CZ202286A3 - Polymethiniové soli jako inhibitory dihydroorotát dehydrogenázy - Google Patents

Abstract

Předmětem řešení jsou deriváty polymethiniových solí obecného vzorce I, kde obě koncové heteroaromatické skupiny methiniového řetězce jsou totožné nebo rozdílné a tvoří je benzothiazol, naftothiazol, benzimidazol, naftoimidazol, benzooxazol, naftooxazol, benzoselenazol, naftoselenazol, chinolin, benzochinolin, indol nebo benzoindol, jejichž konkrétní struktura je charakterizovaná skupinami A, B, X, Y a jejich soli, použitelné jako selektivní inhibitory dihydroorotát dehydrogenázy.

Description

Polymethiniové soli jako inhibitory dihydroorotát dehydrogenázy

Oblast techniky

Vynález se týká použití derivátů polymethiniových solí pro přípravu léčiva k léčbě využívající inhibici dihydroorotát dehydrogenázy.

Dosavadní stav techniky

Mitochondrie hrají velmi důležitou roli v buněčném metabolismu. (Mori MP, Penjweini R, Knutson JR, Wang PY, Hwang PM. Mitochondria and oxygen homeostasis. FEBS J. 2021 Jul 8. doi: 10.1111/febs.16115.) Dodávají energii ve formě ATP, regulují jeho distribuci, a navíc se podílejí na řadě fyziologických a patofyziologických procesů v buňkách, jako je proliferace, diferenciace, přenos informací a apoptóza a hrají důležitou roli v regulaci buněčného růstu a buněčného cyklu. Tento význam mitochondrií vychází z řady biochemických procesů, které v nich probíhají. Mezi nejdůležitější prvky mitochondriálních metabolických drah jsou enzymatické komplexy elektronového transportního řetězce a enzym dihydroorotát dehydrogenáza (DHODH).

Komplexy elektronového transportního řetězce (ETC), složky oxidační fosforylace, jsou ústředními hráči v produkci mitochondriální energie. (Caruana NJ, Stroud DA. The road to the structure of the mitochondrial respiratory chain supercomplex. Biochem Soc Trans. 2020 Apr 29;48(2):621-629. doi: 10.1042/BST20190930.) Savčí respirační řetězec se skládá z 5-ti komplexů. Tedy komplexu I, II, III, IV a V zabudovaných ve vnitřní mitochondriální membráně (uspořádání je uvedeno na obr. 1) a mobilních nosičů elektronů, jimiž jsou ubichinon (UbQ) a cytochrom c, což dohromady vytváří elektronový tok udržující potenciál mitochondriální membrány a elektrochemický protonový gradient vedoucí k produkci ATP.

Dihydroorotát dehydrogenáza (DHODH) je enzym, který se účastní de novo syntézy pyrimidinových bází. Tato dráha se skládá ze 6-ti kroků, kdy první tři kroky vedoucí ke konverzi glutaminu na dihydroorotát katalyzuje polypeptid CAD se třemi enzymatickými aktivitami v cytosolu. (Zhou Y, Tao L, Zhou X, Zuo Z, Gong J, Liu X, Zhou Y, Liu C, Sang N, Liu H, Zou J, Gou K, Yang X, Zhao Y. DHODH and cancer: promising prospects to be explored. Cancer Metab. 2021 May 10:9(1):22. doi: 10.1186/s40170-021-00250-z.) Konverzi dihydroorotátu na orotát katalyzuje DHODH, která se nalézá ve vnitřní mitochondriální membráně. Orotát je konvertován na uridin monofosfát (UMP), opět v cytosolu, což katalyzuje polypeptid uridin monofosfát syntáza se dvěma enzymatickými aktivitami. Při konverzi dihydroorotátu na orotát dochází k uvolnění dvou elektronů, které reagují ve vnitřní mitochondriální membráně s oxidovanou formou koenzymu Q, ubichinonem (UbQ). Ten je takto redukován na ubichinol (UbQH2). UbQH2 následně předává elektrony molekule UbQ v mitochondriálním komplexu III, čímž se sám reoxiduje zpět na UbQ a může opět přijímat další dva elektrony vzniklé konverzí dihydroorotátu na orotát. Pro účinný průběh de novo syntézy pyrimidinů, kdy UMP je první pyrimidin a prekurzor pro další pyrimidiny, je zásadní aktivita části oxidativní fosforylace, což jest komplex III a komplex IV, neboť komplex IV přejímá elektrony od komplexu III a převádí je na molekulární kyslík za vzniku vody. Komplexy III a IV tedy katalyzují tzv. redoxní cyklus koenzymu Q, který přímo ,pohání‘ de novo syntézu pyrimidinů přes enzym DHODH.

Mitochondriální DHODH je klíčovým enzymem při de novo syntéze pyrimidinů. DHODH dodává elektrony pro UbQ, což je zásadní pro zachování jeho funkčnosti. Když je oxidační fosforylace (OXPHOS) nefunkční, je redoxní cyklus UbQ přerušen a DHODH je neaktivní. V naší práci jsme ukázali, že aktivita DHODH je zásadní pro tvorbu nádorů a že delece tohoto enzymu či jeho inhibice tvorbu nádorů potlačí a rakovinné buňky jsou arestovány na počátku S-fáze buněčného cyklu (Bajzikova M, Kovarova J, Coelho A, Boukalova S, Oh S, Rohlenova K, Svec D, Hubackova S, Endaya B, Judasova K, Bezawork-Geleta A, Kluckova K, Chatre L, Zobalova R, Novakova A,

