CZ2020263A3 - Sada gelotvorných roztoků určená pro přípravu hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu k prevenci pooperačních komplikací souvisejících s vytvořením kolorektální anastomózy a její použití - Google Patents

Abstract

Sada alespoň dvou vodných gelotvorných roztoků určených pro přípravu biodegradabilního hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, která obsahuje alespoň dva vodné roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž roztok A a/nebo roztok B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, kde n je v rozmezí 2 až 5000, M je H+ nebo kation farmaceuticky přijatelné soli vybraný ze skupiny obsahující kation alkalického kovu, kovu alkalických zemin, a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHR1ArOH obecného vzorce II, kde Ar je fenylen a R1 ethylen, nebo Ar je indolyden a R1 je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a R1 je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, a zároveň roztok A a/nebo B obsahuje triclosan a hydroxypropyl-β-cyklodextrin, a její použití.

Description

Sada gelotvorných roztoků určená pro přípravu hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu k prevenci pooperačních komplikací souvisejících s vytvořením kolorektální anastomózy a její použití

Oblast techniky

Vynález se týká sady gelotvorných roztoků určené pro přípravu hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu k prevenci pooperačních komplikací souvisejících s vytvořením kolorektální anastomózy, které vznikají následkem anastomického průsaku (leaku), a mezi které patří zejména rozevření (dehiscence) kolorektální anastomózy a rozvoj infekce. Dále se týká použití sady, způsobu přípravy hydrogelu a jeho použití.

Dosavadní stav techniky

Kolorektální karcinom (KRK) je civilizační onemocnění. V České republice je zhoubný novotvar kolorekta jednou z nejčastějších onkologických diagnóz [1], Relativní pětileté přežití pacientů s kolorektálním karcinomem dosahovalo u případů diagnostikovaných v letech 2001 až 2005 okolo 50 % u obou pohlaví (počítáno ze všech hlášených případů, tedy léčených i z různého důvodu neléčených). V Evropské unii je incidence karcinomu rekta 15 až 25 nově diagnostikovaných nádorů na 100 000 obyvatel za rok. Mortalita je udávána mezi 4 až 10 pacienty na 100 000 obyvatel ročně s mírnou převahou mužské populace [2].

Mezi zákroky využívané při chirurgické léčbě KRK patří resekce postižené části střeva a následné vytvoření anastomózy (spojení). Mezi nej závažnější časné komplikace tohoto zákroku patří anastomický průsak (leak), který vede k úniku obsahu trávicí trubice mimo střevní lumen. Přítomnost střevních bakterií v oblasti malé pánve může způsobit infekci s lokalizovanými (absces v oblasti pánve), nebo generalizovanými (peritonitida, sepse) projevy. Průsak anastomózy může rovněž vést k dehiscenci (rozevření) anastomózy. Může se jednat o lokalizovaný problém nepostihující větší část obvodu anastomózy, ale může jít i o kompletní rozpad anastomózy. Takový stav ohrožuje pacienta na životě, je nutné ho řešit operativně a reálně hrozí, že pacient bude po zbytek života odkázán na umělý střevní vývod [1].

Mezi rizikové faktory vzniku anastomického průsaku příp. dehiscence anastomózy patří ischemie střeva v oblasti šicí linie, nadměrné napětí v anastomóze, přítomnost lokální sepse apod. Komplikace vznikají buď díky špatně technicky provedenému spojení (vznikají většinou do 48 hodin od operace), či častěji ze špatného hojení anastomózy. To se projeví obvykle mezi 4. až 6. pooperačním dnem, u velmi nízkých resekcí konečníku i později [1].

V současné době existuje řada operačních postupů, které se snaží minimalizovat vznik této komplikace, přesto k dehiscenci anastomózy dochází u 5 až 20 % operovaných pacientů [1]. Pro opětovné spojení trávicí trubice je využíváno takzvaných staplerů určených k rychlému a rovnoměrnému sešití tkáně [3], Jako doplněk či náhrada šicího materiálu je z důvodů zvýšení odolnosti gastrointestinálních anastomóz velmi často využíváno různých typů tkáňových lepidel [4-6], Jejich úkolem je zpevnit místo spoje trávicí trubice a jejich přítomnost má i omezit průsak obsahu střev do peritonea. V dané indikaci jsou nej častěji používána fibrinová lepidla, kyanoakryláty, hydrogely na bázi polyethylenglykolu a hydrogely na bázi želatiny [7, 8].

