CZ281630B6

CZ281630B6 - Analogy des-tyr dynorfinu

Info

Publication number: CZ281630B6
Application number: CZ943131A
Authority: CZ
Inventors: Nancy M. Lee; Horace H. Loh; Akira E. Takemori
Original assignee: Des-Tyr Dynorphin Partnership
Priority date: 1992-06-12
Filing date: 1993-06-01
Publication date: 1996-11-13
Also published as: HU9403563D0; NO944778D0; WO1993025217A1; FI945811A0; EP0652765A1; CA2137916A1; HUT70160A; JPH08501075A; RU95106651A; EP0652765A4; AU4399093A; FI945811L; FI945811A7; KR950701818A; NO944778L; CZ313194A3

Abstract

Nové peptidy podle vynálezu jsou analogy dynorfinu a mají podobnou účinnost jako endogenní dynorfin, ale oproti endogennímu dynorfinu jsou des-Tyr nebo des-Tyr-Gly. tyto nové peptidy mají terapeutické použití, jako je podávání hostiteli tolerantnímu k narkotickému analgetiku k potenciaci účinnosti narkotického analgetika a/nebo k blokování abstinenčních příznaků. ŕ

Description

Analog des-Tyr dynorfinu a farmaceutický přípravek s jeho obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká obecně analogů dynorfinu a konkrétně nových analogů dynorfinu, které je možno používat s narkotickými analgetiky, jako jsou opiátové alkaloidy. Tento vynález byl učiněn s vládní podporou grantem č. NIDA-02643, poskytnutým národním ústavem zdraví. Na tento vynález má určitá práva vláda.

Dosavadní stav techniky

Endogenní opioidy existují v četných formách v centrálním nervovém systému a zahrnují dynorfiny, což je řada peptidů, odvozených od prekursoru prodynorfinu (proenkefalinu B). Jako první z dynorfinů byl izolován peptid o 17 aminokyselinách struktury s označením SEQ ID NO: 1, někdy též označovaný jako dynorfin A (1-17)'·:

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-AsnGln (SEQ ID NO: 1)

Na rozdíl od enkefalinů nebo endorfinů interaguji mnohé dynorfiny s vysokou afinitou se všemi třemi hlavními typy opioidních receptoru (μ, Sak). Dynorfiny jsou také víceméně unikátní mezi endogenními opioidy v tom, že nejsou analgetické v mozku, i když mohou být v míše.

Smith a Lee shrnuli dosavadní poznatky o farmakologii dynorfinů v Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 28, str. 123 až 140 (1988). Zaznamenávají rostoucí množství důkazů o tom, že endogenní opioidy jsou úzce spojeny s funkcí imunitního systému. Autoři však uvádějí, že dynorfin nebyl testován v žádné z citovaných studii kromě jedné studie týkající se mononukleární buněčné chemotaxe. Zaznamenávají však, že dynorfin se účastnil tvorby nádoru.

Použití dynorfinu je navrhováno v několika patentech USA. Patent US 4,361.553, vydaný 30. 11. 1982 na jména Loh a Lee, uvádí sekvenci prvních třinácti peptidů pro přirozeně se vyskytující dynorfin (obsahující sedmnáct aminokyselin), u něhož byly zjištěny silné agonistické vlastnosti na morčecí ileum a myší vas deferens. Tento patent popisuje zjištění, že dynorfin, a zejména dynorfin A (1-13), má opačný účinek u hostitelů tolerantních k narkotickým analgetikům než účinek (inhibice analgesie, vyvolané morfinem nebo β-endorfinem), který byl pozorován u naivních zvířat (tj. takových, s nimiž dosud nebyl podniknut žádný pokus). Dynorfin (1-13) tedy potencuje analgetický účinek u tolerantních hostitelů. Bylo zjištěno, že dynorfin je použitelný ve spojeni s narkotickým analgetikem ke snížení množství narkotického analgetika, podávaného v jedné dávce.

