PT1067913E - Composições e métodos de ajustamento do metabolismo da hormona esteroide através da absorção facilitada de compostos dietéticos hidrofóbicos - Google Patents

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ΡΕ1067913 1 DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE AJUSTAMENTO DO METABOLISMO DA HORMONA ESTEROIDE ATRAVÉS DA ABSORÇÃO FACILITADA DE COMPOSTOS DIETÉTICOS HIDROFÓBICOS"

1. DESCRIÇÃO DO CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com a utilização de grupos particulares de fitoquímicos para promover um metabolismo mais benéfica de hormonas esteroides. Os grupos de fitoquímicos úteis para a invenção são os fitoquímicos dietéticos alcaloides indólicos e os fitoquímicos flavonoides. São descritas preparações de tais fitoquímicos que promovem uma melhor absorção de substâncias dietéticas insolúveis para alterar beneficamente a atividade de enzimas citocromo P450 que metabolizam esteroides. Esta absorção facilitada de substâncias dietéticas fracamente solúveis amplifica as influências dietéticas úteis sobre o metabolismo de esteroides.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A superfamília de enzimas citocromo P450 ("CYP"), induzível no interior duma variedade de células, é capaz de metabolizar hormonas, fármacos e produtos químicos fracamente solúveis em água. 0 estatuto da hormona esteroide num indivíduo é, portanto, um reflexo da atividade da enzima 2 ΡΕ1067913 CYP subjacente. As enzimas CYP são os motores principais da biossintese, ativação e transformação de esteroides a metabolitos mais solúveis em água. Certas enzimas CYP possuem papéis que se sobrepõem em bioquímica e são responsáveis não só pelo metabolismo de esteroides mas também pelo metabolismo de substâncias estruturalmente relacionadas de origem vegetal. Assim, a ingestão dietética de certos fitoquimicos provenientes de plantas e de produtos quimicos sintéticos que se assemelham a eles, pode influenciar o metabolismo de hormonas esteroides que partilham as mesmas enzimas CYP. A indução ou inibição da atividade da enzima CYP pode ter um importante impacto sobre a ação da hormona esteroide uma vez que é agora conhecido que muita da atividade biológica de um dado esteroide reside com os seus metabolitos específicos, a sua concentração relativa e a meia-vida biológica (Michnovicz e Bradlow, "Dietary Cytochrome P-450 Modifiers In The Control Of Estrogen Metabolism", Capitulo 23, in Huang et al., eds., Food Phytochemicals For Câncer Prevention I, American Chemical Society, 1994). 2.1. Estatuto da Hormona Esteroide e Risco de Doença

Estrogénio, ou 17-beta-estradiol, é uma hormona esteroide de importância critica na reprodução, crescimento, desenvolvimento e metabolismo do bem-estar. É importante na manutenção da saúde quer no homens quer na mulher. As alterações na atividade de estrogénio que começam na meia idade têm sido associadas com um espetro de 3 ΡΕ1067913 processos de doença. 0 metabolismo dos estrogénios está dependente de numerosas enzimas CYP, especialmente 1A1 predominante no fígado, e CYP 1A2 e 1B1 presentes na mama, útero, ovário e pele. 0 nível de indução de CYP 1A1, 1A2 e 1B1 varia de acordo com o estado hormonal (por exemplo hormona tiroideia), ingestão alimentar (por exemplo fito-químicos indólicos) e exposição a toxinas ambientais (por exemplo, fumo de tabaco e pesticidas). índices de metabo-litos do estrogénio-chave refletem o grau de indução de hidroxilação de estrogénio específico, enzimas CYP. Além disso, a enzima aromatase CYP ("aromatase CYP") controla os níveis de estrogénio intracelular, regulando a conversão para estrogénio dos androgénios androstenediona e testos-terona. A aromatase CYP é particularmente importante no tecido adiposo ou tecido conjuntivo especializado chamado estroma.

As observações quanto à importância de meta-bolitos específicos de estrogénio começou na década de 1970, com a descrição de um aumento da 160H-estrona em homens e mulheres com lúpus eritematoso agudo disseminado (Lahita et al., "Alterations Of Estrogen Metabolism In Systemic Lupus Erythematosus, Arthritis And Rheumatism Alterations Of Estrogen Metabolism In Systemic Lupus Erythematosus, Arthritis And Rheumatism", 22(11) (1979)).

Isto foi seguido por um estudo definitivo em 1982 que revelou um aumento semelhante na 160H-estrona em pacientes com cancro da mama (Schneider et al., "Abnormal Oxidative Metabolism Of Estradiol In Women With Breast Câncer" in 4 ΡΕ1067913

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79 (1982) 3047-3051). Esta mesma observação foi posteriormente estendida às mulheres com cancro de útero (Fishman et al., "Increased Estrogen--16-Hydroxylase Activity in Women with Breast and Endometrial Câncer" in Journal of Steroid Biochemistry And Molecular Biology, 20 (48) (1984) 1077-81).

Investigações de doença uterina correlacionaram um aumento na razão da 160H para 20H-estrona no tecido cervical abrangendo displasia cervical em casos de neoplasia intraepitelial cervical (Sepkovic et al., "Estrogen Metabolite Ratios And Risk Assessment Of Hormone- -Related Câncer, Assay Validation And Prediction Of Cervical Câncer Risk" in Annals of the N.Y. Acad. of

Science, 768 (1995) 312-316). A importância de interrupções neste caminho do metabolismo de estrogénio foi posteriormente suportada pela cultura de tecido da mama humana de sitios normais e cancerosos que mostraram aumentos confirmadores da 16-hidroxilação em espécimes de cancro (Osborne et al., "Upregulation Of Estradiol cl6

Hydroxylation In Human Breast Tissue: A Potential Biomarker Of Breast Câncer Risk" in J.C.N.I., 85(23) (1993) 1917-20).

Um estudo de células cancerosas da mama indicou uma possível ligação a agentes químicos ambientais demonstrando um desvio no metabolismo do estrogénio para produção de mais 160H-estrona e menos produção de 20H-estrona após exposição das células a pesticidas feitos pelo homem (Bradlow et al., "Effects of Pesticides on the Ratio of 16/2-Hydroxyestrone: A Biologic Marker Of Breast Câncer 5 ΡΕ1067913

Risk" in Environmental Health Perspectives, 103 (Supl 7) (1995) 147-50).

Toda a importância do metabolismo do estrogénio na determinação de doença relacionada com estrogénio está resumida numa revisão recente gue explica a interação entre substâncias químicas ambientais ("xenoestrogénios") , o metabolismo hormonal e processos de danos no DNA, agora conhecidos por levar ao cancro de mama (Davis et ai., "Medicai Hypothesis: Bifunctional Genetic-Hormonal Pathways To Breast Câncer" in Environmental Health Perspectives, 105 (Sup. 3) (1997) 571-576). 0 peso da evidência atual suporta o conceito de que é não só a exposição cumulativa total de tecidos ao estrogénio mas também o caminho do metabolismo do estrogénio que constituem o risco de doença relacionada com estrogénio. O conhecimento de que enzimas CYP específicas foram responsáveis pela produção de 20H-estrona desencadeou uma reavaliação do trabalho a partir da década de 1970 que dizia respeito à indução de enzimas CYP por fitoquímicos contidos em vegetais dietéticos (Wattenberg e Loub, "Inhibition Of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon-Induced Neoplasia By Naturally Occurring índoles" in Câncer Research, 38 (1976) 1410-1413) . Esta pesquisa mostrou que vegetais, extratos de plantas e fitoquímicos particulares foram todos capazes de prevenir cancro provocado por carcinogénio em animais. Wattenberg e Loub identificaram a inibição de cancro induzido pelo grupo índole de fito- 6 ΡΕ1067913 químicos dietéticos. Este grupo de compostos partilhavam uma estrutura molecular planar que modulou a atividade da enzima CYP através da via de activação do gene conhecida como sistema do recetor de hidrocarboneto de arilo. A atividade contra o cancro induzido por carcinogénio, ou "quimioprevenção", foi ligada a atributos da sua estrutura de anel molecular heterocíclico. 0 reteste desta abordagem, liderada por H. Leon Bradlow na Universidade Rockefeller, estabeleceu que o indole-3-carbinol, um índole dietético de vegetais crucíferos, foi na verdade bem sucedido no desvio do metabolismo do estrogénio a favor da 20H-estrona (Bradlow et al. "Indole-3-Carbinol, A Novel Approach To Breast Câncer Prevention" in Annals of the New York Academy of Science, 768 (1995) 180-200). As influências dietéticas sobre o metabolismo do estrogénio são agora apreciadas como sendo fatores modificáveis importantes para a prevenção de doenças.

2.2. DI-INDOLIL-METANO É um Fitoquímico Indutor de CYP Níveis hepáticos e intestinais da enzima CYP 1A1/1A2 são aumentados em ratos e ratinhos alimentados com indol-3-carbinol ("I3C"), um índole dietético presente em vegetais crucíferos. A suplementação com I3C em animais e humanos tem mostrado aumentar a 2-hidroxilação do estradiol, que se sabe ser devida à atividade das enzimas CYP 1A1 e 1A2. O trabalho subsequente revelou que os produtos de condensação de ácidos formados a partir de I3C durante a passagem através do estômago possuía os efeitos 7 ΡΕ1067913 de modulação da enzima CYP. Os produtos de condensação de ácido, 3,3'-di-indolil-metano ("DIM") e 2,3-bis[3-indolil-metil]índole, foram detetados em conteúdos gástricos e tecido do estômago e uma hora depois os animais receberam uma dose oral de I3C (Stresser et al., "Mechanisms Of Tumor Modulation By Indole-3-Carbinol: Disposition And Excretion In Male Fischer 344 Rats" in Drug Metabolism and Disposition, 23(09) (1995) 965-75). O trabalho subsequente revelou a potência aumentada de DIM sobre I3C em influenciar o metabolismo do estrogénio quando DIM e I3C foram ambos alimentos para ratos e o metabolismo microssómico hepático de estrogénio medido (Jellinck et al., "Ah Receptor Binding Properties Of índole Carbinols And Induction Of Hepatic Estradiol Hydroxylation" in Biochemical Pharmacology, 45(5) (1993) 1129-36).

Recentemente, a observação de culturas celulares demonstrou que DIM foi capaz de suportar o comportamento preventivo do cancro da apoptose, isto é, a morte celular programada (Ge et al. "3,3'-Diindoly methane induces Apoptosis In Human Câncer Cells" in Biochemical And Biophysical Research Communications, 228 (1996) 153-58) . A estrutura de anel policíclico de DIM, semelhante a outros compostos conhecidos por efetuarem o mecanismo de efluxo de glicoproteína-P ligada à membrana, foi mostrada como aumentando a eficácia de fármacos de quimioterapia em células cancerosas multirresistentes (Christensen e Leblanc, "Reversal Of Multidrug Resistance In Vivo By Dietary Administration Of The Phytochemical Indole-3- ΡΕ1067913 -Carbinol" in Câncer Research, 56 (1996) 574-81) . Em conjunto, estas observações sugerem que DIM possui não só atividade de indução de CYP mas também efeitos de modulação sobre a função celular o tornam duplamente útil como um suplemento dietético.