- 1 CZ 2022 - 86 A3

Vanova K, Ezrova Z, Maghzal G, Olsinova M, Krobova L, An YJ, Davidova E, Nahacka Z, Sobol M, Cunha-Oliveira T, Sandoval-Acuna C, Strnad H, Zhang T, Huynh T, Serafim TL, Hozak P, Sardao VA, Koopman WJH, Ricchetti M, Oliveira PJ, Kolar F, Kubista M, Truksa J, DvorakovaHortova K, Pacak K, Gurlich R, Stocker R, Zhou Y, Berridge MV, Park S, Dong LF, Rohlena J, Neuzil J (2019) Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase by respiration restores tumor growth of mitochondrial DNA-depleted cancer cells. Cell Metab 29, 399-416, Hubackova S, Davidova E, Boukalova S, Kovarova J, Bajzikova M, Coelho A, Terp MG, Ditzel H, Rohlena J, Neuzil J (2020) Targeting of dihydroorotate dehydrogenase and checkpoint kinase 1 results in suppression of tumor growth via cell cycle arrest induced by replication stress. Cell Death Disease 11, 110). Potlačení produkce ATP OXPHOS na rozdíl od inhibice DHODH nemusí vést k supresi tumorigeneze. Protože de novo syntéza pyrimidinů je nezbytnou součástí buněčné proliferace, lze očekávat, že inhibitory aktivity DHODH budou mít širokospektrý protinádorový účinek.

Potencionální vlastnosti polymethiniových solí (PMS) využitelné v medicíně, např. toxicita proti nádorovým buňkám, mitochondriální lokalizace a případná selektivita pro nádorové markery byly již popsány. Nicméně jejich účinek nebyl spojený s inhibicí DHODH. Jednalo se například o jejich aplikaci jako photosensitizerů (Krejcir R, Briza T, Sterba M, Simoncik O, Muller P, Coates PJ, Martasek P, Vojtesek B, Zatloukalova P. Anticancer pentamethinium salt is a potent photosensitizer inducing mitochondrial disintegration and apoptosis upon red light illumination. J Photochem Photobiol B. 2020 Aug;209:111939. doi: 10.1016,^j.jphotobiol.2020.111939.), jako apoptotických látek (Krejcir R, Krcova L, Zatloukalova P, Briza T, Coates PJ, Sterba M, Muller P, Kralova J, Martasek P, Kral V, Vojtesek B. A Cyclic Pentamethinium Salt Induces Cancer Cell Cytotoxicity through Mitochondrial Disintegration and Metabolic Collapse. Int J Mol Sci. 2019 Aug 28;20(17):4208. doi: 10.3390/ijms20174208.), (Bříza T, Králová J, Dolenský B, Rimpelová S, Kejík Z, Ruml T, Hajdúch M, Džubák P, Mikula I, Martásek P, Poučková P, Král V. Striking antitumor activity of a methinium system with incorporated quinoxaline unit obtained by spontaneous cyclization. Chembiochem. 2015 Mar 2;16(4):555-8. doi: 10.1002/cbic.201402662.), induktorů transkripčniho faktoru NF-ΚΒ (Bříza T, Králová J, Rimpelová S, Havlík M, Kaplánek R, Kejík Z, Martásek P, Mikula I, Džubák P, Hajdúch M, Ruml T, Král V. Pentamethinium salts as ligands for cancer: Sulfated polysaccharide co-receptors as possible therapeutic target. Bioorg Chem. 2019 Feb;82:74-85. doi: 10.1016/j.bioorg.2018.02.011.), jejich aplikaci jako fluorescenčních mitochondriálních prób (Bříza, S. Rimpelová, J. Králová, K. Záruba, Z. Kejík, T. Ruml, P. Martásek, V. Král, Pentamethinium fluorescent probes: The impact of molecular structure on photophysical properties and subcellular localization, Dyes and Pigments, 107, 2014, Pages 5159, ISSN 0143-7208, https://doi.org/10.10164j.dyepig.2013.12.021.), (Rimpelová S, Bříza T, Králová J, Záruba K, Kejík Z, Císařová I, Martásek P, Ruml T, Král V. Rational design of chemical ligands for selective mitochondrial targeting. Bioconjug Chem. 2013 Sep 18;24(9):1445-54. doi: 10.1021/bc400291f.), (Král V, Bríza T, Kejík Z, Králová J, Rimpelová S, Ruml T, Martásek P. Preparation of gamma heteroaryl substituted symmetric polymethinium salts as mitochondrial probes patent CZ304094B6. 2013), (Kral V, Havlik M, Kaplanek R, Briza T, Kejik Z, Martasek P, Krcová L, Kralova J, Ruml T, Rimpelova S. Imaging agents and methods patent WO2018206126A1. 2018), (Mikšátková L, Rimpelova S, Havlík M, Dolenský B, Vellieux F, Ruml T, Martasek P, Kral V, Bríza T, Highly selective mitochondrial probes based on fluorinated pentamethinium salts: On two-photon properties and microscopic applications. Dyes and Pigments. 2020 1 72, 107802. doi: 10.1016/j.dyepig.2019.107802.), nebo cílení na nádorové buňky na základě rozpoznaní sulfatovaných polysacharidů exprimovaných nádorovými buňkami (Bríza T, Kejík Z, Císarová I, Králová J, Martásek P, Král V. Optical sensing of sufate bypolymethinium salt receptors: colorimetric sensor for heparin. Chem Commun (Camb). 2008 Apr 28;(16):19013. doi: 10.1039/b718492a), (Král V, Králova J, Martasek P, Briza T, Kejik Z, Use of polymethine salts as sensors for tumor markers patent CZ304948B6. 2015), popřípadě zpomalení růstu nádorů na základě afinity pentamethinových solí pro onkogenní signální molekuly např. sulfatové steroly (Kejík Z, Bříza T, Králová J, Mikula I, Poučková P, Martásek P, Král V. New method for recognition of sterol signalling molecules: methinium salts as receptors for sulphated steroids. Steroids. 2015 Feb;94:15-20. doi: 10.1016/j.steroids.2014.10.009.). Několik inhibitorů DHODH již bylo popsáno; jako příklad lze uvést C07 (Lolli ML, Sainas S, Pippione AC, Giorgis M, Boschi

