CS269205B1

CS269205B1 - Stabilized chromogen solution for urea enzyme determination by Berthelot reaction

Info

Publication number: CS269205B1
Application number: CS881177A
Authority: CS
Inventors: Vratislav Ing Csc Chromy; Libuse Rndr Kosikova
Original assignee: Chromy Vratislav; Libuse Rndr Kosikova
Priority date: 1988-02-24
Filing date: 1988-02-24
Publication date: 1990-04-11
Also published as: CS117788A1

Abstract

Stabilizovaný roztok chromogenu sestává z vodného roztoku 3-»ethyl-6-isopropylfenolu o koncentraci 1 až 5 mmol/1 obsahujícího komplexotvorné látky schopné maskovat těžké kovy o koncentraci 0,05 až 5 mmol/1, jako jeou například kyselina ethylendiamintetraoctová nebo azid sodný, stopové množství redukující látky o koncentraci 10 až 500 pmol/l a alifatický alkohol o celkovém počtu 1 až 3 atomy uhlíku o koncentraci 0,1 až 2 mol/1. Stabilizovaný roztok chromogenu může být připraven spolu β pufrem o pH 5 až 9, který je kompatibilní jak β enzymem ureázou, tak i s Berthelotovou reakcí. Vlivem nového typu chromogenu a specifického složení roztoku chromogenu je dosa ženo synergického účinku projevujícího se vysokou stálostí roztoku chromogenu i kompletního roztoku. Je potlačena absorbance kontrolního roztoku a roztok chromogenu uvedeného složení neihinbuje enzym ureózu,jejíž obsah v kompletním roztoku může být několikanásobně snížen. Roztok je velmi stabilní a zjednoduší se tak analytické stanovení močoviny o jeden stupeň při současném zvýšení přesnosti a správnosti a snížení ceny vlivem úspory enzymu ureáza.The stabilized chromogen solution consists of an aqueous solution of 3-ethyl-6-isopropylphenol at a concentration of 1 to 5 mmol/l containing complexing agents capable of masking heavy metals at a concentration of 0.05 to 5 mmol/l, such as ethylenediaminetetraacetic acid or sodium azide, a trace amount of a reducing agent at a concentration of 10 to 500 pmol/l and an aliphatic alcohol with a total number of 1 to 3 carbon atoms at a concentration of 0.1 to 2 mol/l. The stabilized chromogen solution can be prepared together with a β buffer at a pH of 5 to 9, which is compatible with both the β enzyme urease and the Berthelot reaction. Due to the influence of the new type of chromogen and the specific composition of the chromogen solution, a synergistic effect is achieved, manifested in the high stability of the chromogen solution and the complete solution. The absorbance of the control solution is suppressed and the chromogen solution of the above composition does not inhibit the urease enzyme, the content of which in the complete solution can be reduced several times. The solution is very stable and thus simplifies the analytical determination of urea by one step while simultaneously increasing the accuracy and precision and reducing the price due to the saving of the urease enzyme.

Description

Vynález se týká stabilizovaného roztoku chromogenu pro enzymové stanovení močoviny Berthelotovou reakcí.The invention relates to a stabilized chromogen solution for the enzymatic determination of urea by the Berthelot reaction.

Stanovení močoviny je široce využíváno v krmivářství, biochemii, v humánní a veterinární diagnostice. Její stanovení v biologickém materiálu, zejména v séru, patří mezi základní analýzy, nebot močovina je spolu s kreatininem ukazatelem funkce ledvin. Její hladina se zvyšuje u akutní glomerulonefritis, pyelonefritis, obstrukci, uremii, ale i při chorobách jater, při gastrointestinálních poruchách a při nedostatečné činnosti srdce. ’Urea determination is widely used in feed industry, biochemistry, human and veterinary diagnostics. Its determination in biological material, especially in serum, is one of the basic analyses, since urea, together with creatinine, is an indicator of kidney function. Its level increases in acute glomerulonephritis, pyelonephritis, obstruction, uremia, but also in liver diseases, gastrointestinal disorders and insufficient heart function. ’