Patent US 4,396.606, vydaný 2. 8. 1983 na jméno Goldstein, popisuje izolaci sloučeniny, označované jako dynorfin” (dále někdy označován jako dynorfin (1-13)), se strukturou

-1CZ 281630 B6

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 2)

Bylo zjištěno, že tato sloučenina je při testech na morčecím ileu podstatně účinnější než enkefaliny a β-endorfin a byl vysloven předpoklad, že přípravky, obsahující tuto sloučeninu, budou analgetické.

Patent US 4,462.941, vydaný 31. 7. 1984 na jméno Lee a další, popisuje analogy dynorfinu s prvními sedmi aminokyselinami jako v SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2, ale s dalšími několika aminokyselinami znázorněnými vzorcem

AA⁸-AA⁹-AA¹⁰ kde AA⁸ je isoleucin, leucin nebo lysin, AA⁹ je arginin nebo prolin, AA¹⁰ je prolin a karbonylový uhlík__na terminálním zbytku AA¹⁰ je amidován. Tyto amidové analogy dynorfinu (1-10) nemají významnou analgetickou účinnost (pokud nejsou podávány ve velkých dávkách, které mají tendenci vyvolávat křeče), ale liší se od dynorfinu (1-13) SEQ ID NO: 2 tím, že ani nepotencují, ani neantagonizují morfin u naivních zvířat. U tolerantních zvířat se naproti tomu amidové analogy dynorfinu (1-10) zdají být účinnějším a selektivnějším analogem než dynorfin (1-13). SEQ ID NO: 3 představuje jeden tento konkrétní amidový analog dynorfinu (1-10), kde je C-terminální Pro amidován:

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro (SEQ ID NO: 3)

Patent US 4,481.191, vydaný 6. 11. 1984 na jméno Wei a další, popisuje způsob léčení vysokého krevního tlaku a poruch srdeční funkce podáváním dynorfinu příbuzných opioidních peptidů, jako jsou peptidy SEQ ID NO: 2a SEQ ID NO: 3. Zdá se, že endogenní opioidní peptidy podmiňují citlivost periferních nervů na podněty, které ovlivňuji srdeční rytmus a krevní tlak. Za normálních podmínek tedy opioidní peptidy v oběhu fungují tak, že kontrolují citlivost těchto periferních míst autonomního nervového systému vůči těmto endogenním látkám. Použití dynorfinu příbuzných peptidů při léčbě vysokého krevního tlaku patrné modifikuje autonomní nervový systém tak, že zvětšuje a uchovává intenzitu endogenních opioidních peptidů. Jednou z forem působení může být zvyšování citlivosti viscerálních přívodných receptorů.

Analogy enkefalinu, které jsou strukturně omezeny cyklickou strukturou (například disulfidickým můstkem), jsou popsány v patentu US 4,518.711, vydaném 21. 5. 1985 na jméno Hrubý a další. O těchto sloučeninách se uvádí, že mají zvýšenou rigiditu a zvýšenou specificitu pro 8 receptor, je-li polocystein v poloze 2 nahrazen polopenicilaminem (β,β-dimethylpolocystein). V důsledku toho vešly ve známost analogy dynorfinu, které mají cysteinové náhrady na aminokyselinovém zbytku 5 (obvykle leucin) a na amino kyselinovém zbytku 11 (obvykle lysin). Podobné byl v můstkovém uspořádání nahrazen cysteinem aminokyselinový zbytek 8 (obvykle isoleucin) a aminokyselinový zbytek 13 (obvykle lysin). Zdá se, že můstkové nebo cyklické struktury napomáhají při stabilizaci analogů dynorfinu proti degradaci in vivo.

-2CZ 281630 B6

Patent US 4,684.624, vydaný 4.8. 1987 na jméno Hosobuchi a další, popisuje použití dynorfinu příbuzných peptidú v kyselé nebo amidované formě k ošetřování pacientů, trpících cerebrální ischemií. Podávání těchto opioidních peptidů pacientům trpícím akutní fokální cerebrální ischemií se projevilo jako vhodné pro prodloužení přežití a jeví se použitelným při částečném zvratu neurologických defektů, vyplývajících z cerebrální ischemie.