- 2 CZ 2022 - 86 A3

D, Dosio F. Use of human Dihydroorotate Dehydrogenase (hDHODH) Inhibitors in Autoimmune Diseases and New Perspectives in Cancer Therapy. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2018;13(1):86-105. doi: 10.2174/1574892812666171108124218.), DD264 (Lucas-Hourani M, Dauzonne D, Jorda P, Cousin G, Lupan A, He^ynck O, Caignard G, Janvier G, André-Leroux G, Khiar S, Escriou N, Despres P, Jacob Y, Munier-Lehmann H, Tangy F, Vidalain PO. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathog. 2013;9(10):e1003678. doi: 10.1371/journal.ppat.1003678.), DSM265, DSM430 a DMS 450 (Phillips MA, Lotharius J, Marsh K, White J, Dayan A, White KL, Njoroge JW, El Mazouni F, Lao Y, Kokkonda S, Tomchick DR, Deng X, Laird T, Bhatia SN, March S, Ng CL, Fidock DA, Wittlin S, Lafuente-Monasterio M, Benito FJ, Alonso LM, Martinez MS, Jimenez-Diaz MB, Bazaga SF, Angulo-Barturen I, Haselden JN, Louttit J, Cui Y, Sridhar A, Zeeman AM, Kocken C, Sauerwein R, Dechering K, Avery VM, Duffy S, Delves M, Sinden R, Ruecker A, Wickham KS, Rochford R, Gahagen J, Iyer L, Riccio E, Mirsalis J, Bathhurst I, Rueckle T, Ding X, Campo B, Leroy D, Rogers MJ, Rathod PK, Burrows JN, Charman SA. A long-duration dihydroorotate dehydrogenase inhibitor (DSM265) for prevention and treatment of malaria. Sci Transl Med. 2015 Jul 15;7(296):296ra111. doi: 10.1126/scitranslmed.aaa6645.), HZ05 (Popova G, Ladds MJGW, Johansson L, Saleh A, Larsson J, Sandberg L, Sahlberg SH, Qian W, Gullberg H, Garg N, Gustavsson AL, Haraldsson M, Lane D, Yngve U, Lain S. Optimization of Tetrahydroindazoles as Inhibitors of Human Dihydroorotate Dehydrogenase and Evaluation of Their Activity and In Vitro Metabolic Stability. J Med Chem. 2020 Apr 23;63(8):3915-3934. doi: 10.1021/acsjmedchem.9b01658.), IBC (Wu D, Wang W, Chen W, Lian F, Lang L, Huang Y, Xu Y, Zhang N, Chen Y, Liu M, Nussinov R, Cheng F, Lu W, Huang J. Pharmacological inhibition of dihydroorotate dehydrogenase induces apoptosis and differentiation in acute myeloid leukemia cells. Haematologica. 2018 Sep;103(9):1472-1483. doi: 10.3324/haematol.2018.188185.), (Lolli ML, Sainas S, Pippione AC, Giorgis M, Boschi D, Dosio F. Use of human Dihydroorotate Dehydrogenase (hDHODH) Inhibitors in Autoimmune Diseases and New Perspectives in Cancer Therapy. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2018;13(1):86-105. doi: 10.2174/1574892812666171108124218), IMU838 (FitzpatrickLR, Deml L, Hofmann C, Small JS, Groeppel M, Hamm S, Lemstra S, Leban J, Ammendola A. 4SC-101, a novel immunosuppressive drug, inhibits IL-17 and attenuates colitis in two murine models of inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2010 Oct;16(10):1763-77. doi: 10.1002/ibd.21264.), OSU-03012 (Yang CF, Gopula B, Liang JJ, Li JK, Chen SY, Lee YL, Chen CS, Lin YL. Novel AR-12 derivatives, P12-23 and P12-34, inhibitflavivirus replication by blocking host de novo pyrimidine biosynthesis. Emerg Microbes Infect. 2018 Nov 21;7(1):187. doi: 10.1038/s41426-018-0191-1.), BAY-2402234 (Christian S, Merz C, Evans L, Gradl S, Seidel H, Friberg A, Eheim A, Lejeune P, Brzezinka K, Zimmermann K, Ferrara S, Meyer H, Lesche R, Stoeckigt D, Bauser M, Haegebarth A, Sykes DB, Scadden DT, Losman JA, Janzer A. The novel dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) inhibitor BAY 2402234 triggers differentiation and is effective in the treatment of myeloid malignancies. Leukemia. 2019 Oct;33(10):2403-2415. doi: 10.1038/s41375-019-0461-5. Epub 2019 Apr 2.), PP001 (Lolli ML, Sainas S, Pippione AC, Giorgis M, Boschi D, Dosio F. Use of human Dihydroorotate Dehydrogenase (hDHODH) Inhibitors in Autoimmune Diseases and New Perspectives in Cancer Therapy. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2018;13(1):86-105. doi: 10.2174/1574892812666171108124218.), P1788 (Hayek S, Pietrancosta N, Hovhannisyan AA, Alves de Sousa R, Bekaddour N, Ermellino L, Tramontano E, Arnould S, Sardet C, Dairou J, Diaz O, Lotteau V, Nisole S, Melikyan G, Herbeuval JP, Vidalain PO. Cerpegin-derived furo[3,4c]pyridine-3,4(1H,5H)-diones enhance cellular response to interferons by de novo pyrimidine biosynthesis inhibition. Eur J Med Chem. 2020 Jan 15;186:111855. doi: 10.1016/j.ejmech.2019.111855.), TAK-632 (bt ER, Rosser EW, Durst MA, Lok V, Poddar S, Le IM, Cho A, Kim W, Wei L, Song J, Capri JR, Xu S, Wu N, Slavik R, Jung ME, Damoiseaux R, Czernin J, Donahue TR, Lavie A, Radu CG. Metabolic Modifier Screen Reveals Secondary Targets of Protein Kinase Inhibitors within Nucleotide Metabolism. Cell Chem Biol. 2020 Feb 20;27(2):197-205.e6. doi: 10.1016//j.chembiol.2019.10.012.), anebo Vidofludimus (Fitzpatrick LR, Deml L, Hofmann C, Small JS, Groeppel M, Hamm S, Lemstra S, Leban J, Ammendola A. 4SC101, a novel immunosuppressive drug, inhibits IL-17 and attenuates colitis in two murine models of inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2010 Oct;16(10):1763-77. doi:

- 3 CZ 2022 - 86 A3

10M)02/ibd.21264.) Tyto již publikované látky vykazují sice v některých případech vysokou inhibiční aktivitu pro DHODH, nicméně jejich selektivita pro vnitřní mitochondriální membránu, kde je lokalizován DHODH je nízká. Z tohoto důvodu jejich potenciální terapeutické aplikace bude vyžadovat vysokou dávku dané látky, což silně zvyšuje riziko vedlejších účinků. Mimoto tyto látky mají naprosto jiný strukturní motiv, než polymethiniové sole obecného vzorce I, které jsou předmětem tohoto patentu. Přičemž strukturní motiv polymethiniových solí vykazuje výraznou selektivita pro vnitřní mitochondriální membránu. Což umožňuje výraznou akumulaci DHOH inhibitoru v vnitřní mitochondriální membráně v těsné blízkosti DHOH. To umožňuje vysoce efektivní cílení DHOH a medicinálně významnou inhibici v živých systémech i ve velmi nízkých koncentrací s nízkým rizikem vedlejších účinů, na rozdíl, od jíž známých inhibitorů, u kterých se běžně netestuje jejich intracelulární distribuce.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití polymethiniových solí obecného vzorce I,

(I) kde obě koncové heteroaromatické skupiny methiniového řetězce jsou totožné nebo rozdílné a tvoří je benzothiazol, naftothiazol, benzimidazol, nafto imidazol, benzooxazol, naftooxazol, benzoselenazol, naftoselenazol, chinolin, benzochinolin, indol nebo benzo indol, jejichž konkrétní struktura je charakterizovaná skupinami A, B, X, Y, s jednou či více skupinami R na obou koncových heteroaromatických skupinách methiniové sole, kde R je H, alkyl Cl až Cl2, glykolové řetězce s počtem 1 až 8 glykolových (OCH2CH2) opakujících se jednotek končící O-alkyl substitaentem Cl až C12 nebo OH skupinou, alkyl Cl až C8 sulfonové kyseliny nebo odpovídající jejich lithné, sodné, nebo draselné soli, allyl, propargyl, fenyl, benzyl, pyridyl, halogen, CH2OR‘, OR’, CHF₂, CF₃, OCF₃, OCOR‘, CN, CHO, COOR‘, CONHR‘, CONR‘2, CONHOR‘,CONHNHR‘, CONHNR‘₂, N₃, NO₂, SR‘, SCN, NHR‘, NR‘₂, NHCOR‘, NHCONHR‘, NHCONR‘2, NHCSNHR‘, NHCSNR‘2, NHSO₂NHR‘, NHSO₂NR‘₂, NHCOOR‘, N(COOR‘)₂, B(OR‘)₂, SO₃R‘, SO₂NHR‘, SO₂NR‘₂, SO₂R‘, kde R‘ je H, alkyl Cl až C12, fenyl,^-tolyl, benzyl, allyl, propargyl, CF₃; CH=CH-CH=CH (tedy přikondenzované benzenové jádro), kde X je O, S, Se, CR‘2, NR‘, CH=CH, kde R‘ má výše uvedený význam; kde A je alkyl Cl až Cl 2, benzyl, allyl, propargyl, glykolový řetězec s počtem 1 až 8 glykolových (CH2CH2O) opakujících se jednotek končící substitaentem R‘, (CH₂)jCOR‘, (CH₂)jCOOR‘, (CH₂)jSO₃R‘, (CH₂)jSO₃H, (CH2)jCONHR‘, (CH2)jCONR‘2, kde j je v rozmezí 1 až 12 a R’ má výše uvedený význam; kde B je fenyl, pyridyl, pyrazinyl, chinolyl, chinoxalyl, fůranyl, thienyl, benzoxazolyl, benzothiazolyl, které mohou být dále substituovány jedním či více stejnými nebo různými substitaenty R, kde R má výše uvedený význam, kde v případě dvojnásobně nabitých solí skupinu B tvoří pyridyl či chinolyl kvarternizovaný na svém atomu dusíku skupinou A, kde A má výše uvedený význam, kde skupina Y je acetát, acetylacetát, adipát, askorbát, benzoát, besylát, boritan, bromid, butanoát, citrát, deoxycholát, dihydrogenfosfát, fenylacetát, fluorid, fosfát, fůmarát, galát, glutarát, hexafluorofosfát, hippurát, hydrogensulfát, chlorid, chloristan, cholát, isokyanát, isonikotinát, jodid, kaprylát, kyanatan, laktát, laurát, litocholát, malát, maleát, malonát, mandelát, mesylát, monohydrogenfosfát, mravenčan, myristát, napsylát, nikotinát, nitrát, nonafluorbutylsulfonát, oleát, oxalát, oxopropanoát, palmitát, pikrát, pimelát, propionát, rhodanid, salicylát, sebakát,

-4CZ 2022 - 86 A3 skořicát, stearát, suberát, sukcinát, sulfát, tetrafluoroborát, tosylát, triflát, trifluoracetát, trichloracetát, uhličitan, valerát, vinan a sole přirozených aminokyselin, pro přípravu léčiva k léčbě využívající inhibici DHODH.