2.3. DIM É MAIS ESTÁVEL DO QUE I3C I3C é agora usado como um suplemento dietético e tem sido relatado a desviar beneficamente o metabolismo dos estrogénios a favor da 20H-estrona (Michnovicz et al., "Changes In Leveis Of Urinary Estrogen Metabolites After Oral Indole-3-Carbinol Treatment In Humans" in Journal of the Nat '1 Câncer Inst., 89(10) (1997) 718-23). Esta utilização, para a quimioprevenção do cancro da mama e para o controlo da infecção respiratória por papilomavirus (Coll et al., "Treatment Of Recurrent Respiratory Papillomatosis With Indole-3-Carbinol" in American Journal of Otolaryngology, 18(4) (1997) 283-85), requer uma dose minima de 300 mg por pessoa por dia (Wong et al., "A Dose--Response Study Of Indole-3-Carbinol For Breast Câncer Prevention", (submetido, 1998)). Contudo, existem limitações ao uso do I3C em preparações de suplementos dietéticos uma vez que o I3C é instável e sujeito à deterioração espontânea acelerada pelo calor, luz, humidade ou ambientes ácidos. O estudo do prazo de validade do I3C revelou uma perda de aproximadamente 50% do I3C original durante as condições de envelhecimento simulando um período de um mês (BioResponse New Dietary Ingredient FDA Filing, agosto (1997)). Além disso, o I3C demonstra transformação 9 ΡΕ1067913 imprevisível in vivo. Durante a passagem através do estômago, o I3C autorreage numa família de produtos de condensação que consiste de moléculas duplas e triplas (dímeros e trímeros). Um dos produtos da reação é o indolocarbazole, um dímero de I3C de anel fechado linear, que se assemelha a dioxina não só na estrutura mas também na atividade biológica (Bjeldanes et al., "Aromatic Hydrocarbon Responsiveness-Receptor Agonists Generated From Indole-3-Carbinol In Vitro and In Vivo: Comparisons With 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-P-Dioxin" in Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88 (1991) 9543-47). Esta formação imprevisível de indolocarbazole no ácido do estômago torna a suplementação com I3C de segurança incerta. A falta de estabilidade na durabilidade, reação espontânea do I3C com outros ingredientes de suplementos dietéticos e produtos de reação questionáveis formados no estômago limitam a utilidade do I3C como um ingrediente de suplemento dietético. 0 estudo do DIM pelos inventores revelou que ele é inteiramente estável durante a passagem através de um ambiente gástrico simulado (BioResponse New Dietary Ingredient FDA Filing, agosto (1997)). Nenhum indolocarbazole é gerado na digestão, ácido gástrico, ou durante as condições aceleradas de vida em prateleira. DIM possui atributos desejáveis como um indutor de enzimas CYP e é estável em prateleira. Por conseguinte, existe a necessidade de uma formulação biodisponível de DIM bem como dímeros e trímeros relacionados, uma vez que as substâncias hidrofóbicas como o DIM são fracamente absorvidas. 10 ΡΕ1067913

2.4. O Fitoquímico CHRYSIN Inibe a Aromatase CYP

Flavonas, análogos aos índoles dietéticos, são compostos naturais de plantas que efetuam a atividade de estrogénio e podem prevenir o cancro experimental. 5,7-Di--hidroxiflavona ("crisina"), é uma flavona particular encontrada em extratos da flor da paixão, maracujá, (Passi-flora corerula) e no pólen de abelha ou própolis. Esta substância dietética tem demonstrado inibir a atividade da aromatase CYP em culturas celulares e microssomas livres de células (Campbell e Kurzer, "Flavonoid inhibition of aromatase enzyme activity in human pre-adipocytes" in J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 46(3) (1993) 381-388 e Kellis e Vickery, "Inhibition of human estrogen synthetase (aromatase) by flavones" in Science, 225 (1984) 1032-1034). A modulação da atividade da aromatase é importante uma vez que esta enzima CYP controla a conversão de androgénios em estrogénios no tecido periférico tal como a gordura. Com o envelhecimento, a composição corporal altera-se para favorecer um aumento da proporção de gordura para tecido magro tal como o tecido muscular. Como resultado, há um aumento da produção de estrogénio a partir da testosterona e do "androgénio adrenal" desidroepiandrosterona (DHEA), quer em homens quer em mulheres, com o avanço da idade. A atividade antiaromatase CYP por flavonas e isoflavonas dietéticas relacionadas é agora acreditada como proporcionando uma importante fonte de proteção contra doenças relacionadas com o estrogénio, limitando a conversão metabólica de androgénios a estrogénios. 11 ΡΕ1067913

Apesar da atividade anti-aromatase significativa demonstrada pela crisina em estudos de cultura celular e livres de células referenciados acima, a baixa biodis-ponibilidade oral das flavonas tem sido citada como um problema que diz respeito à sua potencial utilidade como suplemento alimentar (Kuhnau, "The flavonoid. A class of semi-essential food components: their role in human nutrition" in World Rev. Nutr. Dieta, 24 (1976) 117-191).

Quando estudados quanto às suas caraterísticas fisico-químicas, a crisina mostrou ser extremamente hidrofóbica com uma solubilidade em água de apenas 2,8 x IO”6 mo-les/litro (Masarova et al. "Solubilization of chrysin by a non-aromatic amine oxide" in Pharmazie, 44 (H 12) (1989) 865-866 (1989)). Por conseguinte, existe a necessidade de melhorar a biodisponibilidade de formulações de suplementos dietéticos de crisina de modo a obter beneficio da sua ação inibidora da aromatase CYP. 2.5. A Biodisponibilidade Oral de Fitoquímicos Hidrofóbicos É

LIMITADA A absorção oral eficiente de fitoquímicos é necessária para proporcionar níveis adequados em tecido sistémico para induzir enzimas CYP protetoras. Substâncias dietéticas insolúveis em água ou hidrofóbicas devem superar múltiplas barreiras para a sua absorção digestiva. Estas barreiras incluem: resistência à emulsificação dentro das micelas intestinais à base de lípidos; imediato "meta- 12 ΡΕ1067913 bolismo pré-sistémico" ao entrarem enterócitos que revestem o intestino delgado; retorno para o lúmen intestinal por ação da bomba de efluxo glicoproteína-P que faz ativamente a extrusão de muitos substâncias hidrofóbicas a partir do interior de enterócitos. As formulações que encorajam a emulsificação em micelas, reduzem o metabolismo do enteró-cito e aumentam a captação de substâncias em quilomícrons podem melhorar a biodisponibilidade de substâncias hidrofóbicas. 0 fluxo aumentado de quilomicron e a passagem de substâncias para o fluxo linfático irá ignorar algum do metabolismo hepático de "primeira passagem" efetuando substâncias solúveis em água ou metabolitos solúveis em água gerados por enterócitos. 0 desenvolvimento inicial de uma síntese laboratorial para DIM na década de 1950 revelou que a substância é altamente insolúvel em água (Leete e Marion, "The Hydrogenolysis Of 3-Hydroxymethylindole And Other índole Derivatives With Lithium Aluminum Hydride" in Canadian J. of Chemistry, 31(9) (1953) 775-84). Estudos de culturas celulares revelaram que DIM para é um potente indutor de enzimas CYP quando adicionado diretamente a culturas de células do fígado (Wortelboer et al., "Effects of Indole-3-Carbinol On Biotransformation Enzymes In The Rat: In Vivo Changes In Liver And Small Intestinal Mucosa In Comparison With Primary Hepatocyte Cultures" in Food Chem. and Toxicology, 30(7) (1992) 589-99). No entanto, quando DIM foi ou adicionado à dieta ou injetado intraperitonealmente em ratos, foi anotado um efeito 13 ΡΕ1067913 marcadamente diminuído. A perda de atividade foi observada abaixo de 5 mg por kg, mesmo guando DIM foi administrado em óleo de sésamo, um veículo aumentador da captação. Os efeitos indutivos enzimáticos foram anotadas a 0,3 mg por kg quando DIM foi injetado por via intraperitoneal (Jellinck et al., "Ah Receptor Binding Properties of índole Carbinols and Induction of Hepatic Estradiol Hydroxylation" in Biochemical Pharmacology, 45(5) (1993) 1129-36). Quando incluída na dieta e misturado com a alimentação, num estudo separado, grandes doses de DIM falharam em induzir enzimas CYP no epitélio do cólon enquanto uma potente atividade indutora foi demonstrada para I3C solúvel em água (McDannell e McLean, "Differential Induction of Mixed-Function Oxidase (MFO) Activity in Rat Liver and Intestine by Diets Containing Processed Cabbage: Correlation with Cabbage Leveis of Glucosinolates and Glucosinolate Hydrolysis Products" in Food Chem. and Toxicology, 25(5) (1986) 363-68). Este estudo demonstra a falta de absorção de DIM na dosagem farmacológica.

Quando a biodisponibilidade da crisina foi investigada como parte de um estudo de alimentação, nenhuns efeitos relacionados com CYP foram observados em fígados de ratos, apesar de duas semanas de ingestão oral de 300 mg/kg de massa corporal. A ingestão de Tangeretina, uma flavona mais solúvel em lípidos, foi associada com a indução de CYP (Μ. H. Siess, M. Guillermic, A. M. LeBon, M. Suschetet, "Induction of monooxygenase and transferase activities in rat by dietary administration of flavonoid" in Xenobiotica, 14 ΡΕ1067913 19(12) (1989) 1379-1386). Existe por conseguinte necessidade de desenvolver formulações especificas, adequadas para utilização como suplementos dietéticos, para facilitar a absorção oral de substâncias dietéticas úteis mas insolúveis . 2.6. Metabolismo Pré-sistémico de Substâncias Dietéticas A biodisponibilidade de numerosos fitoquimicos hidrofóbicos pode ser limitada pelo metabolismo no interior da camada celular de enterócitos que reveste o trato digestivo. Este metabolismo "pré-sistémico" envolve a classe de enzimas citocromo CYP 3A4. A atividade da enzima CYP 3A4 está relacionada com a extrusão de compostos hidrofóbicos a partir da parte posterior do enterócito para o lúmen intestinal através da atividade da bomba de efluxo glicoproteina-P da membrana (Wacher e Bennet, "Overlapping Substrate Specificities and Tissue Distribution of Cytochrome p450 3a and P-Glycoprotein: Implications for Drug Delivery and Activity" in Câncer Chemotherapy, Molecular Carcinogenlsis, 13 (1995) 129-34). Uma vez que os óleos essenciais de diversas fontes vegetais possuem atividade inibitória de CYP 3A4, a coadministração de óleos em emulsões com fármacos hidrófobos tem sido desenvolvida num sistema para aumentar a absorção de certos fármacos através da redução da atividade da bomba de efluxo glicoproteina-P da membrana (Patente No° 5 665 386) . Numerosas substâncias de origem dietética são não só substratos para enzimas CYP 3A4 mas também preferencial- 15 ΡΕ1067913 mente selecionadas para a extrusão a partir da célula pela bomba de efluxo glicoproteina-P. Devido a semelhanças estruturais com vários fármacos é provável que a captação de substâncias dietéticas, como DIM e crisina, seja também efectuada pela atividade de enzimas CYP 3A4 e da glicoproteina-P.

Contudo, DIM provou ser único no que se refere ao sistema de enterócitos do metabolismo selectivo e extrusão de substâncias de volta para dentro do lúmen intestinal. A inibição da função da glicoproteina-P tem sido notado em culturas celulares e in vivo a seguir à administração de DIM. Por conseguinte, DIM reduz a eficácia do sistema na eliminação de outros compostos hidrofóbicos (Christensen e Leblanc, "Reversal of Multidrug Resistance In Vivo by Dietary Administration of the Phytochemical Indole-3--Carbinol" in Câncer Research, 56 (1996) 574-81) . Isto resultou numa maior eficácia dos compostos quimioterapêuti-cos em células cancerosas multirresistentes. A utilização de uma sonda molecular demonstrou a interação direta de DIM com a estrutura de glicoproteina-P da membrana. Portanto, DIM possui o atributo especial de ser capaz de bloquear o seu próprio efluxo depois de ter ganho acesso ao enterócito. Assim, se formulado para superar a barreira de solubilidade para a absorção no interior de enterócitos, DIM vai estimular a sua própria absorção sistémica e biodisponibilidade adicional, bem como a biodisponibilidade de outras substâncias sujeitas a efluxo de glicoproteina-P. 16 ΡΕ1067913

Para além de DIM e óleos essenciais, duas outras classes de compostos têm sido observadas a inibir a biodisponibilidade ligada a CYP 3A4 e glicoproteina-P. A primeira envolve a administração de tensioactivos que efetivam a fluidez da membrana e bloqueiam a atividade de efluxo da glicoproteina-P através de mudanças subtis na interação lipido proteína de que a glicoproteína-P depende. Este conhecimento tem sido desenvolvido num meio de coadministração de agentes tensioativos com fármacos quimioterapêuticos para o tratamento de cancro resistente a fármacos (Patente N° 5 591 715).

Em segundo lugar, também foi notado que substâncias naturais que se encontram no sumo de toranja bloqueam eficazmente a atividade CYP 3A4 para uma gama dos seus substratos, promovendo a absorção melhorada de vários fármacos, tais como quinidina, ciclosporina e felodipina (Lown et al. "Grapefruit Juice Increases Felodipine Oral Availability In Humans By Decreasing Intestinal CYP 3A Protein Expression" in Journal of Clinicai Investigation, 99(10) (1997) 2545-53). Visto que o DIM é estruturalmente semelhante à quinidina, seria vantajoso desenvolver uma formulação de DIM que utilizasse o sumo de toranja e bloqueasse a atividade de CYP 3A4. Isto irá encorajar ainda mais a absorção de DIM e outras substâncias dietéticas coadministradas como flavonas e isoflavonas. Seria também vantajoso ter uma formulação que inibisse não só a atividade de CYP 3A4 mas também bloqueasse diretamente o sistema de bomba glicoproteína-P. Isto é possível através 17 ΡΕ1067913 da coadministração de agentes tensioactivos conhecidos por especificamente interromperem a atividade da glicoproteína--P através de efeitos de membrana, tal como descrito. Idealmente, a absorção facilitada devida a estes efeitos é transitória, permitindo a absorção facilitada de compostos intencionalmente coadministrados com concentrado de toranja e agente tensioativo. Isto seria seguido por um retorno da função da CYP 3A4 dentro de uma questão de horas, permitindo que a barreira de enterócito retome a sua função de protecção de exclusão de outros compostos hidrofóbicos não selecionados e potencialmente tóxicos. 0 estudo de farmacocinética preliminar do efeito do concentrado de sumo de toranja indica a inversão do seu efeito dentro de 8 a 12 horas (B. Ameer e R. A. Weintraub, Clinicai Pharmaco-kinetics, 33(2) (1997) 103-21).

