CZ2020270A3 - Terpolymer pro použití proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií, polymerní kartáče jej obsahujíci - Google Patents

Terpolymer pro použití proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií, polymerní kartáče jej obsahujíci Download PDF

Info

Publication number
CZ2020270A3
CZ2020270A3 CZ2020270A CZ2020270A CZ2020270A3 CZ 2020270 A3 CZ2020270 A3 CZ 2020270A3 CZ 2020270 A CZ2020270 A CZ 2020270A CZ 2020270 A CZ2020270 A CZ 2020270A CZ 2020270 A3 CZ2020270 A3 CZ 2020270A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mol
polymer brush
terpolymer
cbmaa
hpmaa
Prior art date
Application number
CZ2020270A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ309314B6 (cs
Inventor
Hana Lísalová
Hana RNDr Lísalová
Markéta Vrabcová
Markéta Ing. Vrabcová
Ivana Víšová
Ivana Mgr. Víšová
Milan Houska
Milan Ing. Houska
Alexandr Dejneka
Original Assignee
Fyzikální Ústav Av Čr, V. V. I.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fyzikální Ústav Av Čr, V. V. I. filed Critical Fyzikální Ústav Av Čr, V. V. I.
Priority to CZ2020270A priority Critical patent/CZ309314B6/cs
Priority to EP21715772.6A priority patent/EP4149984B1/en
Priority to PCT/CZ2021/050033 priority patent/WO2021228289A1/en
Priority to US17/924,823 priority patent/US20230272138A1/en
Publication of CZ2020270A3 publication Critical patent/CZ2020270A3/cs
Publication of CZ309314B6 publication Critical patent/CZ309314B6/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • C08F220/606—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen and containing other heteroatoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/16—Macromolecular materials obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/04—Macromolecular materials
    • A61L29/041—Macromolecular materials obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. lubricating compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/04—Macromolecular materials
    • A61L31/048—Macromolecular materials obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-acryloylmorpholine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F292/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to inorganic materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
    • C09D5/16—Antifouling paints; Underwater paints
    • C09D5/1656—Antifouling paints; Underwater paints characterised by the film-forming substance
    • C09D5/1662—Synthetic film-forming substance
    • C09D5/1668—Vinyl-type polymers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B2562/00—Details of sensors; Constructional details of sensor housings or probes; Accessories for sensors
    • A61B2562/12—Manufacturing methods specially adapted for producing sensors for in-vivo measurements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2438/00—Living radical polymerisation
    • C08F2438/01—Atom Transfer Radical Polymerization [ATRP] or reverse ATRP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2438/00—Living radical polymerisation
    • C08F2438/03—Use of a di- or tri-thiocarbonylthio compound, e.g. di- or tri-thioester, di- or tri-thiocarbamate, or a xanthate as chain transfer agent, e.g . Reversible Addition Fragmentation chain Transfer [RAFT] or Macromolecular Design via Interchange of Xanthates [MADIX]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

Předmětem předkládaného řešení je statistický terpolymer N-(2-hydroxypropyl) methakrylamidu, karboxybetain methakrylamidu a sulfobetain methakrylamidu, polymerní kartáč a funkcionalizovaný polymerní kartáč obsahující tento terpolymer. Uvedený statistický terpolymer zvyšuje odolnost povrchu substrátu proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií a/nebo proti nespecifické interakci se složkami biologických médií, a je vhodný pro použití ve formě polymerního kartáče např. v senzorech nebo na membránách.

Description

Terpolymer pro použití proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií, polymemí kartáče jej obsahující
Oblast techniky
Vynález se týká nového statistického antifoulingového terpolymeru, polymemích kartáčů jej obsahujících, a jejich použití proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií.
Dosavadní stav techniky
Nespecifická adsorpce je nežádoucí depozice látek z komplexních biologických vzorků, která představuje kritický problém pro vývoj řady moderních bioanalytických a biomedicínských metod, zařízení a materiálů. Jedná se např. o biosenzory, separační metody, funkční nanočástice a nanostrukturované povrchy, nosiče léčiv, membrány, diagnostické částice pro analýzu v tělních tekutinách, obecně o libovolné bioanalytické metody a funkční materiály, které přicházejí do přímého styku s biologickým médiem. Proto je velké úsilí věnováno vývoji tzv. ultrarezistentních materiálů a povrchů, které účinně kombinují schopnost navázání funkčních, např. biorekogničních prvků, a které jsou současně odolné proti nespecifické adsorpci látek i z velmi komplexních biologických médií, j ako j sou např. neředěné tělní tekutiny, potravinové extrakty, média obsahuj ící buňky, vzorky z tkání a částí organismů obecně, či tekutiny z prostředí obecného charakteru.
V současné době jsou považovány za nejvíce odolné (tzv. „antifouling“, či „ultra-low fouling“) a přitom fúnkcionalizovatelné povrchy, které se připravují polymerizací z povrchu („grafting from“) hydrofílních elektroneutrálních polymerů, jako jsou neionogenní poly(oligo(hydroxyethylenglykol methakrylát) (polyHOEGMA), poly(2-hydroxyethyl methakrylát) (polyHEMA), poly(3hydroxypropyl methakrylát) (polyHPMA) poly[N-(2-hydroxypropyl methakrylamid] (polyHPMAA) a ionogenní zwitteriontové poly(karboxybetain methakrylát) (polyCBMA), poly(karboxybetain akrylamid) (polyCBAA) a statistický kopolymer N-(2-hydroxypropyl) methakrylamidu (HPMAA) s karboxybetain methakrylamidem (CBMAA) (poly(HPMAA-coCBMAA), z povrchu substrátů pomocí povrchem iniciované radikálové polymerizace s přenosem atomu (ATRP). Postup se skládá z kovalentního navázání iniciátoru ATRP na povrch substrátu (S). Po přidání polymerizačního roztoku obsahujícího monomery rostou polymemí řetězce od upoutaného zbytku iniciátoru (R) postupným navazováním monomemích jednotek, přičemž iniciační atom halogenu se vždy přenáší na konec rostoucího řetězce polymeru. Výsledkem postupu je tzv. kartáč polymemích řetězců („polymer brush“), což je vrstva hustě uspořádaných polymemích řetězců navázaných jedním koncem k povrchu substrátu dle schématu S-R-polymemí řetězec. Při současném stavu techniky nelze u polymemích kartáčů roubovaných z povrchu spolehlivě stanovit délku jednotlivých řetězců ani hustotu kartáče. Proto bývá kartáč charakterizován pouze tloušťkou měřenou elipsometrickou metodou s využitím metody rezonance povrchových plasmonů (SPR) nebo pomocí mikroskopie atomárních sil (AFM).