V rámci našich studií jsme pozorovali, že tyto látky vykazují velmi silnou inhibiční aktivitu mitochondriálního metabolismu. Podrobné studium mechanismu účinku překvapivě odhalilo, že tyto látky jsou velmi silnými a vysoce selektivními inhibitory DHODH (Příklad 6 a 7 a obrázek 2 a 3). Látky 1 a 2 způsobily snížení DHODH-závislé respirace u nádorových linií PC-3 a U-2 OS, zatímco na buněčnou linii PNT1A reprezentující model normální prostatické tkáně tyto látky vliv neměly. U obou nádorových linií bylo snížení respirace signifikantní (Příklad 6 a obrázek 2). Rovněž hodnoty stanovené vazebné energie ukazují silnou inhibiční aktivitu látek 1 a 2 pro daný enzym (Příklad 4). Mimo toto jsme pozorovali, že účinek těchto látek (inhibice enzymové aktivity, cytotoxicita, potlačení buněčné migrace a invazivity) je specifický pro linie nádorových buněk oproti buňkám nenádorovým (Příklad 6 a 8-10, obrázek 2 a 4-7). Nádorové buňky za přítomnosti těchto látek migrují výrazně pomaleji a tento jev je signifikantní u nádorových linií PC-3 a U-2OS (Příklad 9 a obrázek 5). Vliv látek na pohyb buněk byl ověřen další metodou, která umožňuje i vyhodnocení invazivity buněk, která přímo souvisí s metastatickými potenciálem (Příklad 10 a obrázek 6). Po použití látek buňky nebyly schopny invadovat přes vrstvu Matrigelu (model extracelulárního matrixu) a tedy takto ovlivněné buňky na úrovni organismu nebudou schopny intra- a extravazace (obecně invaze) a tvořit sekundární nádorová ložiska. Provedené mikroskopické experimenty rovněž také potvrzují jejich vliv na mitochondriální metabolismus a vitalitu (Příklad 11 a obrázek 7). Po aplikaci látek dojde k narušení mitochondriální aktivity a ke snížení počtu aktivních mitochondrií, což se projeví zmenšením mitochondriální sítě, která byla pozorována sondou barvící pouze aktivní mitochondrie (obrázek 7 A, C, D). Navíc tyto látky způsobily i to, že se mitochondrie nacházely pouze v okolí jádra a nebyly lokalizovány ve vedoucí hraně buňky, kde je jejich výskyt zásadní pro schopnost migrace/invazivity. Získané výsledky nemohly být predikovány a musely být získány experimentálně.

Objasnění výkresů

Obrázek 1 znázorňuje struktury látek 1 a 2

Obrázek 2 znázorňuje vliv látek 1 a 2 na inhibici DHODH

Obrázek 3 znázorňuje interakce látky BAY-2402234, 1 a 2 s proteinem 3U2O

Obrázek 4 znázorňuje cytotoxicitu látek 1 a 2 vůči PNT1A, PC-3 a U-2 OS

Obrázek 5 znázorňuje vliv látek 1 a 2 na migraci buněk pomocí metody „wound-healing assay“

Obrázek 6 znázorňuje vliv látek 1 a 2 na buněčnou migraci a invazivitu.

Obrázek 7 znázorňuje vliv látek 1 a 2 na mitochondriální síť a vitalitu.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1 Příprava látky 1, obecného vzorce I.

Baňka byla naplněna 2-(4-pyridyl)malondialdehydem (150 mg, 1,0 mmol), 2-methyl-3propylbenzothiazolium jodidem (640 mg, 2,01 mmol) a suchým n-butanolem (25 ml). Směs byla míchána 18 hodin při 110°C. Po ochlazení na laboratorní teplotu byla směs filtrována. Pevná látka byla promyta ethanolem (3 x 5 ml) a sušena ve vakuu. Produkt 1 byl získán jako zelený prášek, 498 mg, 79%. 'H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 25°C): 8,94 (2H, d, J = 6,4 Hz), 8,14-7,80 (8H, m),

- 5 CZ 2022 - 86 A3

7,60 (2H, t, J = 8,2 Hz), 7,46 ( 2H, t, J = 7,6 Hz), 6,20 (2H, d, J = 13,8 Hz), 4,28 (4H, bs), 1,71 (4H, sextet, J = 7,0 Hz), 0,85 (6H, t, J = 7,0) Hz). ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6, 25°C): 165,9, 148,2, 143,6, 141,3, 128,2, 127,1, 125,5, 123,2, 114,0, 98,3, 47,5, 20,9, 10,8. HRMS pro C30H30N3S2, vypočteno: 496,1876 [M]⁺, nalezeno: 496,1879 [M]⁺. Elementární analýza pro 5 C30H30IN3S2 vypočteno: C, 57,78; H, 4,85; N, 6,74; nalezeno: C, 57,59; H, 4,93; N, 6,67.

Příklad 2 příprava látky 2 obecného vzorce L

Baňka byla naplněna 2-(4-pyridyl)malondialdehydem (353 mg, 2,37 mmol), 2,3,3-trimethyl-lpropyl-3//-indol-1-ium jodidem (1600 mg, 4,86 mmol), suchým butanolem (30 ml) a třemi kapkami triethylaminu. Směs byla míchána 18 hodin při 110°C. Po uplynutí této doby byla směs 15 ochlazena na laboratorní teplotu a odpařena do sucha. Produkt se oddělí sloupcovou chromatografií (silikagel, eluent: chloroform/methanol 10: 1). Produkt byl oddělen jako tmavě modrý pás. Oddělená frakce byla odpařena do sucha a ke zbytku byl přidán ethylacetát a celá směs byla sonikována po dobu 2 minut. Čistý produkt byl oddělen filtrací. Výtěžek byl 347 mg, 80% ve formě tmavě zeleného prášku. Ή NMR (300 MHz, DMSO-d6, 25°C): 8,78 (2H, d, J = 5,6 Hz), 8,50 (2H, 20 d, J = 14,3 Hz), 7,67 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,46 - 7,24 (8H, m), 5,59 (2H, d, J = 14,4 Hz), 3,77 (4H, t, J = 6,7 Hz), 1,75 (12H, s), 1,55 (4H, sextet, J = 7,4 Hz), 0,74 (6H, t, J = 7,3 Hz); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6, 25°C): 173,3, 151,7, 150,4, 144,0, 142,0, 141,2, 131,1, 128,5, 125,3, 125,2, 122,6, 111,5, 100,7, 49,2, 45,0, 27,0, 20,2, 11,0; HRMS pro C36H42N3 vypočteno: 516,3373 [M]⁺, nalezeno: 516,3377 [M]⁺. Elementární analýza pro C36H42IN3 vypočteno: C, 67,18; H, 6,58; N, 25 6,53; nalezeno: C, 67,32; H, 6,51; N, 6,74;

