CZ297658B6 - Zpusob prípravy derivátu hyaluronanu vázaných karbamátovou vazbou - Google Patents

Abstract

Zpusob prípravy derivátu hyaluronanu pri nemž v alkalickém prostredí reagují hydroxylové skupiny hyaluronanu o molekulové hmotnosti 10 až 10 000 000 g.mol.sup.-1.n. pri teplote 0 až 50 .degree.C, aktivované pomocí aktivacní slouceniny s hydrofobizující slouceninou zahrnující aminoslouceniny obsahující volnou aminoskupinu a slouceniny obsahující hydrazidovou, hydrazinovou nebo hydroxylaminovou skupinu.

Description

Způsob přípravy derivátů hyaluronanu vázaných karbamátovou vazbou

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy hydrofobizovaných derivátů hyaluronanu, obsahujících substituent vázaný karbamátovou vazbou, které nabízí nové použití v kosmetice nebo farmacii.

Dosavadní stav techniky

Hyaluronová kyselina je přírodní lineární polysacharid tvořený β-l ,4-vázanými opakujícími se disacharidovými jednotkami D-glukuronové kyseliny a /V-acetyl-D-glukosaminu spojenými β1 .Svazbou.

Tento glykosaminoglykan má molekulovou hmotnost 10 a 10 000 000 g.mor¹ a je jedním z glykosaminoglykanů přítomných v extracelulární matrix, synoviální tekutině kloubu a strukturní části chrupavky. Hraje významnou roli při pohybu buněk, buněčné diferenciaci, hojení ran a rakovinné metastázi (Prestwich G.D., Marecak D. M., Mareček D. F. et. al.: Controlled chemical modification of hyaluronic acid: synthesis, upplications, and biodegradation of hydrazide derivatives. Journal of Controled Release 1998, 53. 93-103).

Dosud byly převážně studovány hydrofobni deriváty kyseliny hyaluronové nebo její soli, jejichž substituent byl vázán esterovou (Della Valle F.. ROMEO A., (Fidia S. p.A.): US 4 965 353) nebo amidovou vazbou (Hamilton R„ Fox E., M.. Acharya R. A. et al. (Genzyme Corporation): US 4 937 270). Hydrofobni substituenty se k hyaluronanu připojují přes karboxylovou skupinu, čímž dochází k výrazné změně rozložení elektrických nábojů u takto substituovaného hyaluronanu, která je spojena nejen se změnou fyzikálních vlastností, ale i biologické aktivity. Proto byly vyvinuty přípravky, jejichž substituent je vázán přes hydroxylovou skupinu hyaluronanu.

Podle Ellwood D.C. (Scandigen AB): EP 0 296 740 byly vytvořeny konjugáty hyaluronové kyseliny s fyziologicky aktivními nebo chemoterapeutickými látkami. Tyto konjugáty byly připraveny na základě reakce aktivované hydroxylové skupiny hyaluronové kyseliny s látkou obsahující aminoskupinu. Sloučení fyziologicky aktivní nebo chemoterapeutické látky s hyaluronovou kyselinou zpomaluje uvolňování této látky in vivo a in vitro a může mít vliv na penteraci skrz kůži. Podle Hanushewky M. (Baxter Laboratories): US 3 876 501) byly pomocí aktivace hydroxylových skupin bromkyanem a následným připojením enzymů nebo proteinů přes aminoskupinu připraveny deriváty vodorozpustných sacharidů. Stávající příprava minimalizuje vznik nežádoucích vedlejších produktů a zabývá se přípravou také ve vodě nerozpustných derivátů.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je odstranit nedostatky dosavadního stavu techniky a poskytnout způsob přípravy hydrofobizovaných derivátů hyaluronanu, jež je možné použít jako aktivní látku v kosmetice, nosič nízkomolekulárních látek, součástí složitějších systémů (například liposomy, mikroemulze) nebo nosič aktivních látek cíleným transportem a dále jako stabilizující látku v oftalmonologii. Takto připravené hydrofobizované deriváty jsou hyaluronidasou hůře degradovány, vykazují tedy vyšší stabilitu při působení enzymu.

