow HL a další, 6-alfa30 hydroxylation of estradiol; a possible risk markér for breast cancer. Annals NY Acad. Sci. 1986, 464, 138-151, a Rabat GC, a další, Urinary estrogen metabolites and breast cancer: a casecontrol study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1997 Jul; 6(7): 505-9, fibroidní nádory dělohy, zhoubné nádory endometria podle publikace Fishman, J. a další, Increased estrogen-16hydroxylase activity in women with breast and endometrial cancer. Journal of Steroid Biochem.

and Mol. Biol. 1984; 20, 1077-1081 a endometrióza. Postup se specificky týká snížení rizika zhoubných nádorů mléčné žlázy podle publikace Schneider J. a další, Abnormal oxidative metabolism of estradiol in women with breast cancer. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1982, 89: 3047-3051 a zhoubných nádorů dělohy ve spojení se substituční hormonální therapií s použitím estrogenů.

Zvýšení biologické dostupnosti jednotlivých složek a prostředků podle vynálezu bude ilustrováno následujícími příklady. Pří sledování vstřebávání bylo prokázáno, že technologie zpracování prostředku podle vynálezu zvyšuje vstřebávání DIM nebo chrysinu. Silná účinnost DIM při indikci enzymů CYP byla využita k demonstraci výhodnosti zpracovaného DIM ve srovnání s krystalickým DIM. Tento přístup byl využit u živočichů, kterým byt podáván v krmivu krystalický DIM nebo svrchu uvedeným způsobem zpracovaný DIM a pak byla přímo měřena koncentrace enzymů CYP v játrech a dalších tkáních. U člověka bylo totéž srovnání provedeno opakovaným stanovením steroidních metabolitů v moči misto přímé analýzy tkání. Vzhledem k tomu, že metabolismus steroidních látek je přímo spojen s koncentrací enzymů CYP ve tkáních a s jejich účinností, je použití koncentrace uvedených látek v moči sice nepřímé, avšak odráží měření změn účinností CYP v tělesných tkáních.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Složky prostředku pro usnadnění vstřebávání D1M nebo jiných nerozpustných indolů ze stravy Seznam složek

1. Přibližně 10 až 40% hmotnostních indolu ze stravy, zvoleného z následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: čistý diindolylmethan, tzn. 3,3-diindolylmethan, lineární triindol, ío chemicky [2-(indol-3-ylmethyl)-indol-3-yl]-indol-3-ylmethan, cyklický triindol, chemicky 5,6,11, 12,17,18-hexahydrocyklononal [ 1,2-b:4,5-b':7,8—b]:triindol a lineární diindol, tzn. l-(3hydroxymethyl)indolyl-3-indolylmethan.

2. Přibližně 10 až 40 % hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: poly15 ethylenglykol 1000 ve formě esteru sukcinátu vitamínu E, estery polyethylenglykolu se sukcinátem vitamínu E s molekulovou hmotností 400 až 2000 nebo jiné estery polyethylenglykolu, např. estery s mastnými kyselinami, jako je kyselina olejová nebo stearová, polyvinylpyrrolidony, polyvinylpolypyrrolidony, Poloxamer 188, Tweeny nebo Spaný.

3. Přibližně 5 až 20 % hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: fosfatidylcholin (odvozený od sojového lecithinu a dodávaný ve formě prostředku Phospholipon 50G, Rhone Pouleno Rorer), dioleoylfosfatidylcholin, fosfatidylglycerol, dioleoylfosfatidyglycerol, dimyristoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin, fbsfatidylethanolaminy, fosfatidylseriny nebo sfingomyeliny nebo jiné zdroje fosfolipidu, například globulámí částice mléčného tuku z membrán, glycerolestery, polyglycerolestery nebo ethoxylovaný ricinový olej.

4. Přibližně 15 až 30% hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: hexanol, ethanol, butanol, heptanol, 2-methyl-I-pentanol, různá rozpouštědla typu ketonů, vhodná pro potravinářské účely, jako methylethylketon, aceton a podobně, propylenglykol a některá rozpouštědla typu esterů, jako ethylacetát.

5. Přibližně 20 až 40 % hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: modifikovaný škrob, například prostředek Capsul (National Starch, lne.), methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, hydroxyethylcelulóza, hydroxypropylethylcelulóza, pektin, arabská guma, želatina nebo jiné polymemí látky, vytvářející matrici se známým použitím, rozpustné ve vodě a vhodné pro sušení rozprašováním.

6. Přibližně 0,5 až 35 % hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: aerosil 200 nebo jiná látka, zvyšující sypnost na bázi oxidu křemičitého nebo příbuzné soli se známým použitím.

Příklad 2

Způsob výroby zpracovaného D1M, „p-DIM“ po jednotlivých stupních

1. 6,75 kg TPGS se zahřeje těsně nad teplotu tání za stálého míchání v zahřívané nádobě, označované jako první nádoba.

2. 9,38 kg hexanolu a 9,83 kg D1M, mletého v tryskovém mlýnu, se přidá do první nádoby a směs se míchá pří teplotě 70 °C až do vzniku homogenní suspenze. Pak se přidá 1,4 kg fosfatidylcholinu.

3. Ve druhé větší nádobě se pomocí lopatkového míchadla smísí 185 I vody a 10,7 kg škrobu.

Směs se neutralizuje na pH 7 přidáním malého množství uhličitanu sodného a pak se zahřeje na 75 °C a při této teplotě se 1 hodinu míchá.

Λ

4. Obsah první nádoby se přidá ke škrobu ve druhé větší nádobě a směs se důkladně promísí homogenizátorem s rotorem a statorem při mírné rychlosti po dobu 15 minut.