Příklad 3 příprava látky 3 obecného vzorce L

Baňka byla naplněna 2,3,3-trimethyl-l-propyl-3//-indol-l-ium jodidem (50 mg, 0,15 mmol), 2-(4nitrofenyl)-4-(3-propylbenzo[<f|thiazol-2(3//)-yliden)but-2-enalem (50 mg, 0,14 mmol) a suchým butanolem (7 ml). Směs byla míchána 18 hodin při 110°C. Po ochlazení na laboratorní teplotu byla směs filtrována. Pevná látka byla promyta butanolem (5 ml) a sušena ve vakuu. Produkt 3 byl získán jako zelený prášek, 44 mg. Další podíl produktu byl získán kolonovou chromatografií odpařeného filtrátu (silikagel, eluent: dichlormethan/methanol 10:1). Produkt byl oddělen jako tmavě modrý pás. Oddělená frakce byla odpařena do sucha a ke zbytku byl přidán diethylether (5 ml) a celá směs byla sonikována po dobu 2 minut. Čistý produkt byl oddělen filtrací. Bylo získáno dalších 12 mg produktu. Celkový výtěžek látky 3 byl 56 mg (54%) ve formě kovově zářivého

-6CZ 2022 - 86 A3 zeleného prášku. Ή NMR (300 MHz, DMSO-d6,25°C): 8,50-7,10 (16H, m), 6,01 (2H, d,J= 13,9 Hz), 5,51 (2H, d, J= 13,4 Hz), 4,27 (2H, bs), 3,70 (2H, bs), 1,71 (6H, s), 1,66 (2H, m), 1,53 (2H, m), 0,77 (6H,m); ¹³CNMR(126MHz, DMSO-d6,25°C): 170,5,167,3, 151,7,148,6,146,7,143,2, 142,4, 141,3, 140,5, 131,6, 129,3, 128,5, 128,3, 126,2, 126,0, 124,2, 123,9, 123,5, 122,4, 114,7, 110,4, 101,5, 97,7, 48,3, 48,1, 44,3, 27,3, 21,1, 20,0, 11,1, 10,9; HRMS [M]⁺ (m/z) pro C34H36N3O2S vypočteno: 550,2523, nalezeno: 550,2528.

Příklad 4 příprava látky 4 obecného vzorce I.

Baňka byla naplněna 2,3,3-trimethyl-l-propyl-3//-indol-l-ium jodidem (1320 mg, 4,01 mmol), malondialdehyd dianil hydrochloridem (520 mg, 2,01 mmol) a suchým pyridinem (25 ml). Směs byla míchána 18 hodin při 90°C. Po uplynutí této doby byla směs ochlazena na laboratorní teplotu a odpařena do sucha. Produkt se oddělí sloupcovou chromatografií (silikagel, eluent: dichlormethane/methanol 10: 1). Produkt byl oddělen jako tmavě modrý pás. Oddělená frakce byla odpařena do sucha a ke zbytku byl přidán diethylether (5 ml) a celá směs byla sonikována po dobu 2 minut. Čistý produkt byl oddělen filtrací. Bylo získáno 158 mg (74%) látky 4 ve formě temně zeleného prášku. Ή NMR (300 MHz, DMSO-d6, 25°C): 8,34 (2H, t, J = 12,9 Hz), 7,63 (2H, d, J = 7,35 Hz), 7,41 (4H, m), 7,24 (2H, m), 6,59 (1H, t, J = 12,3 Hz), 6,32 (2H, d, J = 13,8 Hz), 4,08 (4H, t, J = 7,0 Hz), 1,72 (4H, m), 1,69 (12H, s), 0,95 (6H, t, J = 7,3 Hz); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6, 25°C): 172,7, 154,0, 142,1, 141,1, 128,4, 125,5, 124,7, 122,4, 111,2, 103,2,48,9, 44,7, 27,2, 20,4, 11,0; HRMS [M]⁺ (m/z) pro C31H39N2 vypočteno: 439,3108, nalezeno: 439,3109.

Příklad 5 příprava dalších látek obecného vzorce I.

Látky uvedené v Tabulce 1 byly připraveny podle postupů uvedených v Příkladech 1-3. Část připravených látek, včetně popisu přípravy, čistění a charakterizace jsou součástí našich dřívějších patentů apublikací [Dyes Pigments 172 (2020) 107802; Dyes Pigments 107 (2014) 51-59; Bioorg. Chern. 82 (2019) 74-85; CZ304094B6; CZ304948B6; GB2567124; Bioconjugate Chern. 2013, 24, 1445-1454],

Tabulka 1. Připravené látky

-7 CZ 2022 - 86 A3

-8CZ 2022 - 86 A3

Příklad 6: Inhibice respirace závislé na DHODH

Respirace závislá na DHODH byla provedena následujícím způsobem. Buňky byly trypsinizovány, promyty PBS, resuspendovány v množství 2x10⁶ buněk na ml média Mir05 (0. 5 mM EGTA, 3 mM MgCl2, 60 mM K-laktobionát, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO4, 110 mM sacharosa, 1 g/l hovězí sérový albumin, 20 mM Hepes, pH 7,1 při 30 °C) a přeneseny do komory přístroje Oxygraph-2k (Oroboros). Měření respirace se provádělo při 37 °C. Buňky byly permeabilizovány pomocí 5 μg digitoninu na 10⁶ buněk a před přidáním substrátu byl přidán inhibitor komplexu I (0,3 μM rotenon) a testovaná látka v koncentraci od 1 do 4 nM. Respirace zprostředkovaná DHODH byla hodnocena odečtením zbytkové rychlosti respirace zbývající po přidání 30 μM leflunomidu od rychlosti respirace v přítomnosti 1 mM dihydroorotátu (DHO), 3 mM ADP a 10 μM cytochromu c.

Příklad 7. Dokovací studie látek 1 A 2 s DHODH

Podrobnosti o proteinu: Dihydroorotát dehydrogenáza (DHODH); RCSB PDB: krystalová struktura 3U2O DHODH v komplexu s inhibitorem s malou molekulou; Dokovací nástroje: Molegro Virtual Docker mvd 7.0.0 a Chiméra 1.15.