Klinicky je pro podporu hojení anastomózy v současné době nej častěji využíváno fibrinové lepidlo jehož využití má pravděpodobně skutečně pozitivní efekt na průběh hojení kolorektální anastomózy a zvýšení odolnosti spoje vůči průsaku anastomózy [9], Nicméně pokud i přes zvýšenou odolnost anastomózy dojde k perforaci střeva např. z důvodu jeho ischemizace vlivem nevhodné operační techniky, neposkytuje samotná přítomnost tkáňového lepidla žádnou další ochranu před možným rozvojem infekce.

- 1 CZ 2020 - 263 A3

Přes velké množství preklinických studií provedených s cílem ověřit efektivitu využití tkáňových lepidel při tvorbě kolorektální anastomózy, není jejich role zcela jednoznačná. Studie se většinou shodují vtom, že přítomnost tkáňového lepidla sníží nežádoucí průsak střevního obsahu mimo střevní lumen a krátkodobě zvýší pevnost spojení tkání [8], Větší rigidita spoje ale může bránit peristaltickým pohybům střeva, což může zvýšit nebezpečí obstrukce střeva. Využití kyanoakrylátů pak navíc může negativně ovlivnit hojení operační rány [6, 10], Z dlouhodobějšího hlediska nemusí být využití tkáňových lepidel, zejména materiálů na bázi kyanoakrylátů, v dané indikaci výhodné.

Ustek et al. [11] publikoval výsledky preklinické studie, kde popisuje využití liposolmálního jodovaného povidonu (PVP-I) kombinovaného s polyakrylátovým gelem [12], Publikace popisuje pozitivní vliv přítomnosti hydrogelu na hojení anastomózy, což je připisováno kombinaci vlhkého krytí vnitřní rány a širokospektrému antimikrobnímu účinku použitého PVP-I komplexu. Zmíněný hydrogel však neposkytuje mechanickou oporu anastomóze, ani není zmiňována jeho případná bariérová funkce, bránící průsaku obsahu trávicí trubice mimo její lumen.

Jako možná cesta urychlení hojení kolorektální anastomózy bylo rovněž preklinicky testováno využití kombinace hydrogelu s fibroblastovým růstovým faktorem [13] případně s frakcí plazmy bohaté na destičky (PRP) [14], V obou studiích byl pospán příznivý vliv zvýšené koncentrace sledovaných faktorů na hojení anastomózy. Nicméně tyto ani hydrogely neposkytují ochranu před rozšřením infekce v případě dehiscence anastomózy.

Jako prostředek bránící vzniku pooperační infekce v místě zákroku je v současné době možné využít šicí materiál s obsahem antiseptika triclosanu (TCS; např. VICRYL® Plus Antibacterial Suture). Meta-analýzy výsledků klinických studií porovnávajících výskyt pooperačních infekcí při využití šicího materiálu s obsahem a bez obsahu TCS skutečně prokazují snížení pravdopodobnosti vzniku infekce v případě využití šicího materiálu s obsahem této antimikrobiální látky [15, 16], V případě kolorektálních operacích zahrnuté studie popisovaly využití antimikrobiálního šicího materiálu pro uzavření dutiny břišní, resp. sešití abdominální fascie [17-20],

Triclosan (2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydifenylether) je antimikrobiální syntetická látka, špatně rozpustná ve vodě za to dobře rozpustná v polárních organických rozpouštědlech, (ethanol, chloroform, isopropanol). Jedná se o chemicky stabilní látku, která může být za normálních podmínek skladována řadu let [21],

Triclosan (komerční název Irgasan® TCS) se již téměř 50 let využívá jako přísada v řadě kosmetických a farmaceutických receptur. Původně byl využíván jako přísada do mýdel, sprchových gelů, prostředků pro ústní hygienu, ale také jako antiseptikum pro výrobu funkčních tkanin (chirurgické pláště) a plastů (kuchyňské potřeby, dětské hračky, antimikrobiální úprava povrchu zdravotnických prostředků). V důsledku extenzivního využití byl TCS zevrubně popsán z pohledu antimikrobiální účinnosti, akutní a chronické toxicity, mutagenity, reprodukční toxicity a teratogenity [22-25].

