CZ309305B6 - Postup pro zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny vůči nežádoucí depozici z biologických médií - Google Patents

Postup pro zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny vůči nežádoucí depozici z biologických médií Download PDF

Info

Publication number
CZ309305B6
CZ309305B6 CZ2021142A CZ2021142A CZ309305B6 CZ 309305 B6 CZ309305 B6 CZ 309305B6 CZ 2021142 A CZ2021142 A CZ 2021142A CZ 2021142 A CZ2021142 A CZ 2021142A CZ 309305 B6 CZ309305 B6 CZ 309305B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
carboxybetaine
formula
groups
deactivating agent
methacrylate
Prior art date
Application number
CZ2021142A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2021142A3 (cs
Inventor
Ivana Víšová
Ivana Mgr. Víšová
Hana Lísalová
Lísalová Hana RNDr., Ph.D.
Milan Houska
CSc. Houska Milan Ing.
Alina Pilipenco
Alina Ing. Pilipenco
Michala Forinová
Michala Mgr. Forinová
Markéta Vrabcová
Markéta Ing. Vrabcová
Original Assignee
Fyzikální Ústav Av Čr, V. V. I.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fyzikální Ústav Av Čr, V. V. I. filed Critical Fyzikální Ústav Av Čr, V. V. I.
Priority to CZ2021142A priority Critical patent/CZ309305B6/cs
Publication of CZ2021142A3 publication Critical patent/CZ2021142A3/cs
Publication of CZ309305B6 publication Critical patent/CZ309305B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/10—Esters
    • C08F20/12—Esters of monohydric alcohols or phenols
    • C08F20/16—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms
    • C08F20/18—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms with acrylic or methacrylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/56—Acrylamide; Methacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
    • C08F8/32—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups by reaction with amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D1/00—Detergent compositions based essentially on surface-active compounds; Use of these compounds as a detergent
    • C11D1/88—Ampholytes; Electroneutral compounds
    • C11D1/90—Betaines

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Předkládané řešení poskytuje způsob deaktivace aktivních esterů karboxybetainu, vyznačující se tím, že zahrnuje krok reakce aktivních esterů karboxybetainu s deaktivačním činidlem obsahujícím činidlo vzorce I, a činidlo vzorce II nebo III: H2N–(CH2)n–Om–SO3H (I), kde m = 0 nebo 1, a n = 1 až 6; NH2–(CH2)r–COOH (II), NH2–(CH2–CH2–O)s–CH2–COOH (III), kde r = 1 až 2, s = 1 až 6. Tento způsob zvyšuje odolnost funkcionalizovaných substrátů obsahujících karboxybetainové funkční skupiny po vazbě bioaktivních molekul proti depozici z biologických médií.

Description

Postup pro zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny vůči nežádoucí depozici z biologických médií
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy substrátu obsahujícího karboxybetainové skupiny, na který se navazují bioaktivní látky či jiné funkční molekuly aktivací karboxylové skupiny substrátu na aktivní ester a následnou reakcí s aminoskupinou bioaktivní látky. Předmětem vynálezu je chemická úprava takových substrátů s navázanými bioaktivními látkami, která přispívá k vytvoření nábojové rovnováhy. Vynález zásadním způsobem zvyšuje odolnost povrchu proti nežádoucí depozici z biologických médií při zachování funkčnosti navázaných bioaktivních látek tím, že umožňuje individuálně optimalizovat nábojové poměry substrátu s navázanou bioaktivní látkou.
Dosavadní stav techniky
Při styku prakticky všech běžných materiálů s biologickými médii dochází ke spontánní depozici složek média, tzv. „foulingu“ na povrch materiálu. Největší podíl tvoří nespecificky adsorbované proteiny, na které podle složení daného média mohou dále adherovat buňky a mikroorganismy, následované dalšími biologickými procesy, jako je koagulace krve, zánětlivé a imunitní reakce nebo tvorba bakteriálních biofilmů. Výsledné biologické depozity zhoršují fúnkci a životnost materiálů a zařízení, a způsobují tak značné komplikace v biotechnologických a lékařských aplikacích, využívajících zařízení a materiály jako jsou biosenzory, membrány a částice pro separaci a/nebo akumulaci biologických látek a/nebo buněk, nosiče léčiv a diagnostické částice aplikované do krevního oběhu, materiály přicházející do kontaktu s tělními tekutinami implantáty, kompenzační pomůcky, lékařské nástroje či nosiče buněk, tzv. scaffolds, materiály pro tkáňové inženýrství, a také v potravinářství a dalších průmyslových odvětvích (balení a hygiena potravin, životnost podvodních staveb a lodí), obecně v oblastech, kde se pracuje s komplexními a biologickými médii, jako jsou tělní tekutiny, média obsahující buňky, potraviny a média z biologických výrob a z biologického prostředí obecně. Proto jsou povrchy, které jsou odolné proti nespecifické tvorbě depozitů, a zároveň případně umožňující navázání bioaktivních látek zprostředkujících specifickou interakci povrchu s cílovými složkami biologického prostředí, velmi důležité a pro následující rozvoj výše zmíněných metod a odvětví nezbytné.
V současné době jsou proti biologické depozici nejvíce odolné substráty („antifouling povrchy“), které obsahují tzv. polymemí kartáče připravené roubováním elektroneutrálních polymerů, zejména hydrofilních, na povrchy substrátů povrchem iniciovanou radikálovou polymerizací s přenosem atomu (SI-ATRP, roubování z povrchu, tzv. „grafting from“). Polymery takových antifouling povrchů jsou s výhodou buď neionogenní - například poly[A-(2hydroxypropyl)methakrylamid)] (polyHPMAA) a/nebo zwitterionické, například poly(karboxybetainakrylamid) (polyCBAA) nebo poly(karboxybetainmethakrylamid (polyCBMAA). Tyto polymery mohou účinně potlačit i depozici z neředěné krevní plazmy a séra.