3. TÉCNICA ANTECEDENTE A tecnologia de formulação na técnica abordou a necessidade de melhorar a absorção de substâncias hidrofóbicas. O foco deste trabalho diz respeito ao uso de polietilenoglicol (PEG) como agente tensioativo, à criação de microdispersões para reduzir o tamanho de partícula e à utilização de técnicas de secagem por pulverização para formar partículas discretas. O trabalho inicial com PEG é exemplificado pela patente de Riegleman e Chiou que incluiu a associação íntima de fármaco escassamente solúvel com agentes de 18 ΡΕ1067913 suporte de PEG solúveis para absorção melhorada (Patente 4 151 273) . A tecnologia usual em tais formulações foi combinar a mistura aquecida de PEG ou polivinilpirrolidona com fármacos fracamente solúveis, seguido por arrefecimento subsequente para formar uma "solução sólida" do fármaco disperso. Esta mistura ou dispersão sólida foi subsequentemente moida até um pó fino para fazer comprimidos. Os aperfeiçoamentos desta tecnologia dizem respeito à preparação de várias dispersões ou emulsões à base de liquido ou óleo de substâncias insolúveis para administração oral. A tecnologia para a criação de tamanhos de partículas mais finas em dispersões foi subsequentemente descrita para sistemas de excipientes de lípidos e agentes tensioactivos promovendo um tamanho de partícula reduzido (Patente 4 880 634). A adição de ácidos gordos livres e fosfolípidos à tecnologia de formação de emulsão foi em seguida descrita para uma melhor compatibilidade com as micelas intestinais (Patente N° 5 314 921). Emulsões mais complexas e emulsões múltiplas em óleo digerível foram mais recentemente descritas como variações sobre este tema (Patentes Nos 5 645 856 e 5 583 105) . A tecnologia de mistura de substâncias hidrofó-bicas em materiais de revestimento, descrita por Sair e Sair (Patente 4 230 687), tem sido a base para a criação de várias formas de microdispersões estáveis utilizando mistura mecânica em vários materiais de encapsulação poliméricos tais como amido, goma ou proteína. Contudo, esta técnica requer misturas espessas de amido a fim de 19 ΡΕ1067913 preservar as partículas discretas em microdispersão. 0 melhoramento de ingestão oral foi conseguida por dipiridamol pela criação de uma mistura amorfa não cristalina com polivinilpirrolidona como emulsionante, seguido por secagem por pulverização da mistura (Patente N° 4 610 875) . O processo de secagem por pulverização de uma emulsão de lecitina, óleo orgânico e um agente tensioactivo de poloxâmero não iónico foi desenvolvido para a criação de aromatizantes estáveis em prateleira na indústria alimentar (Patente N° 5 362 425) . A formação de partículas melhorada para fármacos insolúveis foi descrita mais tarde, o que incluiu a utilização de ésteres de ácido carboxílico de PEG, como vitamina E na forma de succinato PEG 1000 ("TPGS"), como agentes emulsionantes e um material de revestimento misturados antes da secagem por pulverização para formar partículas (Patente N° 5 430 021). TPGS foi explorado de modo independente, não só como uma forma solúvel em água de vitamina E mas também como um meio de criação de emulsões líquidas em combinação com fármacos hidrófobos ou vitaminas. Este uso tem proporcionado aplicações para aumentar a absorção de vitamina D e de fármacos fracamente solúveis, tal como ciclosporina (Argao et al., "d-a-Tocopheryl Polyethylene Glycol-1000 Succinate Enhances the Absorption of Vitamin D in Chronic Cholestatic Liver Disease of Infancy and Childhood" in Pediatric Research, 31(2) (1992) 146). TPGS e ésteres de PEG de grau alimentar relacionados têm provado ser úteis como um meio para aumentar a absorção da vitamina 20 ΡΕ1067913 E esterificada (Patente 5 179 122). Outras formulações de TPGS em combinação com vitamina E não esterificada têm sido desenvolvidas por mistura de TPGS com agentes aumentadores de fluxo e pulverização (Patente N° 5 234 695). Nestes usos TPGS tinha sido empregado como um agente de emulsificação que melhora a absorção intestinal. No entanto, esta função não é única para TPGS como o uso da fração de lipido não relacionada Milk Fat Globule Membrane de leite de vaca tem mostrado, em que uma emulsão aumentou a absorção da ciclosporina até um grau similar (Sato et al., "Enhancement of the intestinal absorption of a cyclosporine derivative by milk fat globule membrane" in Biol. Pharm. Buli., 17(11) (1994) 1526-1528). O trabalho mais recente com TPGS explorou o mecanismo pelo qual este éster de PEG aumentou a biodisponibilidade da ciclosporina. A medição de metabolitos de ciclosporina revelou que TPGS não tem efeito na ação das enzimas CYP 3A4 e em vez disso implica que, além da solubilização aumentada, deve haver um segundo mecanismo pelo qual TPGS atua de maneira a explicar o aumentado grau de absorção de fármaco observado. Especulou-se que este mecanismo pode envolver a inibição da bomba glicoproteína-P (Chang et al., "The effect of water-soluble vitamin E on cyclosporine pharmacokinetics in healthy volunteers" in Clinicai Pharmacology & Therapeutics, 59 (1996) 297-303).

Com base nas evidências que suportam a utilização de fitoquimicos dietéticos para desviar o metabolismo do 21 ΡΕ1067913 estrogénio para metabolitos mais benéficos como 20H--estrona, existe a necessidade de desenvolver formulações seguras e eficazes para os suplementos . Os fitoquimicos dietéticos prefereridos para a indução de enzimas, como DIM e crisina, são altamente insolúveis e sujeitos a mecanismos anti-absortivos que limitam a biodisponibilidade oral. Por conseguinte, existe a necessidade de tecnologia de formulação e preparações de combinações de fitoquimicos que ultrapassem as barreiras para a sua absorção.

4. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, um processo para a preparação de uma composição que compreende fitoquimicos hidrofóbicos, as composições resultantes e a sua utilização são definidos nas reivindicações.

Preparações de nutrientes especializadas e técnicas de formulação utilizando compostos à base de plantas têm sido desenvolvidas para uso como suplementos dietéticos. Estas preparações são usadas em abordagens dietéticas para manter e restaurar o equilíbrio hormonal. Tais preparações ultrapassam a baixa solubilidade e baixa biodisponibilidade de substâncias dietéticas quando ingeridas como suplementos em seres humanos e animais. Tem sido desenvolvida nova tecnologia de formulação que permite a criação de uma microdispersão de substâncias dietéticas insolúveis em associação com os ésteres de polietileno-glicol e agentes tensioactivos naturais. Esta microdisper- 22 ΡΕ1067913 são é capturada no interior de particulas de amido através de um processo de secagem por pulverização. 0 resultado é um pó fino, com cada particula a conter microparticulas da substância dietética solidificada em complexos amorfos, não cristalinos. A preparação estabiliza a substância dietética, proporcionando um longo periodo de vida útil e a capacidade de se combinar com outros ingredientes de suplementos dietéticos. 0 mais importante destas preparações é aumentar a absorção de substâncias dietéticas insolúveis quando ingeridas, proporcionando tratamento eficaz com uma dose baixa para os utilizadores de longo prazo. A absorção ou captação e biodisponibilidade melhoradas das preparações foram testadas em experimentos em animais e seres humanos. Os resultados estabelecem uma vantagem significativa sobre as mesmas substâncias num estado não processado, cristalino. As preparações constituem um método para de modo seguro entregar nutrientes fracamente solúveis que induzem enzimas CYP especificas a promover o equilíbrio de estrogénio. Estas preparações melhoram a absorção de substâncias vegetais como o indole de plantas, DIM e flavona crisina de plantas. As preparações provaram ser úteis no ajustamento do metabolismo de estrogénio, quando utilizadas por via oral em mamíferos. Estas substâncias dietéticas mostraram induzir o metabolismo de carcinogéneos mais seguro e são, por conseguinte, úteis quando preparadas de acordo com a presente invenção, na forma de formulações quimiopreventivas. 23 ΡΕ1067913

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 ilustra as alterações dos niveis de testosterona e androstenodiona na urina devido à crisina processada quando comparados com crisina não processada.

Figura 2 ilustra as alterações dos niveis de androsterona e etiocolanolona na urina devido a crisina processada quando comparados com crisina não processada.

Figura 3 ilustra as alterações dos niveis de testosterona e androstenodiona na urina devidas a DIM processado.

Figura 4 ilustra as alterações dos niveis de androsterona e etiocolanolona na urina devidas a DIM processado.

Figura 5 ilustra as alterações dos niveis de metabolitos de estrogénio devidas a DIM processado.

Figura 6 ilustra a concentração plasmática do DIM em nanogramas/mL após uma dose oral de 1,0 mg/kg de DIM em DIM processado (Plex) versus DIM cristalino (DDIM) num sujeito adulto, estudada em dias separados durante períodos de 5 horas.

Figura 7 ilustra a concentração plasmática do DIM em nanogramas/mL, após uma dose oral de 0,5 mg/kg de DIM cristalino em três sujeitos adultos durante um período de 5 horas.

Figura 8 ilustra a concentração plasmática do DIM em nanogramas/mL após uma dose oral de 0,5 mg/kg de DIM cristalino e óleo de sésamo em três sujeitos adultos durante um período de 5 horas.

Figura 9 ilustra a concentração plasmática do DIM em nanogramas/mL, após uma dose oral de 0,5 mg/kg de DIM em DIM processado em três sujeitos adultos durante um período de 5 horas. ΡΕ1067913 - 24 -

Figura 9 ilustra a concentração plasmática do DIM em nanogramas/mL, após uma dose oral de 0,5 mg/kg de DIM em DIM processado dado com sumo de toranja em três sujeitos adultos ao longo de um período de 5 horas.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito à formulação e utilização de preparações de nutrientes para a absorção melhorada de fitoquímicos hidrofóbico altamente insolúveis, objectivo final da invenção é promover metabolismo hormonal esteroide mais benéfico, sto é realizado com formulações de substâncias dietéticas cuja absorção facilitada ajusta a atividade de metabolização do esteroide CYP. As preparações são baseadas nos passos de codissolução das substâncias dietéticas num solvente apropriado, um agente emulsionante (por exemplo, Vitamina E éster succinato PEG) e fosfolípidos, seguida pela criação de uma microdispersão estável em agente de formação de matriz solúvel em água. Complexos amorfos de substâncias dietéticas microdispersas são em seguida coprecipitadas no interior de partículas agentes de suporte formadas por secagem por pulverização. Estas formulações, com substâncias dietéticas activas que residem em micropartícuias, promovem a absorção melhorada quando dissolvidas e emulsionadas no interior do intestino delgado de um ser humano ou animal. índoles naturais, tais como DIM, ou flavonoides, tais como crisina, são exemplos de substâncias dietéticas 25 ΡΕ1067913 de origem vegetal, que demonstram solubilidade negligivel em água (2,5 e 0,7 yg/mL, para DIM e crisina, respectivamente) e solubilidade minima em óleo (100 e 50 yg/mL, para DIM crisina, respectivamente). Outras substâncias dietéticas que podem ser utilizados de acordo com a invenção incluem, mas sem constituir limitação, tri--indole([2-(indol-3-il-metil)-indol-3-il]indol-3-ilmetano) linear, tri-indole(5,6,11,12,17,18-hex-hidrociclononal[1,2--b:4,5-b':7,8-b]:tri-indole) cíclico, di-indole(1-(3—hi-droximetil)indolil-3-indolilmetano linear, tectocrisin(5-hidroxi,7-éter metilico-flavona), nepetin(5,3',4'-tri-hi-droxi-6-metoxiflavona), tangeretin(5,6,7,8,4'-pentameto-xiflavona), tricetin(5,7-di-hidroxi-3'4',5'-trimetoxiflavona) , tricin (5,7,4'-tri-hidroxi-3',5'-dimetoxiflavona), amentoflavona, pinocembrin(5,7-di-hidroxiflavanona) , nari-genin(5,7,4'-tri-hidroxiflavanona) , biochanina A, a genis-teína, daidzeína, pólen de abelhas ou própolis. O desenvolvimento de formulações de intensificação da absorção para uso oral tem sido necessário a fim de obter beneficios dos efeitos de promoção da saúde de tais substâncias que estão agora disponiveis em formas sintéticas concentradas. Devido às carateristicas fisico--químicas únicas de fitoquimicos hidrofóbicos como DIM e crisina, novas abordagens de formulação têm sido desenvolvidas para melhorar a sua biodisponibilidade oral. A tecnologia de formulação desenvolvida é identificada por passos de processamento que permitem a redistribuição de ingredientes insolúveis em microparticulas ricas em agente 26 ΡΕ1067913 tensioativo. 0 foco deste processamento tem sido a criação de uma dispersão sólida de micropartículas contidas no interior de uma grande matriz de partículas de amido. Estas partículas de amido de 10 micrómetros contêm os micropar-ticulados que consistem de uma fase amorfa sólida de uma mistura de fitoquímicos hidrofóbicos tais como DIM ou crisina juntamente com emulsionantes de solubilização (por exemplo, vitamina E succinato polietilenoglicol 1000; vitamina E succinato de polietilenoglicóis com polietilenoglicol com uma massa molecular no intervalo de 400-2000; ésteres de polietilenoglicol formados por ácido esteárico; polivinilpirrolidonas) e um fosfolípido. 0 processo de formulação descrito emprega uma nova abordagem para a redução do tamanho das partículas através da formação de uma microdispersão otimizada numa fase aquosa que é em seguida convertida, por meio de secagem por pulverização, a um pó que flui livremente que compreende a matriz solúvel em água que contém as micropartículas embebidas. No processo, a atividade aumentadora de solubilidade de ésteres de polietilenoglicol está adaptada para a dissolução máxima de DIM ou crisina numa mistura quente (de 30 °C a 90 °C) de solventes compatíveis com a alimentação, de fosfolípidos e TPGS.