Pro stanovení močoviny byla postupnš v biochemii využita celá řada metod. Z fotometrických metod, které jsou stále nejrozšířenější, je to reakce močoviny a některými alfa-diketony a jejich oximy, jako je diacetyl, acetylbenzoyl a dlacetylmonoxim. Močovina β nimi reaguje za zvýšené teploty 80 až 100 °C v silně kyselém prostředí a stanovení lze jen obtížně automatizovat. DalSÍ skupinu tvoří metody vhodné pro kinetický způsob stanovení, například chemické stanovení s o-ftaldlaldehydem a N-(l-naftyDethylendiaminem nebo enzymové stanovení s ureázou, glutamátdehydrogenázou a redukovaným nlkotinamidadenindinukleotidem v ultrafialová oblasti spektra.A number of methods have been used in biochemistry to determine urea. Of the photometric methods, the most widespread is the reaction of urea with some alpha-diketones and their oximes, such as diacetyl, acetylbenzoyl and dlacetylmonoxime. Urea β reacts with them at elevated temperatures of 80 to 100 °C in a strongly acidic environment and the determination can only be automated with difficulty. Another group consists of methods suitable for kinetic determination, for example chemical determination with o-phthalaldehyde and N-(l-naphthylethylenediamine or enzymatic determination with urease, glutamate dehydrogenase and reduced nicotinamide adenine dinucleotide in the ultraviolet region of the spectrum.

Hlavní metodou stanovení močoviny zůstává stále v biochemii a klinické chemii její enzymové stanovení s ureázou, která katalyzuje rozklad močoviny na amoniak a oxid uhličitý. Fotometrlcky se obvykle stanovuje amoniak po jeho převedení na indofenol postupem podle Berthelota. Toto stanovení, které je vysoce specifické a citlivé, má ale několik nevýhod, nebot představuje spojení dvou samostatných a současně značně protichůdných reakcí. Protichůdnost požadavků reakčních podmínek pro enzymový rozklad močoviny a na stanovení amoniaku podle Berthelota je hlavním zdrojem potíží. Protože enzym ureáza obsahuje thiolové skupiny, je konverze močoviny na amoniak katalyzovaná ureázou inhibována těžkými kovy. Ureázu inaktivují i látky s oxidačními účinky, které oxidují její thiolové skupiny. Při rozkladu močoviny ureázou lze stálost enzymu prodloužit přítomností látek maskujících těžké kovy, jako jsou komplexotvorné látky, například kyselina ethylendiamintetraoctová, kyselina citrónová a látky s thlolovými skupinami, například glut ethion (W.Schneider a kol.: Ger. Offen, 2 612 726, 1977, Chem. Abstr. 07, 196 469, 1977). Rychlost enzymová hydrolýzy se zvyšuje za přítomnosti některých aminokyselin, které ale ruší vlastní stanovení amoniaku oxidační kopulací podle Berthelota. Mezi látky rušící Berthelotovu reakci patří zejména aminy, thioly, redukující látky, komplexující činidla a obecně látky s nukleofilním účinkem na chlnony, s nimiž tvoří přednostně monoalkyl až bis(alkylamlno)hydrochinony, a brání tak vzniku indofenolu (T. T. NGo a kol.: Anal. Chem. 54, 46, 1982). Podle Pyma a Mllhama (Anal. Chem. 48, 1413, 1976) snižují výtěžek Berthelotovy reakce o 20 až 90 % fluoridy, citráty, oxaláty a kyselina ethylendiamintetraoctová. Podmínkou Berthelotovy reakce je, aby byl fenol přítomen v roztoku ve formě fenolátového anlontu. Jeho aktuální koncentrace v roztoku je závislá nejen na pH, ale i na disociační konstantě užitého fenolu. Citlivost reakce i rychlost vzniku indofenolu bude záviset na typu fenolu a druhu substituentů na fenolovém jádře. Stanovení amoniaku podle Berthelota s fenolem je pro analýzu séra příliš citlivé, se vzorkem o objemu 0,02 ml je výsledný objem roztoku příliš vysoký a dosahuje až 10 ml. Enzymové stanovení močoviny s ureázou v kombinaci s Berthelotovou reakcí se provádí jako několikastupňová a značně komplikovaná analýza. Postupuje se většinou tak, že se vzorek nejprve inkubuje s roztokem ureázy, pak se přidá roztok obsahující fenol a nitroprussid, který slouží jako katalyzátor, nakonec se přidá oxidační roztok obsahující nejčastšji alkalický chlornan nebo i jiné látky jako zdroje aktivního chloru. Vzniklé modrá zbarvení se měří fotometricky. Spojit enzymovou směs s fenolem a katalyzátorem do jednoho inkubačního roztoku je obtížné, nebot fenol inhibuje ureázu.The main method for determining urea in biochemistry and clinical chemistry still remains its enzymatic determination with urease, which catalyzes the decomposition of urea into ammonia and carbon dioxide. Ammonia is usually determined photometrically after its conversion to indophenol according to the Berthelot procedure. This determination, which is highly specific and sensitive, has several disadvantages, however, as it represents a combination of two separate and at the same time quite contradictory reactions. The contradiction of the requirements of the reaction conditions for the enzymatic decomposition of urea and for the determination of ammonia according to Berthelot is the main source of difficulties. Since the enzyme urease contains thiol groups, the conversion of urea to ammonia catalyzed by urease is inhibited by heavy metals. Substances with oxidizing effects that oxidize its thiol groups also inactivate urease. When urea is broken down by urease, the stability of the enzyme can be extended by the presence of substances that mask heavy metals, such as complexing agents, for example ethylenediaminetetraacetic acid, citric acid and substances with thiol groups, for example glutathione (W. Schneider et al.: Ger. Offen, 2 612 726, 1977, Chem. Abstr. 07, 196 469, 1977). The rate of enzymatic hydrolysis increases in the presence of some amino acids, which, however, interfere with the actual determination of ammonia by oxidative coupling according to Berthelot. Substances that interfere with the Berthelot reaction include in particular amines, thiols, reducing agents, complexing agents and in general substances with a nucleophilic effect on quinones, with which they preferentially form monoalkyl to bis(alkylamino)hydroquinones, thus preventing the formation of indophenol (T. T. NGo et al.: Anal. Chem. 54, 46, 1982). According to Pym and Millham (Anal. Chem. 48, 1413, 1976), fluorides, citrates, oxalates and ethylenediaminetetraacetic acid reduce the yield of the Berthelot reaction by 20 to 90%. The condition for the Berthelot reaction is that phenol is present in the solution in the form of a phenolate anion. Its actual concentration in the solution depends not only on the pH, but also on the dissociation constant of the phenol used. The sensitivity of the reaction and the rate of formation of indophenol will depend on the type of phenol and the type of substituents on the phenol nucleus. The determination of ammonia according to Berthelot with phenol is too sensitive for serum analysis; with a sample of 0.02 ml, the resulting volume of the solution is too high and reaches up to 10 ml. The enzymatic determination of urea with urease in combination with the Berthelot reaction is performed as a multi-stage and very complicated analysis. The procedure is usually as follows: the sample is first incubated with a urease solution, then a solution containing phenol and nitroprusside is added, which serves as a catalyst, and finally an oxidizing solution containing most often alkaline hypochlorite or other substances as sources of active chlorine is added. The resulting blue color is measured photometrically. It is difficult to combine the enzyme mixture with phenol and catalyst into one incubation solution, since phenol inhibits urease.