Polymemí kartáče s bioaktivními látkami navázanými na karboxybetainové postranní skupiny polyCBAA a polyCBMAA jsou popsány v řadě dokumentů, např. v US 2014 0370567 a US 2013 0244249. Patentová přihláška PCT/CZ 2016/050011 popisuje kartáče poly(HPMAA-coCBMAA) připravené kopolymerizaci monomerů HPMAA a CBMAA na povrchu různých substrátů a navázání bioaktivních látek na jejich aktivované karboxybetainové skupiny. Ke stavu techniky patří i hydrogely z kopolymerů poly(HEMA-co-CBMAA) (HEMA = 2hydroxyethylmethakrylát) odolné proti biologické depozici (Kostina, et al., Biomacromolecules 2012, 13, 4164-4170), nebo sorbenty, jejichž povrch je modifikován připojením karboxybetainových zwitteriontů (WO 2014/165421 Al).
- I CZ 309305 B6
Funkcionalizace substrátů obsahujících karboxylovou skupinu se provádí prakticky výhradně tak, že se karboxylová skupina nejprve aktivuje za použití N-substituovaných karbodiimidů (CDI) (například l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu, EDC) za vzniku aktivního esteru Oacylisourey. Tento meziprodukt velmi ochotně reaguje s nukleofílní aminoskupinou navazované látky za vzniku kovalentní amidické vazby. Výhodněji se reakce provádí za přítomnosti Nhydroxysukcinimidu (NHS) nebo jeho derivátů, který s O-acylisoureou reaguje za vzniku ve vodě stabilnějšího a s aminoskupinou reaktivnějšího aktivního NHS-esteru. Navazovaná látka, zvláště pokud je objemnější, jako například proteiny, nemůže ze sterických důvodů reagovat se všemi aktivními estery uvnitř povrchové vrstvy. Přítomnost reziduálních aktivních esterů po navázání látky je nežádoucí, neboť mohou jednak reagovat s jinými (méně objemnými) složkami biologického média, a tím způsobovat falešné výsledky, např. při využití pro biosenzory, a dále jejich přítomnost narušuje původní zwitteriontovou nábojovou rovnováhu důležitou pro antifoulingové vlastnosti. Je tedy snahou reziduální aktivní estery deaktivovat, tj. kvantitativně hydrolyzovat zpět na karboxyl ideálně za vzniku původní betainové struktury.
Ovšem kvantitativně regenerovat karboxybetainovou strukturu po aktivaci výše uvedenou metodou (např. činidly EDC/NHS) pouhou hydrolýzou prakticky nelze. Hydrolýza byla proto poměrně nedávno vystřídaná reakcí reziduálních aktivních esterů s malou molekulou látky obsahující amino- a karboxylovou skupinu, která pomáhá alespoň částečně obnovit počet karboxylových skupin (CZ 2016-361), zejména bylo navrženo použití glycinu nebo kyseliny 2aminooctové. Ukázalo se však, že i přes částečnou obnovu množství karboxylových skupin ve struktuře reakcí například s glycinem se nevytvoří původní betainová struktura s ionizovaným karboxylem v rovnováze s kationtem kvartemího amoniového dusíku. Navíc, při navázání látky na aktivní ester vznikají amidické vazby a zanikají karboxylové skupiny, které již nemohou být obnoveny. Dalším důležitým faktorem je, že sama navázaná látka může svými náboji podstatně změnit nábojový stav povrchu. Všechny tyto faktory mohou vést ke zhoršení antifoulingových vlastností v porovnání s původním substrátem. Pro zachování antifoulingových vlastností celé platformy po fůnkcionalizaci je tedy třeba nejen pokud možno co nejlépe obnovit původní zwitteriontovou strukturu polymemího substrátu, ale optimálně kompenzovat nábojové změny v důsledku funkcionalizace, tj. navázání bioaktivní látky. To žádný z dosud známých způsobů neumožňuje.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob chemické úpravy substrátu obsahujícího karboxybetainové skupiny a reziduální aktivní esterové skupiny, který vede ke zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu proti nežádoucí depozici z biologických médií. Zbytkové aktivní estery vznikají při postupech zahrnujících tvorbu aktivních esterů, zejména pomocí činidel EDC/NHS, a navázání bioaktivní látky prostřednictvím některých funkčních aktivních esterových skupin. Způsob podle vynálezu přitom dovoluje zachování fúnkčnosti navázané bioaktivní látky.
Podstata vynálezu spočívá v deaktivaci reziduálních aktivních esterů a optimalizaci nábojového stavu reakcí s deaktivačním činidlem.
Předmětem vynálezu je v jednom aspektu způsob deaktivace aktivních esterů karboxybetainu, který zahrnuje krok reakce aktivních esterů karboxybetainu s deaktivačním činidlem vzorce I:
H2N-(CH2)n-Om-SO3H (I), kde m = 0 nebo 1, a n = 1 až 6, s výhodou 1 nebo 2.
S výhodou je deaktivačním činidlem vzorce I kyselina aminomethansulfonová nebo 2aminoethylhydrogensulfát.