Model krystalové struktury proteinu DHODH v komplexu s malou molekulou inhibitoru (3U2O) byl stažen z RCSB PDB. Pro dokování s ligandy byl použit Molegro Virtual Docker MVD 7.0.0. Využívá skórovací systém MolDock a je založen na hybridním vyhledávacím algoritmu, tzv. řízené diferenciální evoluci. Tento algoritmus kombinuje techniku optimalizace diferenciální evoluce s algoritmem pro predikci dutin. Krystalová struktura proteinu z RCSB PDB byla nahrána do platformy MVD 7.0 pro proces molekulárního dokování. Má zabudovaný algoritmus pro detekci dutin, který identifikuje potenciální vazebná místa označovaná jako aktivní místa/dutiny.

Byl použit vyhledávací algoritmus Moldock SE a počet běhů byl 10, přičemž maximální počet iterací byl 2000 pro velikost populace 50 a energetický práh 100. V každém kroku se hledaly nejmenší min torze/translace/rotace a upřednostňovala se molekula s nejnižší energií. Po simulaci molekulárního dokování byly získané polohy (vazebné módy) klasifikovány podle skóre re-rank.

Vybrané ligandy byly připraveny ručně pomocí programu Chimera V1.15 a připraveny pomocí vestavěného programu MVD. Molekulárnímu dokování byly podrobeny aminokyseliny, u nichž bylo zjištěno, že jsou součástí interakce 3U2O s největší dutinou, v níž se váže známý malomolekulární inhibitor. Rozlišení mřížky bylo nastaveno na 0,3 Á. Maximální iterace a maximální velikost populace byly nastaveny na 1500, resp. 50. Výsledné dokovací pozice založené na skóre MolDocku byly importovány a vizualizovány a jsou ukázaný v tabulce 1.

Tabulka 1. Vazebné energie testovaných látek pro DHODH

Ligand	Vazebná energie(kca/mol)
03U-1(známý inhibitor)	-148,2
Látka 1	-170,4
Látka 2	-141,5
BAY-2402234	-161,2

Příklad 8. Cytotoxické vlastnosti látek 1. a 2.

Ke stanovení životaschopnosti buněk byl použit MTT test. Po pasáži byla suspenze buněk v růstovém médiu naředěna na koncentraci 2 000 - 10 000 buněk/200 _l a přenesena do 96-jamkové destičky. Na každé destičce byla umístěna pozitivní a negativní kontrola. Destičky byly inkubovány 2 dny při 37 °C, aby byla zajištěna adheze buněk. Látka 1 a látka 2 byly přidány do čerstvého média ve zvyšujících se koncentracích (0 - 10 pmol/l pro obě látky). Destičky po přidání

- 9 CZ 2022 - 86 A3 látek byly inkubovány po dobu 24 hodin. Následně bylo médium změněno na čerstvé médium s MTT (4:1, MTT 5 mg/ml v PBS) a inkubováno po dobu 4 h v inkubátoru ve tmě. K rozpuštění krystalů MTT - formazanu byl použit DMSO a absorbance byla měřena při 570 nm (VersaMax microplate reader, USA). Následně byly vypočteny IC50 inhibiční koncentrace, které byly použity v dalších experimentech.

Příklad 9. Migrastatické vlastnosti látek 1. a 2.

Po pasáži byla každá buněčná linie resuspendována a vyseta do 24-jamkové destičky, přičemž množství buněk na jamku v 500 pl média bylo optimalizováno pro každou buněčnou linii. Po 48 hodinách byly buňky 100% konfluentní a byla provedena rýha a přidána 1 μΜ koncentrace látky 1. nebo 2. Po šetrném promytí a výměně média byla každá jamka vyfotografována v čase 0 a po 24 hodin na stejném místě. Fotografie byly analyzovány a software vypočítal procento plochy otevřené rýhy. Každá buněčná linie byla analyzována v min. dvaceti čtyřech opakováních.

Příklad 10. Invazivita (metastatický potenciál in vitro) a stanovení buněčné migrace po aplikaci látek 1. a 2.

Systém xCELLigence založený na impedanční analýze buněk v reálném čase (RTCA) byl použit pro stanovení míry invazivity a migrace. Systém xCELLigence se skládá ze čtyř hlavních součástí: RTCA DP stanice, počítač RTCA s integrovaným softwarem a jednorázové destičky CIM 16. Nejprve byla stanovena koncentrace výsevu buněk optimální pro test proliferace a invazivity. Po nasazení celkového počtu buněk do 200 μl média do každé jamky v E-plate 16 byla každých 15 minut sledována adherence a proliferace buněk. Pro test invazivity byla optimální odpověď zjištěna v jamce obsahující 20 000 buněk. Po potažení horních jamek matrigelem a po přidání FBS jako chemoatraktantu byly do každé jamky v CIM-plate 16 nasazeny buňky ve 100 pl média. Každých 15 minut bylo sledována adherence a růst buněk přes matrigel. Doba trvání všech experimentů byla 150 hodin. Relativní míra invazivity byla definována jako buněčný index pro jamky pokryté matrigelem (buňky musí rozložit/projít matrigelem, aby vytvořily signál) v daném časovém bodě. Impedance toku elektronů způsobená adherujícími buňkami se uvádí pomocí bezjednotkového parametru nazvaného buněčný index (CI), kde CI = (impedance v časovém bodě n - impedance v nepřítomnosti buněk)/nominální hodnota impedance). Aby bylo možné porovnat jednotlivé buněčné linie/léčbu, byly tyto buněčné indexy normalizovány na hodnotu 1,0 v době, kdy byly přidány testované látky. Normalizované buněčné indexy jsou zobrazeny v tabulkách 2 a 3. Koncentrace látek byly voleny na základě inhibiční koncentrace IC50 pro každkou buněčnou linii.