CS 269205 BlCS 269205 Bl

Spojení inkubačního roztoku e oxidačním činidlem vylučuje charakter jejich komponent. Proto byly hledány dalSÍ deriváty fenolu, které by byly a ureázou alespoň částečné kompatibilní. Jedním z nich je salicylan sodný (Tabacco a kol.: Clin. Chem. 25, 336, 1979), který lze sice přidat přímo do inkubačního roztoku, ale za cenu podstatného zvýěení koncentrace ureázy v roztoku z obvyklých 15 až 20 U/ml až na 50 U/ml, nebot i salicylan sodný snižuje katalytickou aktivitu 1 stabilitu ureázy. Tím sice lze stanovení močoviny o jeden stupeň zjednodušit, současně se ale značně zvýší jeho cena. Další nevýhodou, která provází zvyšování obsahu ureázy v inkubačním roztoku, je růst absorbance slepého pokusu. Ureáza obsahuje vždy stopy amonných solí, které zvyšují absorbanci slepého pokusu úměrně se zvyšováním navážky enzymu.The combination of the incubation solution with an oxidizing agent excludes the character of their components. Therefore, other phenol derivatives were sought that would be at least partially compatible with urease. One of them is sodium salicylate (Tabacco et al.: Clin. Chem. 25, 336, 1979), which can be added directly to the incubation solution, but at the cost of a significant increase in the urease concentration in the solution from the usual 15 to 20 U/ml to 50 U/ml, since sodium salicylate also reduces the catalytic activity and stability of urease. This can simplify the determination of urea by one degree, but at the same time its price increases considerably. Another disadvantage that accompanies the increase in the urease content in the incubation solution is the increase in the absorbance of the blank. Urease always contains traces of ammonium salts, which increase the absorbance of the blank proportionally to the increase in the enzyme loading.