-2CZ 309305 B6
V některých provedeních může deaktivační činidlo dále obsahovat druhou složku, kterou je alespoň jedno činidlo obecného vzorce II a/nebo III:
NH2-(CH2)r-COOH
NH2-(CH2-CH2-O)S-CH2-COOH (Π), (III), kde r = 1 nebo 2, a s = 1 až 6, s výhodou 1 nebo 2.
S výhodou je deaktivačním činidlem vzorce II glycin, a/nebo deaktivačním činidlem vzorce III kyselina 2-(2-aminoethoxy)octová.
Deaktivace je reakce, kdy aminoskupina deaktivačního činidla obecného vzorce I, nebo II, nebo III reaguje se zbytkovým aktivním esterem za vzniku amidové skupiny a tím se deaktivační činidlo kovalentně naváže na povrch.
Složky deaktivačního činidla popsané obecnými vzorci I, II a III jsou malé molekuly obsahující vždy aminoskupinu pro reakci s aktivním esterem a karboxylovou skupinu nebo sulfátovou nebo sulfoskupinu. Sulfátová nebo sulfoskupinajsou skupiny s permanentním záporným nábojem.
Vícesložkové deaktivační činidlo s výhodou obsahuje 0,1 až 60 % mol. činidla vzorce I, a 40 až 99,9 %mol. činidla vzorce II a/nebo III.
Výhodněji vícesložkové deaktivační činidlo s výhodou obsahuje 1 až 60 % mol. činidla vzorce I, a 40 až 99 % mol. činidla vzorce II a/nebo III.
Deaktivační reakce se s výhodou provádí po dobu alespoň 20 minut. S výhodou se deaktivační reakce provádí inkubací s deaktivačním činidlem při celkové koncentraci deaktivačního činidla alespoň 0,1 M, výhodněji při celkové koncentraci deaktivačního činidla 0,7 až 2M.
Způsob podle vynálezu je vhodný pro úpravy organických i anorganických povrchů obsahujících karboxybetainové struktury, které se fůnkcionalizují aktivací karboxylové skupiny, což je nej běžnější způsob fůnkcionalizace. Takto připravené biologicky aktivní povrchy vykonávající funkci v biologickém médiu (odolnost proti nespecifické adsorpci, biorekogniční funkce, biomodulační funkce, atd.), mohou mít libovolnou morfologii, zahrnující např. částice, plochy, membrány, trubky, hadičky, destičky, porézní materiál, sítě vláken, a různé použití, zahrnující, např. biosenzory, afmitní částice a membrány pro separaci a akumulaci biologických látek, cílené nosiče pro dopravu léčiv, biomateriály pro tkáňové inženýrství, antitrombogenní materiály určené pro styk s krví.
Dalším předmětem vynálezu je tedy způsob fůnkcionalizace substrátu obsahujícího karboxybetainové skupiny nebo antifoulingového povrchu obsahujícího karboxybetainové skupiny bioaktivní látkou nesoucí aminoskupinu, který zahrnuje následující kroky:
a) chemická aktivace karboxybetainových skupin převedením karboxylových skupin karboxybetainu na aktivní esterové skupiny, a to zejména pomocí činidel EDC/NHS;
b) kovalentní navázání bioaktivní látky reakcí její aminoskupiny s aktivní esterovou skupinou připravenou v kroku a); a
c) deaktivace reziduálních aktivních esterových skupin nezreagovaných v kroku b) reakcí s deaktivačním činidlem obsahujícím činidlo vzorce I, popřípadě i činidlo vzorce II nebo III.
Deaktivace aktivních esterových skupin (resp. aktivních esterů karboxybetainu) deaktivačním činidlem se s výhodou provede tak, že se nejprve produkt z kroku b) opláchne vodou či pufrem,
-3 CZ 309305 B6 následně se produkt inkubuje s deaktivačním činidlem, s výhodou při pH 6 až 8 (nejvýhodněji pH 7), a následně se opláchne vodou či pufrem. Pro další zpracování se může produkt následně opláchnout roztokem, do kterého je pak vložen pro skladování, nebo vodou, vysušit a skladovat suchý.
Princip deaktivační reakce je takový, že během inkubace aktivních esterových skupin s deaktivačním činidlem koncové aminoskupiny deaktivačních činidel reagují s aktivními estery (které například zůstaly na substrátu po navázání bioaktivních látek). Kvartemí amoniová skupina karboxybetainu se reakce neúčastní a její permanentní kladný náboj zůstává zachován, přičemž ani deaktivací slabou karboxykyselinou nemusí dojít kjeho účinné neutralizaci. Díky tomu, že deaktivační činidlo obsahuje složku s permanentním záporným nábojem, se může vyrovnat tento deficit i optimalizovat změny v důsledku funkcionalizace.
Díky použití malých molekul je postup vhodný zejména (nikoli pouze) pro deaktivaci struktur, které mají na substrátu vysokou hustotu polymemích řetězců obsahujících karboxybetainy, jako jsou polymemí kartáče připravené metodou „grafting from“ nebo zesíťované hydrogely. Malé molekuly EDC/NHS mohou pronikat mezi polymemí řetězce a reagovat s karboxybetainy v celém objemu kartáče, zatímco pro navázání velkých bioaktivních látek, např. proteinů, jsou dostupné pouze karboxybetainy u povrchu kartáče.