Os solventes possíveis incluem hexanol, etanol, butanol, heptanol, 2-metil-l-pentanol, vários solventes cetonas que deverão ser aceitáveis nos alimentos, tais como cetona etílica e metílica, acetona e outros, propileno- 27 ΡΕ1067913 glicol e certos solventes ésteres, tais como acetato de etilo.

Os fosfolipidos possíveis incluem os constituintes de lecitinas fosfatidil-serina, fosfatidil-colina e fosfatidil-glicerol; dioleoil-fosfatidilcolina; fosfatidil-glicerol; dioleoilfosfatidilglicerol; dimiristoilfosfatidilcolina; dipalmitoilfosfatidilcolina; fosfatidiletanol--aminas; fosfatidilserinas ou esfingomielinas. 0 fosfo-lípido é adicionado a TPGS/mistura solvente para causar a redução no tamanho da fase dispersa após a mistura com água. A mistura de alto corte desta fase orgânica provoca ou dissolução, ou a produção de uma suspensão extremamente fina do DIM, crisina, outro fitoquímico, ou mistura de fitoquímicos numa mistura íntima com o emulsionante solubilizante (por exemplo, TPGS) e fosfolipidos. A proporção das misturas foi refinada para cada fitoquímico para maximizar a estabilidade da emulsão. A proporção de TPGS para ou DIM ou crisina deve estar no intervalo de 0,5 : 1 a 1,5 : 1 Uma proporção de 1:1 é preferida. 0 amido deve ser de 25% a 75% da massa total dos componentes e está, de preferência, numa proporção de 0,8:1 a 1,5:1 relativamente a TPGS. Os agentes emulsionantes, que podem incluir qualquer um de fosfatidilcolina e sais biliares ou ambos (por exemplo, colato, desoxicolato, taurocolato, etc., de sódio) devem ser desde 1% a 10% da massa total, com 3% a 5% de preferência. O solvente deve estar numa razão ponderai de 0,5:1 a 5:1 com o ingrediente ativo (por exemplo, crisina-p ou DIM). 28 ΡΕ1067913 A seguir, esta "fusão" de componentes hidrofóbi-cos extraídos é homogeneizada numa solução à base de água de amido ou outro encapsulator (por exemplo, amido modificado tal como Capsul™ Starch da National Starch, Inc., metilcelulose, hidroxipropil-metilcelulose, hidroxie-tilcelulose, hidroxipropiletilcelulose, pectina, goma arábica, gelatina, ou outra preparação que forma matriz polimérica conhecida dos peritos na técnica, adequada para secagem por pulverização). Este passo cria uma microdisper-são que resiste à coalescência e mantém micropartícuias discretas de TPGS, fosfolípido e fitoquímico hidrofóbico (tais como DIM ou crisina) mantendo aproximadamente um intervalo de tamanho de 5 micrómetros ou inferior. Numa incorporação preferida, a micropartícula é de 2 micrómetros ou menos. Numa incorporação particularmente preferida, a micropartícula é de 1 micrómetro ou menos. Subsequentemente, através do processo de secagem por pulverização, o solvente é eliminado e o agente de suporte (por exemplo, TPGS e fosfatidil-colina) é precipitado para formar "micropartículas" no interior de partículas de amido maiores. As micropartículas amorfas, não cristalinas, são facilmente libertadas das partículas de amido em contacto com os fluidos intestinais. Depois disto, as micropartículas são compatíveis e coalescem com micelas intestinais de fosfolípido/sal biliar. A seguir à secagem por pulverização, as micropartículas solidificadas de emulsionante solubilizante 29 ΡΕ1067913 coprecipitado, fosfolipídico e fitoquímico hidrofóbico estão numa forma facilmente emulsionável. No intestino, a presença de TPGS, por exemplo, resulta numa atividade de agente tensioativo que facilita a incorporação de micelas ricas em fitoquímico em membranas lipídicas de enterócitos. A associação íntima de fitoquímicos em complexos de micropartículas com TPGS produz a captação vantajosa através da superfície intestinal. Conforme descrito

anteriormente para os diésteres de PEG e a classe de tensioativos Cremophor (Buckingham et al., "Reversal Of Multi-drug Resistance In Vitro By Fatty Acid PEG

Diesters" in International J. of Câncer, 65 (1996) 74-79), ação de TPGS no interior da membrana é capaz de prejudicar intencionalmente a função de efluxo de glicoproteína-P. Os TPGS e DIM são presumidos como atuando sinergicamente para inibir a "bomba de efluxo" mediada por glicoproteína-P reduzindo o retorno do indole ou outro fitoquímico a partir de células enterócitos intestinais para o lúmen intestinal. As formulações feitas desta maneira resultou em biodisponibilidade inesperadamente elevada de DIM. Também, os compostos específicos coadministrados para a inibição do sistema da enzima CYP 3A4 dentro de enterócitos podem ser adicionados à preparação no passo de composição. Este componente "anti-CYP 3A4" é exemplificado pelo concentrado de toranja ou sulfoforano dos bróculos, mostrou anterior-mente aumentar a absorção de substratos de CYP 3A4 pela inibição do metabolismo de substâncias uma vez dentro das células enterócitos. 30 ΡΕ1067913 A ação inesperada de TPGS não só como um emulsionante mas também como um inibidor da bomba de efluxo em combinação com fitoquimicos que também inibem a glicoproteína-P e enzimas CYP 3A4 resultou em formulações de substâncias dietéticas e tensioativos que estimulam a sua própria absorção através da ação sinérgica. Cada preparação descrita nos exemplos seguintes aumenta a biodisponibilidade de substâncias dietéticas hidrofóbicas pela combinação de três ações especificas: i) incorporação aumentada em micelas intestinais e penetração dos enterócitos através da ação de TPGS e f osf olipidos; ii) inibição do efluxo mediado por glicoproteina-P de volta para o lúmen intestinal através dos efeitos combinados de TPGS e DIM; e iii) inibição do metabolismo de substâncias hidrofóbicas entregues pelo CYP 3A4 através de ação de concentrado de toranja coadministrado ou fitoquimicos como sulfoforano ou DIM. Os fitoquimicos absorvidas são por conseguinte passados para a circulação linfática e portal em concentração aumentada, em comparação com a administração sem processamento para o interior de microparticulas de TPGS/fosfolipidios e coadministração com um inibidor de CYP 3A4 como concentrado de toranja ou sulfoforano.

Aplicações da tecnologia de formulação existem para fitoquimicos sintéticos puros como DIM e crisina, e para a preparação de produtos naturais tais como concentrados de feijão-soja, extratos de urtiga (Urtica dioica) e preparações de pólen de abelhas ou própolis. Em cada caso, o processo de formulação segrega componentes 31 ΡΕ1067913 fitoquímicos solúveis em lípidos a partir de componentes solúveis em água no produto final. 0 uso de hexanol, propilenoglicol ou outro sistema de solventes no processo de formulação reparte substâncias compatíveis lipídicas nas micropartículas de TPGS e fosfolípidos, deixando as substâncias solúveis em água residir no amido ou outro agente de suporte formador de material de matriz. No caso de Urtica dioica, por exemplo, substâncias solúveis em lípidos como ácido hidroxioctadecanóico, possuindo atividade antiaromatase, são segregadas nos complexos TPGS/fosfolípidos enquanto os fitoquímicos mais solúveis em água são segregados para a matriz de amido. A biodisponibilidade dos fitoquímicos mais hidrofóbicos é aumentado pelo processo de formulação. Pólen de abelhas e própolis representam produtos naturais nos quais as flavonas, incluindo a crisina, estão concentradas numa mistura de grânulos de pólen e resinas vegetais (Siess et al., "Flavonoids of Honey and Propolis: Characterization and effects on hepatic drug-metabolizing enzymes and benzo[a]pyrene-DNA binding in rats" in J. Agric. Food Chem., 44 (8) (1996) 2297-2301). Uma vez que a atividade indutora do CYP de própolis dietético é superior à do extrato de flavonoides de própolis, o processamento do pólen de abelha (estreitamente relacionado com o própolis) de acordo com a presente tecnologia de formulação foi experimentada para proporcionar uma preparação útil para suplementação dietética. A adição de um passo de moagem e 32 ΡΕ1067913 dissolução da mistura complexa num sistema solvente à base de propilenoglicol permitiu a microencapsulação dos componentes de flavona insolúveis em água em associação com TPGS. Outros componentes úteis do pólen de abelhas, incluindo os ácidos cinâmicos, foram de modo semelhante associados com TPGS. A vantagem desta abordagem é que a crisina ou outra flavona útil pode ser concentrada proporcionando às abelhas uma fonte vegetal de conteúdo de flavonas conhecido, tal como girassóis, obviando à necessidade de pré-processamento de purificação ou da sintese sintética da crisina. As formulações de preparações processadas combinadas de DIM e crisina permitiram uma eficácia aumentada no equilíbrio do metabolismo do estro-génio, pela permissão da entrega simultânea de substâncias que induzem CYP1A1/1A2 e inibem a aromatase CYP. 0 uso dos componentes descritos acima permitiu a formulação de suplementos dietéticos que modificaram a atividade do CYP para promover o metabolismo mais benéfico do estrogénio em três condições especificas. Estes incluem a promoção da saúde da próstata e da limitação da acumulação de estrogénio associada com o envelhecimento masculino, o ajustamento do metabolismo do estrogénio em mulheres para promover a formação de 20H-estrona e manter os níveis de estrogénio e a promoção de uma proporção alta de testosterona para estrogénio para promover o condicionamento físico em atletas. 33 ΡΕ1067913 5.1. Formulação para ajustamento do CYP no envelhecimento

MASCULINO

Esta formulação combinou os efeitos de modulação das enzimas CYP de DIM, crisina e do produto natural Urtica dioica para intervir em aspectos relacionados com o estrogénio do envelhecimento masculino ou "andropausa". Em distinção da visão tradicional do envelhecimento masculino, como principalmente relacionado com a diminuição da testosterona biodisponivel, a presente invenção introduz o conceito do envelhecimento masculino como impulsionado pela acumulação de estrogénio e depuração (ou «clearance») de estrogénio diminuída. 0 uso nesta formulação de DIM biodisponivel aumentou as enzimas CYP responsáveis pelo metabolismo de estrogénios para 20H-estrona e 2-metoxi-estrona. A ação da formulação com DIM, em conjunto com a crisina biodisponivel, reduziu não só a combinação de precursor de androstenodiona (Jellinck et al., "Influence of índole carbinols and growth hormone on the metabolism of 4-androstenedione by rat liver microsomes" in J. Steroid Biochemistry and Molec. Biol., 46:6 (1993) 791-798) e a atividade do sistema da enzima aromatase CYP para reduzir ainda mais os níveis teciduais de estrogénio. A adição de extratos de Urtica dioica proporcionou atividade anti-aromatase adicional, na forma de ácido hidroxi-octa-decanóico bem como um componente solúvel em água que impede especificamente a ativação de estrogénio da globulina de ligação à hormona sexual (SHBG ou GLHS) (Hryb et al., "The effect of extracts of the roots of the Stinging Nettle 34 ΡΕ1067913 (Urtica dioica) on the interaction of SHBG with its receptor on human prostatic membranes", Planta Medica, 61 (1995) 31-32). Estas atividades combinadas sobre o metabolismo e ação esteroide reduzem a estimulação guiada por estrogénio da glândula da próstata, reduzem os aumentos relacionados com estrogénio na síntese da SHBG pelo fígado e promovem o aumento da testosterona biodisponível. 5.2. Formulação para o ajustamento do CYP para promover o