Příprava a aktivace kartáčů z homopolymerů polyCBMA a polyCBAA jsou zahrnuty v dokumentu US20140370567. Tento dokument mimo jiné popisuje antifouling povrchy připravené roubováním polyCBMA a polyCBAA homopolymerů z povrchu substrátu polymerizací ATRP nebo RAFT, a blokové kopolymery, které obsahují blok z hydrofobního polymem a blok z homopolymerů polyCBMA nebo polyCBAA, roubované polymerizací z povrchu nebo vazbou na povrch substrátu. Dokument US20130244249 popisuje postup používající dvoustupňovou ATRP, při níž se napřed na povrch naroubuje vrstva polymem s vysokou hustotou řetězců a dobrými antifouling vlastnostmi. Na tuto vrstvuje naroubována druhá vrstva z polyCBMA nebo polyCBAA o nízké hustotě polymemích řetězců s reaktivními skupinami podél řetězce, které slouží k imobilizaci bioaktivních prvků. Výslovně uvedeným cílem tohoto postupuje zvýšení dostupnosti reaktivních skupin pro vazbu velkých molekul v dmhé vrstvě, přičemž otázkou vedlejších reakcí a nežádoucích reakčních reziduí se nezabývá. Dokument PV 2015-313 se zabývá přípravou a využitím
- 1 CZ 2020 - 270 A3 statistického kopolymeru poly(HPMAA-co-CBMAA) a srovnává jeho antifoulingové vlastnosti po ukotvení funkčních prvků s polyCBAA.
I když všechny výše zmíněné polymemí kartáče potlačují nespecifickou adsorpci z modelových proteinových roztoků a snižují depozici z neředěné krevní plasmy pod 50 ng/cm2, jsou kartáče na bázi HPMAA, CBMA a CBAA v současnosti jedinými „ultra-low fouling“ povrchy snižujícími nespecifické vazby látek z krevní plasmy pod 5 ng/cm2. Obecně se uznává, že vysoká odolnost proti nespecifické adsorpci je dána kombinací vysoké hydrofility, která omezuje hydrofobní interakce, a celkové elektroneutrality, omezující elektrostatické interakce.
Vazba funkčních entit, což mohou být látky a velké molekuly s různými doménami a velkým počtem nábojů, může tuto charakteristiku povrchu podstatně změnit a původně vynikající odolnost zhoršit.
Např. pro vazbu na neionogenní polymemí řetězce je využívána aktivace jejich bočních hydroxylových skupin, která však vede k tvorbě produktů, které do velké míry zhoršují odolnost kartáčů, příp. tyto schopnosti zcela ztratí.
Elektroneutrální zwitteriontové boční skupiny polyCBMA a polyCBAA řetězců obsahují karboxylový aniont a kvartemí amoniový kationt. Karboxylová skupina zwitteriontu se, obvykle pomocí EDC-NHS chemie, ale lze použít i jiná odborníkovi známá aktivační činidla pro aktivaci karboxylu (Bioconjugate Techniques, G.T.Hermanson, Elsevier, 2008), přemění na aktivní ester, který potom reaguje s aminoskupinou funkčního prvku za vzniku amidové vazby. V polymeru ovšem vždy zůstane část nezreagovaných aktivních esterů, které musí být kvantitativně odstraněny, jednak aby při následném styku s biologickým médiem nemohly nespecificky reagovat sjeho složkami, a dále aby se pokud možno zachovala původní elektroneutralita polymem, tj. kompenzovala převaha permanentního kladného náboje kvartemí amoniové skupiny. Ktomu nepostačuje prostá hydrolýza aktivního esteru, a proto se s výhodou zbylé aktivní estery eliminují reakcí s malou molekulou obsahující aminoskupinu a karboxylovou skupinu, např. s glyčinem (PV 2016-361). Nicméně žádný z těchto postupů se doposud neukázal jako plně vyhovující, a právě ztráta celkové elektroneutrality povrchu je považována zajeden z klíčových faktorů, který vede ke snížené odolnosti kartáče po vazbě funkčních prvků.
Předkládaný vynález si klade za cíl odstranit výše uvedené nevýhody.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je statistický terpolymer N-(2-hydroxypropyl) methakrylamidu (HPMAA), karboxybetain methakrylamidu (CBMAA) a sulfobetain methakrylamidu (SBMAA). Tento terpolymer lze zapisovat jako poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA).
S výhodou tento statistický terpolymer obsahuje od 0,1 mol % do 40 mol % SBMAA, s výhodou od 0,5 mol % do 30 mol % SBMAA.
S výhodou statistický terpolymer podle vynálezu obsahuje od 0,1 mol % do 50 mol % CBMAA, výhodněji od 5 mol % do 30 mol % CBMAA, ještě výhodněji od 10 mol % do 20 mol % CBMAA.
HPMAA tvoří v terpolymeru zbytek do 100 mol %.
Předmětem vynálezu je dále tzv. polymemí kartáč (angl. „polymer brush“) statistického terpolymeru N-(2-hydroxypropyl) methakrylamidu (HPMAA), karboxybetain methakrylamidu (CBMAA) a sulfobetain methakrylamidu (SBMAA), jehož řetězce jsou jedním koncem navázány na substrát (angl. „end-tethered“), přičemž polymemí kartáč má stmktum I,
-2CZ 2020 - 270 A3
S - R - poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) (I) kde
S je substrát, na jehož povrch lze kovalentně navázat iniciátory polymerizace;
R je zbytek iniciátoru, vybraného ze skupiny zahrnující iniciátory radikálové polymerizace s přenosem atomu ATRP, iniciátory živé radikálové polymerizace s přenosem jednotlivého elektronu SET-LRP a činidla pro polymerizaci s reverzibilním adičně-fragmentačním přenosem RAFT;
-je kovalentní vazba.
Polymemí kartáč je struktura, která se skládá z polymemích řetězců jedním koncem navázaných na substrát, přičemž polymemí řetězce jsou uspořádány hustě vedle sebe, takže směřují od substrátu. Výsledná struktura polymemích řetězců připomíná vlákna kartáče, odtud název.
S výhodou je tloušťka vrstvy statistického terpolymem v polymemím kartáči 10 nm až 500 nm, výhodněji 20 nm až 200 nm, měřeno elipsometrickou metodou ve vodě.
Předmětem vynálezu je rovněž funkcionalizovaný polymemí kartáč statistického terpolymem N(2-hydroxypropyl) methakrylamidu (HPMAA), karboxybetain methakrylamidu (CBMAA) a sulfobetain methakrylamidu (SBMAA), mající strukturu II
S - R - poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) - F (II) kde
S je substrát, na jehož povrch lze kovalentně navázat iniciátory polymerizace;
R je zbytek iniciátom, vybraného ze skupiny zahrnující iniciátory radikálové polymerizace s přenosem atomu ATRP, iniciátory živé radikálové polymerizace s přenosem jednotlivého elektronu SET-LRP a činidla pro polymerizaci s reverzibilním adičně-fragmentačním přenosem RAFT;
-je kovalentní vazba;
F je alespoň jedna funkční entita kovalentně navázaná na polymer amidovou vazbou.