Derivát hyaluronanu o molekulové hmotnosti 10 až 10 000 000 g.moF¹, obsahující substituent vázaný karbamátovou vazbou, se připraví ve dvou krocích. Nejprve se provede aktivace OH skupiny hyaluronanu v alkalickém prostředí pomocí aktivní sloučeniny, načež se aktivovaný hyaluronan nechá reagovat v alkalickém prostředí s hydrofobizující sloučeninou v teplotním rozmezí 0 až 50 °C.

- I CZ 297658 B6

Aktivace OH skupiny hyaluronanu podle vynálezu se s výhodou provádí v alkalickém prostředí při pH vyšším než 8. Hodnota pH alkalického prostředí je výhodněji počátkem aktivace alespoň 10.

Aktivační sloučenina podle vynálezu je výhodně vybrána ze skupiny obsahující halogenkyany, dimethylaminopyridium tetrafluoroborát nebo 7V-kyanoethylamonnou sůl.

Hydrofobizující sloučenina podle vynálezu je vybrána ze skupiny obsahující aminosloučeniny, io výhodně alkylaminy, hydroxylaminy, dále hydrofobizující sloučeniny zahrnující hydraziny, hydrazidy, oximy a jejich deriváty.

Alkylamin podle vynálezu je výhodně vybrán ze skupiny obsahující butylamin, pentylamin. hexylamin, heptylamin, oktylamin, decylamin nebo dodecylamin.

Pro reakci může být použitý hyaluronan o molekulové hmotnosti 10 až 10 000 000 g.mol¹.

Při přípravě derivátů hyaluronanu dochází k navázání alkylaminů nebo jiných aminů na aktivovanou hydroxylovou skupinu hyaluronanu.

Pro aktivaci této hydroxylové skupiny může být použít bromkyan nebo některé z jiných halogenkyanů. Použité množství halogenkyanu závisí na požadovaném stupni substituce. Množství použitého halogenkyanu není nijak omezeno, výhodně se však použije 0,5 až 2,0 ekvivalentního množství na dimerovou jednotku hyaluronové kyseliny. Stejně může být použit pro aktivaci 25 hydroxylové skupiny stabilnější dimethylaminopyridinium tetrafluoroborát (CDAP) nebo Nkyanotriethylamonná sůl (CTEA).

Neboť hyaluronan není rozpustný v nevodném rozpouštědle, je pro tuto reakci využívána demineralizovaná voda. Reakce probíhá v alkalickém prostředí, pH roztoku může být upraveno pří30 davkem hydroxidu alkalických kovů. Do reakční směsi je přidáváno takové množství alkálií aby pH bylo vyšší než 8.

Na počátku přípravy je žádoucí, aby do roztoku hyaluronanu bylo přidáno takové množství alkálií, aby pH bylo alespoň 10, neboť po aktivaci tohoto glykosaminoglukanu dochází ke spotře35 ba alkálie během reakce. Do reakční směsi je po aktivaci hydroxylové skupiny přidán alkylamin (butyl-, pentyl-, hexyl-, heptyl-, oktyl-, decyl-, dodecylamin) nebo jiné látky obsahující aminoskupinu. Reakční podmínky jsou dále charakterizovány reakční teplotou v rozmezí 0 až 50 °C.

Výsledný produkt je v závislosti na délce alkylového řetězce a stupni substituce rozpustný ve 40 vodě. Stupeň substituce je roven 100 %. když je modifikována jedna hydroxylová skupina dimeru hyaluronové kyseliny. Připravený derivát je izolován dialýzou nebo ultrafiltrací proti destilované vodě a následně lyofilizován, nebo vakuově sušen. Pro odstranění látek nižší molekulové hmotnosti byla použita dialyzační celulózová střeva se zadržovanou molekulovou hmotností 12 000 g.mof¹, případně polyetersulfonová ultraflltrační membrána Pall (Omega 1 OK) se zdržo45 vanou molekulovou hmotností 10 000 g.mof¹. Derivát může být přečištěn také běžnými metodami jako je srážení alkoholem, či gelovou filtrací.