Výzkumní pracovníci se v poslední době začali pokoušet spojovat imunoregulaci s neurálními opioidními systémy. Stává se stále zřejmějším, že existuje velký počet opioidních účinků na buňky imunitního systému, ale mechanismy zůstávají nevyjasněny. Autoři nedávné práce soudí, že význam opioidů pro funkci imunitního systému zůstává věcí spekulace; Sibinga a Goldstein, Ann. Rev. Immunol. 6, str. 219 až 249 (1988).

V roce 1991 uvedl Roy a další, že myši, ošetřované dlouhodobě morfinem, byly imunosuprimovány, zatímUb použití SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3 blokovalo opioidovou inhibici faktoru stimulujícího kolonie makrofágů v závislosti na dávce; Eur. J. of Pharm. 195, 359-363 (1991), 202, 355-359 (1991).

Podstata vynálezu

V jednom aspektu jsou předmětem vynálezu nové peptidy, které mají alespoň šest aminokyselinových zbytků, jsou analogy dynorfinu, ale jsou des-Tyr vzhledem k endogennímu dynorfinu. Tyto nové peptidy mohou být formulovány do farmaceuticky přijatelného roztoku nebo s farmaceuticky přijatelným nosičem, a obvykle se podávají hostiteli tolerantnímu k narkotickému analgetiku za účelem potenciace účinnosti narkotického analgetika a/nebo k blokování příznaků při vysazení. Další použití zahrnuje zvrat alespoň určitého neurologického deficitu při léčbě cerebrální a spinálni ischemie, při inhibici respirační deprese nebo gastroenterických spasmů, vyvolaných narkotickými analgetiky, u naivního hostitele jako doplněk protizánětlivé léčby a při blokování narkotiky vyvolaného zhoršeni imunity u hostitele, jehož imunitní systém byl poškozen narkotickým analgetikem.

Nové peptidy podle vynálezu mají tedy podobnou účinnost jako endogenní dynorfin (SEQ ID NO: 1), jako dynorfin s třinácti aminokyselinami (SEQ ID NO: 2) a jako dynorfin v amidové formě s deseti aminokyselinami (SEQ ID NO: 3); je však překvapující, že tyto nové sloučeniny, které jsou des-Tyr vzhledem k dříve známým dynorfinovým sloučeninám, vykazují podobnou biologickou účinnost, protože N-terminální tyrosin byl považován za v podstatě universální předpoklad rozpoznání opioidních peptidů opioidními receptory. Například výzkumníci v oblasti zabývající se klonováním cDNA kódující opioidní receptor nedávno zaznamenali, že des-Tyr Dyn A (1-13) se vůbec neuplatnil v konkurenci v pokusech s různými ligandy (str. 4126 a 4127 až 4128) a zopakovali běžný poznatek o nezbytnosti N-terminálního Tyr; Xie, Miyajima a Goldstein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, str. 4124 až 4128 (1992).

Při terapeutickém použití vynálezu, které zahrnuje podávání hostiteli tolerantnímu k narkotickému analgetiku, je možno používat nižších dávek narkotických analgetik, jako je morfin, u pacientů, vyžadujících trvalou léčbu narkotiky ke zmírnění bolesti,

-3CZ 281630 B6 jako jsou pacienti s rakovinou v konečném stadiu, nebo používat nižších dávek narkotika, jako je methadon, při léčbě narkomanů. V důsledku toho je možno aplikací vynálezu snížit různé známé vedlejší účinky dlouhodobé léčby vysokými dávkami narkotik, jako je respirační deprese a zácpa.

Nové peptidy podle vynálezu pro různé požadované terapeutické aplikace mají alespoň šest aminokyselin. Pokud je přítomno téchto alespoň šest aminokyselin, mají přednostně sekvenci

Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile (SEQ ID NO: 22)

V jednom aspektu vynálezu je možno na nové peptidy pohlížet jako na peptidy s aminokyselinovými zbytky analogickými s endogenním dynorfinem (SEQ ID NO: 1), přičemž však nové peptidy jsou des-Tyr, jak ukazuji sekvence SEQ ID NO: 4-12:

Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu^Lys-Trp-Asp-Asn (SEQ ID NO: 4)

Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp (SEQ ID NO: 5) Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp (SEQ ID NO: 6) Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 7) Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu (SEQ ID NO: 8) Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys (SEQ ID NO: 9) Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro (SEQ ID NO: 10) Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg (SEQ ID NO: 11) Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile (SEQ ID NO: 12)

V každé z nových sekvenci SEQ ID NO : 4-12 je dále možno nahradit kterýkoli jeden nebo dva zbytky stejným nebo odlišným zbytkem aminokyseliny v D-konfiguraci (ke zvýšení stability in vivo), například jestliže se N-terminální Gly nahradí D-Ala, nebo je možno provést modifikaci konformačni stability nebo rigidity, například nahradi-li se určité množství určitých aminokyselin zbytky schopnými vytvořit kruhovou strukturu nebo můstek (například disulfidický můstek).

Na nové peptidy podle vynálezu je možno také nahlížet jako na des-Tyr-Gly-deriváty, jak je patrné ze sekvencí SEQ ID NO: 13-22, které možno modifikovat podobným způsobem jako v případě SEQ ID NO: 4-12 ke zvýšení stability in vivo a konformačni stability:

Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln (SEQ ID NO : 13)

Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn (SEQ ID NO : 14) Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp (SEQ ID NO : 15) Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp (SEQ ID NO: 16) Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 17) Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu (SEQ ID NO: 18) Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys (SEQ ID NO: 19) Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro (SEQ ID NO: 20) Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg (SEQ ID NO: 21) Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile (SEQ ID NO: 22)

-4CZ 281630 B6

Nové peptidy, znázorněné jako SEQ ID NO : 1-22, mohou mít na C-konci formu kyseliny nebo amidu. Kromě toho může být obvyklý zbytek aminokyseliny isoleucinu v SEQ ID NO: 4-22 nahrazen leucinem nebo lysinem a obvyklý arginin v poloze 8 SEQ ID NO : 4-11 a v poloze 7 SEQ ID NO : 13-21 může být nahrazen prolinem.

Jeden z modelů, použitelných pro výběr konkrétních modifikaje založen na předpokladu, že receptorová selektivita opioidje kromě strukturních a konformačních požadavků k) ovládána jejich výsledným model předpokládá, že kladným výsledným nábojem budou vykazovat zatímco neutrální a negativně nabité interagovat s δ-receptorem ci, nich peptidů konkrétního typu receptoru (μ, δ a nábojem a/nebo amfifilním momentem. Tento opioidní peptidy s preferenci μ-receptorů, opioidní peptidy budou přednostně a tento model byl použit například při navrhování malých peptidů Schillerem a dalšími, J. of Med. Chem. 22, str. 698 až 703 (1989).

J.

Peptidy mohou být syntetizovány různými vhodnými chemickými metodami, přednostně syntézou v pevné fázi, manuální nebo automatizovanou, která byla poprvé vyvinuta R. B. Merrifieldem a popsána J. M. Stewartem a J. D. Youngem v Solid Phase Peptide Synthesis (1984). Při chemické syntéze se počínaje z C-konce připojují jednotlivé aminokyseliny v předem stanoveném pořadí. Základní metody v pevné fázi vyžadují navázání C-terminální chráněné α-aminokyseliny na vhodný nosič z nerozpustné pryskyřice. Popisobenzhydrylaminovou (MBHA) pryskyřici,

Aminokyseliny pro správnému vytvoření s nosičem). Po dokončení kondenzační se α-amino-chránicí skupina odstradalší zbytek. Bylo popsáno několik skuviz J. M. Stewart a J. D. Young v (1984), přičemž historicky je terč.butyloxykarbonylová (Boc) skupina na bázi možno použit jiných strategií, labilní v nutno chránit reaktivní aminokyselin. Komplexní se strategiemi a omeze, Peptide Synthesis Solid váné peptidy vyžaduj i 4-methylbenzhydrylaminovou vznikl C-terminální amid, chránění α-aminoskupiny ke s předchozím zbytkem (nebo reakce na karboxylovém konci ní, aby mohl být navázán pin α-chránicích skupin, Phase Peptide Synthesis na terč.butyloxykarbonylová (Boc) labilní v kyselém prostředí. Je skupin a souvisejících chemických 9-fluorenylmethyloxykarbonylové (FMOC), prostředí. Do dokončení syntézy je také funkční skupiny v postranních řetězcích přehled blokování funkčních skupin spolu nimi jejich použití, je uveden v M. Bodansky (1976) a J. M. Stewart a J. D. Young, Synthesis (1984).