Předkládaný vynález řeší výše popsaný problém ztráty celkové elektroneutrality povrchu při problematických hydrolýzách reziduálních aktivních esterů, který vede ke snížené odolnosti kartáče po vazbě funkčních molekul. V dosud známých postupech se hydrolýzou reziduálních aktivních esterů, i s použitím látek obsahujících karboxylovou slupinu, sice mohou karboxylové skupiny regenerovat, nikoli však úplně, protože se nenahradí úbytek způsobený vazbou fúnkčního prvku. Takto nahrazený zwitterion také není strukturně identický s původním zwitterionem. Je také obecně známo, že elektroneutralita karboxybetainů je závislá na pH v důsledku změn ionizace karboxylové skupiny při zachování permanentního kladného náboje kvartemího amoniového kationtu. Vazba fúnkční entity, což může být například velká molekula s různými doménami a velkým počtem vlastních nábojů, vytváří na povrchu podstatně změněné mikrookolí, tedy i lokální pH, a tím ovlivňuje nábojovou rovnováhu. Předložený vynález řeší tento nedostatek novým způsobem, a to doladěním rovnováhy přidáním monomemí jednotky SBMAA, což je betain s trvale ionizovanou sulfoskupinou. Sulfoskupina se neúčastní vazebné reakce při aktivaci karboxylových skupin pomocí aktivačních činidel (např. EDC-NHS nebo jiných odborníkovi známých aktivačních činidel pro aktivaci karboxylu), takže samotný homopolymer polySBMAA by nemohl být takto funkcionalizován, a jako homopolymer ostatně také nemá příliš dobrou
-3CZ 2020 - 270 A3 odolnost proti nespecifické adsorpci. V poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) zajišťuje funkcionalizovatelnost přítomnost CBMAA. Použití SBMAA v kombinaci s HPMAA a CBMAA pro polymemí kartáč dosud nebylo známo, přičemž, jak je doloženo dále, použití SBMAA je pro popsaný účel velmi výhodné a účinné.
Obsah SBMAA ve statistickém terpolymeru se v rámci výše uvedeného rozmezí od 0,1 mol % do 30 mol % optimalizuje podle navazované funkční entity tak, aby se po jejím navázání dosáhlo nejvyšší odolnosti proti nespecifické adsorpci. Tuto optimalizaci lze provést přípravou několika vzorků s různými obsahy SBMAA v rámci uvedeného rozmezí, a volbou vhodného obsahu SBMAA podle změřených požadovaných parametrů.
Terpolymer podle předkládaného vynálezu má vysokou odolnost proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií, a stejně tak i polymemí kartáče, které jej obsahují, mají tuto vysokou odolnost, a to i po aktivaci (tj. reakci tvorby aktivních esterů), navázání fúnkční entity a deaktivaci.
Biologickými médii jsou zde míněny zejména tělní tekutiny, jako je například krev, mozkomíšní mok, moč, sliny, ascitická tekutina, ale i další média biologického původu, jako je například krevní plasma a sémm, buněčné lyzáty, tkáňové extrakty, buněčné suspenze, média z biologických výrob, pitná či odpadní voda a potraviny.
Substrátem S je materiál, který se pokrývá funkcionalizovatelnou vrstvou terpolymeru odolnou proti nespecifické adsorpci. Substrátem je jakýkoliv materiál, na jehož povrch lze kovalentně navázat iniciátory polymerizace. Vhodnými substráty jsou tedy zejména materiály obsahující reaktivní skupiny na povrchu nebo inertní materiály povlečené vrstvou dobře adherující k jejich povrchu a obsahující reaktivní skupiny pro navázání iniciátom, typicky polydopaminem připraveným autopolymerizací na povrchu materiálu. Tvar, rozměry, morfologie a chemická povaha substrátu nejsou rozhodující, může se jednat o planámí či různě tvarované objekty, trubice, vlákna, částice, membrány, mikročástice, nanočástice, porézní materiály, kovy, křemík, materiály na bázi křemičitanů či hlinitokřemičitanů (např. sklo), polymery, anorganické materiály - zejména oxidy kovů či nekovů, apod. Ve výhodném provedení se zejména jedná o kovy, křemík, oxidy kovů či nekovů, včetně křemičitanů či hlinitokřemičitanů. Substrátem může být například povrch senzoru, povrch biosenzoru, nebo sorbent, nebo povrch zařízení či materiálu používaného ve zdravotnictví.
Skupina Rje zbytek iniciátoru. Pro ukotvení řetězce kopolymeru je potřeba nejprve na substrát navázat iniciátor polymerizace. Vhodné iniciátory a vhodné typy polymerizace pro roubování z povrchu jsou odborníkovi v oboru známy, jedná se o iniciátory polymerizace ATRP (atom transfer radical polymerization), iniciátory polymerizace SET-LRP (single-electron transfer living radical polymerization) nebo RAFT (reversible addition fragmentation transfer polymerization) činidla. Způsob vazby, kterou se iniciátor váže k substrátu, závisí na tom, o jaký substrát a jaký iniciátor se jedná, ale její určení, stejně jako určení vhodného iniciátoru pro každý substrát, je plně v rozsahu znalostí a schopností odborníka v oboru, bez potřeby vynaložení dalšího inventivního úsilí (odborník v oboru má k dispozici řadu monografií, učebnic a přehledových článků, jako příklad lze uvést Advanced Materials by Atom Transfer Radical Polymerization, Kryzstof Matyjaszewki, Wiley Online Library, 2018).
F je fúnkční entita kovalentně navázaná amidovou vazbou k polymemímu kartáči, přesněji ke zbytku karboxylové skupiny monomemí jednotky CBMAA. F je entita obsahující aminoskupinu, např. proteiny, peptidy, protilátky, oligonukleotidy, nukleové kyseliny, DNA sondy. F může být biorekogniční entita, která specificky interaguje s cílovým analytem, kterým může být například protein, peptid, nukleová kyselina, oligonukleotid a jiné organické nebo anorganické analyty.
Terpolymer poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) se připravuje známými technikami, např. metodou tzv. živé radikálové polymerizace. Polymemí kartáč obsahující tento terpolymer se připravuje živou radikálovou polymerizací z povrchu substrátu za vzniku řetězců polymemích
-4CZ 2020 - 270 A3 kartáčů jedním koncem vázaných na povrchu substrátu. Lze použít i metody „grafting to“, kdy se již uskupená polymemí entita naváže na substrát.
Vhodné způsoby polymerizace pro přípravu statistického terpolymeru podle vynálezu či polymemího kartáče obsahujícího tento terpolymer, např. ATRP polymerizace, SET-LRP polymerizace, RAFT polymerizace, jejich použití pro jednotlivé typy substrátů, odpovídající iniciátory a odpovídající vazebné skupiny pro kombinace iniciátoru a substrátu jsou známy z literatury. Jako příklady kombinací iniciátorů vhodných pro substráty lze uvést 11(trichlorsilyl)undecyl-2-bromo-2-methyl propanoát na sklo a křemík pokrytý oxidem, nebo ωmerkaptoundecyl bromisobutyrát na zlato, nebo iniciátor navázaný na povrchu substrátu obsahujícím karboxylové skupiny, který se připraví inkubací s roztokem kyseliny a-bromisomáselné, NHS a EDC, nebo 2-brom-2-methylpropanoyl bromid jako iniciátor pro substrát obsahující na povrchu amino nebo hydroxylové skupiny, což je i případ vrstvy polydopaminu.