5. Směs ze stupné 4 se suší rozprašováním po přidání malého množství přibližně 0,5 % hmotnostních hydrofilního oxidu křemičitého, čímž se získá volně sypný prášek jemně dispergovaných mikročástic, které obsahují společně vysrážený TPGS, fosfatidylcholin a DIM v amorfní nekrystalické struktuře.

io 6. Sypný práškový povrch se uloží do evakuovaných sáčků z folie po odvzdušnění a propláchnutí dusíkem.

7. Při analýze přítomnosti nezměněné účinné složky bylo prokázáno 30 až 35 % hmotnostních DIM.

8, DIM, připravený způsobem podle příkladu 2, bude dále uváděn jako zpracovaný DIM nebo p-DIM,

Pro účinné léčení se svrchu uvedený prostředek podává savcům v dávce přibližně 1,5 až

12 mg/kg denně perorálně. Toto podávání účinně zajistí rovnováhu metabolismu estrogenů posunem ve prospěch 2-hydroxyestronu a 2-methoxyestronu.

Příklad 3

Složky prostředku pro zlepšení vstřebávání chrysinu nebo jiných flavonoidů Seznam složek:

1. Čistý flavon, flavonol, flavanon, isoflavon, dimer flavonu v mikrokrystalické formě (přibližně 10 až 40 % hmotnostních) ze skupiny chrysin, apígenin, kafr, kvercetin, morin, naringenin, genistein, biochanin A, diadzein, amentoflavon, ginkgetin, isoginkgetin.

2. Přibližně 10 až 40 % hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci. Ester polyethylenglykolu 1000 se sukcinátem vitamínu E, estery polyethylenglykolu s molekulovou hmotností 400 až 2000 se sukcinátem vitamínu E, další estery polyethylenglykolu, vytvořené například s mastnými kyselinami, jako kyselinou olejovou nebo stearovou, polyvinylpyrrolidony, polyvinylpolypyrrolidony, Poloxamer 188, Tweeny nebo Spaný.

3. Přibližně 5 až 20 % hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: fosfatidylcholin (odvozený od sojového lecithinu a dodávaný ve formě prostředku Phosphoiipon 50G,

Rhone Pouleno Rorer), dioleoylfosfatidylcholin, fosfatidylglycerol, dioleoylfosfatidyglycerol, dimyristoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin, fosfatidylethanolaminy, fosfatidylseriny nebo sfingomyeliny nebo jiné zdroje fosfolipidů, například globulární částice mléčného tuku z membrán, glycerolestery, polyglycerolestery nebo ethoxylovaný ricinový olej.

4. Přibližně 15 až 30 % hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: hexanol, ethanol, butanol, heptanol, 2-methyl-l-pentanol, různá rozpouštědla typu ketonů, vhodná pro potravinářské účely, jako methylethylketon, aceton a podobně, propylenglykol a některá rozpouštědla typu esterů, jako ethylacetát.

so 5. Přibližně 20 až 40 % hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: modifikovaný škrob, například prostředek Capsul (National Starch, lne.), methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, hydroxyethylcelulóza, hydroxypropylethylcelulóza, pektin, arabská guma, želatina nebo jiné polymemí látky, vytvářející matrici se známým použitím, rozpustné ve vodě a vhodné pro sušeni rozprašováním.

« e

CZ 300840 Bó

6. Přibližně 0,5 až 35% hmotnostních následujících složek jednotlivě nebo v kombinaci: aerosil 200 nebo jiná látka, zvyšující sypnost na bázi oxidu křemičitého nebo příbuzné soli se známým použitím.

Příklad 4

Příprava prostředku pro zlepšení vstřebávání chrysinu (p-chrysin) v jednotlivých stupních io 1. 6,5 kg TPGS se zahřeje těsně nad teplotu tání za míchání v zahřívané první nádobě.

2. 19,5 kg propylenglykolu a 7,5 kg chrysinu, mletého v tryskovém mlýnu, se přidá do první nádoby a směs se míchá při teplotě 80 °C až do vzniku homogenní suspenze. Pak se přidá 0,5 kg fosfatidylcholinu.

3. Ve druhé větší nádobě se důkladně promísí pomocí lopatkového míchadla 75 1 vody a 9,5 kg škrobu. Pak se přidá I kg deoxycholátu sodného, který se promísí s vodou a škrobem. Výsledná směs se neutralizuje na pH 7 přidáním malého množství uhličitanu sodného, načež se zahřeje na 75 °C a ještě jednu hodinu míchá.

5. Směs ze stupně 4 se suší rozprašováním po přidání malého množství přibližně 0,5 % hmot25 nostních hydrofilního oxidu křemičitého, čímž se získá volně sypný prášek jemně dispergovaných mikročástic, které obsahují společně vysrážený TPGS, fosfatidylcholin a chrysin v amorfní nekrystalícké struktuře.

6. Sypný práškový povrch se uloží do evakuovaných sáčků z folie po odvzdušnění a propláchnutí dusíkem.

7. Analýza přítomnosti nezměněné účinné látky prokázala 25 až 30 % hmotnostních chrysinu.

Chrysin, připravený způsobem podle příkladu 4 bude dále uváděn jako zpracovaný chrysin nebo p-chrysin.

Prostředek se podává živočichům v přibližné dávce 3 až 30 mg/kg denně perorálně a upravuje rovnováhu metabolismu estrogenů omezením účinnosti aromatázy CYP. Tímto způsobem se snižuje přeměna androstendionu na estrogeny.