(BHA) nebo aby po dokončení syntézu vyžadují peptidické vazby

Solid preferováurethanu, chránících například alkalickém

Phase Peptide

Syntéza v pevné fázi se zahajuje navázáním C-terminálního α-chráněného aminokyselinového zbytku. Kondenzace vyžaduje aktivační činidla, jako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC) s 1-hydroxybenzotriazolem (HOBT) nebo bez něho, diisopropylkarbodiimd (DIIPC) nebo ethyldimethylaminopropylkarbodiimid (EDC).

Nové peptidy podle vynálezu se výhodně formulují do farmaceuticky přijatelného roztoku nebo s farmaceuticky přijatelným nosičem a potom se podávají ve spojeni s narkotickým analgetikem.

V závislosti na aplikační formě může být peptid formulován s různými fyziologicky přijatelnými nosiči, jako je vodný fyzio

-5CZ 281630 B6 logický roztok a fosfátem tlumený fyziologický roztok, a může obsahovat fyziologicky přijatelné přísady, jako je glukóza, mannitol a podobně.

Kromě použiti nových peptidů v dále popsaných terapeutických aplikacích jsme překvapivě zjistili, že dynorfin (1-17), známý také jako SEQ ID NO : 1, avšak ve formě des-Tyr (a takto popsaný jako SEQ ID NO: 23), si podržuje dostatečnou účinnost pro použití ve spojení s narkotickými analgetiky.

Vynález je použitelný v podstatě se všemi narkotickými analgetiky a výhodné s opiátovými alkaloidy a opioidními peptidy (jak syntetickými, tak přírodními). Vynález je například použitelný s různými alkaloidy opia, jako je morfin, soli morfinu (například hydrobromid morfinu, hydrochlorid morfinu, muškát morfinu, oleát morfinu, morfin-N-oxid a sulfát morfinu) a analogy morfinu, jako je normorfin, diacetyldihydromorfin, diacetylmorfinhydrochlorid, kodein a diacetylmorfin (heroin). Další široce používaná narkotická analgetika, s nimiž je možno používat sloučeniny podle vynálezu, zahrnují alfaprodin, methadon, meperidin, levorfanol, propoxyfen, fentanyl a jeho analogy, oxymorfon, anileridin, dilaudid a metopon. Použití je možno rozšířit na peptidická analgetika, jako jsou analogy enkefalinu a β-endorfinu.

Jak je známo, trvalé užívání těchto narkotických analgetik vede k návyku nebo narkomanii a užívání jednoho z nich vede ke křížové toleranci vůči ostatním. Navzdory svému návykovému potenciálu však mají tato narkotická analgetika terapeutické použití, například u pacientů, vyžadujících dlouhodobou léčbu ke zmírnění bolesti.

I při takovém terapeutickém použití se však u pacientů vyvíjí vzrůstající tolerance k těmto narkotickým analgetikům, takže k úlevě od bolesti jsou nutné stále účinnější dávky. U velkých dlouhodobých dávek narkotických analgetik se potom snadno vyvíjejí nežádoucí vedlejší účinky.

Agonistické působení a vlastnosti vyvolávající závislost mohou být a jsou kromě člověka studovány na různých druzích savců, protože praktické a vládní úvahy často vyžadují, aby před testováním analgetických vlastností léčiv na lidech byly provedeny nejprve zkoušky na malých hlodavcích a/nebo opicích. Dosud však bylo zjištěno, že všechna léčiva, která mají morfinu podobné vlastnosti u savců jiných než lidí, se chovají jako morfin i u lidí, a byly vyvinuty různé analgetické testy na zvířatech, které jsou široce uznávány jako model pro předpověď vlastností u člověka.