Všechny monomery jsou methakrylamidy z hlediska polymerizace podobného typu, mají podobnou rychlostní konstantu polymerizace, a statistický charakter polymerizace dokládá molámí poměr koncentrací monomemích jednotek SBMAA, HPMAA a CBMAA v terpolymerech, shodný se složením polymerizační násady.
Příprava fůnkcionalizovaných polymemích kartáčů se provádí tak, že se karboxylové skupiny polykarboxybetainů (CBMAA jednotek) v polymemím kartáči podrobí reakci s aktivačními činidly, jako jsou například EDC (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimid) a NHS (Nhydroxysukcinimid), za vzniku aktivních esterových skupin. Vzniklé aktivní esterové skupiny se dále podrobí reakci s aminovou skupinou funkční entity za vzniku amidové kovalentní vazby. Zbylé nezreagované aktivní esterové skupiny se pak podrobí reakci s deaktivačním činidlem, například ethanolamin-O-sulfátem a/nebo amino-PEG2-octovou kyselinou a/nebo glycinem. Výhodnost použití ethanolamin-O-sulfátu spočívá v možnosti optimalizovat celkový náboj povrchu.
Vynález umožňuje univerzální modifikaci různých substrátů obsahujících reaktivní skupiny pro navázání iniciátorů polymerizace. Na povrch inertních substrátů, na které nelze iniciátory polymerizací navázat přímo, je možné napřed deponovat kotvicí mezivrstvu, na příklad polydopaminu, která obsahuje reaktivní skupiny pro navázání iniciátorů.
Předmětem předkládaného vynálezu je pak také použití statistického terpolymeru poly(HPMAAco-CBMAA-co-SBMAA) pro zvýšení odolnosti povrchů proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií. Povrch lze při takovém použití pokrýt terpolymerem poly(HPMAA-coCBMAA-co-SBMAA), například ve formě povlaku či ve formě polymemího kartáče.
Konkrétněji je předmětem vynálezu použití statistického terpolymeru poly(HPMAA-co-CBMAAco-SBMAA) nebo polymemího kartáče jej obsahujícího nebo fůnkcionalizovaného polymemího kartáče jej obsahujícího pro dosažení odolnosti povrchu (substrátu) proti nežádoucí nespecifické interakci se složkami biologických médií, zejména molekul proteinů a buněk, a proti adsorpci/depozici složek biologických médií na povrchy chráněné tímto polymerem.
Použití fůnkcionalizovaného polymemího kartáče obsahujícího statistický terpolymer poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) pro specifickou a selektivní interakci s cílovými analyty, zahrnujícími zejména proteiny, peptidy, nukleové kyseliny, oligonukleotidy.
Předkládaný vynález dále zahrnuje senzory, zejména biosenzory pro přímou detekci analytů nebo vícestupňovou detekci s použitím přidaných reagentů, jako jsou senzory rezonance povrchových plasmonů (SPR senzory), křemenné krystalové mikrováhy (quartz crystal microbalance) nebo fluorescenční senzory, které obsahují polymemí kartáč či fimkcionalizovaný polymemí kartáč podle vynálezu.
-5CZ 2020 - 270 A3
Předkládaný vynález dále zahrnuje membrány obsahující polymemí kartáč či funkcionalizovaný polymemí kartáč podle vynálezu. Substrátem je pak typicky membrána, vrstva polymemích řetězců je naroubována na povrch membrány. Je-li membrána porézní, je vrstva polymemích řetězců naroubována na povrchu pórů.
Objasnění výkresů
Obr. 1 ukazuje typické IRRAS spektrum kartáče poly[HPMAA(70 mol %)-coCBMAA(15 mol %)-co-SBMAA(15 mol %)] na zlatě. Vyznačeny jsou charakteristické absorpční pásy skupin jednotlivých složek: Am I a Am II amidové pásy řetězce, -OH pás hydroxylové skupiny HPMAA, -COO“ pás ionizované karboxylové skupiny CBMAA, -SO3“ pás ionizované sulfoskupiny SBMAA.
Obr. 2 je záznam odezvy SPR senzoru s čipem se zlatým povrchem opatřeným polymemím kartáčem, dle Příkladů 3 a 4.
Obr. 3 je záznam odezvy SPR senzoru při detekci E.coli na fůnkcionalizovaném terpolymením kartáči, dle příkladu 5.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava polymemího kartáče na zlatě
Skleněná destička s napařenou vrstvou zlata byla čištěna 10 min v UV ozonovém generátoru, ihned poté byla opláchnuta vodou a ethanolem. Potom byla destička ponořena do 0,lmM roztoku iniciátoru ω-merkaptoundecyl bromoisobutyrátu v ethanolu na 48 hodin v pokojové teplotě bez přístupu světla. Katalytická směs byla připravena ve Schlenkově baňce rozpuštěním CuCl (28 mg), CuCh (8,4 mg) a Me4cyclam (96,8 mg) v odplyněném methanolu (2 ml) pod dusíkovou atmosférou a sonikována 5 min do úplného rozpuštění. Ve druhé Schlenkově baňce byly rozpuštěny monomery SBMAA (138 mg, 3 mol %), CBMAA (572 mg, 15 mol %) a HPMAA (1847 mg, 82 mol %) v odplyněné vodě (16,9 ml) a methanolu (0,1 ml). Příklady dalších navážek pro přípravu povrchů s jiným procentuálním zastoupením složek jsou uvedeny v Tabulce 1. Po rozpuštění byla katalytická směs pod dusíkem přidána ke směsi monomerů. Homogenní polymerační směs byla pod dusíkem přidána do reaktoru s destičkou pokrytou iniciátorem. Polymerace probíhala v uzavřeném reaktoru 2 hod při pokojové teplotě. Poté byla destička opláchnuta vodou a před dalším použitím byla skladována ve fosfátovém pufiru (pH 7,4) při teplotě 4 °C.
Metodou infračervené reflexní absorpční spektroskopie (PM-IRRAS) byla ověřena chemická struktura terpolymemího kartáče. Na obrázku 1 je ukázáno typické IRRAS spektrum pro jedno provedení terpolymemího kartáče.
Tabulka 1: Vybrané příklady navážek pro přípravu terpolymeru s různým obsahem jednotlivých monomerů.