EQUILÍBRIO DE ESTROGÉNIO NA MULHER

Uma formulação para a mulher foi desenvolvida usando DIM biodisponível, extrato de «saw palmetto», extrato de chá verde e concentrado de fitoestrogénio (por exemplo, concentrado de isoflavonas de soja). Em contraste com a formulação para os homens, esta combinação de fitoquímicos de modulação da enzima CYP preserva e suporta os níveis de estrogénio. A indução por DIM de enzimas CYP 1A1/1A2 assegura o metabolismo do estrogénio na direção segura de 20H-estrona, aumentando assim a razão de 20H para 160H-estrona. A ação dos extratos de «saw palmetto» e chá verde, não utilizados anteriormente em suplementos para mulheres, é bloquear 5-alfa-redutase e, assim, preservar a androstenodiona (S. Liao e R. A. Hiipakka, Biochem. Bio-phys. Res. Comm., 214 (3) (1995) 833-38). Androstenodiona, derivada diretamente de DHEA, é um substrato para a aromatase CYP e uma importante fonte de estrogénio em mulheres idosas. Este novo uso de «Saw Palmetto» na mulher, e o evitar da crisina ou outro inibidor de aromatase, 35 ΡΕ1067913 preserva a atividade da aromatase CYP e mantém o estrogénio derivado de precursores de androgénios. 0 uso de isoflavonas de soja na formulação proporciona metabolitos ativados, especialmente equol, daidzeina e genisteina, que têm ação predominantemente estrogénica. Niveis mais elevados de estrogénio e isoflavonas de soja suportam a mineralização óssea e aumentam a produção de SHBG pelo figado. A SHBG nas mulheres é protetora do tecido da mama e uterino, prevenindo a estimulação excessiva pelo estrogénio não ligado. Pelo ajustamento do equilíbrio da atividade da enzima CYP, esta formulação aumenta a segurança da Terapia Hormonal Substitutiva (THS) com estrogénio, progesterona e DHEA. Num modo alternativo, um concentrado de lignanos que produzem os metabolitos estrogénicos, enterodiol e enterolactona, pode ser substituído por concentrado de isoflavonas de soja. 5.3. Formulação para Ajustamento do CYP para Promover o Condicionamento Físico

Uma formulação de suplemento dietético de promoção do condicionamento e massa muscular em atletas foi desenvolvida com base numa combinação de DIM biodisponível, crisina biodisponível, extrato de «Saw Palmetto» e extrato de chá verde. Uma proporção elevada de testosterona para estrogénio foi promovida através dos efeitos moduladores da enzima CYP destes fitoquímicos combinados. A ação da crisina em conjunto com extratos de «saw palmetto» e chá verde preservou os níveis de androstenodiona pela limitação 36 ΡΕ1067913 do metabolismo através da aromatase CYP e 5-alfa-redutase. Níveis mais elevados de androstenodiona resultam na conversão aumentada para testosterona, especialmente se acompanhado de suplementação adicional com DHEA e androstenodiona. 0 DIM biodisponível baixou o estrogénio circulante devido ao aumento da depuração através de 20H-estrona e 2-metoxiestrona. Juntamente com a inibição de aromatase por crisina, o efeito DIM ajudou a preservar a secreção de LH da hipófise, uma vez que o estrogénio e a aromatase atuam para inibir essa secreção. Maiores níveis de LH promoveram uma maior produção de testosterona nos homens. Esta combinação de substâncias dietéticas desloca o metabolismo esteroide a favor de uma proporção de testosterona para estrogénio elevada, especialmente nas células musculares. Para melhorar os efeitos moduladores de CYP da formulação, o extrato de Urtica dioica contendo o princípio de inibição da aromatase, ácido hidroxi--octadecanóico, foi adicionado à formulação. Quando combinado com exercício e treino de resistência, o anabolismo e hipertrofia muscular resultaram de suplementação dietética com a formulação. 5.4. Maximização da Absorção do Ingrediente Ativo

Cada uma das formulações acima incluem adicionalmente quer concentrado de toranja quer extrato vegetal de crucíferas contendo sulfoforano para limitar a ação do "metabolismo pré-sistémico" de CYP 3A4 intestinal de componentes fitoquímicos. Efeitos de aumento de captação 37 ΡΕ1067913 também foram derivados da ação de TPGS e DIM quando eles estavam presentes. A prática preferida da suplementação dietética com as formulações acima também envolve a administração de suplementos com pequenas quantidades de alimentos gordos. Isto encoraja ainda mais a captação de fitoquimicos lipossolúveis através do aumento da velocidade de formação de quilomícron do enterócito. A formação aumentada de quilomícron e o fluxo para dentro do fluxo linfático melhora a absorção total de substâncias por via linfática evitando o metabolismo de "primeira passagem" pelo fígado. 5.5. Outras Doenças , Condições ou Distúrbios que podem ser

TRATADOS COM AS COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Utilização de sumo de toranja, concentrado de sumo de toranja ou concentrado e toranja, isolado ou em combinação com DIM processado, proporciona um método para o tratamento de perturbações associadas com um desequilíbrio no metabolismo dos estrogénios caraterizado pela predominância de atividade de estrogénio sobre a atividade de outros esteroides sexuais. Este desequilíbrio também pode ser caraterizado por uma elevação na proporção de metabo-litos de 16-hidroxi-estrogénio para metabolitos de 2-hidro-xi-estrogénio, quando comparado com a população normal. Este método de tratamento de distúrbios associados a desequilíbrio no metabolismo de estrogénio aplica-se particularmente a distúrbios do envelhecimento masculino caraterizados pela acumulação de estrogénio, tais como ateros- 38 ΡΕ1067913 clerose prematura (G. B. Phillips et al., "Association of hyperestrogenemia and coronary heart disease in men in the Framingham cohort" in American J. of Medicine, 74 (1983) 863-869) e hipertrofia da próstata (P. H. Gann et al., "A prospective study of plasma hormone leveis, nonhormonal factors, and development of benign prostatic hyperplasia" in The Prostate, 26 (1995) 40-49). O método aplica-se de forma semelhante a distúrbios do sistema imunológico, em homens e mulheres caraterizados por desequilíbrio de estrogénio, tais como lúpus eritematoso sistémico (R. G. Lahita et al. , "Increased 16-cx-hydroxylation of estradiol in systemic lupus erythematosus" in J. Clin. Endocrinol. Metab., 53 (1981) 174-178). O método aplica-se a tratamento de distúrbios em mulheres associados com desequilíbrio de estrogénio, incluindo transtornos de humor, conforme visto com a sindrome de tensão pré-menstrual (TPM) , dor na mama recorrente ou mastalgia (B. Ashley, "Mastalgia" in Lippincotts Primary Care Practice, 2(2) (1998) 189-93), e condições relacionadas com o virus do papiloma humano, particularmente displasia cervical (D. W. Sepkovic et al., "Estrogen Metabolite Ratios and Risk Assessment of Hormone

Related Cancers: Assay Validation and Prediction of Cervical Câncer Risk" in Annals of the N. Y. Acad. of

Science, 768 (1995) 312-316) e papilomatose respiratória recorrente (K. Auborn et al., "Estrogen metabolism and laryngeal papillomatosis: A Pilot Study on Dietary

Prevention" in Anticancer Research, 18 (1998) 4569-4574). O método aplica-se de forma semelhante à prevenção de distúrbios, especialmente em mulheres associadas com 39 ΡΕ1067913 desequilíbrio de estrogénio, incluindo alterações fibro-quísticas da mama, cancro da mama (H. L. Bradlow, et al., "16 a hydroxylation of estradiol: a possible risk marker for breast câncer" in Annals NY Acad. Sei., 464 (1986) 138--151; e G. C. Kabat et al., "Urinary estrogen metabolites and breast câncer: a case-control study" in Câncer Epidemiol Biomarkers Prev., 6(7) (jul 1997) 505-9), fibromas uterinos, cancro de endométrio (J. Fishman et al., "Increased estrogen-16-hydroxylase activity in women with breast and endometrial câncer" in Journal of Steroid Biochem. and Mol. Blol., 20 (1984) 1077-1081) e endometriose. O método aplica-se especificamente à redução do risco de cancro da mama (J. Schneider et al., "Abnormal oxidative metabolism of estradiol in women with breast câncer" in Proc Natl Acad Sei USA, 79 (1982) 3047-3051) e cancro uterino associado à terapia hormonal substitutiva envolvendo estrogénio.

Seguem-se exemplos para demonstrar a ação aumentadora da biodisponibilidade dos ingredientes e formulações conforme descrito. A tecnologia de sistemas de entrega foi estudada e mostrou aumentar a absorção de DIM ou crisina. A forte atividade indutora da enzima CYP do DIM foi utilizada para demonstrar a vantagem do DIM processado sobre o DIM cristalino sozinho. Esta abordagem tem sido utilizada em animais com alimentação com ou DIM cristalino ou DIM processado e pela medição direta dos níveis de enzimas CYP no fígado e outros tecidos. Nos seres humanos, as mesmas comparações foram feitas usando ensaios repetidos 40 ΡΕ1067913 de metabolitos de esteroides na urina em vez de análise de tecido direta. Uma vez que os metabolitos esteroides estão diretamente ligados a niveis teciduais de enzimas CYP e à atividade, o uso de estudos de urina foi utilizado como medida indireta mas refletiva de alterações da atividade do CYP no tecido. 6. EXEMPLOS 6.1. Exemplo 1:

Ingredientes de uma Formulação de Aumento de Absorção para DIM ou Outros índoles Dietéticos Insolúveis

Lista de Ingredientes: 1. Cerca de 10 a cerca de 40 por cento numa base ponderai de um indole dietético selecionado de entre os seguintes, isolado ou em combinação: di-indolilmetano (3,3'-di-indolilmetano) puro, tri-indole([2-(indol-3-il--metil)-indol-3-il]indol-3-ilmetano) linear, tri-indole-(5,6,11,12,17,18-hex-hidrociclononal[1,2-b:4,5-b':7, 8 —b] :-tri-indole) cíclico e di-indole(1-(3-hidroxi-metil)--indolil-3-indolilmetano linear. 2. Cerca de 10 a cerca de 40 por cento, numa base ponderai do seguinte, isolado ou em combinação: vitamina E succinato de polietilenoglicol 1000; vitamina E succinato de polietilenoglicóis com polietilenoglicol com uma massa molecular no intervalo de 400-2000; ésteres de polietilenoglicol formados por ácido esteárico; polivinilpirrolidonas. 3. Cerca de 5 a cerca de 20 por cento, numa base 41 ΡΕ1067913 ponderai, dos seguintes, isolados ou em combinação: fosfatidilcolina (derivado a partir de lecitina de soja e fornecido como Phospholipon 50G de Rhone Poulenc Rorer), dioleoil-fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, dioleoilfos-fatidilglicerol, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoil-fosfatidilcolina, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas ou esfingomielinas. 4. Cerca de 15 a cerca de 30 por cento, numa base ponderai, dos seguintes, isolados ou em combinação: hexanol, etanol, butanol, heptanol, 2-metil-l-pentanol, vários solventes de cetona que deverão ser aceitáveis nos alimentos, tais como cetona etilica e metilica, acetona e outros; propilenoglicol; e certos solventes de ésteres, tais como acetato de etilo. 5. Cerca de 20 a cerca de 40 por cento, numa base ponderai, dos seguintes, isolados ou em combinação: amido modificado tal como Capsul™ Starch da National Starch, Inc., metilcelulose, hidroxipropil-metilcelulose, hidroxi-etilcelulose, hidroxipropiletilcelulose, pectina, goma arábica, gelatina ou outra preparação que forma matriz polimérica conhecida dos peritos na técnica, solúvel em água e adequada para secagem por pulverização. 6. Cerca de 0,5 a cerca de 35 por cento, numa base ponderai, dos seguintes, isolados ou em combinação: aerosil 200, ou qualquer outro excipiente aumentador do fluxo de silica, ou sal relacionado, conhecido dos peritos na técnica. 42 ΡΕ1067913 6.2 . Exemplo 2 : LISTA Detalhada dos Passos de Produção Utilizados para o Fabrico de DIM Processado ("DIM-p") 1. 6,75 kg de TPGS foram aquecidos justamente acima do seu ponto de fusão, com agitação constante, num recipiente aquecido ("primeiro vaso"). 2. 9,38 kg de hexanol e 9,83 kg de DIM moido em jato foram adicionados ao primeiro vaso e a mistura foi agitada a uma suspensão uniforme a 70 °C. 1,4 kg de fosfatidil- -colina foram em seguida adicionados. 3. Num segundo vaso maior, 185 L de água e 10,7 kg de amido foram profundamente misturados com uma lâmina Cowles. Esta mistura foi neutralizada para pH 7 com uma pequena quantidade de carbonato de sódio e em seguida aquecida a 75 °C e agitada durante 1 hora. 4. 0 conteúdo do primeiro vaso foi adicionado à mistura de amido no segundo vaso maior e profundamente misturado com um misturador tipo rotor/estator de homogeneização a uma velocidade moderada durante 15 minutos. 5. A mistura do passo 4 foi seca por pulverização com uma pequena quantidade (aproximadamente 0,5%) de silica hidrofilica para produzir um pó de fluxo livre de microparticulas finamente dispersas contendo TPGS coprecipitado, fosfatidilcolina e DIM numa estrutura não cristalina amorfa. 6. O produto em pó fluivel foi recolhido e guardado em sacos de folha sob vácuo, depois de desaeração e lavagem com azoto. 43 ΡΕ1067913 7. A análise da presença do ingrediente dietético inalterado revelou cerca de 30 a cerca de 33 por cento numa base ponderai de DIM. DIM preparado de acordo com o processo do Exemplo 2 é aqui referido como "DIM processado", ou "DIM-p".