CL 297658 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

1,0 g hyaluronanu o molekulové hmotnosti 450 000 g.mol'¹ se rozpustí ve 140 ml destilované vody a pH roztoku se upravilo na 10,5 pomocí 1M NaOH. Do roztoku se přidalo 0,23 g bromkyanu v 1 ml acetonitrilu a po 5 minutách míchání při pokojové teplotě se přidalo 0,37 g oktylio aminu v 5 ml acetonitrilu. pH se udržovalo v rozmezí 9,5 až 10,5. Reakční směs se míchala po dobu 23 hodin. Poté byla reakční směs dialyzována a produkt lyofilizován.

DS(z'HNMR): 0,21

M_w (z HPLC, SEC-MALLS): 394 000 g.mol''

Příklad 2

1,0 g hyaluronanu o molekulové hmotnosti 450 000 g.mol'¹ se rozpustil v 150 ml destilované 20 vody a pH roztoku se upravilo na 10,5. Do tohoto roztoku se přidalo 0,22 g bromkyanu v 1 ml acetonitrilu a za udržování pH mezi 9,5 až 10,5 se po 5 minutách míchání přidalo 0,256 g hexylaminu. pH reakční směsi se upravovalo IM NaOH. Reakční směs se míchala po dobu 22 h. Produkt byl izolován dialýzou a následovanou lyofilizací (viz obr. 1).

DS (z 'H NMR): 0,41

IR: pro vyšší stupeň substituce delší alkylovým řetězcem je výrazný pás valenční vibrace v(CH) při 2926 cm'¹ a důkazem aktivace je v_as (C=N=O) při 2250 cm¹.

Příklad 3

0,1 g hyaluronanu o molekulové hmotnosti 450 000 g.mol’¹ se rozpustilo v 10 ml demineralizované vody a pH roztoku se upravilo pomocí 0.1M NaOH na 9,5 a přidalo se 0,0248 g CDAP 35 (dimethylaminopyridinium tetrafluoroborát) v 0,3 ml acetonitrilu a pH se udržovalo při této hodnotě po dobu 3 minut. Následně se přidalo 0,100 g 6-amino-[3-cyklodextrinu a po 23 hodinách se reakční směs neutralizovala 0,2M kyselinou octovou. Produkt byl izolován dialýzou a lyofilizací.

to elementární analýza: 3,0 %N, 38,62 % C, 6,2 % H

IR: substituent vázaný karbamátovou vazbou se projevil navýšením amidových pásů zejména Amid I a Amid II při vlnočtech 1655 cm'¹ a 1565 cm'¹ (vizobr.2)

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy derivátů hyaluronanu, vyznačující se tím, že v alkalickém prostředí reagují hydroxylové skupiny hyaluronanu o molekulové hmotnosti 10 až 10 000 000 g.mol'¹ při teplotě 0 až 50 °C, aktivované pomocí aktivační sloučeniny s hydrofobizující sloučeninou zahrnující aminosloučeniny obsahující volnou aminoskupinu a sloučeniny obsahující hydrazidovou, hydrazinovou nebo hydroxylaminovou skupinu.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vy zn ač u j í c í se t í m , že molekulová hmotnost hyaluronanu se pohybuje v rozmezí 1000 až 2 500 000 g.mol·'.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hyaluronan může být volná kyselina hyaluronová nebo kterákoli její farmakologicky přijatelná sůl .
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pH alkalického prostředí během aktivace OH skupiny hyaluronanu je vyšší než 8.
5. 5. Způsob podle nároku I, vyznačující se tím, že aktivační sloučenina je vybrána ze skupiny obsahující halogenkyany, dimethylaminopyridium tetrafluoroborát nebo Λ-kyanoethylamonnou sůl.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hydrofobizující sloučenina je vybrána ze skupiny obsahující aminosloučeniny, hydraziny, hydrazidy, oximy a jejich deriváty.
7. 7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že hydrofobizující sloučenina, obsahující volnou aminoskupinu, je vybrána ze skupiny obsahující alkylaminy, hydroxylaminy.
8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakce se provádí ve vodném prostředí nebo v organickém rozpouštědle.