Příklad 5

Výroba prostředku pro zlepšení vstřebávání s obsahem včelího medu s pylem

Včelí med s pylem byl získán od C. C. Polen Co., Phoenix, Arizona, a byl použit místo čistého chrysinu při přípravě zpracovaného chrysinu. Výchozí materiál byl mlet za vlhka ke zmenšení velikosti částic a k rozrušení pylových zrn. Od tohoto okamžiku byl materiál zpracováván naprosto stejným způsobem, jako čistý chrysin. Med s pylem, připravený způsobem podle příkladu 4 se označuje jako zpracovaný med s pylem nebo p-med s pylem.

Pro účinné léčení se svrchu uvedený prostředek savcům podává v přibližné dávce 5 až 30 mg/kg denně perorálně. V těchto dávkách je prostředek účinný pro indukci enzymů CYP v játrech a zvláště pro inhibicí aromatázy CYP.

I f

Příklad 6

Příprava prostředku pro zlepšení vstřebávání s obsahem kombinace zpracovaného DIM, zpraco5 váného chrysinu, LFrtica dioica a koncentrátu grapefruitu pro zlepšení zdravotního stavu u mužů a pro zachování normálních poměrů prostaty.

Postupuje se svrchu uvedeným způsobem, čímž se připraví následující složky v suchém stavu, které se smísí v následujících množstvích spolu s vhodnými pomocnými látkami, pojivý a ío prostředky pro zvýšení sypnosti pro plnění do kapsli nebo pro výrobu tablet.

p-DIM p-chrysin extrakt Urtica dioica i s koncentrát grapefruitové šťávy

150 až 300 mg 300 až 1500 mg 300 až 600 mg 300 až 600 mg

Svrchu uvedený prostředek může být připraven také ve formě gelových globulí při přidání pygeum africanum, lycopenu, vitamínu D a zínečnatých solí ve formě suspenze ve vhodném nosiči, například v oleji z tykvových semen.

Pro účinné léčení se podává jednou denně 1 až 3 tablety nebo kapsle perorálně.

Příklad 7

Příprava prostředku s kombinací zpracovaného DIM, koncentrátu isoflavonu ze sóji, koncentrátu Saw Palmetto, koncentrátu ze zeleného čaje a koncentrátu grapefruitu pro zlepšení hormonální rovnováhy u žen

Dále bude popsán způsob výroby prostředku, obsahujícího kombinaci p-DIM, koncentrátu fytoestrogenu a koncentrátu grapefruitové šťávy, prostředek je vhodný pro zachování správné funkce mléčné žlázy a děložní tkáně.

Složky:

1. Koncentrát fytoestrogenu se připraví z koncentrovaného extraktu sojových bobů, který obsahuje isoflavony genistein, daidzein a lignany ve významnějším množství, použije se vhodný způsob extrakce. Obvykle se užívá extrakce zředěnou zásadou, tímto způsobem se připravuje například běžně dodávaný výrobek Genista (Natus lne.).

2. Připraví se částicový prostředek s obsahem p-DIM, koncentrátu fytoestrogenu, extraktu ze zeleného čaje a koncentrátu grapefruitové Šťávy tak, že se smísí následující složky v suchém stavu v uvedeném množství spolu s vhodnými pomocnými látkami, pojivý a látkami pro zlepšení sypnosti a výsledná směs se plní do kapslí nebo se zpracuje na tablety.

p-DIM koncentrát fytoestrogenu extrakt ze zeleného čaje koncentrát Saw Palmetto koncentrát grapefruitové šťávy

150 až 300 mg 300 až 600 mg 300 až 600 mg 300 až 600 mg 200 až 1000 mg

K léčebným účelům se podává perorálně 1 až 6 kapslí nebo tablet denně.

Příklad 8

Příprava prostředku pro zlepšení vstřebávání s obsahem kombinace zpracovaného DIM, zpracovaného chrysinu, koncentrátu Saw Palmetto, koncentrátu zeleného čaje, koncentrátu Urtica dioica a koncentrátu grapefruitové šťávy pro zlepšení fyzické kondice

Při přípravě prostředku s obsahem p-DIM, p-chrysinu a Urtica dioica se misi následující suché složky v uvedených množstvích v suchém stavu spolu s vhodnými pomocnými látkami, pojivý a látkami pro zlepšení sypnosti a výsledná směs se plní do kapslí nebo se zpracovává na tablety.

P-DIM p-chrysin koncentrát Saw Palmetto (4:1) extrakt Urtica dioica extrakt ze zeleného čaje koncentrát grapefruitové šťávy

150 až 300 mg 300 až 1500 mg 300 až 600 mg 300 až 600 mg 300 až 600 mg 300 až 600 mg

Při léčebných postupech se perorálně podává 1 až 6 kapslí nebo tablet denně spolu s maiým množstvím potravin s obsahem tuku a vodou.

Příklad 9

Průkaz zlepšeného vstřebávání p-DIM u živočichů

Zlepšení vstřebávání DIM po zpracování této látky mikrozapouzdřením za vzniku p-DIM bylo prokazováno v pokusu na krysách. Dospělé krysy, samci i samice kmene Sprague Dawley dostávaly krystalický DIM nebo zpracovaný DIM. Po třech dnech byly krysy usmrceny a byla odebrána játra. Po izolaci mikrosomů z jater bylo stanoveno množství enzymů CYP metodou Western Blot a bylo prokázáno, že množství CYP 1A1/1A2 je přibližně až 11,4krát vyšší po podávání p-DIM než po podávání krystalického DIM. Pokus byl prováděn následujícím způsobem:

Skupiny krys Sprague-Dawley dostávaly žaludeční sondou krystalický DIM nebo p-DIM ve formě suspenze v methylcelulóze v dávce 100 mg/kg ve třech po sobě následujících dnech. Po usmrcení byla játra promyta fyziologickým roztokem chloridu sodného a zpracována k izolaci mikrosomální frakce. Indukce enzymu byla v mikrosomech měřena současně s protilátkami proti enzymům typu cytochromu CYP a spolu se specifickými enzymy CYP 1A1/1A2. Výsledky byty vyjádřeny v % kontrolní hodnoty. Při stanovení CYP 1A1/1A2 bylo možno pozorovat 3,9ná$obné zvýšení v případě p-DIM ve srovnání s krystalickým DIM u samců a i l,4násobné zvýšení pro p-DIM ve srovnání s krystalickým DIM u samic.