-6CZ 2020 - 270 A3
Složení polymerizační násady [mol %] Složení polymerizační násady [mg]
HPMAA CBMAA SBMAA HPMAA CBMAA SBMAA
84,5 15,0 0,5 1903 572 23
82,0 15,0 3,0 1847 572 138
80,0 15,0 5,0 1802 572 230
75,0 15,0 10,0 1689 572 460
70,0 15,0 15,0 1576 572 690
55,0 15,0 30,0 1239 572 1379
Příklad 2: Příprava polymemího kartáče na skle
Skleněná destička byla opláchnuta acetonem, čištěna 20 min ultrazvukem v 50% methanolu při teplotě 20 °C a poté sonikována dalších 20 min v chloroformu. Potom byla destička opláchnuta vodou, osušena vzduchem a čištěna 4 min v UV ozonovém generátoru. Po čištění byla destička dehydratována 1 hod při teplotě > 90 °C v přítomnosti silikagelu a ihned poté byla na 2 hod ponořena do 3mM roztoku iniciátoru (MeO)3-Si-(CH2)n-Br v bezvodém n-heptanu při pokojové teplotě. Potom byla destička opláchnuta ethanolem a vodou a vložena do reaktoru k polymeraci. Další postup přípravy polymemího kartáče je analogický s výše uvedeným příkladem 1. Katalytická směs byla připravena ve Schlenkově baňce rozpuštěním CuCl (28 mg), CuCE (8,4 mg) a Me4cyclam (96,8 mg) v odplyněném methanolu (2 ml) pod dusíkovou atmosférou a sonikována ultrazvukem 5 min do úplného rozpuštění. Ve dmhé Schlenkově baňce byly rozpuštěny monomery SBMAA (138 mg, 3 mol %), CBMAA (572 mg, 15 mol %) a HPMAA (1847 mg, 82 mol %) v odplyněné vodě (16,9 ml) a methanolu (0,1 ml). (Další příklady navážekjsou stejné jako příklady navážek uvedených v Tabulce 1). Po rozpuštění byla katalytická směs pod dusíkem přidána ke směsi monomerů. Homogenní polymerační směs byla pod dusíkem pňdána do reaktoru s destičkou s navázaným iniciátorem. Polymerace probíhala v uzavřeném reaktoru 2 hod při pokojové teplotě. Poté byla destička opláchnuta vodou a před dalším použitím byla skladována ve fosfátovém pufiru (pH 7,4) při teplotě 4 °C.
Příklad 3: Vazba bakteriální protilátky
Dle příkladu 1 byl na zlaté vrstvě čipu připraven terpolymemí kartáč poly[(HPMAA(80 mol %)co-CBMAA(15 mol %)-co-SBMAA(5 mol %)]. Čip byl opláchnut vodou, vložen do SPR senzoru a karboxylové skupiny CBMAA byly aktivovány 20 min za průtoku 10 μΐ/min roztokem 0,lM NHS a 0,5M EDC v deionizované vodě na aktivní ester. Po aktivaci byla zaznamenána hladina odezvy senzoru pro povrch ve vodě. 50 pg/ml bakteriální protilátky anti-Salmonella bylo rozpuštěno v borátovém pufiru (10 mM, pH 8,5), napuštěno rychlostí 30 μΐ/min do mikrofluidického systému SPR senzoru a reakcí s aktivovaným kartáčem kovalentně navázáno (20 minut). Po imobilizaci protilátky byla opět zaznamenána hladina odezvy senzoru ve vodě. Množství navázané protilátky bylo určeno z rozdílu odezvy senzoru ve vodě před nástřikem protilátky a odezvy ve vodě po ukončení imobilizace (Obrázek 2, červeně označená „hladina imobilizace“ odpovídá hodnotě 206 ng/cm2).
Příklad 4: Funkcionalizační kapacita a odolnost proti nespecifické adsorpci po navázání funkčních entit
Dle příkladu 1 byly připraveny terpolymemí kartáče poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) obsahující (a) 84,5 mol % HPMAA, 15 mol % CBMAA, 0,5 mol % SBMAA, (b) 82 mol % HPMAA, 15 mol % CBMAA, 3 mol % SBMAA a (c) 55 mol % HPMAA, 15 mol % CBMAA, 30 mol % SBMAA na zlaté vrstvě. Dále byly připraveny dva již známé referenční antifoulingové povrchy, vykazující vysokou mim rezistence k nespecifickým vazbám a zároveň dostatečnou funkcionalizační kapacitu - kopolymer obsahující 85 mol % HPMAA a 15 mol % CBMAA
-7 CZ 2020 - 270 A3 (WO2016177354A3) a homopolymer polyCBAA. Dále je uveden postup přípravy těchto polymerů:
poly[HPMAA(85 mol %)-co-CBMAA(15 mol %)]
Skleněná destička s napařenou vrstvou zlata byla čištěna 10 min v UV ozonovém generátoru, ihned poté byla opláchnuta vodou a ethanolem. Potom byla destička ponořena do 0,lmM roztoku iniciátoru ω-merkaptoundecyl bromoisobutyrátu v ethanolu na 48 hodin v pokojové teplotě bez přístupu světla. Katalytická směs byla připravena ve Schlenkově baňce rozpuštěním CuCl (28 mg), CuC12 (8,4 mg) a Me4cyclam (96,8 mg) v odplyněném methanolu (2 ml) pod dusíkovou atmosférou a sonikována 5 min do úplného rozpuštění. Ve druhé Schlenkově baňce byly rozpuštěny monomery CBMAA (572 mg, 15 mol %) aHPMAA (1914 mg, 85 mol %) v odplyněné vodě (16,9 ml) a methanolu (0,1 ml). Po rozpuštění byla katalytická směs pod dusíkem přidána ke směsi monomerů. Homogenní polymerační směs byla pod dusíkem přidána do reaktoru s destičkou pokrytou iniciátorem. Polymerace probíhala v uzavřeném reaktoru 2 hod při pokojové teplotě. Poté byla destička opláchnuta vodou a před dalším použitím byla skladována ve fosfátovém pufiru při teplotě 4 °C.
polyCBAA
Skleněná destička s napařenou vrstvou zlata byla čištěna 10 min v UV ozonovém generátoru, ihned poté byla opláchnuta vodou a ethanolem. Potom byla destička ponořena do 0,lmM roztoku iniciátoru ω-merkaptoundecyl bromoisobutyrátu v ethanolu na 48 hodin v pokojové teplotě bez přístupu světla. Katalytická směs byla připravena ve Schlenkově baňce rozpuštěním CuCl (28 mg), CuC12 (8,4 mg) a Me4cyclam (96,8 mg) v odplyněném methanolu (2 ml) pod dusíkovou atmosférou a sonikována 5 min do úplného rozpuštění. Ve druhé Schlenkově baňce byly rozpuštěny monomer CBAA (3590 mg) v odplyněné vodě (16,9 ml) a methanolu (0,1 ml). Po rozpuštění byla katalytická směs pod dusíkem přidána ke směsi monomerů. Homogenní polymerační směs byla pod dusíkem přidána do reaktoru s destičkou pokrytou iniciátorem.
Polymerace probíhala v uzavřeném reaktoru 2 hod při pokojové teplotě. Poté byla destička opláchnuta vodou a před dalším použitím byla skladována ve fosfátovém pufiru (pH 7,4) při teplotě 4 °C.