Substrátem se zejména rozumí materiál, který se pokrývá fiinkcionalizovatelnou vrstvou odolnou proti nespecifické adsorpci. Substrátem je jakýkoliv materiál, na jehož povrch lze kovalentně navázat iniciátory polymerizace. Vhodnými substráty jsou tedy zejména materiály obsahující reaktivní skupiny na povrchu nebo inertní materiály povlečené vrstvou dobře adherující k jejich povrchu a obsahující reaktivní skupiny pro navázání iniciátom, typicky polydopaminem připraveným autopolymerizací na povrchu materiálu. Tvar, rozměry, morfologie a chemická povaha substrátu nejsou rozhodující, může se jednat o planámí či různě tvarované objekty, tmbice, vlákna, částice, membrány, mikročástice, nanočástice, porézní materiály, kovy, křemík, materiály na bázi křemičitanů či hlinitokřemičitanů (např. sklo), polymery, anorganické materiály - zejména oxidy kovů či nekovů, apod. Ve výhodném provedení se zejména jedná o kovy, křemík, oxidy kovů či nekovů, včetně křemičitanů či hlinitokřemičitanů. Substrátem může být například povrch senzoru, povrch biosenzoru, nebo sorbent, nebo povrch zařízení či materiálu používaného ve zdravotnictví, potravinářství či stavebnictví. Zejména se může jednat o biosenzory, membrány a částice pro separaci a/nebo akumulaci biologických látek a/nebo buněk, nosiče léčiv a diagnostické částice pro aplikaci do krevního oběhu, materiály přicházející do kontaktu s tělními tekutinami implantáty, kompenzační pomůcky, lékařské nástroje, nosiče buněk pro tkáňové inženýrství, obaly pro potraviny, povrchy staveb.
Substrátem se také může rozumět materiál, jehož povrch je modifikovaný navázáním molekuly obsahující karboxybetainové skupiny, nebo materiál, který obsahuje karboxybetainové skupiny ve své struktuře, např. polymemí gel, kde některé monomemí jednotky obsahují karboxybetainové skupiny.
V některých provedeních jsou substrátem částice. Částice jsou s výhodou z materiálu vybraného ze skupiny obsahující zlato, stříbro, magnetické materiály, křemík, S1O2, polymery, mají s výhodou průměr od 5 nm do 1 mm. Částice s bioaktivními látkami navázanými na aktivované karboxybetainové skupiny na povrchu částic včetně vnitřního povrchu porézních částic jsou aplikovatelné jako nosiče pro cílenou terapii a diagnostiku in vivo, separaci a akumulaci biologických látek a enzymatickou katalýzu v bioreaktorech.
V některých provedeních je substrátem detekční povrch biosenzoru pro přímou detekci nebo vícestupňovou detekci analytů v komplexních biologických médiích, např. pomocí optických nebo hmotnostních biosenzorů. S výhodou je detekční povrch pokryt polymemím kartáčem z polyCBMAA, polyCBMA, polyCBAA nebo poly(HPMAA-co-CBMAA) nebo poly(HPMAA-co
-4CZ 309305 B6
CBMAA-co-SBMAA) s navázanými bioreceptory. Bioreceptory v této aplikaci jsou bioaktivní láky mající selektivní afinitu k cílovým složkám analyzovaného média.
Antifoulingovým povrchem čili povrchovou vrstvou odolnou vůči nespecifické adsorpci, a s výhodou fůnkcionalizovanou, se zejména rozumí polymemí kartáč nebo polymemí povlak obsahující monomemí jednotky karboxybetainakrylamidu (CBAA), karboxybetainmethakrylátu (CBMA) nebo karboxybetainmethakrylamidu (CBMAA). Polymemí kartáč nebo polymemí povlak mohou dále obsahovat další monomemí jednotky, jako je N-(2hydroxypropyljmethakrylamid (HPMAA), oligo-ethylenglykolmethakrylát (HOEGMA), 2hydroxyethylmethakrylát (HEMA), 2-hydroxypropylmethakrylát (HPMA), nebo sulfobetainmethakrylamid (SBMAA). Kopolymery jsou zejména statistické kopolymery. Antifoulingovým povrchem se také může rozumět hydrogel z kopolymerů poly(HEMA-coCBMAA) (HEMA = 2-hydroxyethyhnethakrylát) nebo sorbent, jehož povrch je modifikován připojením karboxybetainových zwitteriontů.
Antifoulingové povrchy lze připravit na substrátu postupy známými odborníkovi v obom, například ATRP polymerizací (tzn. radikálovou polymerizací s přenosem atomu), SET-LRP polymerizací (tzn živou radikálovou polymerizací s přenosem jednotlivého elektronu), RAFT polymerizací (tzn. polymerizací s reverzibilním adičně-fragmentačním přenosem), hydrogelací, apod.
Biologické (komplexní) medium je pro účely předkládaného vynálezu tekutina obsahující biologické látky, tj. biomolekuly a jejich asociáty (proteiny, sacharidy, póly sacharidy lipidy, nukleové kyseliny, lipoproteiny, glykoproteiny, organely atd.), viry, buňky, mikroorganismy a jejich fragmenty. Biologickým médiem je tedy, např. krev a ostatní tělní tekutiny, krevní plasma a sérum, tkáňové extrakty, buněčné lyzáty a suspense, potravinové extrakty.
Bioaktivní (biologicky aktivní) látkou je pro účely předkládaného vynálezu látka, obsahující alespoň jednu primární aminoskupinu, selektivně interagující s cílovou složkou biologického média. Takovými bioaktivními látkami mohou být například proteiny, peptidy, protilátky, oligonukleotidy, nukleové kyseliny, DNA sondy. Bioaktivní látka může mít afinitu k cílové složce, může katalyzovat chemickou přeměnu cílové látky, nebo může vyvolávat biologickou odezvu. Bioaktivními látkami mohou být také například nanočástice fúnkcionalizované primární aminoskupinou skupinou, zejména kovové, polymemí, silikonové nanočástice, nanočástice na bázi oxidů kovů či polymemí nanočástice s magnetickým jádrem.