Stanovení cytochromů prostředek s obsahem DIM

I. CYP celkem (nmol/mg proteinu) krystalický p-DIM % kontrolní hodnoty (p-DIM a krystalický DIM)

140 % (samci)

224 % (samci, 1,6krát)

II

CYP 1A1/1A2 (densitometrické jednotky) krystalický p-DIM krystalický p-DIM

462 % (samci)

1.831 (samci, 3,9krát) 232 % (samice)

2.663 % (samice, 1 l,4x)

Příklad 10

Průkaz nezbytnosti použití DIM ve zpracované formě pro zvýšení biologické dostupnosti 5 u živočichů

Byl proveden další pokus k průkazu výhodnosti zapouzdření pro vstřebáváni účinných složek.

Byla srovnávána biologická dostupnost zpracovaného DIM ve srovnání s dostupností krystal ického DIM, podávaného současně s izolovanými částicemi TPGS/fosfatidylové látky tak, aby io bylo možno prokázat nutnost zapouzdřeni k dosažení lepšího vstřebávání. Ke zjištění zlepšené biologické dostupnosti byla opět sledována indukce enzymu CYP jako biologický markér.

V průběhu pokusu byla srovnávána indukce enzymů u krysích samic po podání krystalického

DIM, Í3C a zpracovaného DIM v příslušných dávkách v krmivu. Pak byla měřena koncentrace ií CYP IAI/1A2 a 1B1 v děloze a v jatemích mikrosomech jako koncový bod příjmu a známka biologické dostupnosti.

K pokusu bylo použito 30 krysích samic kmene Sprague-Dawley s hmotnosti přibližně 200 g.

Pokus byl proveden následujícím způsobem:

1. Krysy byly aklimatizovány 5 až 7 dnů v klecích po skupinách, jako krmivo bylo podáváno minimální krmívo AIN76A.

2. 3 dny bylo podáváno totéž krmivo, k němuž bylo přidáno 7 různých kombinací indolů.

3. Přibližně desátého dne byly krysy usmrceny a byla izolována játra a dělohy po propláchnutí břišních orgánů k odstranění krve.

4. Orgány byly zpracovány k získání mikrosomální frakce, bohaté na enzymy CYP.

5. ímunoblotovou metodou byla stanovena koncentrace specifických enzymů CYP standardním způsobem při použití existujících protilátek proti CYP.

Zkouškám byly podrobeny mikrosomy z následujících skupin:

Skupina 1.	N 3	Krmivo pouze AIN76A	Přísada/účel neg.
Kontroly
2.	3	pouze AIN76A	poz.
Kontrola/TCDD	(dioxin) sondou
3.	3	DIM 2 mg/kg/den	krystalický DIM
4.	3	DIM 10 mg/kg/den	krystalický DIM
5.	3	p-DIM 6,8 mg/kg/den	srovnání DIM
6.	3	p-DIM 34 mg/kg/den	srovnání DIM
7.	3	13C 5 mg/kg/den	srovnání I3C
8.	3	I3C 25 mg/kg/den	srovnání I3C
9.	3	placebo TPGS 34 mg/kg/den	ověření TPGS
10.	3	TPGS 6,8 mg/kg/den a DIM 2 mg/kg/den

Hmotnost orgánů byla zjištěna při nekropsii. Pak byla srovnávána koncentrace specifických enzymů CYP podle standardizovaných densitometrických jednotek. Výsledky prokázaly zcela zřejmou výhodnost zpracovaného DIM ve srovnání s krystalickým DIM pří současném podávání s TPGS. Výsledky, vyjádřené v densitometrických jednotkách a prokazující příjem indolu a so stupeň indukce enzymů, jsou uvedeny v následujících skupinách.

Π

Skupina N 1. 2.	3 3	Forma DIM Densitometrické jedn.
kontrola TCDD (dioxin) pozitivní kontrola	0 251,7
3.	3	DIM 2 mg/kg/den	0
4.	3	DIM 10 mg/kg/den	0
5.	3	p-DIM 6,8 mg/kg/den	0
6.	3	p-DIM 34 mg/kg/den	38,2
7.	3	13 C 5 mg/kg/den	0
8.	3	I3C 25 mg/kg/den	5,1
9.	3	placebo TPGS 34 mg/kg/den	0,8
10.	3	krystalické TPGS a DIM	2,5

Vzhledem k tomu, že p-DIM odpovídá 34 % hmotnostním krystalického DIM, byl ve skupině 4 podáván ekvivalent DIM v mg, totéž platí pro skupinu 6.

Výsledky prokazují zvýšení biologické dostupnosti p-DIM ve srovnání s krystalickým DIM a nezbytnost přítomnosti DIM ve zpracované mikroěásticové formě, jaká se nachází v p-DIM pro dosažení této zvýšené biologické dostupnosti.

