CZ281122B6 - Stabilizované enzymové činidlo s ureasou pro stanovení močoviny Berthelotovou reakcí - Google Patents

Abstract

Stabilizované enzymové činidlo sestává z pevné směsi obsahující na 1 MU enzymu ureasa 0,2 až 20 mmolů poly-1,6-anhydroglukosy o molekulové hmotnosti 40000 až 120000 g/mol, síran alkalického kovu 0,4 až 6 molů, nitroprussid alkalického kovu 0,01 až 1 mol, komplexotvornou látku schopnou maskovat těžšké kovy, například kyselinu ethylendiamintetraoctovou nebo azid sodný v množství 0,04 až 0,4 molů a redukující látku, s výhodou kyselinu askorbovou nebo siřičitan alkalického kovu v množství 1 až 15 mmolů. ŕ

Description

Stabilizované enzymové činidlo s ureasou pro stanovení močoviny Berthelotovou reakci.

Oblast techniky

Stanovení močoviny je široce využíváno v krmivářstvi, biochemii, v humánní a veterinární diagnostice. Její stanovení v biologickém materiálu, zejména v séru, patří mezi základní analýzy# protože močovina je spolu s kreatininem ukazatelem funkce ledvin. Její hladina se zvyšuje u akutní glomerulonefritis, pyelonefritis, obstrukci, uremii, ale i při chorobách jater, při gastrointestinálních poruchách a při nedostatečné činnosti srdce.

Dosavadní stav techniky

Pro stanoveni močoviny byla postupné v biochemii využita celá řada metod. Z fotometrických metod, které jsou stále nej rozšířenější, je to reakce močoviny s některými alfa-diketony a jejich oximy jako je diacetyl, acetylbenzoyl a diacetylmonoxim. Močovina s nimi reaguje za zvýšené teploty 80 až 100 °C v silné kyselém prostředí a stanovení lze jen obtížně automatizovat. Další skupinu tvoři metody vhodné pro kinetický způsob stanovení, například chemické stanovení s o-ftaldialdehydem a N-(1-naftyl)ethylendiaminem nebo enzymové stanoveni s ureasou, glutamátdehydrogenasou a redukovaným nikotinamidadenindinukleotidem v ultrafialové oblasti spektra.

Hlavní metodou stanovení močoviny zůstává stále v biochemii a klinické chemii její enzymové stanovení s ureasou, která katalyzuje rozklad močoviny na amoniak a oxid uhličitý. Fotometricky se obvykle stanovuje amoniak exidační kopulaci po jeho převedení pa indofenol postupem podle Berthelota. Toto stanovení, které je vysoce specifické a citlivé, má ale několik nevýhod, protože představuje spojení dvou samostatných a současné značné protichůdných reakci. Protichůdnost požadavků reakčních podmínek pro enzymový rozklad močoviny a na stanoveni amoniaku podle Berthelota jsou hlavním zdrojem potíži. Protože enzym ureasa obsahuje thiolové skupiny, je konverze močoviny na amoniak katalyzovaná ureasou inhibována těžkými kovy. Ureasu inaktivuji i látky s oxidačními účinky, které oxidují její thiolové skupiny. Při rozkladu močoviny uerasou lze stálost enzymu prodloužit přítomností látek maskujících těžké kovy, jako jsou komplexotvorné látky, například kyselina ethylendiamintetraoctová, kyselina citrónová a látky s thiolovými skupinami, například glutathion (W. Schneider a kol.: Ger.Offen. 2612726, 1977, Chem. Abstr. 87, 196469, 1977). Rychlost enzymové hydrolýzy se zvyšuje za přítomnosti některých aminokyselin, které ale ruší vlastní stanovení amoniaku oxidační kopulací podle Berthelota. Mezi látky rušící Berthelotovu reakci patří zejména aminy, thioly, redukující látky, komplexující činidla a obecné látky s nukleofilním účinkem na chinony s nimiž tvoří přednostně monoalkyl až bis(alkylamino)hydrochinony a brání tak vzniku indofenolu (T.T.NGo a kol.: Anal. Chem. 54,46,1982). Podle Pyma a Milhama (Anal.Chem. 48,1413,1976) snižují výtěžek Berthelotovy reakce o 20 až 90 % fluoridy, citráty, oxaláty a kyselina ethylendiamintetraoctová. Podmínkou Berthelotovy reakce je, aby byl fenol přítomen v roztoku ve formě fenolátového aniontu. Jeho aktuální koncentrace v roztoku je tedy závislá nejen na pH, ale i

-1CZ 281122 B6 na disociační konstantě užitého fenolu. Citlivost reakce i rychlost vzniku indofenolu bude záviset na typu fenolu a druhu substituentů na fenolovém jádře. Stanovení amoniaku podle Berthelota s fenolem je pro analýzu séra příliš citlivé, se vzorkem o objemu 0,02 ml je výsledný objem roztoku vysoký a dosahuje až 10 ml.