Para o tratamento eficaz, a preparação acima é administrada a um mamifero numa dose aproximada de cerca de 1,5 a cerca de 12 mg por kg por dia por administração oral. Esta administração é eficaz no ajustamento do equilíbrio do metabolismo dos estrogénios a favor de 2-hidroxiestrona e 2-metoxiestrona. 6.3. Exemplo 3:

Ingredientes de uma Formulação de Aumento de Absorção para CRISINA ou Outros Flavonoides

Lista de Ingredientes: 1. Flavona, flavonol, flavanona, isoflavona, dímero de flavona na forma microcristalina pura (cerca de 10 a cerca de 40% numa base ponderai) selecionado do grupo constituído por: crisina apigenina, campferol, quercetina, morina, naringenina, genisteína, biochanina A, daidzeína, amentoflavona , ginkgetina, isoginkgetina. 2. Cerca de 10 a cerca de 40 por cento, numa base ponderai, dos seguintes, isolados ou em combinação: vitamina E succinato de polietilenoglicol 1000; vitamina E succinato de polietilenoglicóis com polietilenoglicol com 44 ΡΕ1067913 uma massa molecular no intervalo de 400-2000; ésteres de polietilenoglicol formados por ácido esteárico; polivinil-pirrolidonas. 3. Cerca de 5 a cerca de 20 por cento, numa base ponderai, dos seguintes, isolados ou em combinação: fosfatidilcolina (derivado de lecitina de soja e fornecido como Phospholipon 50G de Rhone Poulenc Rorer), dioleoil-fosfatidilcolina; fosfatidilglicerol; dioleoil-fosfatidil-glicerol; dimiristoil-fosfatidilcolina; dipalmitoilfos-fatidilcolina; fosfatidiletanolaminas; fosfatidilserinas; ou esfingomielinas. 4. Cerca de 15 a cerca de 30 por cento, numa base ponderai, dos seguintes, isolados ou em combinação: hexanol, etanol, butanol, heptanol, 2-metil-l-pentanol, vários solventes de cetona que deverão ser aceitáveis nos alimentos, tais como cetona etílica e metílica, acetona e outros, propilenoglicol e certos solventes ésteres, tais como acetato de etilo. 5. Cerca de 20 a cerca de 40 por cento, numa base ponderai, dos seguintes, isolados ou em combinação: amido modificado tal como Capsul™ Starch da National Starch, Inc.; metilcelulose; hidroxipropilmetilcelulose; hidroxi-etilcelulose; hidroxipropiletilcelulose, pectina, goma arábica; gelatina; ou outra preparação que forma matriz polimérica conhecida dos peritos na técnica, solúvel em água e adequada para secagem por pulverização. 6. Cerca de 0,5 a cerca de 35 por cento numa base ponderai dos seguintes, isolados ou em combinação: aerosil 45 ΡΕ1067913 200, ou qualquer outro excipiente melhorador de fluxo de sílica, ou sal relacionado, conhecido dos peritos na técnica. 6.4. Exemplo 4:

Produção de uma Preparação para Aumentar a Absorção de crisina ("CRISINA-P")

Fabrico de uma formulação aumentadora da absorção para crisina. 1. 6,5 kg de TPGS foram aquecidos justamente acima do seu ponto de fusão com agitação constante num vaso aquecido ("primeiro vaso"). 2. 19,5 kg de propilenoglicol e 7,5 kg de crisina moída em jacto foram adicionados ao primeiro vaso e a mistura foi agitada até uma suspensão uniforme a 80 °C. 0,5 kg de fosfatidil colina foram em seguida adicionados. 3. Num segundo vaso maior, 75 L de água e 9,5 kg de amido foram profundamente misturados com uma lâmina Cowles. Em seguida, 1 kg de desoxicolato de sódio foi adicionado e misturado com a água e o amido. Esta mistura foi neutrali- zada a pH 7 com uma pequena quantidade de carbonato de sódio e , em seguida, aquecida a 75 °C e agitada durante 1 hora. 4 . 0 conteúdo do primeiro vaso foi adicionado à mistura de amido no segundo vaso maior e profundamente misturado com um misturador tipo rotor/estator de homogeneização a uma velocidade moderada durante 15 minutos. 46 ΡΕ1067913 5. A mistura do Passo 4 foi seca por pulverização com uma pequena quantidade (aproximadamente 0,5%) de silica hidrofilica para proporcionar um pó de fluxo livre de microparticulas finamente dispersas contendo TPGS coprecipitado, fosfatidilcolina e DIM numa estrutura não cristalina, amorfa. 6. O produto em pó fluido foi recolhido e armazenado em sacos de folha evacuados, após desaeração e lavagem com azoto. 7. A análise à presença de ingrediente dietético inalterado revelou cerca de 25 a cerca de 30 por cento numa base ponderai de crisina. A crisina preparada de acordo com o processo do Exemplo 4 é aqui referida como "crisina processada", ou "crisina-p". O método através do qual a preparação acima é administrada a um animal com uma dose aproximada de cerca de 3 a cerca de 30 mg/kg/dia, por administração oral é útil no ajustamento do equilíbrio do metabolismo do estrogénio pela limitação da atividade do sistema de enzima aromatase CYP. Isto reduz a conversão de androstenodiona em estrogénio. 6.5. Exemplo 5:

Fabrico de uma Formulação de Intensificação da Absorção de Pólen de Abelhas O pólen de abelhas foi obtido a partir de uma 47 ΡΕ1067913 fonte preferida (C.C. Pollen Co., Phoenix, Arizona) e sustituiu a crisina pura utilizada no fabrico de crisina processada. 0 pólen de abelhas foi moido a húmido para reduzir o tamanho das partículas e esmagar os grãos de pólen. A partir deste ponto foi tratado exatamente como a crisina pura e foram seguidos os passos de fabrico como para a crisina processada. 0 pólen de abelhas foi preparado de acordo com o processo do Exemplo 4 é aqui referido como "pólen de abelhas processado", ou "pólen-p".

Para tratamento eficaz, a preparação acima é administrada a um mamifero numa dose appoximada desde cerca de 5 até cerca de 30 mg por kg por dia por administração oral. Esta administração é eficaz na indução de enzimas CYP hepáticas e, especificamente, na inibição da enzima aromatase CYP. 6.6. Exemplo 6:

Preparação de uma Formulação de Intensificação da Absorção da Combinação de DIM processado (DIM-p), Crisina Processada (CRISINA—P), Urtica dioica e Concentrado de TORANJA para a Melhoria da Saúde Masculina e do Bem-Estar da Glândula da Próstata

Com preparações de partículas de e preparados de acordo com os passos acima, os seguintes ingredientes secos são combinados de acordo com as seguintes razões (mg) , 48 ΡΕ1067913 juntamente com excipientes, agentes de ligação e agentes intensificadores do fluxo adequados para encapsulação ou formação de comprimidos: P-DIM™ 150-300 mg

Crisina-p 300-1500 mg

Extrato de Urtica dioica 300-600 mg

Concentrado de sumo de toranja 300-600 mg

Alternativamente, a preparação acima pode ser preparada numa forma de cápsula de gelatina «gelcap» com a adição de Pygeum africanum, licopeno, vitamina D e sais de zinco, em suspensão num agente de suporte adequado tal como óleo de sementes de abóbora.

Para tratamento eficaz, são administrados de um a três dos comprimidos ou cápsulas acima uma vez por dia a um mamifero por via oral. 6.7. Exemplo 7:

Preparação de uma Formulação de Intensificação da Absorção da Combinação de DIM Processado (DIM-p), Concentrado de Isoflavona de Soja, Concentrado de «Saw Palmetto», Extrato de Chá Verde e Concentrado de Toranja para melhorar o Equilíbrio Hormonal na Mulhere

Produção de uma formulação de intensificação da absorção da combinação de DIM-p, concentrado fitoestrogénio 49 ΡΕ1067913 e concentrado de sumo de toranja é útil para melhorar o estado geral de saúde e o bem-estar do tecido da mama e do útero na mulher.

Os ingredientes incluem os seguintes: 1. 0 concentrado de fitoestrogénio é obtido a partir de um extrato concentrado de soja contendo as isoflavonas genisteina, daidzeina e lignanos em niveis significativos por uma técnica de extração adequada. Uma tal extração aquosa numa solução diluida de álcali é exemplificada pelo produto em pó comercialmente disponível, Genista por Natus, Inc. 2. Com preparações de partículas de DIM-p, concentrado de fitoestrogénio, extrato de chá verde e concentrado de sumo de toranja, os seguintes ingredientes secos são combinados de acordo com as seguintes proporções (mg) , juntamente com excipientes, agentes ligantes e aumentadores de fluxo adequados para encapsulação ou formação de comprimidos: 150-300 mg 300-600 mg 300-600 mg 300-600 mg 200-1000 mg DIM-p

Concentrado de fitoestrogénio Extrato de chá verde Concentrado de «saw palmetto» Concentrado de sumo de toranja 0 método de tratamento pelo qual 1-6 cápsulas ou comprimidos por dia é administrada por via oral a uma mulher. 50 ΡΕ1067913 6.8 . Exemplo 8 :

Preparação de uma Formulação de Intensificação da Absorção da Combinação de DIM processado, Crisina processada, Concentrado de «Saw Palmetto», Extrato de Chá Verde, Urtica dioica e Concentrado de Sumo de Toranja para Melhorar o Condicionamento Fisico

Com preparações de partículas de DIM-p, crisina-p e Urtica dioica preparados de acordo com os passos acima descritos os seguintes ingredientes secos são combinados de acordo com as seguintes proporções (mg), juntamente com os excipientes, agentes de ligação e agentes intensificadores de fluxo adequados para encapsulação ou formação de comprimidos: 150-300 mg 300-1500 mg 300-600 mg 300-600 mg 300-600 mg 300-600 mg DIM-p crisina-p

Concentrado de «Saw Palmetto» (4:1) Extrato de Urtica dioica Extrato de chá verde Concentrado de sumo de toranja O método de tratamento pelo qual 1-6 cápsulas ou comprimidos por dia é administrada por via oral a um ser humano com uma pequena quantidade de alimentos gordos e água. 51 ΡΕ1067913 6.9. Exemplo 9:

Evidência para Absorção Aumentada de DIM Processado em Animais 0 efeito de intensificação da absorção do processo de microencapsulação de DIM (produzindo DIM-p) foi demonstrada em experiências com ratos. Ratos Sprague Dawley machos e fêmeas maduros foram alimentados quer com DIM cristalino quer com DIM processado. Após 3 dias, os ratos foram sacrificados e os seus fígados colhidos. A seguir ao isolamento de microssomas do fígado, as enzimas CYP foram avaliadas por Western Blots e CYP 1A1/1A2 mostrou ser até 11,4 vezes maior após a alimentação com DIM processado do que com o DIM cristalino. 0 procedimento e os resultados são os seguintes:

Grupos de ratos Sprague-Dawley foram alimentados por sonda com DIM cristalino ou DIM processado suspenso em metilcelulose numa dose de 100 mg por kg, durante 3 dias consecutivos. Após o sacrifício, os fígados foram perfundidos com solução salina e processados para isolar a fração microssómica. A indução enzimática comparativa foi medida em microssomas com anticorpos contra o total do enzimas citocromo (CYP) e específicas CYP 1A1/1A2. Os resultados são como se segue, expressos como uma percentagem do nível de controlo. No ensaio CVP1A1/1A2 uma vantagem de 3, 9 vezes do DIM processado relativa mente ao DIM cristalino foi mostrado nos machos e uma 52 ΡΕ1067913 vantagem de 11,4 vezes de DIM processado relativamente a DIM cristalino foi mostrado nas fêmeas.

Citocromo Avaliado Formulação de DIM I. Total de CYP (nmol/mg cristalino DIM-p II. CYP 1A1/1A2 (unidades cristalino DIM-p cristalino DIM-p

Percentagem de controle (DIM-p sobre DIM cristalino) de proteína) machos 140% machos 224% (1,6 vezes) de densitometria) machos 462% machos 1,831% (3,9 vezes) fêmeas 232% fêmeas 2,663% (11,4 vezes) 6.10. Exemplo 10:

Evidência de que DIM devem ser incorporados na forma processada ter aumentado BIODISPONIBILIDADE DE ANIMAIS A segunda experiência em animais foi realizada para demonstrar a vantagem da tecnologia de microencapsulação e a sua função como um sistema de entrega de nutrientes. A biodisponibilidade do DIM processado foi comparada com a do DIM cristalino coadministrado com "branco" de 53 ΡΕ1067913 TPGS/fosfatidilo (partículas) para demonstrar a necessidade de processamento de microencapsulação para obter um ganho de absorção. A indução de enzimas CYP foi novamente utilizada como um biomarcador de biodisponibilidade. 0 estudo comparou a indução da enzima resultante da exposição de ratas ao DIM cristalino, I3C e DIM processado em doses relevantes na alimentação. Níveis de CYP 1A1/1A2 e 1B1 foram medidos em microssomas uterinos e hepáticos como um ponto final substituto de captação e biodisponibilidade.