Příklad 11

Průkaz nezbytnosti přítomnosti DIM ve zpracované formě pro zvýšení biologické dostupnosti u člověka

Vzhledem k tomu, že účinek indolů ve stravě na indukci CYP se přímo odráží ve změnách metabolismu estrogenů, je možno prokázat tyto změny odebíráním moči a její kvantitativní analýzou na přítomnost klíčových metabolitů působení enzymů CYP. Tento přístup byl vyvinut firmou Immunacare, lne. Byl využit zkušební balíček Estratest typu imunologické zkoušky ELISA pro 20H a 160H estron v moči tak, aby bylo možno prokázat biologickou dostupnost p-DIM. Uvedenou zkouškou je možno kvantitativně stanovit 20H estron a 160H estron v ng/ml v první ranní moči. Jde o metabolity, které vznikají působením cytochromu 1A1/1A2. Ze získaného kvantitativního stanovení se vypočítá poměr 20H/160H. Estratest byl poprvé použit k průkazu zvýšené biologické dostupnosti p-DIM ve srovnání s dostupností krystalického DIM u člověka po průkazu této skutečnosti u živočichů. Krystalický DIM nebo p-DIM byl podáván pokusným osobám různou dobu v různých dávkách. Před podáváním a po něm byla sbírána moč, která byla analyzována zkouškou ELISA na množství a poměr 20H estronu a 160H estronu. Jde o metabolity, vznikající působením enzymů CYP 1A1/1A2. Výsledky prokázaly zřetelné zvýšení poměru 20H/160H.

40 Pokusná osoba	Dávka DIM % zvýšení 20H/160H	Forma DIM
D. F.	100 mg/den 0%	krystalický
M. Z.	300 mg/den	krystalický
45	0%
D. F.	50 mg/den 38%	p-DIM
M. Z.	200 mg/den 71 %	p-DIM

Mimo to je možno prokázat v případě indukce enzymu indukci při prokazatelně nižších dávkách zpracovaného DIM v případě jeho podávání po dobu nejméně 1 týdne, jak je možno prokázat poměrem 20H/I60H před podáváním a po podání účinné látky. Tato studie v závislosti dávky na účinku potvrdila biologickou dostupnost zpracovaného DIM při perorálním podání v dávkách nižších než 1 mg/kg tělesné hmotnosti vzhledem k tomu, že rada pokusných osob měla hmotnost vyšší než 70 kg. Výsledky prokazují biologickou dostupnost zpracovaného DIM v dávkách, které jsou nižší než dávky, které byly použity u pokusných zvířat, kde bylo použito dávky 1 mg/kg DIM v kukuřičném oleji. Tyto výsledky tedy podporují zvýšení biologické dostupnosti při s podávání p-DIM ve srovnání s podáváním krystalického DIM.

	Pokusná osoba	Dávka DIM % poměru 20H/160H	Forma DIM
I0	E. C.	300 mg/den 235 %	p-DIM
	M. W.	200 mg/den 67%	p-DIM
	C.C.	200 mg/den 39%	p-DIM
I5	K. K.	100 mg/den 318 %	p-DIM
	S.S.	100 mg/den 15%	p-DIM
20	P. S.	100 mg/den 40%	p-DIM
	E. Z.	75 mg/den 4%	p-DIM
	M. F.	75 mg/den 4%	p-DIM
25	K. W.	75 mg/den 79%	p-DIM
	M. W.	50 mg/den 66%	p-DIM
30	Η, B.	50 mg/den 37%	p-DIM
	M. S.	50 mg/den 158%	p-DIM
	K. D.	25 mg/den 45%	p-DIM
35	M. W.	25 mg/den 36%	p-DIM

Příklad 12

Průkaz zvýšeného vstřebávání při podání zpracovaného chrysinu

Všechny druhy steroidní metabolitů, které jsou vylučovány močí, je možno identifikovat a kvantitativně stanovit plynovou chromatografii, spojenou s hmotovou spektrometrií. K rozštěpení steroidních glukuronidových metabolitů, a tím k vytvoření „profilu steroidní metabolitů“ bylo použito standardizovaného předběžného štěpení s použitím enzymu glukuronidázy. Tento postup byl použit k průkazu posunu v metabolismu estrogenů po doplněni stravy biologicky dostupným chrysinem a chrystinem v kombinaci s biologicky dostupným DIM. Bylo provedeno sledování na pokusných osobách k průkazu zlepšení vstřebávání při podání zpracovaného chrysinu. V průběhu jediného dosud provedeného a zveřejněného pokusu průkazu biologické dostupnosti flavonoidů při perorálním podání nebylo možno prokázat žádnou absorpci těchto látek.

Aby bylo možno sledovat biologickou dostupnost chrysinu ve formě mikročástic s obsahem TPGS a fosfatidylcholinu (zpracovaný chrysin), byly odebírány ve 24 hodinách vzorky moči ve třech časových intervalech. Mimo to byla sbírána celých 24 hodin veškerá moč. Tyto odběry byly

nejprve zkoumány bez jakéhokoliv přídavku. Druhé sledování bylo provedeno po 1 týdnu podávání 500 mg mikrokrystalického chrysinu denně, třetí sledování bylo prováděno po dalším týdnu, v němž bylo podáváno 500 mg zpracovaného chrysinu denně. Analytický postup pro stanovení profilu estrogenů a androgenů v moči bylo založeno na kapilární plynové chromato5 grafit, spojené s hmotovou spektrometrií, GC/MS podle publikace Johannessen, D, C., Adiecreutz, H., Fotssi, T., a Lonning, P. E., Plasma and urinary oestrogens in brest cancer patients on treatment with 4-hydroxyandrostenedione, British, J. of Cancer, 68, s. 393-398, 1993. Byly stanoveny následující steroidní metabolity v moči: androstendion, testosteron, etiocholanolon a androsteron.

io

Výsledky uvedených pokusů jsou shrnuty na obr. 1 a 2, kde je možno pozorovat zvýšené vylučování metabolitů typu androgenu po použití zpracovaného chrysinu, avšak nikoliv po použití mikrokrystalického chrysinu. To je v souladu se zvýšeným příjmem zpracovaného chrysinu, sníženou přeměnou androstendionu na estron působením aromatázy a zvýšením produkce testosteronu v důsledku inhibice aromatázy.