Enzymové stanovení močoviny s ureasou v kombinaci s Berthelotovou reakcí se většinou provádí jako několikastupňová a značně komplikovaná analýza. Postupuje se obvykle tak, že se vzorek nejprve inkubuje s roztokem ureasy, potom se přidá roztok obsahující fenol a nitroprussid. Nitroprussid slouží jako katalyzátor. Nakonec se přidá oxidační roztok obsahující nejčastěji alkalický chlornan, nebo i jiné látky jako zdroje aktivního chloru. Vzniklé modré zbarvení se měří fotometricky. Spojit enzymovou směs s fenolem a katalyzátorem do jednoho inkubačního roztoku je obtížné, protože fenoly více nebo méně inhibuji ureasu.

Spojení inkubačního roztoku s oxidačním činidlem vylučuje charakter jejich komponent. Proto byly hledány další deriváty fenolu, které by byly s ureasou alespoň částečně kompatibilní. Jedním z nich je salicylan sodný (Tabacco a kol: Clin. Chem. 25, 336, 1979), který lze sice přidat přímo do inkubačního roztoku, ale za cenu podstatného zvýšeni koncentrace ureasy v roztoku z obvyklých 15 až 20 U/ml až na 50 U/ml, protože i salicylan sodný snižuje katalytickou aktivitu a stabilitu ureasy. Tím sice lze stanovení močoviny o jeden stupeň zjednodušit, současně se ale značně zvýší jeho cena. Další nevýhodou, která provází zvyšování obsahu ureasy v inkubačním roztoku, je růst absorbance slepého pokusu.

Ureasa obsahuje vždy stopy amonných solí, které zvyšují absorbanci slepého pokusu úměrné se zvyšováním navážky enzymu.

Uvedené nevýhody, spočívající v rozdílných a protikladných požadavcích na složení činidel pro enzymovou hydrolýzu močoviny ureasou a pro následné stanovení amoniaku Berthelotovou reakci, spolu s komplikovaným několikastupňovým postupem analýzy, jsou důvodem k hledáni jiných, výhodnějších řešení, která by uvedené nevýhody odstranila, nebo alespoň potlačila.

Jedná se nejen o nalezeni vhodnějšího typu fenolu jako chromogenu pro oxidační kopulaci při Berthelotově reakci, který by neinhiboval ureasu, ale i o takovou formulaci enzymového činidla, která by zaručovala maximální stálost v roztoku. Nedávno byl popsán nový typ fenolové kopulenty, 3-methyl-6-isopropylfenol, s podstatně nižší pK_a. Je kompatibilní s enzymem ureasou a může být použit v řádově nižší koncentraci než známý salicylan sodný. Umožňuje připravit před použitím spojený inkubační roztok, obsahující ureasu, katalyzátor i fenol (V. Chromý, L. Košíková, čs.AO 269205). Se 3-methyl-6-isopropylfenolem, a za přítomnosti běžně užívané ochranné látky pro ureasu, kyseliny ethylendiamintetraoctové, je inkubační roztok s ureasou použitelný až čtrnáct dnů.

Jak již bylo uvedeno, obsahuje ureasa thiolové skupiny a enzym je zejména v roztoku rychle inaktivován. I za přítomnosti běžného stabilizátoru, jimž je již uvedená kyselina ethylendiamintetraoctová, je roztok ureasy v chladu stálý nejvýše dva týd

-2CZ 281122 B6 ny. Berthelotovu reakci rusí thioly, redukující látky a komplexující činidla, a tedy i kyselina ethylendiamintetraoctová. Je obtížné až nemožné použít tyto látky ke stabilizaci ureasy, aniž by nebyla negativné ovlivněna následná reakce pro stanoveni amoniaku, oxidační kopulace na principu Berthelotovy reakce. Inkubační roztok s ureasou se proto připravuje vždy až před analýzou. V průmyslové výrobě analytických činidel pro tyto účely se s malou stabilitou enzymu počítá. Enzymové činidlo je proto obvykle připravováno odděleně od ostatních složek, například ve směsi s albuminem a komplexující látkou, nebo s komplexující látkou a vhodným pufrem. I za těchto podmínek je ale stálost roztoku enzymu omezená a obvykle nepřesahuje čtrnáct dnů. Omezená stálost roztoku ureasy je limitujícím faktorem pro stabilitu a použitelnost celé diagnostické soupravy. Soupravy činidel pro stanovení močoviny na tomto principu jsou proto koncipovány na menší počet analýz, nebo dokonce ve formě monotestů, které jsou určeny pro jednotlivé analýzy. Obé varianty výrobků jsou proto podstatně nákladnější, než výrobky určené pro velký počet analýz. Je tedy žádoucí dosáhnout co nejvyšší stálosti ureasového roztoku, který by obsahoval i další nezbytné složky pro stanoveni amoniaku jako jsou katalyzátor a fenol. V tomto případě lze analýzu zjednodušit a postup lze snadněji automatizovat.

