CS269205B1 - Stabilizovaný roztok chromogenu pro enzymové stanovení močoviny Berthelotovou reakcí - Google Patents

Abstract

Stabilizovaný roztok chromogenu sestává z vodného roztoku 3-»ethyl-6-isopropylfenolu o koncentraci 1 až 5 mmol/1 obsahujícího komplexotvorné látky schopné maskovat těžké kovy o koncentraci 0,05 až 5 mmol/1, jako jeou například kyselina ethylendiamintetraoctová nebo azid sodný, stopové množství redukující látky o koncentraci 10 až 500 pmol/l a alifatický alkohol o celkovém počtu 1 až 3 atomy uhlíku o koncentraci 0,1 až 2 mol/1. Stabilizovaný roztok chromogenu může být připraven spolu β pufrem o pH 5 až 9, který je kompatibilní jak β enzymem ureázou, tak i s Berthelotovou reakcí. Vlivem nového typu chromogenu a specifického složení roztoku chromogenu je dosa­ ženo synergického účinku projevujícího se vysokou stálostí roztoku chromogenu i kompletního roztoku. Je potlačena absorbance kontrolního roztoku a roztok chromogenu uvedeného složení neihinbuje enzym ureózu,jejíž obsah v kompletním roztoku může být několikanásobně snížen. Roztok je velmi stabilní a zjednoduší se tak analytické stanovení močoviny o jeden stupeň při současném zvýšení přesnosti a správnosti a snížení ceny vlivem úspory enzymu ureáza.

Description

Vynález se týká stabilizovaného roztoku chromogenu pro enzymové stanovení močoviny Berthelotovou reakcí.

Stanovení močoviny je široce využíváno v krmivářství, biochemii, v humánní a veterinární diagnostice. Její stanovení v biologickém materiálu, zejména v séru, patří mezi základní analýzy, nebot močovina je spolu s kreatininem ukazatelem funkce ledvin. Její hladina se zvyšuje u akutní glomerulonefritis, pyelonefritis, obstrukci, uremii, ale i při chorobách jater, při gastrointestinálních poruchách a při nedostatečné činnosti srdce. ’

Pro stanovení močoviny byla postupnš v biochemii využita celá řada metod. Z fotometrických metod, které jsou stále nejrozšířenější, je to reakce močoviny a některými alfa-diketony a jejich oximy, jako je diacetyl, acetylbenzoyl a dlacetylmonoxim. Močovina β nimi reaguje za zvýšené teploty 80 až 100 °C v silně kyselém prostředí a stanovení lze jen obtížně automatizovat. DalSÍ skupinu tvoří metody vhodné pro kinetický způsob stanovení, například chemické stanovení s o-ftaldlaldehydem a N-(l-naftyDethylendiaminem nebo enzymové stanovení s ureázou, glutamátdehydrogenázou a redukovaným nlkotinamidadenindinukleotidem v ultrafialová oblasti spektra.

Hlavní metodou stanovení močoviny zůstává stále v biochemii a klinické chemii její enzymové stanovení s ureázou, která katalyzuje rozklad močoviny na amoniak a oxid uhličitý. Fotometrlcky se obvykle stanovuje amoniak po jeho převedení na indofenol postupem podle Berthelota. Toto stanovení, které je vysoce specifické a citlivé, má ale několik nevýhod, nebot představuje spojení dvou samostatných a současně značně protichůdných reakcí. Protichůdnost požadavků reakčních podmínek pro enzymový rozklad močoviny a na stanovení amoniaku podle Berthelota je hlavním zdrojem potíží. Protože enzym ureáza obsahuje thiolové skupiny, je konverze močoviny na amoniak katalyzovaná ureázou inhibována těžkými kovy. Ureázu inaktivují i látky s oxidačními účinky, které oxidují její thiolové skupiny. Při rozkladu močoviny ureázou lze stálost enzymu prodloužit přítomností látek maskujících těžké kovy, jako jsou komplexotvorné látky, například kyselina ethylendiamintetraoctová, kyselina citrónová a látky s thlolovými skupinami, například glut ethion (W.Schneider a kol.: Ger. Offen, 2 612 726, 1977, Chem. Abstr. 07, 196 469, 1977). Rychlost enzymová hydrolýzy se zvyšuje za přítomnosti některých aminokyselin, které ale ruší vlastní stanovení amoniaku oxidační kopulací podle Berthelota. Mezi látky rušící Berthelotovu reakci patří zejména aminy, thioly, redukující látky, komplexující činidla a obecně látky s nukleofilním účinkem na chlnony, s nimiž tvoří přednostně monoalkyl až bis(alkylamlno)hydrochinony, a brání tak vzniku indofenolu (T. T. NGo a kol.: Anal. Chem. 54, 46, 1982). Podle Pyma a Mllhama (Anal. Chem. 48, 1413, 1976) snižují výtěžek Berthelotovy reakce o 20 až 90 % fluoridy, citráty, oxaláty a kyselina ethylendiamintetraoctová. Podmínkou Berthelotovy reakce je, aby byl fenol přítomen v roztoku ve formě fenolátového anlontu. Jeho aktuální koncentrace v roztoku je závislá nejen na pH, ale i na disociační konstantě užitého fenolu. Citlivost reakce i rychlost vzniku indofenolu bude záviset na typu fenolu a druhu substituentů na fenolovém jádře. Stanovení amoniaku podle Berthelota s fenolem je pro analýzu séra příliš citlivé, se vzorkem o objemu 0,02 ml je výsledný objem roztoku příliš vysoký a dosahuje až 10 ml. Enzymové stanovení močoviny s ureázou v kombinaci s Berthelotovou reakcí se provádí jako několikastupňová a značně komplikovaná analýza. Postupuje se většinou tak, že se vzorek nejprve inkubuje s roztokem ureázy, pak se přidá roztok obsahující fenol a nitroprussid, který slouží jako katalyzátor, nakonec se přidá oxidační roztok obsahující nejčastšji alkalický chlornan nebo i jiné látky jako zdroje aktivního chloru. Vzniklé modrá zbarvení se měří fotometricky. Spojit enzymovou směs s fenolem a katalyzátorem do jednoho inkubačního roztoku je obtížné, nebot fenol inhibuje ureázu.