Vynález zahrnuje podávání dávky jednoho z analogů SEQ ID NO: 4-23 nebo jeho shora popsané modifikované verze hostiteli ve spojení s podáváním dávky narkotického analgetika, přičemž k takovému podání dochází v rozmezí alespoň asi 30 min od dávky narkotického analgetika. Výhodně se podáváni provádí v jedné smíšené dávce, kde je narkotickým analgetikem morfin, analog morfinu nebo sůl morfinu nebo jiné peptidické analgetikům.

Podává-li se jako narkotické analgetikům morfin a podává-li se naivnímu pacientovi, činí normální dávka řádové asi 5 mg i. v.

-6CZ 281630 B6 za předpokladu tělesné hmotnosti asi 70 kg. Má se za to, že vhodná dávka analogu dynorfinu, podávaného ve spojení s analgetikem, je asi 30 až 1 500 μg na kg tělesné hmotnosti. I když analog dynorfinu nepotencuje narkotické analgetikum v původně naivním hostiteli, při dlouhodobé léčbě narkotiky ke zmírněni bolesti bude množství narkotika, nutné k dosaženi dostatečné úrovně analgesie, po dobu léčby nižší než bez použití analogu dynorfinu ve spojení s narkotikem. V důsledku toho je možno snížit nežádoucí vedlejší účinky opakovaných vysokých dávek narkotik.

Dávkování u tolerantních pacientů je možno určit tímto způsobem: Stanoví se první nebo dostatečná dávka narkotického analgetika, která dostačuje k vytvoření analgesie u hostitele. Místo podání této dostatečné dávky se však podá předem stanovená dávka narkotického analgetika. Tato předem stanovená nebo druhá dávka zahrnuje méně narkotického analgetika než by postačovalo k vytvoření analgesie u hostitele. Skutečné podaná dávka narkotického analgetika se doplní analogem Uynorfinu. Doplněk je výhodně dostačující k vyvolání takové hladiny analgesie u hostitele, která je v podstatě ekvivalentní hladině analgesie v případech, kdy by bylo podáváno pouze narkotické analgetikum. Jak je zřejmé, budou se první neboli dostatečná dávka, nižší druhá dávka a dodatečná dávka lišit v závislosti na konkrétní hladině pacientovy tolerance k narkotickému analgetiku, a bude je obvykle určovat ošetřující lékař.

Další terapeutickou metodou použití je léčba narkomanů v podstatě k zablokování abstinenčních příznaků.

V současné době se u mnoha narkomanů aplikuje methadonový (obvykle hydrochlorid methadonu) udržovací program. Ve spojení s podáváním methadonu se podává další léčivo, jako je klonidin. Jak je však známo, je sám methadon návykový, a o klonidinu se má za to, že pouze maskuje abstinenční příznaky. V důsledku toho nejsou pacienti v takovém programu ve skutečnosti léčeni ze své závislosti na narkotikách.

Naproti tomu analogy dynorfinu blokují abstinenční příznaky hostitelů závislých na morfinu a přitom jsou alespoň lOOkrát méně návykové než morfin. Proto je možno podávání podle vynálezu používat k podpoře blokování abstinenčních příznaků při terapeutickém ošetřeni narkomanů, léčených ze závislosti.

Má se tedy za to, že podání dávky analogu dynorfinu hostiteli, tolerantnímu k narkotickému analgetiku, poskytne značné příznivější ošetření při léčbě závislosti na narkotikách.

Nové peptidy podle vynálezu je dále možno částečně použít ke zvrácení neurologických deficitů při cerebrální ischemii. Má se za to, že faktory ovlivňující odpověď na léčbu cerebrální ischemie podle vynálezu zahrnují dávkování, způsob aplikace a dobu léčby. Nezdá se však, že by faktorem, ovlivňujícím odpověď na léčbu cerebrální ischemie podle vynálezu, byl krevní tlak.

Při léčbě pacientů trpících akutní fokální cerebrální ischemií podle vynálezu se léčba zahajuje podáním dávky analogu dynorfinu a potom se výhodné pokračuje v podávání dalších dávek.