Uvedené nevýhody, spočívající v rozdílných a protlkladných požadavcích na složení činidel pro enzymovou hydrolýzu močoviny ureázou a pro stanovení amoniaku ’B.erthelotovou reakcí, spolu s komplikovaným několikastupňovým postupem analýzy, jsou důvodem k hledání jiných, výhodnějších řeSení, která by uvedené nevýhody odstranila nebo alespoň potlačila. Jedná se zejména o nalezení vhodnějšího .typu fenolu jako chromogenu pro oxidační kopulaci při Berthelotově reakci, který by nelnhiboval ureázu, a jehož indofenol by měl nižěí absorpční molární koeficient, aby nebylo nutné pracovat s velkými výslednými objemy při fotometrickém měření.The above disadvantages, consisting in different and contradictory requirements for the composition of reagents for the enzymatic hydrolysis of urea by urease and for the determination of ammonia by the Berthelot reaction, together with the complicated multi-stage analysis procedure, are the reason for searching for other, more advantageous solutions that would eliminate or at least suppress the above disadvantages. This is mainly about finding a more suitable type of phenol as a chromogen for oxidative coupling in the Berthelot reaction, which would not inhibit urease, and whose indophenol would have a lower absorption molar coefficient, so that it would not be necessary to work with large resulting volumes in photometric measurement.

K odstranění uvedených nedostatků směřuje vodný stabilizovaný roztok chromogenu pro enzymové stanovení močoviny Berthelotovou reakcí podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se skládá z vodného roztoku 3-tnethyl-6~leopropylfenolu o koncentraci 1 až 5 mmol/1, komplexotvorné látky schopné maskovat těžké kovy, například kyseliny ethylendlamintetraoctové nebo azidu sodného o koncentraci 0,05 až 5 mmol/1, stopového množství redukující látky, s výhodou kyseliny askorbové, siřičltanu nebo kyseliny thiobarbiturové o koncentraci 10 až 500 ^umol/1 a alifatického alkoholu o koncentraci 0,1 až 2 mol/1 o celkovém počtu 1 až 3 atomy uhlíku a pufr o pH 5 až 9 kompatibilní s enzymem ureázou 1 s Berthelotovou reakcí, s výhodou barblturan, fosforečnan nebo cltronan alkalického kovu.The aqueous stabilized chromogen solution for the enzymatic determination of urea by the Berthelot reaction according to the invention aims to eliminate the above shortcomings, the essence of which is that it consists of an aqueous solution of 3-methyl-6-leopropylphenol with a concentration of 1 to 5 mmol/l, a complexing agent capable of masking heavy metals, for example ethylenediaminetetraacetic acid or sodium azide with a concentration of 0.05 to 5 mmol/l, a trace amount of a reducing agent, preferably ascorbic acid, sulfite or thiobarbituric acid with a concentration of 10 to 500 µmol/l and an aliphatic alcohol with a concentration of 0.1 to 2 mol/l with a total number of 1 to 3 carbon atoms and a buffer with a pH of 5 to 9 compatible with the enzyme urease 1 with the Berthelot reaction, preferably an alkali metal barbiturate, phosphate or chloride.