Triclosan má široké spektrum biocidní aktivity, které zahrnuje Gram pozitivní a Gram negativní nesporolující bakterie, některé druhy hub a kvasinek. Zároveň vykazuje antivirové účinky [22, 23], TCS vykazuje v závislosti na koncentraci jak bakteriostatické, tak baktericidní účinky [26], Při nižších koncentracích se projevuje především inhibiční efekt TCS na aktivitu enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase (Fabl), který je klíčovým enzymem pro syntézu mastných kyselin bakterií [27, 28], Při vyšších koncentracích TCS se na biocidním účinku podílí i nespecifické mechanismy působení bisfenolů, jako je např. poškození integrity membrán [29, 30],

Možnost inkorporace TCS do struktury hydrogelů je omezena jeho malou rozpustností ve vodě. Možným řešením je příprava inkluze TCS s cyklodextriny (CD) [31, 32], Tímto postupem byly připraveny např. triclosan obsahující supramolekulámí hydrogely na bázi pluronové kyseliny F-2CZ 2020 - 263 A3

127 a α-cyklodextrinu [33]. Na základě strukturních studií a vzhledem ke svému velice příznivému farmakologickému profilu se jako nej vhodnější kandidát pro přípravu vstřebatelných hydrogelů s obsahem inkluze TCS/CD jeví 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (ΗΡ-β-CD) [34, 35], Dokument US20170281781A1 popisuje, že cyklodextriny jsou schopny interagovat s povrchovými proteiny mukózy a přítomnost ve vodě rozpustných derivátů cyklodextrinů zvyšuje mukoadhezivní vlastnosti hydrogelů [36],

Hyaluronan je polysacharid, který se skládá z disacharidických jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a D-N-acetylglukosaminu vázaných alternujícími β-1,4 a β-1,3 glykosidickými vazbami. Hmotnostní průměr molekulové hmotnosti (pokud bude v dalším textu zmiňována molekulová hmotnost, bude se vždy jednat o hmotnostní průměr molekulové hmotnosti) in vivo bývá v rozsahu 3 kDa až 20 MDa. Jedná se o polysacharid, který je snadno rozpustný ve vodném prostředí, kde v závislosti na molekulové hmotnosti a koncentraci vytváří velmi viskózní roztoky. Hyaluronan je součástí téměř všech tkání a tělních tekutin obratlovců, přičemž se v hojné míře nachází především v pojivových tkáních. Jedná se o vysoce hygroskopickou molekulu, roztoky hyaluronanu jsou silně osmoticky aktivní a přítomnost hyaluronanu je mimo jiné důležitá pro hydrataci tkání [37],

Kromě toho je hyaluronan schopen modulovat zánětlivé reakce tkání, a to jednak prostřednictvím ovlivnění produkce cytokinů a jednak svým vlivem na adhezi cytokiny aktivovaných lymfocytů. Jeho antioxidační vlastnosti a schopnost vychytávat volné radikály působí snížení aktivity proteináz působících během zánětu, čímž hyaluronan přispívá ke stabilizaci postižené tkáně a podporuje její granulaci [37],

Kromě využití pro léčbu chronických ran, jsou přípravky na bázi hyaluronanu hojně využívány v oblasti prevence pooperačních srůstů. Roztoky hyaluronanu jsou používány k vyplnění dutiny břišní po chirurgických zákrocích. Přítomnost roztoku hyaluronanu má sloužit k mechanické separaci traumatizovaných povrchů vnitřních orgánů a tím bránit jejich srůstům. Nevýhodou využití těchto roztoků je krátký biologický poločas nemodifikovaného hyaluronanu, který neposkytuje dostatečně dlouho trvající ochranu před vznikem srůstů. S cílem vyřešit tento problém byly v minulosti navrženy hyaluronan obsahující gely a folie, které v místě účinku působí jako bariéra proti vzniku srůstů po delší časový úsek [37],