-7CZ 281630 B6

Počáteční dávka může činit asi 1,0 |ig/kg hmotnosti pacienta až asi 10 mg/kg hmotnosti pacienta, přednostně asi 100 úg/kg hmotnosti pacienta a může být aplikována různými známými způsoby, například intravenózní injekcí (i. v.”). Další dávky je možno také aplikovat různými známými způsoby, jako je injekce nebo topické aplikace ve spojení s nosičem léčiva, jako je dimethylsulf oxid. Je však výhodné, jsou-li další dávky aplikovány v podstatě nepřetržitě po tak dlouho, dokud je pacient v život ohrožujícím stavu nebo dokud se stav pacienta nestabilizuje, a činí-li asi 0,01 až asi 100 μg/h. Kontinuální infusi lze například provádět pomocí implantovaného miničerpadla nebo i. v. cestou. Jakmile se stav pacienta stabilizuje, je možno dávky postupné snížit nebo titrovat.

Příklady provedeni vynálezu

Vynález je osvětlen na příkladech provedení.

Příklad 1

Metody a materiály

Analgesie byla měřena na základě švihání ocasem metodou podle D'Amoura a Smitha, J. Pharmac. Exp. Ther. 72, str. 74 až 79 (1941), kde na práci se zde odkazuje, modifikovanou Tulunayem a Takemorim, J. Pharmac. Exp. Ther. 190, str. 395 až 400 (1974), kde na práci se zde také odkazuje. Při stanovení ED_5Q (tj. účinných dávek pro 50 % pokusné skupiny) byly odpovědi zvířat kvantifikovány stanovením konečného bodu, který představoval významné prodlouženi doby reakce. Konečný bod představoval prodloužení doby reakce jednotlivého zvířete o více než 3 SD (tj. standardní odchylky) od kontrolní střední reakční doby pro všechna zvířata, použitá v tomto pokusu. Obvyklá kontrolní střední reakční doba byla 3,1 ± 0,05 s. Nereagující zvířata byla od tepelného stimulu oddálena, jakmile reakční doba překročila 10 s, aby se zabránilo poranění ocasu.

Léčiva byla injekčně aplikována 30 min před pokusem, není-li uvedeno jinak. Morfin byl aplikován subkutánně (s. c.) a peptidy byly aplikovány i. v. ve 4 ml fyziologického roztoku.

Morfinová tolerance byla stanovena tak, že morfinové pelety, 75 mg báze, byly subkutánně implantovány metodou podle Waye a dalších, J. Pharmac. Exp. Ther. 167, str. 1 až 8 (1969), kde na práci se zde odkazuje. Použitým léčivem byl sulfát morfinu (Mallinckrodt Chemical Works, St. Louis, MO). Hodnoty ED₅₀, jejich 95% meze spolehlivosti a signifikance poměru potenciace mezi dvěma hodnotami ED₅₀ byly zjišťovány metodou podle Litchfielda a Wilcoxona, J. Pharmac. Exp. Ther. 96, 99 až 113 (1949), kde na práci se zde odkazuje.

Postup získáni dat v tabulce 1:

Zvířata tolerantní k morfinu (závislá) měla pelety implantovány po dobu tří dní. Potom byly zvířatům podávány dávky naloxonu

-8CZ 281630 B6 (přičemž peleta morfinu zůstávala na místě). Naloxon uvádí zvířata do stavu odvykání narkotiku a zvíře vykazuje abstinenční příznaky, protože naloxon je antagonistou morfinu. V tabulce 1 jsou shrnuty údaje pro kontrolní zvířata a pro skupiny zvířat ošetřených třemi různými peptidy. Každý peptid byl podán v dávce 5 μπιοΐ/kg i. v. před podáním naloxonu.

Tabulka 1

podaný peptid	naloxon EDjq	(pmol/kg)	poměr potenciace
(kontrola)	79	(59 až 107)	---
Dyn (2-17) SEQ ID NO: 23	289	(218 až 378)	3,7 (2,5 až 5,4)
[Cys⁵-Cysⁿ] Dyn (1-11) NH₂	208	(151 až 279)	2,6 (1,7 až 3,9)
Dyn (3-13) SEQ ID NO: 17	154	(102 až 249)	2,0 (1,2 až 3,6)

Jak je patrné z údajů v tabulce 1, kontrolní zvířata měla ED₅₀ 79 μπιοΐ/kg, což je základní hodnota. Když však byl kterýkoli ze tří peptidů, uvedených v tabulce 1, podán 5 min před podáním naloxonu, bylo k uvedení zvířete do stavu odvykání droze třeba mnohem více naloxonu. To znamená, že každý ze tří peptidů, uvedených v tabulce 1, způsobil, že narkomanické zvíře nebylo tolik závislé na morfinu, jak by tomu bylo bez takového předběžného ošetření.