Použití 3-aethyl-6-isopropylfenolu jako chromogenu pro enzymové stanovení močoviny ve spojení s Berthelotovou reakcí má proti užívaným chromogenům, jimiž jsou fenol a salicylan sodný, řadu výhod. Fenol inhibuje enzym a roztok chromogenu nelze spojovat s enzymem. Salicylan sodný, který má dlsoclační konstantu pK_a asi 13,4 musí být k dosažení optimální analytické koncentrace v reakční směsi, kde musí být přítomen v disoclované, reaktivní formě, přidáván do reakční směsi v množství 62 mmol/1, zatímco 3-methyl-6-isopropylfenol postačuje v koncentraci o více než řád nižší 1 až 5 mmol/1. Množství ureázy lze s chromogenem podle tohoto vynálezu snížit až čtyřnásobně, tím podstatně snížit absorbanci kontrolního roztoku a celou analýzu zpřesnit.The use of 3-ethyl-6-isopropylphenol as a chromogen for the enzymatic determination of urea in conjunction with the Berthelot reaction has a number of advantages over the chromogens used, which are phenol and sodium salicylate. Phenol inhibits the enzyme and the chromogen solution cannot be combined with the enzyme. Sodium salicylate, which has a dissociation constant _pK of about 13.4, must be added to the reaction mixture in an amount of 62 mmol/l to achieve the optimal analytical concentration in the reaction mixture, where it must be present in a dissociated, reactive form, while 3-methyl-6-isopropylphenol is sufficient in a concentration that is more than an order of magnitude lower, 1 to 5 mmol/l. The amount of urease can be reduced by up to fourfold with the chromogen according to the invention, thereby significantly reducing the absorbance of the control solution and making the entire analysis more precise.

Látky maskující těžké kovy spolu se stopovým množstvím redukující látky chrání roztok chromogenu před jeho spontánní oxidací, způsobující postupné vybarvování roztoku chromogenu, která je nežádoucí vlastností provážející oxidaci prakticky všech fenolů. Koncentrace obou látek, která Interferují při Berthelotově reakci, je volena specificky tak, aby tyto látky nerušily oxidační kopulaci amoniaku se 3-methyl-6-Isopropylfenolem a s alkalickým chlornanem.Heavy metal masking agents together with a trace amount of reducing agent protect the chromogen solution from its spontaneous oxidation, causing gradual discoloration of the chromogen solution, which is an undesirable property accompanying the oxidation of practically all phenols. The concentration of both substances that interfere with the Berthelot reaction is chosen specifically so that these substances do not interfere with the oxidative coupling of ammonia with 3-methyl-6-isopropylphenol and with alkaline hypochlorite.

Alifatický alkohol usnadňuje přípravu roztoku chromogenu a spolu s ním současně potlačují bakteriální kontaminaci. Obě' látky tedy roztok současně konzervují.The aliphatic alcohol facilitates the preparation of the chromogen solution and, together with it, suppresses bacterial contamination. Both substances therefore simultaneously preserve the solution.

Pro enzymové stanovení močoviny lze ve spojení s Berthelotovou reakcí užít omezený okruh pufrů, nebot řada z nich, například všechny aminoalkoholy, při kopulaci Interferují. Požadavku kompatibility pufru s oběma reakSními syetémy splňují například barblturan a fosforečnany nebo cltronany alkalických kovů, které mají současně příznivý vliv nejen na stálost roztoku chromogenu, ale i na stálost kompletního roztoku obsahujícího současně i enzym ureázu a katalyzátor kopulace. StabilizovanýFor the enzymatic determination of urea, a limited range of buffers can be used in conjunction with the Berthelot reaction, since many of them, for example all amino alcohols, interfere during coupling. The requirement of buffer compatibility with both reaction systems is met, for example, by barbiturates and phosphates or chlorides of alkali metals, which simultaneously have a positive effect not only on the stability of the chromogen solution, but also on the stability of the complete solution containing both the urease enzyme and the coupling catalyst. Stabilized

CS 269205 Bl roztok chromogenu podle vynálezu je stálý nejméně jeden rok. Kompletní roztok chromogenu s ureázou je stálý v temnu a chladu při teplotách +10 °C nejméně čtrnáct dnů.CS 269205 B1 chromogen solution according to the invention is stable for at least one year. The complete solution of chromogen with urease is stable in the dark and cold at temperatures of +10 °C for at least fourteen days.

Stabilizovaný roztok chromogenu podle vynálezu obsahující specifickou kombinaci ochranných látek, které samy o sobě působí na enzymové stanovení močoviny ureázou ve spojení s Berthelotovou reakcí rušivě, stabilizují chromogen svým eynergickým účinkem a podporují i dobrou stálost kombinovaného roztoku chromogenu s ureázou.The stabilized chromogen solution according to the invention contains a specific combination of protective substances, which in themselves interfere with the enzymatic determination of urea by urease in conjunction with the Berthelot reaction, stabilize the chromogen with their einergic effect and also support good stability of the combined chromogen solution with urease.