Aktivní ester karboxybetainu je produkt reakce karboxylové skupiny karboxybetainu s Nsubstituovaným karbodiimidem, tj. O-acylisourea, a/nebo produkt reakce karboxylové skupiny karboxybetainu s Λ'-siibstituováným karbodiimidem a A-hydroxysukcinimidem (NHS) nebo jeho deriváty, s výhodou je aktivním esterem NHS-ester nebo sulfo NHS-ester.
Způsob deaktivace povrchu substrátu obsahujícího karboxybetainové skupiny podle předkládaného vynálezu poskytuje oproti dosavadnímu stavu techniky účinné, rychlé a provedením nenáročné řešení nedostatků plynoucích z depozice nežádoucích složek biologických médií na povrchy fúnkcionalizované bioaktivní látkou a tím i zlepšení fiinkce celého systému.
Objasnění výkresů
Obr. 1: FTIR-RAS spektra polyCBMAA „grafted from“ na zlatě (1) nemodifikovaný pólyCBMAA před aktivací; (2) polyCBMAA aktivovaný EDC/NHS; (3) polyCBMAA deaktivovaný 0,5M kyselinou 2-(2-aminoethoxy)octovou + 0,5M kyselinou aminomethansulfonovou při pH 7.
-5CZ 309305 B6
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: PolyCBMAA kartáč aktivovaný EDC/NHS a deaktivovaný činidlem podle vynálezu.
Polymemí kartáč polyCBMAA byl připraven metodou SI-ATRP následujícím postupem. Zlatý čip (BK7/Ti/Au, 50nm) byl opláchnut ethanolem a vodou a dočištěn 10 min v UV ozonolyzátoru. Čip byl poté ponořen do 0,1 M roztoku iniciátoru ω-merkaptoundecyl bromoisobutyrátu v ethanolu na 24 hodin bez přístupu světla. Do Schlenkovy ampule obsahující CuCl (20,0 mg), CuCU (6,0 mg) a Me4Cyclam (69,1 mg) bylo přidáno 1,5 ml odplyněného methanolu a katalytická směs byla míchána do úplného rozpuštění. Ve druhé Schlenkově ampuli bylo za chlazení ledem rozpuštěno 2,722 g monomeru CBMAA v 12,1 ml odplyněné vody. Po rozpuštění byl do ampule přidán pod dusíkem katalytický roztok. Homogenní polymerační směs byla nadávkována pod dusíkem do druhé Schlenkovy ampule s vloženou destičkou pokrytou iniciátorem a směs byla polymerována 120 min při laboratorní teplotě. Čip byl poté opláchnut vodou a před dalším použitím byl uchována v PBS pufru při 6 °C.
Čip byl opláchnut ultračistou vodou, osušen proudem dusíku a změřeno FT-IRRAS spektrum. Tento čip byl poté 20 min aktivován ve vodném roztoku EDC (0,5 M) a NHS (0,1 M). Po aktivaci a osušení bylo ihned změřeno FT-IRRAS spektrum. Čip připravený stejným způsobem jako čip předchozí byl dále po aktivaci 30 min inkubován v dvousložkovém deaktivačním činidle o složení 0,5M kyselina 2-(2-aminoethoxy)octová + 0,5M kyselina aminomethansulfonová, pH 7. Po inkubaci byl čip opláchnut ultračistou vodou a změřeno FT-IRRAS spektrum. Spektrum (1) v obrázku 1 ukazuje výchozí nemodifikovaný polyCBMAA s dominantními pásy ionizované karboxylové skupiny (1609 cm 1, 1370 cm1). Ve spektru (2) polyCBMAA po aktivaci téměř vymizely pásy ionizované karboxylové skupiny a objevily se nové pásy aktivního esteru v oblasti 1818 cm1 až 1704 cm1. Ve spektru (3) polyCBMAA po deaktivaci vymizely pásy aktivního esteru, zvýšila se intenzita pásů ionizované karboxylové skupiny a objevily se nové pásy sulfo skupiny při 1205 cm1 a 1030 cm1, dokládající navázání deaktivačního činidla.
Příklad 2: Odolnost kartáčů polyCBAA a poly(HPMAA-co-CBMAA/15 % mol.) proti biologické depozici z neředěné krevní plazmy po EDC/NHS aktivaci, fimkcionalizaci anti-E. coli protilátkou a deaktivaci aktivních esterů činidly podle vynálezu
Polymemí kartáč polyCBAA byl připraven stejným postupem jako v příkladu 1.
Polymemí kartáč poly(HPMAA/85 % mol.-co-CBMAA/15 % mol.) byl připraven metodou SIATRP následujícím postupem. Zlatý čip (BK7/Ti/Au, 50nm) byl opláchnut ethanolem a vodou a dočištěn 10 min v UV ozonolyzátom. Čip byl poté ponořen do 0,1 M roztoku iniciátom ωmerkaptoundecylbromoisobutyrátu v ethanolu na 24 hodin bez přístupu světla. Do Schlenkovy ampule obsahující CuCl (40,0 mg), CuCE (12,0 mg) aMe4Cyclam (138,3 mg) bylo přidáno 2,9 ml odplyněného methanolu a katalytická směs byla míchána do úplného rozpuštění. Ve dmhé Schlenkově ampuli bylo za chlazení ledem rozpuštěno 0,817 g monomem CBMAA a 2,734 g HPMAA ve 24,1 ml odplyněné vody. Po rozpuštění byl do ampule přidán pod dusíkem katalytický roztok. Homogenní polymerační směs byla nadávkována pod dusíkem do dmhé Schlenkovy ampule s vloženou destičkou pokrytou iniciátorem a směs byla polymerována 120 min při laboratorní teplotě. Čip byl poté opláchnut vodou a před dalším použitím byl uchována v PBS pufm při 6 °C.