CS 269205 Bl

Spojení inkubačního roztoku e oxidačním činidlem vylučuje charakter jejich komponent. Proto byly hledány dalSÍ deriváty fenolu, které by byly a ureázou alespoň částečné kompatibilní. Jedním z nich je salicylan sodný (Tabacco a kol.: Clin. Chem. 25, 336, 1979), který lze sice přidat přímo do inkubačního roztoku, ale za cenu podstatného zvýěení koncentrace ureázy v roztoku z obvyklých 15 až 20 U/ml až na 50 U/ml, nebot i salicylan sodný snižuje katalytickou aktivitu 1 stabilitu ureázy. Tím sice lze stanovení močoviny o jeden stupeň zjednodušit, současně se ale značně zvýší jeho cena. Další nevýhodou, která provází zvyšování obsahu ureázy v inkubačním roztoku, je růst absorbance slepého pokusu. Ureáza obsahuje vždy stopy amonných solí, které zvyšují absorbanci slepého pokusu úměrně se zvyšováním navážky enzymu.

Uvedené nevýhody, spočívající v rozdílných a protlkladných požadavcích na složení činidel pro enzymovou hydrolýzu močoviny ureázou a pro stanovení amoniaku ’B.erthelotovou reakcí, spolu s komplikovaným několikastupňovým postupem analýzy, jsou důvodem k hledání jiných, výhodnějších řeSení, která by uvedené nevýhody odstranila nebo alespoň potlačila. Jedná se zejména o nalezení vhodnějšího .typu fenolu jako chromogenu pro oxidační kopulaci při Berthelotově reakci, který by nelnhiboval ureázu, a jehož indofenol by měl nižěí absorpční molární koeficient, aby nebylo nutné pracovat s velkými výslednými objemy při fotometrickém měření.

K odstranění uvedených nedostatků směřuje vodný stabilizovaný roztok chromogenu pro enzymové stanovení močoviny Berthelotovou reakcí podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se skládá z vodného roztoku 3-tnethyl-6~leopropylfenolu o koncentraci 1 až 5 mmol/1, komplexotvorné látky schopné maskovat těžké kovy, například kyseliny ethylendlamintetraoctové nebo azidu sodného o koncentraci 0,05 až 5 mmol/1, stopového množství redukující látky, s výhodou kyseliny askorbové, siřičltanu nebo kyseliny thiobarbiturové o koncentraci 10 až 500 ^umol/1 a alifatického alkoholu o koncentraci 0,1 až 2 mol/1 o celkovém počtu 1 až 3 atomy uhlíku a pufr o pH 5 až 9 kompatibilní s enzymem ureázou 1 s Berthelotovou reakcí, s výhodou barblturan, fosforečnan nebo cltronan alkalického kovu.

Použití 3-aethyl-6-isopropylfenolu jako chromogenu pro enzymové stanovení močoviny ve spojení s Berthelotovou reakcí má proti užívaným chromogenům, jimiž jsou fenol a salicylan sodný, řadu výhod. Fenol inhibuje enzym a roztok chromogenu nelze spojovat s enzymem. Salicylan sodný, který má dlsoclační konstantu pK_a asi 13,4 musí být k dosažení optimální analytické koncentrace v reakční směsi, kde musí být přítomen v disoclované, reaktivní formě, přidáván do reakční směsi v množství 62 mmol/1, zatímco 3-methyl-6-isopropylfenol postačuje v koncentraci o více než řád nižší 1 až 5 mmol/1. Množství ureázy lze s chromogenem podle tohoto vynálezu snížit až čtyřnásobně, tím podstatně snížit absorbanci kontrolního roztoku a celou analýzu zpřesnit.