Užití stabilizovaného roztoku chromogenu ke stanovení močoviny je doloženo tímto příkladem. V roztoku stabilizovaného chromogenu se rozpustí takové množství ureázy, které odpovídá její katalytické koncentraci 15 až 12 kU/1, spolu s nitroprussidem sodným o koncentraci 1 až 10 mmol/1. Ke vzorku močoviny o objemu 0,01 až 0,02 ml se přidá 1,5 ml kompletního roztoku a inkubuje se 10 minut při 20 °C, přidá se 0,5 ml alkalického roztoku chlornanu a po dalších 10 minutách se změří absorbance v absorpčním pásu 600 až 700 na. S roztokem chromogenu podle vynálezu lze postup analýzy miniaturizovat a snížit výsledný reakční objem směsi až pětkrát.The use of a stabilized chromogen solution for the determination of urea is illustrated by the following example. In a stabilized chromogen solution, an amount of urease is dissolved that corresponds to its catalytic concentration of 15 to 12 kU/l, together with sodium nitroprusside at a concentration of 1 to 10 mmol/l. 1.5 ml of the complete solution is added to a urea sample of 0.01 to 0.02 ml and incubated for 10 minutes at 20 °C, 0.5 ml of alkaline hypochlorite solution is added and after another 10 minutes the absorbance is measured in the absorption band of 600 to 700 nm. With the chromogen solution according to the invention, the analysis procedure can be miniaturized and the resulting reaction volume of the mixture can be reduced by up to five times.

Příklad 1Example 1

Připraví se roztok fosforečnanového pufru o pH 7,0 obsahující 3-methyl-6-isopropylfenol o koncentraci 2 mmol/1 rozpuštěný v ethanolu 0,3 mol/1 disodnou sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové v množství 1 mmol/1 a 100 yumol/1 kyseliny askorbové.A phosphate buffer solution of pH 7.0 containing 3-methyl-6-isopropylphenol at a concentration of 2 mmol/l dissolved in ethanol 0.3 mol/l disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid in an amount of 1 mmol/l and 100 μmol/l ascorbic acid is prepared.

Příklad 2 ,Example 2,

Připraví se roztok citronanového pufru o pH 5,0 obsahující 3-methyl-6-isopropylfenol o koncentraci 5 mmol/1 rozpuštěný v methanolu 0,1 mol/1, azid sodný v množství 0,05 mmol/1 a 10 /umol/1 kyseliny thiobarbiturové.A citrate buffer solution of pH 5.0 containing 3-methyl-6-isopropylphenol at a concentration of 5 mmol/l dissolved in 0.1 mol/l methanol, sodium azide at an amount of 0.05 mmol/l and 10 µmol/l thiobarbituric acid is prepared.

Příklad 3Example 3

Připraví se roztok barbituranového pufru o pH 8,0 obsahující 3-methyl-6-ixopropylfenol o koncentraci 1 mmol/1 rozpuštěný v propanolu 2 mol/1, kyselinu ethylendiamintetraoctovou v množství 5 mmol/1 a 500 /umol/1 siřičitanu sodného.A barbiturate buffer solution of pH 8.0 is prepared containing 3-methyl-6-isopropylphenol at a concentration of 1 mmol/l dissolved in 2 mol/l propanol, 5 mmol/l ethylenediaminetetraacetic acid and 500 µmol/l sodium sulfite.

Claims

Stabilized chromogen solution for enzymatic determination of urea by the Berthelot reaction, characterized in that it consists of an aqueous solution of 3-methyl-6-isopropylphenol with a concentration of 1 to 5 mmol/l, a complexing agent capable of masking heavy metals, for example ethylenediaminetetraacetic acid or sodium azide with a concentration of 0.05 to 5 mmol/l, a trace amount of a reducing agent, preferably ascorbic acid, sulfite or thiobarbituric acid with a concentration of 10 to 500 µmol/l and an aliphatic alcohol with a concentration of 0.1 to 2 mol/l with a total number of 1 to 3 carbon atoms and a buffer with a pH of 5 to 9 compatible with the urease enzyme and the Berthelot reaction, preferably a barbiturate, phosphate or alkali metal citrate.