Oba čipy s polyCBAA a poly(HPMAA/85 % mol.-co-CBMAA/15 % mol.) byly postupně opláchnuty vodou, osušeny dusíkem, vloženy do SPR senzom se 4 mikrofluidickými kanály a 5 min omývány ultračistou vodou. Poté byly karboxybetainové skupiny ve všech kanálech 20 min aktivovány vodným roztokem 0,5M EDC a 0,lM NHS. Následoval oplach čistou vodou po dobu 1 min. 50 pg/ml bakteriální protilátky anti-E. coli bylo rozpuštěno v 10 mM borátovém pufm, pH 8,5 a roztok byl rychlostí 30 μΐ/min injikován do mikrofluidického systému SPR senzom. Reakcí
-6CZ 309305 B6 s aktivovaným povrchem bylo na polyCBAA navázáno 350 ± 180 ng/cm2 a na poly(HPMAA/85 % mol.-co-CBMAA/15 % mol.) 80 ± 35 ng/cm2. Následně byly oba čipy deaktivovány 30 min reakcí s různými deaktivačními činidly podle vynálezu. Pro oba povrchy byly jako referenční metody deaktivace použité již publikované postupy deaktivace povrchů přeměnou aktivních esterů zpět na karboxylové skupiny reakcí s 1 M roztokem samotné kyseliny 2-(2-aminoethoxy)octové (AEAA) anebo 1 M roztokem glycinu při pH 7. Zkušební čipy byly deaktivovány 30 min dvousložkovými činidly MIX 1 až MIX 5, jejichž složení je uvedeno v tabulce 1 ajednosložkovým činidlem 0,75 M kyselinou aminomethansulfonovou, pH 7 podle vynálezu.
ίο Tabulka 1: Deaktivační dvousložková činidla použitá pro demonstraci vynálezu na dvou polymemích kartáčích.
polyCBAA poly(HPMAA/85 % mol.-co-CBMAA/15 %mol.)
MIX 1 960 mM glycin + 40 mM 2-aminoethyl hydrogen sulfát, pH 7 MIX 4 900 mM kyselina 2-(2aminoethoxy) octová + lOOmM 2aminoethyl hydrogen sulfát, pH 7
MIX 2 900 mM glycin +100 mM kyselina aminomethansulfonová, pH 7 MIX 5 500 mM kyselina 2-(2aminoethoxy) octová + 500 mM kyselina aminomethansulfonová, pH 7
MIX 3 900 mM glycin +100 mM 2-aminoethyl hydrogen sulfát, pH 7
Následně byl každý čip opláchnut vodou a inkubován v pufru PBS (10 mM fosfátový pufir + 15 150 mM NaCl + 2,7 mM KC1, pH 7,4) pro dosažení rovnováhy a konstantní odezvy senzoru. Poté byla injektována 100% lidská krevní plasma rychlostí 30 μΐ/min při 25 °C po dobu 10 min, následovaná opět pufrern PBS. Hmotnost nespecifického depozitu byla určena z rozdílu odezvy senzoru v pufru před injektováním krevní plasmy a 10 min po ukončení injektace. Tabulka 2 udává výsledný nespecifický fouling z neředěné krevní plasmy na površích připravených různým 20 způsobem. Pro přepočet odezvy senzoru na povrchovou hustotu hmotnosti byl použit vztah 0,001° = 0,85 ng/cm2.
Tabulka 2: Hmotnost nespecifického depozitu z neředěné krevní plasmy na dvou rozdílných fůnkcionalizovaných kartáčích deaktivovaných pěti různými dvousložkovými činidly podle 25 vynálezu a porovnání s dvěma referenčními již publikovanými způsoby.
polyCBAA AEAA (srovnávací) GLYCIN (srovnávací) MIX 1 MIX 2 MIX 3
26 ng/cm2 29 ng/cm2 4 ng/cm2 9 ng/cm2 9 ng/cm2
poly(HPMAA/85 % mol.-coCBMAA/15% mol.) AEAA (srovnávací) GLYCIN (srovnávací) MIX 4 MIX 2 MIX 5
nestanoveno 15 ng/cm2 7 ng/cm2 7 ng/cm2 8 ng/cm2
Tabulka 3: Hmotnost nespecifického depozitu z neředěné krevní plasmy na dvou rozdílných fůnkcionalizovaných kartáčích deaktivovaných jednosložkovým činidlem podle vynálezu a porovnání s referenčními již publikovanými způsoby.
polyCBAA AEAA (srovnávací) GLYCIN (srovnávací) 0,75 M kyselina aminomethansulfonová, pH 7
26 ng/cm2 29 ng/cm2 20 ng/cm2
poly(HPMAA/85 % AEAA GLYCIN 0,75 M kyselina
mol.-co- (srovnávací) (srovnávací) aminomethansulfonová, pH 7
CBMAA/15% mol.) nestanoveno 15 ng/cm2 14 ng/cm2
-7 CZ 309305 B6
Příklad 3: Odolnost karboxybetainových polymemích kartáčů proti biologické depozici ze vzorků potraviny po EDC/NHS aktivaci, funkcionalizaci anti-E. coli a deaktivaci aktivních esterů činidly podle vynálezu.