Um total de 30 ratos Sprague-Dawley fêmeas pesando aproximadamente 200 g foram tratados como se segue: 1. Aclimatação de 5-7 dias em gaiolas em grupo, alimentação com dieta minimamente indutora de AIN76A. 2. 3 dias de alimentação com a mesma alimentação misturada com 7 combinações diferentes de índoles dietéticos. 3. Sacrifício de animais cerca do dia 10. Colheita de fígados e úteros após a perfusão de órgãos abdominais para remover sangue. 4. Processamento de órgãos para se obter a fração microssómica rica em enzima CYP.

5. Determinação por immunoblot dos níveis de enzimas CYP específicos por meios padrão, utilizando anticorpos CYP existentes. ΡΕ1067913 54

Foram ensaiados microssomas dos seguintes grupos:

Grupo N Alimentação Obj etivo/Tratamento Especial 1. 3 plano AIN76A Neg Controlo 2 . 3 plano AIN76A Pos Controlo/TCDD (dioxina) por sondagem 3. 3 DIM baixo 2 mg/kg/dia DIM cristalino 4 . 3 DIM alto 10 mg/kg/dia DIM cristalino 5. 3 DIM-p baixo 6,8 mg/kg/dia Comparar DIM 6. 3 DIM-p alto 34 mg/kg/dia Comparar DIM 7 . 3 I3C baixo 5 mg/kg/dia Comparar I3C 8 . 3 I3C alto 25 mg/kg/dia Comparar I3C 9. 3 Placebo TPGS 34 mg/kg/dia Verificar TPGS 10 . 3 TPGS 6,8 mg/kg/dia e DIM 2 mg/kg/dia 0 peso dos órgãos foi obtida na necropsia. Os níveis de enzimas CYP específicas foram comparados com base em unidades de densitometria padronizados. Os resultados demonstraram clara vantagem de DIM processado sobre DIM cristalino coadministrado com TPGS. Os resultados expressos como unidades de densitometria indicando a captação de indole e grau de indução enzimática são listados de acordo com os grupos acima: 55 ΡΕ1067913

Grupo N Forma de DIM Unidades de densitometria 1 . 3 Controlar 0 2 . 3 TCDD (dioxina) (controlo positivo) 251,7 3. 3 DIM baixo 2 mg/kg/dia 0 4 . 3 DIM elevada de 10 mg/kg/dia 0 5. 3 DIM-p baixo 6,8 mg/kg/dia 0 6. 3 DIM-p alto 34 mg/kg/dia 38,2 7 . 3 I3C baixo 5 mg/kg/dia 0 8. 3 I3C alto 25 mg/kg/dia 5,1 9. 3 Placebo TPGS 34 mg/kg/dia 0,8 10. 3 TPGS e cristais DIM 2,5 Uma vez que DIM-p é 34% DIM cristalino numa ponderai, uma quantidade em mg equivalente de DIM foi entregue no grupo 4 (DIM alto) e grupo 6 (DIM-p alto).

Estes resultados demonstram o aumento na biodis-ponibilidade de DIM-p sobre o DIM cristalino e a exigência de que DIM esteja presente na forma de microparticulas processadas como no DIM-p de maneira a ter uma tal biodisponibilidade acrescida. 6.11. Exemplo 11:

Evidência de que DIM Deve Ser Incorporado na Forma Processada para Ter Biodisponibilidade Aumentada em Seres Humanos

Uma vez que o efeito indutivo de CYP de indoles dietéticos se reflete diretamente por alterações no padrão de metabolismo de estrogénio, a recolha de urina e a análise quantitativa à presença de metabolitos-chaves é um 56 ΡΕ1067913 ponto final substituto de confiança para o estado da enzima CYP. Esta abordagem tem sido desenvolvida como uma metodologia de ensaio por Immunacare, Inc.. 0 seu imunoensaio ELISA Estratest™ para 20H- e ΙβΟΗ-estrona na urina tem sido utilizado na avaliação da biodisponibilidade de DIM-p. Este teste fornece uma medida quantitativa da 20H-estrona e ΙβΟΗ-estrona em ng/mL da primeira urina da manhã. Estes são os metabolitos gerados a partir de enzimas citocromo CYP 1A1/1A2. A partir desta quantificação, uma razão 20H/160H é calculada. 0 Estratest™ foi usado pela primeira vez para replicar a evidência de que DIM-p proporcionou biodisponibilidade aumentada relativamente a DIM cristalino em humanos, conforme foi mostrado em animais. DIM cristalino ou DIM-p foi administrado a seres humanos durante vários periodos em várias doses. Antes e depois foram feitas recolhas de urina e analisadas por ensaio ELISA em relação às quantidades e proporções de 20H-versus 160H-estrona. Estes são os metabolitos gerados a partir de enzimas CYP 1A1/1A2. Os resultados mostraram claros aumentos na proporção 20H/160H.

Individual Dose de DIM % Aumento da Razão 20H/160H Forma de DIM DF 100 mg/dia cristalino 0% MZ 300 mg/dia cristalino 0% DF 50 mg/dia DIM-p 38% MZ 200 mg/dia DIM-p 71% 57 - ΡΕ1067913

Em segundo lugar, existe evidência de indução enzimática em doses progressivamente mais baixas de DIM processado dadas por períodos de pelo menos uma semana avaliada por antes e depois de razões 20H/160H. Esta série de estudos de intervalo de dose confirmou a biodispo-nibilidade oral de DIM processado em dosagens abaixo de um mg/kg de massa corporal uma vez que muitos dos indivíduos testados pesavam 70+ kg. Estes resultados demonstram a biodisponibilidade da formulação de DIM processado a um nível de dosagem menor do que a demonstrada no único estudo de alimentação animal com DIM, que mostraram nenhuma indução de enzima hepática quando os animais foram alimentados com um mg/kg de DIM em óleo de milho. Assim, a biodisponibilidade melhorada de DIM-p sobre DIM cristalino é suportada.

Indivíduos i Dose de DIM % Aumento da Razão 20H/160H lForma de DIM E.C. 300 mg/dia DIM-p 235 o. o M.W. 200 mg/dia DIM-p 67% C.C. 200 mg/dia DIM-p 39% K.K. 100 mg/dia DIM-p 318 o “O s.s. 100 mg/dia DIM-p 15% P.S. 100 mg/dia DIM-p 40% E.Z. 75 mg/dia DIM-p ΡΕ1067913 58 (continuação)

Individu Dose de DIM % Aumento da Razão Forma de os 20H/160H DIM M.F. 75 mg/dia DIM-p 4% K.W. 75 mg/dia DIM-p 79% M.W. 50 mg/dia DIM-p 66% H.B. 50 mg/dia DIM-p 37% M.S. 50 mg/dia DIM-p 158% K.D. 25 mg/dia DIM-p 45% M.W. 25 mg/dia DIM-p 36% 6.12 . Exemplo 12 :

Evidência de que a Crisina Processada Promove a Intensificação da Absorção

A técnica analítica da cromatografia gasosa associada a espetrometria de massa é capaz de identificar e quantificar todas as espécies moleculares de metabolitos esteroides excretados na urina. Um passo de pré-digestão com a enzima glucuronidase foi padronizado para quebrar os metabolitos glucuronido de esteroides e assim produzir um "perfil de metabolito esteroide". Esta técnica foi utilizada para demonstrar os desvios no metabolismo dos estrogénios resultantes de suplementação dietética com crisina biodisponível e crisina em combinação com DIM 59 ΡΕ1067913 biodisponível. Um experimento em seres humanos foi conduzida para demonstrar a ação de promoção da absorção de crisina processada. 0 único estudo publicado anteriormente para a biodisponibilidade oral de um flavonoide em seres humanos não demonstrou qualquer absorção.

Para testar a biodisponibilidade de crisina microparticulada processada com TPGS e fosfatidilcolina (crisina processada), foram feitas recolhas de urina de 24 horas num indivíduo humano em 3 momentos. Uma recolha de urina de 24 horas é uma recolha de toda a urina produzida por um indivíduo ao longo de um periodo de 24 horas. Estas recolhas foram testados em primeiro lugar na linha de base sem suplementação; em segundo lugar, depois de uma semana a tomar 500 mg por dia de crisina microcristalina (crisina); em terceiro lugar, depois de mais uma semana a tomar 500 mg por dia de crisina na forma de crisina processada (crisina processada). O método analítico para a determinação do perfil estrogénio/androgénio urinário foi baseado em cromatografia gasosa capilar-espetrometria de massa (GC/MS) no modo de monitorização de ião selecionado (D. C. Johannessen, H. Adlecreutz, T. Fotsis e P. E. Lonning, "Plasma and urinary oestrogens in breast câncer patients on treatment with 4-hydroxyandrostenedione", British J. of Câncer, 68 (1993) 393-398). Os seguintes metabolitos esteroides urinários foram determinados: androstenodiona, testosterona, etiocolanolona e androsterona.

Os resultados estão resumidos nas Figuras 1 e 2. 60 ΡΕ1067913

Elas mostram um aumento na excreção de metabolitos de androgénios após utilização da crisina processada mas não após a utilização da crisina microcristalina. Isto é consistente com o aumento da captação de crisina processada, reduzida conversão de androstenodiona em estrona através da aromatase, e produção de testosterona aumentada em virtude da inibição da aromatase. 6.13. Exemplo 13:

Evidência de que DIM PROCESSADO Produz um Padrão Benéfico de Metabolismo de Esteroides em Seres Humanos

Usando a técnica de cromatografia gasosa- espetrometria de massa, uma outra experiência foi realizada com voluntários humanos para demonstrar o efeito do DIM processado em metabolitos urinários de esteroides. Uma amostra de urina de 24 horas foi obtida antes e após 1 semana de suplementação com DIM processado a 200 mg por dia (entregando 70 mg por dia de DIM). A análise de amostras de urina foi realizada por técnicas de GC/MS conforme descrito no Exemplo 12. Um aumento na excreção de androgénios e metabolitos de androgénios favorecendo niveis mais elevados de testosterona, androstenodiona, androsterona e etioco-lanolona é demonstrado nas Figuras 3 e 4 para dois sujeitos.

Num terceiro indivíduo, os efeitos da suplementação de DIM processado sobre o metabolismo de estrogénio foram estudados usando a mesma técnica. Uma 61 ΡΕ1067913 linha de base de recolha de urina de 24 horas foi seguida por uma segunda recolha após 2 semanas de suplementação com DIM processado a 200 mg por dia (entregando 70 mg/dia de DIM) . Os resultados, mostrados na Figura 5, mostraram uma alteração nos metabolitos de estrogénio favorecendo a formação de 2-metoxi-estrona após a suplementação.

Estas análises quantitativas de padrões de excreção de metabolitos de esteroides antes e depois da suplementação mostram efeitos atribuíveis ao DIM processado e são evidência de sua biodisponibilidade reforçada relativamente ao DIM não processado. O fitoquimico processado, através da indução da hidroxilação de estrogénio e da inibição da aromatase produziu uma alteração única e caraterística nos metabolitos urinários de esteroides. 6.14. Exemplo 14:

Estudos de Biodisponibilidade em Humanos Utilizando Determinações de GC-MS de DIM no Plasma Sanguíneo Mostrando Captação Aumentada com DIM PROCESSADO

Um ensaio baseado em GC-MS para DIM e seu metabolito mono-hidroxilado no plasma sanguíneo foi desenvolvido para determinar a biodisponibilidade oral de DIM processado em seres humanos. Esta pesquisa foi feita com base em espetros de massa publicados para DIM e confirmada pelo estudo preliminar de DIM padrão e um conhecido metabolito de DIM identificado no soro de rato a seguir a dosagem oral. 62 ΡΕ1067913 "Intensificação da Absorção de DIM Oral por DIM Processado" 0 ensaio por GC-MS para DIM foi usado para estudar a biodisponibilidade oral de DIM cristalino em comparação com DIM em DIM processado. A uma dose de 1 mg/kg de DIM, estes resultados demonstram um aumento na captação de DIM proveniente de DIM processado. Os resultados, representados na Figura 6, mostram um pico de absorção para DIM aos 120 minutos pós-dose. A área sob a curva é dramaticamente aumentada pela formulação de DIM processado. Apenas um vestigio de DIM foi absorvido a partir do DIM cristalino e este foi observado num momento semelhante ao pico de absorção documentado com DIM processado. O aumento dramático na área sob a curva que se segue à administração oral de DIM processado em comparação com DIM cristalino oral demonstra a atividade e a vantagem da tecnologia de DIM processado. A dose oral de 1 mg/kg/dia representa a dose no intervalo recomendado para a utilização suplementar crónica de DIM. A segunda experiência foi realizada em 3 indivíduos novamente comparando a captação de DIM a partir da formulação cristalina versus a formulação de DIM processado. Este experimento foi conduzido com metade da dose anterior (0,5 mg/kg/dia de DIM). Em dias separados, as formulações que se seguem foram testadas nos mesmos três indivíduos para permitir a comparação da biodisponibilidade 63 ΡΕ1067913 de DIM. Dia 1, DIM cristalino com água (Figura 7); Dia 2, DIM cristalino com 15 cm3 de óleo de sésamo (Figura 8); dia 3, DIM processado com água (Figura 9); Dia 4, DIM processado tomado com sumo de toranja (SDT) (Figura 10). Os resultados mostram aumentos dramáticos na biodisponibilidade de DIM atribuível à formulação de DIM processado, bem como a absorção aumentada de DIM a partir de DIM processado em combinação com SDT que excedeu a absorção a partir de DIM processado isolado.