Podstata vynálezu

K tomuto čili směřuje stabilizované enzymové činidlo s ureasou pro stanovení močoviny Berthelotovou reakcí, vyznačené tím, že na 1 MU ureasy obsahuje 0,2 až 20 milimolů poly-1,6-anhydroglukosy o molekulové hmotnosti 40 000 až 120 000 g/mol, 0,4 až 6 molů síranu alkalického kovu, 0,01 až 1 mol nitroprussidu alkalického kovu, 0,04 až 0,4 molu komplexotvorné látky schopné maskovat těžké kovy, například kyseliny ethylendiamintetraoctové nebo azidu sodného a 1 až 15 milimolů redukující látky, s výhodou kyseliny askorbové nebo siřičitanu alkalického kovu.

Stabilizované enzymové činidlo s ureasou podle vynálezu je v pevném stavu v chladu stálé nejméně jeden rok. Jeho roztok je v chladu stálý až čtyři měsíce, a to i za přítomnosti vhodné fenolové kopulenty, například již uvedeného 3-methyl-6-isopropylfenolu. Enzymové činidlo podle vynálezu je tedy kompatibilní i s ostatními nezbytnými komponentami pro enzymové stanoveni močoviny Berthelotovou reakci a umožňuje zjednodušit postup analýzy o jeden krok. Výjimečné stálosti enzymového činidla je dosaženo kombinovaným synergickým účinkem všech jeho shora uvedených komponent, jejichž vzájemný poměr je volen tak, aby zaručoval optimální ochranný účinek a nerušil oxidační kopulaci.

Stabilizované enzymové činidlo s ureasou umožňuje vyrobit stabilní diagnostickou soupravu pro stanoveni močoviny určenou pro velký počet analýz, která může obsahovat jediné ureasové činidlo. Souprava nemusí být koncipována ve formě nákladných monotestů, nebo testů pro malé počty vyšetřeni.

Použití stabilizovaného enzymového činidla s ureasou je doloženo příkladem uvedeným jako přiklad použití.

-3CZ 281122 B6

Příklady provedení

Příklad 1

Připraví se pevná směs obsahující:

Ureasa	1 MU
Kyselina ethylendiamintetraoctová, disodná sůl	0,4 mol
Nitroprussid sodný	1,0 mol
Kyselina askorbová	15,0 mmol
Poly-1,6-anhydroglukosa o molekulové hmotnosti
40 000 g/mol	20,0 mmol
Síran sodný	6,0 mol

Příklad 2

Připraví se pevná směs obsahující:

Ureasa

Azid sodný

Nitroprussid draselný

Siřičitan draselný

Póly 1,6-anhydroglukosa o molekulové hmotnosti 120 000 g/mol

Síran draselný

MU

40,0

10,0

1,0

0,2

0,4 mmol mmol mmol mmol mol

Pevná směs připravená podle příkladů 1 ' a 2 se uchovává v temnu a chladu pod +10 ’C.

Příklad použiti

V roztoku fosforečnanového pufru o koncentraci 50 mmol/1 a pH 6,8 až 7,0 obsahujícího 3-methyl-6-isopropylfenol o koncentraci 2 až 3 mmol/1 se rozpustí takové množství pevné enzymové směsi podle příkladů 1 nebo 2, aby výsledný roztok obsahoval ureasu o katalytické koncentraci 10 až 20 U/ml. Roztok se uchovává v temnu a chladu a je stálý až 4 měsíce.

Při stanoveni obsahu močoviny se postupuje tak, že se k 10 až 20 μ.1 vzorku přidá 1,5 ml roztoku ureasy v pufru, směs se inkubuje 5 min při 37 ’C, přidá se 0,5 ml oxidačního roztoku obsahujícího chlornan sodný 60 mmol/1 v roztoku hydroxidu sodného 450 mmol/1 a za dalších 10 min se změří absorbance při vlnové délce 600 nm v kývete 1 cm.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Stabilizované enzymové činidlo s ureasou pro stanovení močoviny Berthelotovou reakcí, vyznačené tím, že nal MU ureasy obsahuje 0,2 až 20 milimolů poly-1,6-anhydroglukosy o molekulové hmotnosti 40 000 až 120 000 mol/g, 0,4 až 6 molů síranu alkalického kovu, 0,01 až 1 mol nitroprussidu alkalického kovu, 0,04 až 0,4 molu komplexotvorné látky schopné maskovat těžké kovy, například kyselinu ethylendiamintetraoctovou nebo azid sodný a 1 až 15 milimolů redukující látky, s výhodou kyselinu askorbovou nebo siřičitan alkalického kovu.