Polymemí kartáč polyCBAA byl připraven postupem uvedeným v příkladu 1 a funkcionalizován 350 ±180 ng/cm2 anti-E. coli, postupem uvedeným v příkladu 2. Následně byl čip deaktivován 30 min reakcí s různými deaktivačními činidly. Jako referenční metoda deaktivace byla použitá již publikovaná metoda přeměny aktivních esterů zpět na karboxylové skupiny reakcí s 1 M roztokem glycinu při pH 7. Zkušební čipy byly deaktivovány 30 min dvousložkovými činidly MIX 1 a MIX 2 podle vynálezu, jejich složení je uvedeno v tabulce 1 u příkladu 2.
Následně byl čip opláchnut vodou a inkubován v pufiru PBS (10 mM fosfátový pufir + 150 mM NaCl + 2,7 mM KC1, pH 7,4) pro dosažení rovnováhy a konstantní odezvy senzoru. Poté byl injektován vzorek hovězího mletého masa (připravený homogenizací dle protokolu popsaného v ČSN ISO 7251 a ČSN EN ISO 6579 platných ke dni podání přihlášky) rychlostí 30 μΐ/min při 25 °C po dobu 10 min, a potom opět pufr PBS. Hmotnost nespecifického depozitu uvedená v tabulce 4 byla určena z rozdílu odezvy senzoru v pufiru před injektováním vzorku potraviny a 10 min po ukončení injektace. Pro přepočet odezvy senzoru na povrchovou hustotu hmotnosti byl použit vztah 0,001° = 0,85 ng/cm2.
Tabulka 4: Hmotnost nespecifického depozitu ze vzorku potraviny - hovězího mletého masa - na funkcionalizovaném polyCBAA deaktivovaném dvěma různými činidly podle vynálezu a porovnání s referenčním již publikovaným způsobem.
polyCBAA Glycin (srovnávací) MIX 1 MIX 2
10 ng/cm2 8 ng/cm2 2 ng/cm2
Příklad 4: Příklad aplikace vynálezu při detekci bakterie E. coli ve vzorcích potravin.
Polymemí kartáč polyCBAA byl připraven postupem uvedeným v příkladu 1 a funkcionalizován 350 ±180 ng/cm2 anti-E. coli postupem uvedeným v příkladu 2. Následně byl čip deaktivován 30 min reakcí s různými deaktivačními činidly. Jako referenční metoda deaktivace byla použitá již publikovaná metoda přeměny aktivních esterů zpět na karboxylové skupiny reakcí s 1 M roztokem glycinu při pH 7. Zkušební čip byl deaktivován 30 min dvousložkovým činidlem MIX 2 podle vynálezu, jehož složení je uvedeno v tabulce 1 u příkladu 1. Následně byl čip opláchnut vodou a inkubován v pufiru PBS (10 mM fosfátový pufr ± 150 mM NaCl ± 2,7 mM KC1, pH 7,4) pro dosažení rovnováhy a konstantní odezvy senzoru. Poté byl injektován vzorek hovězího mletého masa (připravený homogenizací dle protokolu popsaného v ČSN ISO 7251 a ČSN EN ISO 6579) infikovaný různými koncentracemi bakterie E. coli (0 až 1 * 107 CFU/ml) rychlostí 30 μΐ/min při 25 °C po dobu 10 min. Následovalo opět propláchnutí PBS. Hladina detekce byla určena z rozdílu odezvy senzoru v pufiru před injektováním vzorku potraviny a 10 min po ukončení injektace. Data byla poté kompenzována odezvou referenčního kanálu s nulovou koncentrací bakterie E. coli. Tabulka 5 udává výsledné meze detekce (LOD, hodnota blanku ± 3 χ směrodatná odchylka šumu) a meze stanovitelnosti (LQD, hodnota blanku ±10* směrodatná odchylka šumu) dopočítané ze získaných kalibračních křivek. Pro přepočet odezvy senzoru na hmotnost na jednotku povrchu byl použit vztah 0,001° = 0,85 ng/cm2.
Tabulka 5: LOD a LOQ kalibračních křivek detekce E. coli ve vzorcích potraviny (hovězí mleté maso) za použití referenční (již publikované) přípravy vzorku a podle vynálezu.
polyCBAA LOD (Glycin) LOD (MIX 2) LOQ (Glycin) LOQ (MIX 2)
[ng/cm2]
4 x 104 9 x 101 2 x 105 1 x 103

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob funkcionalizace substrátu obsahujícího karboxybetainové skupiny nebo antifoulingového povrchu obsahujícího karboxybetainové skupiny bioaktivní látkou nesoucí amino skupinu, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
    a) chemická aktivace karboxybetainových skupin převedením karboxylových skupin karboxybetainu na aktivní estery karboxybetainu, a to zejména pomocí činidel EDC/NHS;
    b) kovalentní navázání bioaktivní látky reakcí její aminoskupiny s aktivním esterem karboxybetainu připraveným v kroku a); a
    c) deaktivace reziduálních aktivních esterů karboxybetainu nezreagovaných v kroku b) reakcí s deaktivačním činidlem obsahujícím činidlo vzorce I, a činidlo vzorce II nebo III:
    H2N-(CH2)n-Om-SO3H (I), kde m = 0 nebo 1, a n = 1 až 6;
    NH2-(CH2)r-COOH (Π),
    NH2-(CH2-CH2-O)S-CH2-COOH (III), kde r=laž2, s=laž6.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že deaktivačním činidlem vzorce I je kyselina aminomethansulfonová nebo 2-aminoethyl hydrogensulfát.