Výše uvedené polymemí kartáče byly zkoušeny na odolnost proti nespecifické adsorpci: (a) aktivovaný a deaktivovaný povrch, (b) aktivovaný a funkcionalizovaný povrch po deaktivaci. Pro všechny kartáče byl dále uvedený analogický postup. Čip s kartáčem byl opláchnut vodou, vložen do SPR senzoru a za průtoku 10 μΐ/min aktivován 20 min roztokem 0,1 M NHS a 0,5 M EDC v deionizované vodě. V případě ad (a) byl povrch dále 25 min omýván borátovým pufrem (10 mM, pH 8,5, průtok 30 μΐ/min), v případě ad (b) byl povrch 25 min omýván borátovým (10 mM, pH 8,5, průtok 30 μΐ/min) obsahujícím konkrétní rozpuštěnou funkční entitu obsahující primární aminy. Na následující povrchy byly imobilizovány dále uvedené entity:
poly[HPMAA(84,5 mol %)-co-CBMAA(15 mol %)-co-SBMAA(0,5 mol %)]: DNA oligonukleotid s koncovou amino skupinou (roztok o koncentraci 4 pM);
poly[HPMAA(82 mol %)-co-CBMAA(15 mol %)-co-SBMAA(3 mol %]: anti-bakteriální protilátka anti-Salmonella (roztok o koncentraci 50 pg/ml);
poly[HPMAA(55 mol %)-co-CBMAA(15 mol %)-co-SBMAA(30 mol %)]: póly L-lysin (roztok o koncentraci 50 pg/ml);
poly[HPMAA(85 mol %)-co-CBMAA(15 mol %)]:
-8CZ 2020 - 270 A3 anti-bakteriální protilátka anti-Salmonella (roztok o koncentraci 50 pg/ml), nebo DNA oligonukleotid s koncovou amino skupinou (roztok o koncentraci 4 μΜ), nebo póly L-lysin (roztok o koncentraci 50 pg/ml);
polyCBAA: anti-bakteriální protilátka anti-Salmonella (roztok o koncentraci 50 pg/ml), nebo DNA oligonukleotid s koncovou amino skupinou (roztok o koncentraci 4 pM), nebo póly L-lysin (roztok o koncentraci 50 pg/ml).
Dále byl v obou případech ad (a) a (b) u všech povrchů použit stejný postup. Kartáč byl deaktivován reakcí s 1M kyselinou (2-aminoethoxy)octovou (30 min, průtok 10 pl/min) a potom inkubován v PBS (10 mM fosfátový pufir + 150 mM NaCl + 2,7 mM KC1, pH 7,4) pro dosažení rovnováhy a konstantní odezvy senzoru. Poté byla injektována 100% lidská krevní plasma rychlostí 30 pl/min při 25 °C po dobu 10 min, následovaná opláchnutím PBS. Po 10 min oplachování PBS byl na 5 minut injektován PBS s vyšší iontovou silou (10 mM fosfátový pufir + 750 mM NaCl + 2,7 mM KC1, pH 7,4) pro odmytí elektrostaticky adsorbovaného nespecifického depozitu a nakonec byl celý povrch relaxován opět v normálním PBS. Hladina nespecifické adsorpce byla určena z rozdílu odezvy senzoru v PBS před injektací krevní plasmy a 10 min po ukončení injektace. Hladina nespecifické adsoprce po odmytí v PBS s vyšší iontovou silou byla určena z rozdílu odezvy senzoru v PBS před nástřikem krevní plasmy a 10 min po ukončení odmývání v PBS s vyšší iontovou silou. Výsledky jsou ukázány v Obrázku 2, Tabulce 2 a Tabulce 3.
Obrázek 2 dokládá, že i při koncentraci 15 mol % CBMAA v terpolymeru se na povrch naváže dostatečné množství funkčního prvku (206 ng/cm2 anti-Salmonella), a přitom se dosáhne vysoké odolnosti proti nespecifické adsorpci - nespecifická adsorpce z neředěné lidské plasmy byla 0 ng/cm2.
Tabulka 2 - Nespecifická adsorpce z neředěné krevní plasmy po aktivaci a deaktivaci a aktivaci/kovalentním navázáním protilátky anti-Salmonella a deaktivaci.
Nespecifická adsorpce z neředěné krevní plasmy [ng/cm2]
poly[HPMAA(82 mol %)co-CBMAA(15 mol %)co-SBMAA(3 mol %)] polyCBAA poly[HPMAA(85 mol %)co-CBMAA(15 mol %)]
Po aktivaci/deaktivaci 8,1 66,1 20,8
Po aktivaci/deaktivaci a odmytí PBS s vyšší iontovou silou 0 2,5 16,9
Po aktivaci/ukotvení antiSalmonella/deaktivaci 10,9 51,9 39,5
Po aktivaci/ukotvení antiSalmonella/deaktivaci a odmytí PBS s vyšší iontovou silou 4,5 8,5 40,9
Tabulka 2 dokládá zlepšené antifoulingové vlastnosti terpolymemího kartáče poly(HPMAA-coCBMAA-co-SBMAA) po aktivaci a imobilizaci funkčních prvků v porovnání se známými antifoulingovými karboxy-fůnkčními povrchy. Zároveň ukazuje významně nižší hladinu nespecifické adsorpce i bez nutnosti odmývání elektrostaticky adsorbovaného nespecifického depozitu.
-9CZ 2020 - 270 A3
Tabulka 3 - Nespecifická adsorpce z neředěné krevní plasmy po aktivaci a kovalentním navázáním kladně (poly L-lysin) a záporně (DNA oligonukleotid zakončený amino skupinou) nabitého ligandu za daných fiinkcionalizačních podmínek na terpolymemích kartáčích s různým molámím zastoupením jednotlivých monomemích jednotek.
Nespecifická adsorpce z neředěné krevní plasmy [ng/cm2]
poly[HPMAA(84,5 mol %)co-CBMAA(15 mol %)co-SBMAA(0,5 mol %)] poly[HPMAA(85 mol %)co-CBMAA(15 mol %)]
Po aktivaci/ukotvení DNA oligonukleotidů s koncovou amino skupinou /deaktivaci 1,7 4,1
Po aktivaci/ ukotvení DNA oligonukleotidů s koncovou amino skupinou /deaktivaci a odmytí PBS s vyšší iontovou silou 0 3,0
poly[HPMAA(55 mol %)co-CBMAA(15 mol %)co-SBMAA(30 mol %)] poly[HPMAA(85 mol %)co-CBMAA(15 mol %)]
Po aktivaci/ukotvení poly Llysinu/deaktivaci a odmytí PBS s vyšší iontovou silou 6,0 11,7
Tabulka 3 ukazuje výhodu laditelnosti složení terpolymemího kartáče v širokém rozmezí obsahu sulfobetainové složky. Pro různé ligandy lze na základě rozložení nábojů vyhodnotit vhodné složení kartáče tak, aby po imobilizaci zůstal povrch co nejvíce neutrální a tedy odolný proti nespecifické adsorpci. Lze tak docílit ještě nižší hladiny nespecifické adsorpce, než u známých fimkcionalizovatelných antifoulingových povrchů bez sulfobetainové složky.