Uma vantagem clara do DIM processado na promoção da absorção de DIM e persistência de niveis sanguíneos de DIM é vista por comparação dos gráficos do Dia 1 (DIM cristalino) e no Dia 2 (DIM cristalino em óleo de sésamo) ao dia 3 (DIM processado) . A comparação do dia 3 (DIM processado) ao dia 4 (DIM processado e SDT) é facilitada pelo cálculo e comparação de valores relativos para as áreas sob as curvas de nível no sangue (AUCs) para cada indivíduo. Estes valores são contrastados na carta que segue. SUJEITO NÚMERO Área sob a curva (AUC) nanograma/mL X minuto Concentração média nanograma/mL DIM Processado DIM Processado mais SDT DIM Processado DIM Processado mais SDT n° 1 T.K. 12 647,2 14 765,4 42,12 49,22 n° 2 M.Z. 3 835,7 7 423,7 12,79 35,10 n° 3 B.H. 6 523,6 10 906,6 21,75 36, 36 64 ΡΕ1067913

Indivíuo % Aumento na AUC de GFC mais DIM processado _vs. DIM Processado Isolado_ T.K. aumento de 17% M.Z. aumento de 93% B ♦ H ♦_aumento de 67%_ Média aumento de 59%

Como indicado, uma facilitação consistente da captação de DIM resultou da coadministração de DIM e SDT. Esta interação não foi relatada anteriormente. 0 efeito é significativo com o aumento médio do valor de AUC subindo a 59%. Este efeito contribui para o presente método de ajustamento do metabolismo de esteroides, não só por facilitar uma maior resposta sistémica ao DIM mas também por o efeito adicional de SDT aumentar a 2-hidroxilação de estrogénio descrito no Exemplo 15. 6.15. Exemplo 15:

Evidência de que o SOMO DE TORANJA (SDT) Contribui para os Métodos de Ajustamento do Metabolismo de Esteroides em Humanos

SDT, um colaborador conhecido para o aumento da absorção de várias substâncias fracamente solúveis em virtude dos seus componentes inibidores CYP3A4, também contribui para o método presente para o ajustamento benéfico do metabolismo esteroide por um efeito especifico sobre o metabolismo do estrogénio. Foi descoberto que SDT administrado diariamente durante 5 dias, desvia significativamente o metabolismo de estrogénio a favor de metabolitos 2-hidroxi de um modo semelhante ao do DIM 65 ΡΕ1067913 processado. Este efeito surpreendente foi demonstrada em 4 voluntários usando o Estratest para a determinação dos metabolitos de estrogénio 20H e 160H na urina. 0 teste foi realizado em amostras da primeira urina da manhã obtidas antes e após 5 dias de consumo de 8 onças de SDT congelado reconstituído Minute Maid 3 vezes por dia. 0 que segue resume os resultados obtidos.

Indivíduo KK MW BS JL

Aumento em % de 20H/160H 1.613% de aumento 273% de aumento 236% de aumento 516% de aumento

Com base nestes resultados, pode concluir-se que o SDT irá proporcionar um efeito adicional ao do DIM processado. Isto irá amplificar o aumento benéfico em metabolitos 2-hidroxiestrogénio quando o SDT é usado como um componente dos suplementos dietéticos da presente invenção. Este efeito é separado e adicional para a atividade intensificadora da absorção do SDT coadministrado com substâncias fracamente solúveis.

Em conclusão, tem sido descrita nova tecnologia que proporciona a entrega oral de substâncias naturais recentemente sintetizadas para utilização como suplementos dietéticos. As formulações são únicas uma vez que nem DIM nem crisina tinham estado anteriormente disponíveis em quantidades suficientes para permitir tal utilização. As 66 ΡΕ1067913 novas formulações superam os problemas da baixa solubilidade das substâncias naturais. As formulações proporcionam por conseguinte novos métodos de ajustamento do metabolismo de esteroides em mamíferos tratados. 0 processo de formulação tem envolvido o desenvolvimento de novas técnicas na formação de microdispersões das substâncias activas. A tecnologia de formação de microdispersão foi refinada para permitir a formação de microparticulas mais pequenas e mais estáveis de DIM e outros fitoquimicos quimiopreventivos. Esta tecnologia proporcionou um novo sistema de entrega para intensificar a absorção oral de vários nutrientes ou fármacos, fracamente solúveis em água. Além disso, é proporcionado um novo efeito do sumo de toranja. 0 sumo de toranja, surpreendentemente, tem a capacidade de alterar vantajosamente a proporção de metabolitos do estrogénio. A utilização de sumo de toranja e/ou DIM processado para o tratamento de, por exemplo, doenças, condições ou distúrbios caraterizados por uma razão baixa de metabolitos 2-hidroxiestrogénio para metabolitos 16-hidroxiestrogénio também é proporcionada.

Lisboa, 28 de novembro de 2012

Claims (31)

1. ΡΕ1067913 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a preparação de uma composição compreendendo os passos de: a. aquecimento de um ou mais emulsionantes solubilizantes selecionados do grupo constituído por vitamina E succinato de polietilenoglicol 1000, vitamina E succi-nato de polietilenoglicóis com polietilenoglicol com uma gama molecular de 400-2000, polivinilpirrolidona, estearato de polioxietileno, colato, desoxicolato e taurocolato de sódio; b. adição ao produto do Passo (a) de um solvente e um agente tensioativo fosfolípido selecionado do grupo constituído por fosfatidilcolina, dioleoilfosfatidil-colina, fosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidil-glicerol, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoil-fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina, fosfatidil-serina e esfingomielina para produzir uma solução; c. dissolução na solução do Passo (b) de um ou mais fitoquímicos hidrofóbicos selecionados do grupo constituído por índoles e flavonoides; d. adição à solução do Passo (c) de uma solução contendo um encapsulador; e. mistura da solução produzida no Passo (d) para produzir uma microdispersão com um tamanho de partícula de 5 ym ou menos, e 2 ΡΕ1067913 f. secagem por pulverização da mistura resultante para deixar uma composição fitoquimica hidrofóbica sólida.
2. 2. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido encapsulador é selecionado de entre um ou mais do grupo constituído por amido, gelatina, metil-celulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropiletilcelulose, pectina e goma arábica.
3. 3. 0 processo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o referido solvente é selecionado do grupo constituído por hexanol, etanol, butanol, heptanol, 2-metil-l-pentanol, cetona etílica e metílica, acetona, propilenoglicol e acetato de etilo.
4. 4. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido tamanho de partícula é de 2 micrómetros ou menos.
5. 5. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que o referido tamanho de partícula é de 1 ym ou menos.
6. 6. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido índole é selecionado a partir do grupo constituído por di-indolilmetano (3,3'-di-indolilmetano), tri-indole([2-(indol-3-il-metil)--indol-3-il]indol-3-ilmetano) linear, tri-indole(5,6,11,-12,17,18-hexa-hidrociclononal[l,2-b:4,5-b':7,8 —b] :tri-indo- 3 ΡΕ1067913 le) cíclico e di-indole(1-(3-hidroximetil)-indolil-3-indo-lilmetano linear.
7. 7. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o referido flavonoide é selecionado a partir do grupo constituído por crisina (5,7--di-hidroxiflavona), tectocrisina (5-hidroxi,7-éter metíli-co-flavona), nepetina (5,3',4'-tri-hidroxi-β-metoxiflavona) , tangeretina (5,6,7,8,4'-pentametoxiflavona), tricetina (5,7-di-hidroxi-3'4',5'-trimetoxiflavona), tricina (5,7,4'--tri-hidroxi-3',5'-dimetoxiflavona), amentoflavona, pino-cembrina (5,7-di-hidroxiflavanona), narigenina (5,7,4'-tri--hidroxiflavanona), biochanina A, genisteína, daidzeína, própolis e pólen de abelhas.
8. 8. 0 processo de acordo com a reivindicação 6, em que o referido indole é di-indolilmetano.
9. 9. 0 processo de acordo com a reivindicação 7, em que o referido flavonoide é crisina.
10. 10. O processo de acordo com a reivindicação 7 em que o referido flavonoide é pólen de abelhas.
11. 11. Uma composição preparada de acordo com o processo de qualquer uma das reivindicações 1-10.
12. 12. Uma composição preparada de acordo com o processo de acordo com a reivindicação 8. 4 ΡΕ1067913
13. 13. Uma composição preparada de acordo com o processo de acordo com a reivindicação 9.
14. 14. A composição de acordo com a reivindicação 11, compreendendo ainda concentrado de toranja ou extrato vegetal de crucifera contendo sulfoforano.
15. 15. A composição de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda a composição de acordo com a reivindicação 13, extrato de Urtica dioica e concentrado de sumo de toranja.
16. 16. A composição de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda concentrado de fitoestrogénio, extrato de «saw palmetto», extrato de chá verde e concentrado de sumo de toranja.
17. 17. A composição de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda a composição de acordo com a reivindicação 13, extrato de «saw palmetto», extrato de chá verde, concentrado de sumo de toranja e extrato de Urtica dioica.
18. 18. Utilização de uma quantidade eficaz da composição de acordo com a reivindicação 15 para o fabrico de um medicamento para a redução dos niveis de estrogénio no tecido de um humano do sexo masculino. 5 ΡΕ1067913
19. 19. Utilização de uma quantidade eficaz da composição de acordo com a reivindicação 16 para o fabrico de um medicamento para a manutenção de niveis de estrogénio e ajustamento das quantidades relativas de metabolitos de estrogénio num humano do sexo feminino.
20. 20. Utilização de uma quantidade eficaz da composição de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda extrato de «saw palmetto», extrato de chá verde e concentrado de fitoestrogénio, para o fabrico de um medicamento para o ajustamento das quantidades relativas de metabolitos de estrogénio num humano do sexo feminino, sendo a referida quantidade eficaz para aumentar a proporção de 20H-estrona para 160H-estrona do referido humano do sexo feminino.
21. 21. Utilização de uma quantidade eficaz da composição de acordo com a reivindicação 17 para o fabrico de um medicamento para a promoção da massa muscular num ser humano.
22. 22. Utilização de uma quantidade eficaz da composição de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda a composição de acordo com a reivindicação 13, compreendendo ainda extrato de «saw palmetto» e extrato de chá verde, para o fabrico de um medicamento para o abaixamento do estrogénio circulante num ser humano.
23. 23. Utilização de uma quantidade eficaz da 6 ΡΕ1067913 composição de qualquer uma das reivindicações 11-17, para o fabrico de um medicamento para o ajustamento do metabolismo de estrogénio, quando usado oralmente em mamíferos.
24. 24. Utilização de concentrado de toranja ou extrato vegetal de crucifera contendo sulfoforano com a composição de acordo com a reivindicação 11 no fabrico de um medicamento tendo absorção intensificada da composição de acordo com a reivindicação 11 e limitando a ação de "metabolismo pré-sistémico" de CYP 3A4 da composição de acordo com a reivindicação 11.
25. 25. Uma composição de acordo com a reivindicação 15 para a redução dos niveis de estrogénio no tecido num humano do sexo masculino.
26. 26. Uma composição de acordo com a reivindicação 16, para a manutenção dos niveis de estrogénio e ajustamento das quantidades relativas de metabolitos de estrogénio num humano do sexo feminino.
27. 27. Uma composição de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda extrato de «saw palmetto», extrato de chá verde e concentrado de fitoestrogénio, para o ajustamento das quantidades relativas de metabolitos de estrogénio num humano do sexo feminino, em que uma quantidade da referida composição é eficaz para aumentar a proporção de 20H-estrona para 160H-estrona do referido humano do sexo feminino. 7 ΡΕ1067913
28. 28. Uma composição de acordo com a reivindicação 17 para a promoção da massa muscular num ser humano.
29. 29. Uma composição de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda a composição de acordo com a reivindicação 13, e compreendendo ainda extrato de «saw palmetto» e extrato de chá verde, para o abaixamento do estrogénio circulante num ser humano.
30. 30. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-17 para o ajustamento do metabolismo de estrogénio quando usada oralmente em mamíferos.
31. 31. Uma composição de acordo com a reivindicação 11, compreendendo ainda concentrado de toranja ou extrato vegetal de crucíferas contendo sulfoforano, em que a referida composição tem a absorção da composição de acordo com a reivindicação 11 intensificada e ação limitada do "metabolismo pré-sistémico" de CYP 3A4 da composição de acordo com a reivindicação 11. Lisboa, 28 de novembro de 2012