Tabulka 2 Vliv testovaných látek 1 a 2 na buněčnou migraci

Normalizovaný buněčný index	Kontrola	Látka 1	Látka 2
PNTA	18.6	3,4	7,0
Kontrola-látka	-	15,2	11,6
PC-3	38,8	8,8	19,5
Kontrola-látka	-	30,0	19,3
U2 OS	24,3	3,5	3,9
Kontrola-látka	-	20,8	20,4

- 10 CZ 2022 - 86 A3

Tabulka 3 Vliv testovaných látek 1 a 2 na invazivitu buněk

Normalizovaný buněčný index	Kontrola	Látka 1	Látka 2
PNTA	19,7	2,8	3,2
Kontrola-látka	-	16,9	16,5
PC-3	22,8	1,4	5,4
Kontrola-látka	-	21,4	17,4
U2 OS	25,6	1,3	1,9
Kontrola-látka	-	24,3	23,7

Příklad 11. Intracelulární lokalizace látek 1 a 2 a vliv na mitochondriální síť

K testovaným liniím (2x10⁶ buněk na ml média) byla přidána látka 1 nebo 2 tak, aby její koncentrace byla 200 nM. K pořízení detailních snímků buněk byl použit mikroskop Leica DM RXA (vybavený motorizovaným stolkem DMSTC, z-pohybem Piezzo, kamerou MicroMax CCD, konfokální jednotkou CSU-10 a laserovými diodami 488, 562 a 714 nm s AOTF) (100^ objektiv Plan Fluotar s olejovou imerzí, NA 1,3). Celkem bylo pořízeno 50 řezů s velikostí kroku Z 0,3 μm. Následně byla obrazová data analyzována. Aktin byl značen faloidinem Alexa Fluor™ 488 (A12379, Invitrogen); 1 jednotka na sklíčko. Pro upevnění bylo použito Duolink® In Situ Mounting Medium s DAPI (DUO82040). Buňky byly fixovány v 3,7% paraformaldehydu a permeabilizovány pomocí 0,1% Tritonu X-100. Mitochondriální síť byla značena různými typy MitoTracker© prób.

Průmyslová využitelnost

Vynález je využitelný ve farmaceutickém průmyslu, k přípravě nových léčiv, které cílí na inhibici dihydroorotát dehydrogenázy.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití látek obecného vzorce I

   (I) kde obě koncové heteroaromatické skupiny methiniového řetězce jsou totožné nebo rozdílné a tvoří je benzothiazol, naftothiazol, benzimidazol, naftoimidazol, benzooxazol, naftooxazol, benzoselenazol, naftoselenazol, chinolin, benzochinolin, indol nebo benzo indol, jejichž konkrétní struktura je charakterizovaná skupinami A, B, X, Y, s jednou či více skupinami R na obou koncových heteroaromatických skupinách methiniové sole, kde R je H, alkyl Cl až Cl2, glykolové řetězce s počtem ž 8 glykolových (OCH2CH2) opakujících se jednotek končící O-alkyl substituentem Cl až C12 nebo OH skupinou, alkyl Cl až C8 sulfonové kyseliny nebo odpovídající jejich lithné, sodné, nebo draselné soli, allyl, propargyl, fenyl, benzyl, pyridyl, halogen, CH2OR‘, OR’, CHF2, CF₃, OCF₃, OCOR‘, CN, CHO, COOR‘, CONHR‘, CONR‘2, CONHOR‘,CONHNHR‘, CONHNR‘2, N₃, NO2, SR‘, SCN, NHR‘, NR‘₂,NHCOR‘, NHCONHR‘, NHCONR‘₂, NHCSNHR‘, NHCSNR‘2, NHSO₂NHR‘, NHSO₂NR‘₂, NHCOOR‘, N(COOR‘)₂, B(OR‘)₂, SO₃R‘, SO₂NHR‘, SO₃NR‘2, SO₃R‘, kde R‘je H, alkyl Cl až C12, fenyl, p-tolyl, benzyl, allyl, propargyl, CF₃; CH=CHCH=CH (tedy přikondenzované benzenové jádro), kde X je O, S, Se, CR‘2, NR‘, CH=CH, kde R‘ má výše uvedený význam; kde A je alkyl Cl až Cl2, benzyl, allyl, propargyl, glykolový řetězec s počtem ž 8 glykolových (CH2CH2O) opakujících se jednotek končící substituentem R‘, (CH2)jCOR‘, (CH₂)jCOOR‘, (CH₂)jSO₃R‘, (CH₂)jSO₃H, (CH₂)jCONHR‘, (CH₂)jCONR‘₂, kde j je v rozmezí 1 až 12 a R’ má výše uvedený význam; kde B je fenyl, pyridyl, pyrazinyl, chinolyl, chinoxalyl, furanyl, thienyl, benzoxazolyl, benzothiazolyl, které mohou být dále substituovány jedním či více stejnými nebo různými substituenty R, kde R má výše uvedený význam, kde v případě dvojnásobně nabitých solí skupinu B tvoří pyridyl či chinolyl kvarternizovaný na svém atomu dusíku skupinou A, kde A má výše uvedený význam, kde skupina Y je acetát, acetylacetát, adipát, askorbát, benzoát, besylát, boritan, bromid, butanoát, citrát, deoxycholát, dihydrogenfosfát, fenylacetát, fluorid, fosfát, fůmarát, galát, glutarát, hexafluorofosfát, hippurát, hydrogensulfát, chlorid, chloristan, cholát, isokyanát, isonikotinát, jodid, kaprylát, kyanatan, laktát, laurát, litocholát, malát, maleát, malonát, mandelát, mesylát, monohydrogenfosfát, mravenčan, myristát, napsylát, nikotinát, nitrát, nonafluorbutylsulfonát, oleát, oxalát, oxopropanoát, palmitát, pikrát, pimelát, propionát, rhodanid, salicylát, sebakát, skořicát, stearát, suberát, sukcinát, sulfát, tetrafluoroborát, tosylát, triflát, trifluoracetát, trichloracetát, uhličitan, valerát, vinan a sole přirozených aminokyselin, pro přípravu léčiva k léčbě využívající inhibici dihydroorotát dehydrogenázy.