Příklad 5: Biorekogniční schopnost terpolymemího kartáče po navázání funkčních entit
Dle příkladu 1 byl na zlatém povrchu čipu připraven poly[HPMAA(75 mol %)-co-CBMAA (15 mol %)-co-SBMAA(10 mol %)]. Čip byl vložen do SPR senzoru a postupem dle příkladu 3 byl fimkcionalizován protilátkou proti bakterii Escherichia coli (E.coli), anti-E.coli, a protilátkou proti karcinoembryonálnímu antigenu (CEA), anti-CEA. Druhá zmíněná protilátka byla použita jako reference pro ukázání specifičnosti detekce bakterie E.coli. Po fimkcionalizaci byly zbylé aktivní estery deaktivovány 30 min reakcí s roztokem 1M kyseliny (2-aminoethoxy)octové (30 min, průtok 10 μΐ/min) a potom se čip nechal ustálit v PBS (10 mM fosfátový pufir +150 mM NaCl + 2,7 mM KC1, pH 7,4). Po ustálení odezvy senzoru byl na čip injektován roztok inaktivované bakterie E.coli o koncentraci IxlO7 KTJ/mL (kolonie tvořících jednotek na ml) v PBS (15 min, průtok 45 μΐ/min). Potom byl čip opět oplachován PBS do ustálení odezvy senzoru.
Obrázek 3 ukazuje záznam odezvy SPR senzoru. Odezva z referenčního kanálu (černá barva), ve kterém byla mobilizovaná protilátka anti-CEA, byla zanedbatelná proti specifické odezvě SPR senzoru (červená barva), kde byla mobilizovaná protilátka anti-E.coli.
Polymemí kartáče v příkladech 3, 4 a 5 byly připraveny v rozmezí tlouštěk vrstvy statistického polymeru 80 nm až 100 nm (tloušťka byla ověřena elipsometrií a metodou SPR ve vodě).
- 10CZ 2020 - 270 A3
Příklad 6
Dle příkladu 1 byl na zlatém povrchu čipu připraven terpolymemí kartáč o složení 81 mol % HPMAA, 15 mol % CBMAA, 4 mol % SBMAA. Čip byl opláchnut vodou, vložen do SPR senzoru a karboxylové skupiny CBMAA byly 20 min za průtoku 10 μΐ/min aktivovány roztokem 0,5M EDC a 0,lM NHS v deionizované vodě za vzniku aktivního esteru. Po aktivaci byla zaznamenána hladina odezvy sensoru pro povrch ve vodě. 50 pg/ml bakteriální protilátky anti-Ecoli v borátovém pufru (10 mM, pH 8,5) bylo za průtoku 30 μΐ/min napuštěno do mikrofluidického systému SPR senzoru a mobilizováno 104±25 ng/cm2 protilátky. Následně byly reziduální aktivní estery deaktivovány 36 min jedním ze tří roztoků deaktivačních činidel: (1) roztok glycinu (1M v deionizované vodě, pH 7), nebo (2) roztok kyseliny (2-aminoethoxy)octové (1M v deionizované vodě, pH 7), a nebo (3) roztok ethanolamin-O-sulfátu (0,9 M v deionizované vodě, pH 8).
Takto připravené povrchy byly dále 10 min promývány PBS (10 mM fosfátový pufir +150 mM NaCl + 2,7 mM KC1, pH 7,4). Potom byla injektována 100% lidská krevní plasma rychlostí 30 μΐ/min při 25 °C po dobu 10 min, následovaná opět promýváním PBS. Po 10 min promývání PBS byl na 5 minut injektován PBS s vyšší iontovou silou (10 mM fosfátový pufir + 750 mM NaCl + 2,7 mM KQ, pH 7,4) a nakonec byl celý povrch relaxován opět v PBS. Nespecifická adsorpce byla určena z rozdílu odezvy sensoru v PBS před injektováním krevní plasmy a 10 min po ukončení injektace. Nespecifická adsorpce po odmytí PBS s vyšší iontovou silou byla určena z rozdílu odezvy sensoru v PBS před injektací krevní plasmy a 10 min po ukončení injektace PBS s vyšší iontovou silou.
Tabulka 4: Porovnání deaktivace reziduálních aktivních esterů - nespecifická adsorpce z neředěné krevní plasmy po deaktivaci dvěma referenčními, v literatuře používanými, činidly a novým činidlem ethanolamin-O-sulfátem.
Deaktivační činidlo Nespecifická adsorpce ze 100% krevní plasmy ng/cm2) Nespecifická adsorpce ze 100% krevní plasmy/odmytí PBS s vyšší iontovou silou (ng/cm2)
glycin 20,3 13,7
kyselina (2-aminoethoxy)octová 21,2 18,1
ethanolamin-O-sulfát 16,6 6,0
Tabulka 4 dokládá nižší nespecifickou adsorpci z komplexního roztoku po deaktivaci fůnkcionalizovaného terpolymemího povrchu ethanolamin-O-sulfátem v porovnání s referenčními již publikovanými metodami a dokládá tak zlepšení regenerace antifoulingových vlastností po deaktivaci ethanolamin-O-sulfátem.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Statistický terpolymer N-(2-hydroxypropyl) methakrylamidu, karboxybetain methakrylamidu a sulfobetain methakrylamidu.
  2. 2. Statistický terpolymer podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje
    - od 0,1 mol % do 40 mol % sulfobetain methakrylamidu;
    - od 0,1 mol % do 50 mol % karboxybetain methakrylamidu; a
    - N-(2-hydroxypropyl) methakrylamid tvoří v terpolymeru zbytek do 100 mol %.
  3. 3. Polymemí kartáč mající strukturu I
    S - R - poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) (I) kde
    S je substrát, na jehož povrch lze kovalentně navázat iniciátory polymerizace;
    R je zbytek iniciátoru, vybraného ze skupiny zahrnující iniciátory radikálové polymerizace s přenosem atomu ATRP, iniciátory živé radikálové polymerizace s přenosem jednotlivého elektronu SET-LRP a činidla pro polymerizaci s reverzibilním adičně-fragmentačním přenosem RAFT;
    poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) je statistický terpolymer podle nároku 1 nebo 2;
    -je kovalentní vazba.
  4. 4. Funkcionalizovaný polymemí kartáč mající strukturu II
    S - R - poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) - F (II) kde
    S je substrát, na jehož povrch lze kovalentně navázat iniciátory polymerizace;
    R je zbytek iniciátoru, vybraného ze skupiny zahrnující iniciátory radikálové polymerizace s přenosem atomu ATRP, iniciátory živé radikálové polymerizace s přenosem jednotlivého elektronu SET-LRP a činidla pro polymerizaci s reverzibilním adičně-fragmentačním přenosem RAFT;
    poly(HPMAA-co-CBMAA-co-SBMAA) je statistický terpolymer podle nároku 1 nebo 2;
    -je kovalentní vazba;
    F je alespoň jedna funkční entita kovalentně navázaná na statistický terpolymer amidovou vazbou prostřednictvím aminoskupiny funkční entity, přičemž s výhodou je funkční entita vybrána ze skupiny zahrnující proteiny, protilátky, peptidy, nukleové kyseliny, oligonukleotidy.
  5. 5. Polymemí kartáč podle nároku 3 nebo funkcionalizovaný polymemí kartáč podle nároku 4, vyznačený tím, že je tloušťka vrstvy statistického terpolymeru v polymemím kartáči 10 nm až 500 mm, s výhodou 20 nm až 300 nm, měřeno elipsometrickou metodou ve vodě.