Ze tři peptidů, shrnutých v tabulce 1, je dynorfin (3-13) SEQ ID NO: 17 novou sloučeninou. Přestože tato nová sloučenina je des-Tyr-Gly, má poměr potenciace 2. To znamená, že narkomanická zvířata, která byla před aplikací antagonisty narkotika předběžné ošetřena tímto novým peptidem, byla pouze polovičně závislá na morfinu než zvířata, která nebyla takto předběžně ošetřena. Kromé toho použitý amid cyklického dynorfinu (kde byly obvyklý leucin v poloze 5 a obvyklý lysin v poloze 11 nahrazeny cysteiny, jejichž disulfidický můstek poskytuje konformační stabilitu) měl poměr potenciace 2,6, zatímco des-Tyr sloučenina měla překvapivé poměr potenciace 3,7.

Příklad 2

Materiál a metody

Zvířata a postupy testů byly analogické jako v příkladu 1.

Protokol pro tabulku 2:

Antinociceptivni účinnost (mírnění bolesti) morfinu byla testována u myší tolerantních (tj. závislých) k morfinu, stejné jako u naivních, nezávislých (tj. normálních) zvířat. Byly tak stanoveny dvé základní hodnoty pro dvé různá kontrolní zvířata.

-9CZ 281630 B6

Tabulka 2 podaný peptid morfin ED₅₀ (μιηοΐ/kg s. c.) index tolerance (kontrola^{* 1}

naivní, nezávislá)	6,5	(5,0	až 8,9)		—
(kontrola²
závislá)	55,6	(42,	6 až 73,	5)	8,5 (5,7	až	12,0)
(závislá)
Dyn (2-17) SEQ ID NO:23	32,2	(26,	7 až 40,	0)	4,7 (3,5	až	6,2)

Jak je patrné z údajů v tabulce 2, měla první kontrolní (nezávislá) zvířata ED_5Q morfinu 6,5. To znamená, ze když se naivním zvířatům před testem šviháním ocasem podalo 6,5 μπιοΐ/kg morfinu, potom polovina zvířat necítila bolest. Naproti tomu druhá kontrolní skupina, což byla zvířata závislá na morfinu, vyžadovala k tomu, aby polovina zvířat necítila bolest, 8,5krát vyšší množství morfinu. Avšak u podobně závislých zvířat, pokud byla předem ošetřena des-Tyr sloučeninou (2,5 μmol/kg i. v. 5 min před testem), bylo množství morfinu, nutné ke zmírnění bolesti, významně sníženo.

Ačkoli byl vynález popsán ve spojení s výhodnými konkrétními provedeními, je nutno popis a příklady chápat pouze jako ilustrativní a nikoli omezující rozsah vynálezu, který je definován v patentových nárocích.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Analog des-Tyr dynorfinu se sekvenci

A-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-R kde

A je vodík, zbytek Gly nebo zbytek aminokyseliny v D-konfiguraci,

R je skupina OH, skupina NH₂ nebo zbytek

Arg,

Arg-Pro,

Arg-Pro-Lys,

Arg-Pro-Lys-Leu, Arg-Pro-Lys-Leu-Lys, Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp, Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp, Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn nebo Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln.

-10CZ 281630 B6
2. Analog des-Tyr dynorfinu podle nároku 1 pro potenciaci účinku narkotického analgetika, mající účinek in vivo při podávání ve spojení s narkotickým analgetikem nebo následné po ném, kde pro zvýšení stability in vivo za zachování uvedeného účinku in vivo A znamená zbytek aminokyseliny v D-konfiguraci.
3. Farmaceutický přípravek, vyz ačující se tí , že jako účinnou složku obsahuje analog des-Tyr dynorfinu podle nároku 1.