Příklad 13

Průkaz příznivého vlivu zpracovaného DIM na metabolismus steroidů u člověka

Při použité plynové chromatografie a hmotové spektrometrie byl proveden pokus na lidských dobrovolnicích k průkazu účinku zpracovaného DIM na steroidní metabolity v moči. Byl vždy odebírán 24hodinový vzorek moči před podáním zpracovaného DIM po dobu jednoho týdne v dávce 200 mg denně, což odpovídá dávce 70 mg čistého DIM denně. Vzorky moči byly analyzovány technikou GC/MS, tak jak je popsáno v příkladu 12. Na obr. 3 a 4 jsou znázorněny výsledky pro 2 pokusné osoby, které prokazují zvýšené vylučování androgenů a metabolitů androgenů, což je známkou vyšší koncentrace testosteronu, androstendionu, androsteronu a etiocholanolonu.

U třetí pokusné osoby byl účinek zpracovaného DIM na metabolismus estrogenů sledován stejným způsobem. Nejprve byla odebrána moč ve 24hodinovém vzorku, druhý odběr byl proveden po dvou týdnech doplněním stravy zpracovaným DIM v dávce 200 mg denně, což odpovídá 70 mg čistého DIM denně. Výsledky, které jsou znázorněny na obr. 5 prokazují posun v metabolítech estrogenů ve prospěch tvorby 2-methoxyestronu.

Tyto kvantitativní analýzy vylučování steroidních metabolitů před a po podání účinných látek prokazují výsledky, jejichž příčinou je podání zpracovaného DIM a které jsou průkazem zlepšené biologické dostupnosti této látky ve srovnání s nezpracovaným DIM. Zpracovaná fytochemická látka indukcí hydroxylace estrogenů a inhibicí aromatázy vyvolává charakteristický posun steroidních metabolitů v močí.

Příklad 14

Sledování biologické dostupnosti DIM v krevní plazmě při použití GC/MS

Ke stanovení biologické dostupnosti zpracovaného DIM u člověka při perorálním podání bylo vyvinuto stanovení této látky a jejího monohydroxylovaného metabolitů v krevní plazmě plynovou chromatografií, spojenou s hmotovou spektrometrií. Postup je založen na známém hmotovém spektru DIM a byl potvrzen předběžným sledováním standardního DIM a známého metabolitů DIM identifikovaného v séru krys po perorálním podání uvedené látky.

Zlepšené vstřebávání zpracovaného DIM při perorálním podání

Jak již bylo uvedeno svrchu, byla použita pro sledování biologické dostupnosti krystalického DIM ve srovnání se zpracovaným DIM plynová chromatografie ve spojení s hmotovou spektra metrií. V dávce 1 mg DIM/kg je možno prokázat zvýšený příjem DIM po jeho zpracování. Výsledky, znázorněné na obr. 6 prokazují vrchol vstřebávání pro DIM 120 minut po perorálním podání. Plocha pod křivkou se dramaticky zvětšuje pro prostředek s obsahem zpracovaného DIM. Při podání krystalického DIM dojde pouze ke vstřebání stop DIM v obdobném časovém intervalu. Dramatické zvýšení plochy pod křivkou po perorálním podání zpracovaného DIM ve srovnáni s podáním krystalického DIM perorálně prokazuje výhody zpracování DIM. Perorální podání denní dávky 1 mg/kg je přitom doporučenou dávkou pro dlouhodobé podání DIM jako potravinového doplňku.

io Druhý pokus byl proveden na třech pokusných osobách za účelem srovnáni příjmu DIM z krystalického stavu ve srovnání s prostředkem s obsahem zpracovaného DIM. Tento pokus byl proveden s polovinou svrchu uvedené dávky, to znamená 0,5 mg/kg denně. Aby bylo možno srovnávat biologickou dostupnost DIM, byiy obě dvě formy této látky sledovány u týchž tři osob v různých dnech. Ve dni 1 byl podán krystalický DIM s vodou, výsledky jsou uvedeny na obr, 7. is Ve dni 2 byl podán krystalický DIM s 15 ml sezamového oleje, výsledky jsou uvedeny na obr. 8. Ve dní 3 byl podán zpracovaný DIM s vodou, výsledky jsou znázorněny na obr. 9. Ve dni 4 byl podán zpracovaný DIM spolu s grapefruitovou šťávou GFJ, výsledky jsou uvedeny na obr. 10. Z výsledků je zřejmý dramatický vzestup biologické dostupnosti DIM po jeho zpracování a také zvýšené vstřebávání zpracovaného DIM v kombinaci s GJF, toto vstřebávání je vyšší než vstřebávání samotného zpracovaného DIM.