V minulosti byly rovněž vyvinuty různé typy derivátů hyaluronanu, které jsou schopny podstupovat přechod sol-gel za fyziologických podmínek in situ [38, 39], Pro tyto účely lze využít např. fenolické deriváty hyaluronanu. Calabro et al. [40-42] popisují ve spisech EP 1587945 Bia EP 1773943 B1 metodu přípravy hydroxyfenylového derivátů hyaluronanu reakcí karboxylů přítomných ve struktuře D-glukuronové kyseliny hyaluronanu, s aminoalkyl-deriváty fenolu např. tyraminem. Produktem této reakce jsou amidy hyaluronanu [43], Stejný dokument také popisuje, že zesítění hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu může být iniciováno přídavkem peroxidázy (např. křenové peroxidázy) a zředěného roztoku peroxidu vodíku. Křenová peroxidáza (Horseradish peroxidase, HRP, E.C. 1.11.1.7) je v současné době široce využívána jako katalyzátor organických a biotransformačních reakcí [44-48], Hydrogely na bázi hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu mohou být využívány jako injekčně aplikovatelné matrice pro řízené uvolňování látek nebo jako materiály vhodné pro kultivaci a implantaci buněk [49], Patentový dokument WO/2017/197262 popisuje využití tyraminovaného derivátu hyaluronanu pro přípravu hydrogelové matrice obsahující více typů rezervoárů biologicky aktivních látek. K zesítění hydrogelu rovněž využívá reakci zprostředkovanou křenovou peroxidázou. Wolfová et al. popisují ve spisu CZ 303879 konjugát hyaluronanu a tyraminu obsahující alifatický linker vložený mezi řetězec polymeru a tyramin. Přítomnost alifatického linkeru umožňuje vyšší efektivitu síťovací reakce a dodává síti vyšší elasticitu. Tento dokument rovněž popisuje možné využití hydrogelů na bázi příslušného derivátu jako biodegradabilní bariéry bránící vzniku pooperačních srůstů.

Přestože je hyaluronan hojně využíván jako materiál pro prevenci pooperačních srůstů, v případě prevence komplikací spojených s tvorbou kolorektální anastomózy, kde ve zvýšené míře hrozí

-3CZ 2020 - 263 A3 nebezpečí vzniku infekce a rozvoj peritonitidy, není využití materiálů na jeho bázi vždy výhodné. Hydrogel hyaluronanu zesítěný pomocí vícevazných železitých iontů (Intergel) byl v minulosti vyhodnocen jako materiál zvyšující virulenci některých bakteriálních kmenů a zvyšující riziko pooperačních komplikací [37, 50], Antiadhezivní membrány na bázi směsi hyaluronanu a karboxymethylcelulózy jsou kontraindikovány v případě jejich využití v přímém kontaktu se střevními anastomózami, pro přímý kontakt s linií stehu anastomózy a v případě klinicky manifestované infekce [51],

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je překonat nedostatky dosavadního stavu techniky a vyvinout prostředek pro přípravu biodegradabilního hydrogelu na bázi hyaluronanu obsahujícího antiseptickou látku za účelem prevence pooperačních komplikací spojených s vytvořením kolorektální anastomózy. Takovýmto prostředkem je sada gelotvomých roztoků určených pro přípravu hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, jejíž podstatou je, že obsahuje alespoň dva vodné roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž roztok A a/nebo roztok B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

kde n je v rozmezí 2 až 5000, M je H⁺ nebo kation farmaceuticky přijatelné soli vybraný ze skupiny obsahující kation alkalického kovu, kovu alkalických zemin, a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHRiArOH obecného vzorce II,

NH (Π), kde Ar je feny len a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, a zároveň roztok A a/nebo roztok B obsahuje triclosan a hydroxypropyl-β-cyklodextrin. Kation farmaceuticky přijatelné soli je s výhodou vybrán ze skupiny obsahující Na⁺, K⁺, Mg²⁺nebo Li⁺.

S výhodou je v sadě podle vynálezu aktivita křenové peroxidázy v rozsahu 0,5 až 1,5 U/ml, s výhodou 0,9 až 1,35 U/ml, výhodněji 0,8 až 1,2 U/ml, koncentrace peroxidu vodíku je v rozmezí 1 až 6 mmol/1, s výhodou 3 až 5 mmol/1, hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I má hmotnostně střední molámí hmotnost v rozmezí 60 000 g/mol až 2 000 000 g/mol, s výhodou 100 000 g/mol až 1 000 000 g/mol, výhodněji 200 000 g/mol až 400 000 g/mol; stupeň substituce v rozmezí 1 % až 10 %, s výhodou 1 % až 5 %, výhodněji 2 % až 4 % a koncentraci 10 až 50 mg/ml, s výhodou 15 až 25 mg/ml, výhodněji 20 mg/ml; a koncentrace triclosanu jev rozmezí 0,1 až 2,2 mg/ml, s výhodou 1 až 2,2 mg/ml, výhodněji 2 mg/ml a koncentrace

-4CZ 2020 - 263 A3 hydroxypropyl-β-cyklodextrinu je v rozmezí 4 až 100 mg/ml, s výhodou 25 až 80 mg/ml, výhodněji 60 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-β-cyklodextrinu je v rozmezí 1 : 4 až 1 : 10, s výhodou v rozmezí 1 : 5 až 1 : 8, výhodněji 1 : 6.