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že deaktivačním činidlem vzorce lije glycin, a/nebo deaktivačním činidlem vzorce III je kyselina 2-(2-aminoethoxy)octová.
  4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že deaktivační činidlo obsahuje 0,1 až 60 % mol. činidla vzorce I, a 40 až 99,9 % mol. činidla vzorce II nebo III.
  5. 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že antifoulingovým povrchem je polymemí kartáč nebo polymemí povlak obsahující monomemí jednotky karboxybetain akrylamidu, karboxybetain methakrylátu nebo karboxybetain methakrylamidu, a popřípadě obsahující další monomemí jednotky, kterými je N-(2-hydroxypropyl) methakrylamid, oligoethylenglykol methakrylát, 2-hydroxyethyl methakrylát, 2-hydroxypropyl methakrylát, nebo sulfobetain methakrylamid; nebo antifoulingovým povrchem je hydrogel z kopolymerůpoly(HEMA-co-CBMAA) nebo sorbent, jehož povrch je modifikován připojením karboxybetainových zwitteriontů.
CZ2021142A 2021-03-22 2021-03-22 Postup pro zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny vůči nežádoucí depozici z biologických médií CZ309305B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021142A CZ309305B6 (cs) 2021-03-22 2021-03-22 Postup pro zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny vůči nežádoucí depozici z biologických médií

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021142A CZ309305B6 (cs) 2021-03-22 2021-03-22 Postup pro zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny vůči nežádoucí depozici z biologických médií

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2021142A3 CZ2021142A3 (cs) 2022-08-10
CZ309305B6 true CZ309305B6 (cs) 2022-08-10

Family

ID=82799570

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2021142A CZ309305B6 (cs) 2021-03-22 2021-03-22 Postup pro zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny vůči nežádoucí depozici z biologických médií

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ309305B6 (cs)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090061533A1 (en) * 2007-08-23 2009-03-05 Canon Kabushiki Kaisha Structure, target substance detection element and target substance detection kit
WO2010065960A2 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Semprus Biosciences Corp. Non-fouling, anti-microbial, anti-thrombogenic graft-from compositions
CZ2016361A3 (cs) * 2016-06-17 2017-11-22 Ústav Fotoniky A Elektroniky Av Čr, V. V. I. Způsob přípravy povrchu substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090061533A1 (en) * 2007-08-23 2009-03-05 Canon Kabushiki Kaisha Structure, target substance detection element and target substance detection kit
WO2010065960A2 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Semprus Biosciences Corp. Non-fouling, anti-microbial, anti-thrombogenic graft-from compositions
CZ2016361A3 (cs) * 2016-06-17 2017-11-22 Ústav Fotoniky A Elektroniky Av Čr, V. V. I. Způsob přípravy povrchu substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2021142A3 (cs) 2022-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Baggerman et al. Romantic surfaces: a systematic overview of stable, biospecific, and antifouling zwitterionic surfaces
EP3292161B1 (en) Copolymer of n-(2-hydroxypropyl) methacrylamide and carboxybetaine methacrylamide, polymer brushes
Cullen et al. Polymeric brushes as functional templates for immobilizing ribonuclease A: study of binding kinetics and activity
Tsai et al. Dopamine-assisted immobilization of poly (ethylene imine) based polymers for control of cell–surface interactions
Dai et al. High-capacity binding of proteins by poly (acrylic acid) brushes and their derivatives
Goddard et al. Polymer surface modification for the attachment of bioactive compounds
Larsson et al. Photografted poly (ethylene glycol) matrix for affinity interaction studies
Wiarachai et al. Clickable and Antifouling Platform of Poly [(propargyl methacrylate)-ran-(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)] for Biosensing Applications
US10031138B2 (en) Hierarchical films having ultra low fouling and high recognition element loading properties
Roeven et al. PLL–poly (HPMA) bottlebrush-based antifouling coatings: three grafting routes
JPS63500079A (ja) アンチトロンビン活性表面を有する基材
Amoako et al. Multimodal, biomaterial‐focused anticoagulation via superlow fouling zwitterionic functional groups coupled with anti‐platelet nitric oxide release
WO2017215683A1 (en) Method of preparation of a substrate containing carboxybetaine groups and bound bioactive substances which is resistant against undesirable deposition from biological media
JP2022525305A (ja) 双性イオンコポリマーコーティングとその方法
WO2005111618A1 (ja) 物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体
Kitano et al. Polymer brush with pendent glucosylurea groups constructed on a glass substrate by RAFT polymerization
Kirkness et al. Modified pluronic F127 Surface for bioconjugation and blocking nonspecific adsorption of microspheres and biomacromolecules
Chou et al. Bioinspired pseudozwitterionic hydrogels with bioactive enzyme immobilization via pH-responsive regulation
Arcot et al. Optimizing the surface density of polyethylene glycol chains by grafting from binary solvent mixtures
JP2004528414A (ja) 光学的シグナル変換器のための燐含有ポリマー
CZ309305B6 (cs) Postup pro zvýšení odolnosti funkcionalizovaného substrátu obsahujícího karboxybetainové funkční skupiny vůči nežádoucí depozici z biologických médií
JP5409671B2 (ja) アフィニティヒドロゲルとその標識非依存性検出方法
Bernand‐Mantel et al. Protein‐functionalized ultrathin glycidyl methacrylate polymer grafts on gold for the development of optical biosensors: an SPR investigation
JP2006321829A (ja) 共重合体およびその製造方法
CA2392080C (en) Blood-compatible polymer surfaces