Zřejmou výhodu použití zpracovaného DIM ve smyslu zlepšeného vstřebávání a přetrvávání koncentrace DIM v krvi je možno pozorovat srovnáváním výsledků ve dni 1 (krystalický DIM) a ve dni 2 (krystalický DIM v sezamovém oleji) s výsledky ve dni 3 (zpracovaný DIM). Při srovnání dne 3 (zpracovaný DIM) a dne 4 (zpracovaný DIM a GFJ) je možno srovnávání zjednodušit srovnáním plochy pod křivkou AUC pod křivkami pro koncentraci uvedené látky v krvi. Dále je uvedeno shrnutí těchto výsledků.

Subjekt č.	Plocha pod křivkou AUC ng/ml x minuta	Průměrná koncentrace ng/ml
	zpracovaný DIM	zpracovaný DIM + GFJ	zpracovaný DEM	zpracovaný DIM + GFJ
1T.K.	12.647,2	14.765,4	42,12	49,22
2M. Z.	3.835,7	7.423,7	12,79	35,10
3B.H.	6.523,6	10.906,6	21,75	3636

Pokusná osoba

T. K.

M.Z.

B. H.

průměr zvýšení % zvýšení AUC, GFJ + zpracovaný DIM ve srovnání se zpracovaným DIM zvýšení 17 % zvýšení 93 % zvýšení 67 %

59%

Jak již bylo uvedeno, dochází k usnadněnému vstřebávání při současném podání DIM a GFJ. Tato interakce ještě nebyla popsána. Dochází ke statisticky významnému účinku při průměrném vzestupu AUC 59 %. Tento účinek napomáhá upravovat metabolismus steroidů usnadněním systemické odpovědi na DIM a navíc účinkem GFJ, takže výsledkem je zvýšení 2-hydroxylace estrogenů, popsané v příkladu 15.

Příklad 15

Zvýšení úpravy metabolismu steroidú u člověka po podání grapefruitové šťávy

Grapefruitová šťáva GFJ, o níž je známo, že zvyšuje vstřebávání různých nesnadno vstřebatel5 ných látek svou inhibici složek CYP 3A4 rovněž přispívá k příznivé úpravě metabolismu steriodů specifickým účinkem na tento metabolismus. Bylo zjištěno, že při podávání GFJ denně po dobu dnů dochází k významnému posunu metabolismu estrogenů ve prospěch 2-hydroxymetabolitů podobně jako při podávání zpracovaného DIM, Tento překvapující účinek byl prokázán u čtyř dobrovolníků při použití zkušebního balíčku Estratest pro stanovení 20H a I60H metabolitů io estrogenů v moči. Zkouška byla prováděna na vzorcích první ranní moči, odebrané před pokusem a po pětidenním podávání zmražené GFJ třikrát denně, šlo o rekonstituovanou zmrazenou grapefruitovou šťávu Minuté Maid v množství 2,5 dl. Dále jsou shrnuty získané výsledky.

Pokusná osoba 15 K. K.

M. W.

B. S.

J.L.

% zvýšení 20H/I60H zvýšení 1.613 % zvýšení 273 % zvýšení 236 % zvýšení 516 %

Na základě těchto výsledků je možno uzavřít, že při použití GFJ je možno dále zlepšit výsledný účinek ve srovnání s použitím zpracovaného DIM. Uvedeným způsobem je tedy možno dosáhnout příznivého zvýšení 2-hydroxyestrogenu jako metabolitů. Účinek grapefruitové šťávy je nezávislý na účinku ostatních složek a znamená zlepšení vstřebávání navíc v případě použití nesnadno rozpustných látek.

Je tedy možno uzavřít, že byla popsána nová technologie, která umožňuje perorální podání nově syntetizovaných přírodních látek jako potravinových doplňků. Prostředky podle vynálezu jsou zcela nové a znamenají podstatný technický pokrok vzhledem k tomu, že až dosud nebyl k dispozici žádný prostředek, který by umožnil podání DIM nebo chrysinu v dostatečném množ30 ství. Nové prostředky podle vynálezu překonávají problémy, spojené s nízkou rozpustností přírodních látek. Při jejich použití je možno žádoucím způsobem upravovat metabolismus steroidú u savců, Při výrobě nových prostředků podle vynálezu se vytváří mikrodisperze účinných látek. Technologie tvorby mikrodisperze byla zdokonalena tak, že nyní je možno vytvářet menší a stálejší mikročástice DIM a dalších fytochemických látek. Byt tedy připraven nový systém pro zlepšení vstřebávání různých, ve vodě málo rozpustných živin nebo léčiv pri perorálním podání. Mimo to se využívá nového účinku grapefruitové šťávy. Tato šťáva má zcela neočekávaně schopnost výhodným způsobem měnit poměry metabolitů estrogenů. Tímto způsobem je tedy možno využít grapefruitovou šťávu a/nebo zpracovaný DIM k léčení chorob, chorobných stavů nebo poruch, charakterizovaných nízkým poměrem metabolitů 2-hydroxyestrogenu k

16-hydroxyestrogenu.

Vynález byl popsán v souvislosti se specifickými provedeními v jednotlivých příkladech, je však zřejmé, že by bylo možno navrhnout řadu funkčně ekvivalentních provedení, rovněž spadajících do rozsahu vynálezu. Takové modifikace může připravit každý odborník. Je tedy zřejmé, že vynález nemůže být omezen na provedení, popsaná v příkladové části přihlášky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby prostředku s obsahem fytochemické sloučeniny, vyznačující se tím, že se:

Λ

a) zahřeje jedna nebo větší počet solubilizačních emulgačních látek ze skupiny esteru polyethylenglykolu se sukcinátem vitamínu E, polyvinylpyrrolidonu, polyoxyethylenstearátu, cholátu sodného, deoxycholátu nebo taurocholátu sodného;

b) k produktu z kroku a) se přidá rozpouštědlo a smáčedio typu fosfolipidu zvoleného ze

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že rozpouštědlo se volí ze skupiny, kterou tvoří hexanol, ethanol, butanol, heptanol, 2-methyl-l-pentanol, methylethylketon, aceton, propylenglykol, a ethyl-acetát.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že velikost částic je 2 mikrometry

25 nebo nižší.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že velikost Částic je l mikrometr nebo nižší.