    - 12CZ 2020 - 270 A3
  6. 6. Způsob přípravy funkcionalizovaných polymemích kartáčů podle nároku 4, vyznačený tím, že se karboxylové skupiny polykarboxybetainů v polymemím kartáči podrobí reakci s aktivačními činidly pro aktivaci karboxylu za vzniku aktivních esterových skupin; vzniklé aktivní esterové skupiny se dále podrobí reakci s aminovou skupinou funkční molekuly za vzniku amidové kovalentní vazby; a zbylé nezreagované aktivní esterové skupiny se pak podrobí reakci s ethanolamin-O-sulfátem a/nebo amino-PEG2-octovou kyselinou a/nebo glycinem.
  7. 7. Použití statistického terpolymeru podle nároku 1 nebo 2 pro zvýšení odolnosti povrchů proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií a/nebo proti nespecifické interakci se složkami biologických médií.
  8. 8. Použití polymemího kartáče podle nároku 3 nebo funkcionalizovaného polymemího kartáče podle nároku 4 pro zvýšení odolnosti povrchu substrátu proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií a/nebo proti nespecifické interakci se složkami biologických médií.
  9. 9. Použití funkcionalizovaného polymemího kartáče podle nároku 4 pro specifickou a selektivní interakci s cílovými analyty, zahrnujícími zejména proteiny, peptidy, nukleové kyseliny, oligonukleotidy.
  10. 10. Senzor, zejména vybraný ze skupiny zahrnující senzory rezonance povrchových plasmonů, křemenné krystalové mikrováhy nebo fluorescenční senzory, vyznačený tím, že obsahuje polymerní kartáč podle nároku 3 či funkcionalizovaný polymerní kartáč podle nároku 4.
  11. 11. Membrána, vyznačená tím, že obsahuje polymerní kartáč podle nároku 3 či funkcionalizovaný polymerní kartáč podle nároku 4.
CZ2020270A 2020-05-14 2020-05-14 Polymerní kartáč obsahující terpolymer pro použití proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií CZ309314B6 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2020270A CZ309314B6 (cs) 2020-05-14 2020-05-14 Polymerní kartáč obsahující terpolymer pro použití proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií
EP21715772.6A EP4149984B1 (en) 2020-05-14 2021-03-18 Terpolymer and polymer brushes for use against non-specific adsorption of substances from biological media
PCT/CZ2021/050033 WO2021228289A1 (en) 2020-05-14 2021-03-18 Terpolymer and polymer brushes for use against non-specific adsorption of substances from biological media
US17/924,823 US20230272138A1 (en) 2020-05-14 2021-03-18 Terpolymer and polymer brushes for use against non-specific adsorption of substances from biological media

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2020270A CZ309314B6 (cs) 2020-05-14 2020-05-14 Polymerní kartáč obsahující terpolymer pro použití proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2020270A3 true CZ2020270A3 (cs) 2021-11-24
CZ309314B6 CZ309314B6 (cs) 2022-08-17

Family

ID=75339380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2020270A CZ309314B6 (cs) 2020-05-14 2020-05-14 Polymerní kartáč obsahující terpolymer pro použití proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230272138A1 (cs)
EP (1) EP4149984B1 (cs)
CZ (1) CZ309314B6 (cs)
WO (1) WO2021228289A1 (cs)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3671502A (en) * 1970-11-12 1972-06-20 Kendall & Co Betaine copolymers with hydroxyalkylacrylates and hydroxyalkylmethacrylates
US20040082241A1 (en) * 2002-10-29 2004-04-29 Rodrigues Klein A. Fiberglass nonwoven binder
CA2674632A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 University Of Washington Dual-functional nonfouling surfaces and materials
CA2799786A1 (en) * 2010-06-09 2011-12-15 Semprus Biosciences Corp. Non-fouling, anti-microbial, anti-thrombogenic graft compositions
US10031138B2 (en) 2012-01-20 2018-07-24 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Hierarchical films having ultra low fouling and high recognition element loading properties
CZ2015313A3 (cs) * 2015-05-07 2016-07-07 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Polymerní kartáče odolné proti depozici složek biologických médií, způsob jejich přípravy a jejich použití
CZ307026B6 (cs) * 2016-06-17 2017-11-22 Ústav Fotoniky A Elektroniky Av Čr, V. V. I. Způsob přípravy povrchu substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny
WO2018185313A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 Noviosense B.V. Coating for implantable medical device

Also Published As

Publication number Publication date
EP4149984A1 (en) 2023-03-22
CZ309314B6 (cs) 2022-08-17
US20230272138A1 (en) 2023-08-31
EP4149984C0 (en) 2023-12-13
EP4149984B1 (en) 2023-12-13
WO2021228289A1 (en) 2021-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2015313A3 (cs) Polymerní kartáče odolné proti depozici složek biologických médií, způsob jejich přípravy a jejich použití
US20040043508A1 (en) Polymer-coated substrates for binding biological molecules
US20060110594A1 (en) Polymer-coated substrates for binding biomolecules and methods of making and using thereof
US7517705B2 (en) Phosphorus-containing polymers for optical signal transducers
Wiarachai et al. Clickable and Antifouling Platform of Poly [(propargyl methacrylate)-ran-(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)] for Biosensing Applications
Song et al. Fabrication of a detection platform with boronic-acid-containing zwitterionic polymer brush
US20060160089A1 (en) Fixing agents, method of fixing substance with the same, and substrate having sustance fixed thereto with the same
Xu et al. Spatially well-defined binary brushes of poly (ethylene glycol) s for micropatterning of active proteins on anti-fouling surfaces
JP5543179B2 (ja) 標識独立検出バイオセンサ組成およびその方法
EP1348125A1 (en) Products with biofunctional coating
WO2017215683A1 (en) Method of preparation of a substrate containing carboxybetaine groups and bound bioactive substances which is resistant against undesirable deposition from biological media
JP4505581B2 (ja) 物質固定化方法
EP1567569B1 (en) Method for immobilizing biologic molecules on solid surfaces
JP5409671B2 (ja) アフィニティヒドロゲルとその標識非依存性検出方法
CZ2020270A3 (cs) Terpolymer pro použití proti nespecifické adsorpci látek z biologických médií, polymerní kartáče jej obsahujíci
EP1000083A1 (en) Oxidized styrenic polymers for dna binding
US7195908B2 (en) Supports treated with triamine for immobilizing biomolecules
US20090171052A1 (en) Polyelectrolyte Monolayers and Multilayers for Optical Signal Transducers
CZ309305B6 (cs) Postup pro zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny vůči nežádoucí depozici z biologických médií
JP4171982B2 (ja) バイオチップ
Starodub et al. Approaches for Structured Immobilisation of Recognising Elements on the Transducer Surface of Biosensors
PICHOT et al. Amino-containing latexes as a solid support of single-stranded DNA fragments and their use in biomedical diagnosis
JPH01269494A (ja) 生体物質固定化用担体