Látky maskující těžké kovy spolu se stopovým množstvím redukující látky chrání roztok chromogenu před jeho spontánní oxidací, způsobující postupné vybarvování roztoku chromogenu, která je nežádoucí vlastností provážející oxidaci prakticky všech fenolů. Koncentrace obou látek, která Interferují při Berthelotově reakci, je volena specificky tak, aby tyto látky nerušily oxidační kopulaci amoniaku se 3-methyl-6-Isopropylfenolem a s alkalickým chlornanem.

Alifatický alkohol usnadňuje přípravu roztoku chromogenu a spolu s ním současně potlačují bakteriální kontaminaci. Obě' látky tedy roztok současně konzervují.

Pro enzymové stanovení močoviny lze ve spojení s Berthelotovou reakcí užít omezený okruh pufrů, nebot řada z nich, například všechny aminoalkoholy, při kopulaci Interferují. Požadavku kompatibility pufru s oběma reakSními syetémy splňují například barblturan a fosforečnany nebo cltronany alkalických kovů, které mají současně příznivý vliv nejen na stálost roztoku chromogenu, ale i na stálost kompletního roztoku obsahujícího současně i enzym ureázu a katalyzátor kopulace. Stabilizovaný

CS 269205 Bl roztok chromogenu podle vynálezu je stálý nejméně jeden rok. Kompletní roztok chromogenu s ureázou je stálý v temnu a chladu při teplotách +10 °C nejméně čtrnáct dnů.

Stabilizovaný roztok chromogenu podle vynálezu obsahující specifickou kombinaci ochranných látek, které samy o sobě působí na enzymové stanovení močoviny ureázou ve spojení s Berthelotovou reakcí rušivě, stabilizují chromogen svým eynergickým účinkem a podporují i dobrou stálost kombinovaného roztoku chromogenu s ureázou.

Užití stabilizovaného roztoku chromogenu ke stanovení močoviny je doloženo tímto příkladem. V roztoku stabilizovaného chromogenu se rozpustí takové množství ureázy, které odpovídá její katalytické koncentraci 15 až 12 kU/1, spolu s nitroprussidem sodným o koncentraci 1 až 10 mmol/1. Ke vzorku močoviny o objemu 0,01 až 0,02 ml se přidá 1,5 ml kompletního roztoku a inkubuje se 10 minut při 20 °C, přidá se 0,5 ml alkalického roztoku chlornanu a po dalších 10 minutách se změří absorbance v absorpčním pásu 600 až 700 na. S roztokem chromogenu podle vynálezu lze postup analýzy miniaturizovat a snížit výsledný reakční objem směsi až pětkrát.

Příklad 1

Připraví se roztok fosforečnanového pufru o pH 7,0 obsahující 3-methyl-6-isopropylfenol o koncentraci 2 mmol/1 rozpuštěný v ethanolu 0,3 mol/1 disodnou sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové v množství 1 mmol/1 a 100 yumol/1 kyseliny askorbové.

Příklad 2 ,

Připraví se roztok citronanového pufru o pH 5,0 obsahující 3-methyl-6-isopropylfenol o koncentraci 5 mmol/1 rozpuštěný v methanolu 0,1 mol/1, azid sodný v množství 0,05 mmol/1 a 10 /umol/1 kyseliny thiobarbiturové.

Příklad 3

Připraví se roztok barbituranového pufru o pH 8,0 obsahující 3-methyl-6-ixopropylfenol o koncentraci 1 mmol/1 rozpuštěný v propanolu 2 mol/1, kyselinu ethylendiamintetraoctovou v množství 5 mmol/1 a 500 /umol/1 siřičitanu sodného.

Claims (1)

1. Stabilizovaný roztok chromogenu pro enzymové stanovení močoviny Berthelotovou reakcí, vyznačující se tím, že se skládá z vodného roztoku 3-methyl-6-isopropylfenolu o koncentraci 1 až 5 mmol/1, komplexotvorné látky schopné maskovat těžké kovy, například kyseliny ethylendiamintetraoctové nebo azidu sodného o koncentraci 0,05 až 5 mmol/1, stopového množství redukující látky, s výhodou kyseliny askorbové, siřičitanu nebo kyseliny thiobarbiturové o koncentraci 10 až 500 ^mol/l a alifatického alkoholu o koncentraci 0,1 až 2 mol/1 o celkovém počtu 1 až 3 atomy uhlíku a pufr o pH 5 až 9 kompatibilní s enzymem ureázou i s Berthelotovou reakcí, s výhodou barbituran, fosforečnan nebo citronan alkalického kovu.