30 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako indol se použije diindolylmethan.

5 f) výsledná směs se suší rozprašováním za vzniku pevného prostředku s obsahem hydrofobní fytochemické látky.

5 skupiny, kterou tvoří fosfatidylcholin, dioleoylfosfatidylcholin, fosfatidyiglycerol, dioleoylfosfatidyl glycerol, dimyristoylfosfatidylcholín, dipalmitoylfosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin, fosfatidylserin a sfingomyeiín za vzniku roztoku;

c) v roztoku ze stupně b) se rozpustí jedna nebo více hydrofobních fytochemíckých látek ze skupiny indolů a flavonoidů, přičemž indoly jsou zvolené ze skupiny, kterou tvoří díindolylio methan, lineární triindol, cyklický triindol, a lineární diindol, a kde flavonoidy se volí ze skupiny, kterou tvoří chrysin, tectochrysin, nepetin, tangeretin, třicetin, tricin, amentoflavon, pinocembrin, narigenin, biochanin A, genistein, daidzein, propolis a včelí pyl;

d) k roztoku ze stupně c) se přidá roztok obsahující zapouzdřující látku, zvolenou ze skupiny škrob a želatina;

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako flavonoid se použije chrysin.

35

7. Způsob podle nároku t, vyznačující se tím, že jako flavonoid se použije včelí pyl.

8. Prostředek připrav itelný způsobem, při kterém se:

a) zahřeje jedna nebo větší počet solubilizačních emulgačních látek ze skupiny esteru poly40 ethylenglykolu se sukcinátem vitamínu E, polyvinylpyrrolidonu, polyoxyethylenstearátu, cholátu sodného, deoxycholátu nebo taurocholátu sodného;

b) k produktu z kroku a) se přidá rozpouštědlo a smáčedio typu fosfolipidu zvoleného ze skupiny, kterou tvoří fosfatidylcholin, dioleoylfosfatidylcholin, fosfatidyiglycerol, dioleoylfosfatidylglycerol, dimyristoylfostatidylcholin, dípalitoylfosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin,

45 fosfatidylserin a sfingomyeiín za vzniku roztoku;

c) v roztoku ze stupně b) se rozpustí jedna nebo více hydrofobních fytochemíckých látek ze skupiny indolů a flavonoidů, přičemž indoly jsou zvolené ze skupiny, kterou tvoří diindolylmethan, lineární triindol, cyklický triindol, a lineární diindol, a kde flavonoidy se volí ze skupiny, kterou tvoří chrysin, tectochrysin, nepetin, tangeretin, třicetin, tricin, amentoflavon, pinocembrin, so narigenin, btochanin A, genistein, daidzein, propolis a včelí pyl;

TC

d) k roztoku ze stupně c) se přidá roztok obsahující zapouzdřující látku, zvolenou ze skupiny škrob nebo želatina;

e) roztok připravený ve stupni d) se míchá za vzniku mikrodisperze s velikostí Částic 5 mikrometrů nebo nižší; a

9. Prostředek podle nároku8, vyznačující se tím, že jako indol v kroku c) se použije diindolylmethan.

io

10. Prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že jako flavonoid v kroku c) se použije chrysin.

11. Prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že jako flavonoid v kroku c) se 15 použije včelí pyl.

12. Použití prostředku podle nároku 9 pro výrobu léčiva pro snížení koncentrace estrogenů ve tkáních u mužů.

20

13. Použití prostředku podle nároku 9 pro výrobu léčiva pro udržení koncentrace estrogenů a úpravu relativních množství metabolitů estrogenů u žen.

14. Použití prostředku podle nároku 9 pro výrobu léčiva pro úpravu relativního množství metabolitů estrogenů u žen, přičemž se použije množství, které účinně zvýší poměr 20H estronu

25 k 160H estronu u žen.

15. Použití prostředku podle nároku 9 pro výrobu léčiva pro zvýšení svalové hmoty u člověka.

15 e) roztok připravený ve stupni d) se mísí za vzniku mikrodisperze s velikostí částic 5 pm nebo nižší; a

f) výsledná směs se suší rozprašováním za vzniku pevného prostředku s obsahem hydrofobní fytochemické látky.

20

16. Použití prostředku podle nároku 8 spolu s grapefruitovou šťávou, koncentrátem grape30 fruitové šťávy nebo grapefruitovým koncentrátem pro výrobu léčiva se zvýšenou absorpcí prostředku podle nároku 8 a zvýšenou biologickou dostupností prostředku podle nároku 8 u člověka.

17. Použití prostředku podle nároku 9 spolu s grapefruitovou šťávou, koncentrátem grape35 fruitové šťávy nebo grapefruitovým koncentrátem pro výrobu léčiva se zvýšenou absorpcí prostředku podle nároku 9 a zvýšenou biologickou dostupností prostředku podle nároku 9 u člověka.

18. Použití prostředku podle nároku 10 spolu s grapefruitovou šťávou, koncentrátem grape40 fruitové šťávy nebo grapefruitovým koncentrátem pro výrobu léčiva se zvýšenou absorpcí prostředku podle nároku 10 a zvýšenou biologickou dostupností prostředku podle nároku 10 u člověka.