Polysacharidy, včetně hyaluronanu a z něj připravovaných derivátů, patří mezi polymery tvořené směsí různě dlouhých makromolekul a tvoří tak neuniformní (polydisperzní) systémy. Molámí hmotnost takových polymerů může být vyjádřena jako početně střední molámí hmotnost (Mn) nebo hmotnostně střední molámí hmotnost (Mw). Poměr těchto dvou typů středních molámích hmotností řetězců polymerů (Mw/Mn) vyjadřuje mim neunimorfity (polydisperzity) vzorku polymeru a je označován jako index polydisperzity (PI). PI hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, jak je uveden výše, je v rozmezí 1 až 3.

Výhodněji sada podle vynálezu zahrnuje roztok A, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 60 000 g/mol až 2 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 1 % až 10 %, přičemž je v koncentraci 10 až 50 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 1,5 U/ml, • Triclosan, který je v koncentraci 0,2 až 2,2 mg/ml, • Hydroxypropyl-β-cyklodextrin, který je v koncentraci 4 až 100 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-β-cyklodextrinu je v rozmezí 1 : 4 až 1 : 10.

a roztok B, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 60 000 g/mol až 2 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupňem substituce v rozmezí 1 % až 10 %, v koncentraci 10 až 50 mg/ml, • Peroxid vodíku, přičemž je v rozmezí koncentrace 1 až 6 mmol/1.

Dále výhodněji sada podle vynálezu zahrnuje roztok A, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 100 000 g/mol až 1 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 1 % až 5 %, přičemž je v koncentraci 15 až 25 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,9 až 1,35 U/ml, • Triclosan, který je v koncentraci 1 až 2,2 mg/ml, • Hydroxypropyl-β-cyklodextrin v koncentraci 25 až 80 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-β-cyklodextrinu se pohybuje v rozmezí 1 : 5 až 1 : 8.

a roztok B, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 100 000 g/mol až 1 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 1 % až 5 %, přičemž je v koncentraci 15 až 25 mg/ml,

-5CZ 2020 - 263 A3 • Peroxid vodíku, který je v rozmezí koncentrace 3 až 5 mmol/1.

A ještě dále výhodněji sada podle vynálezu zahrnuje roztok A, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 200 000 g/mol až 400 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 2 % až 4 %, v koncentraci 20 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,8 až 1,2 U/ml, • Triclosan, který je v koncentraci 2 mg/ml, • Hydroxypropyl-β-cyklodextrin, který je v koncentraci 60 mg/ml.

a roztok B, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 200 000 g/mol až 400 0000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 2 % až 4 %, přičemž je v koncentraci 20 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Dále podstata vynálezu také spočívá v použití sady podle vynálezu k přípravě biodegradabilního hydrogelů na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu v místě jeho účinku v oblasti malé pánve, kde vzniklý hydrogel slouží k prevenci pooperačních komplikací souvisejících s vytvořením kolorektální anastomózy. Pooperační komplikace související s vytvořením kolorektální anastomózy jsou vybrány ze skupiny obsahující anastomický průsak, rozevření (dehiscence) kolorektální anastomózy, rozvoj infekce v oblasti malé pánve a peritonea.

Dalším provedením vynálezu je způsob přípravy hydrogelů obsahujícího kovalentně zesíťený hydroxyfenylový derivát hyaluronanu, jehož podstata spočívá vtom, že se připraví odděleně alespoň dva roztoky A a B, jak byly popsány výše, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu o aktivitě v rozsahu 0,5 až 1,5 U/ml a roztok B obsahuje peroxid vodíku o koncentraci v rozmezí 1 až 6 mmol/1, přičemž roztok A a/nebo roztok B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, jak je popsán výše, kde jeho hmotnostně střední molámí hmotnost je v rozmezí 60 000 g/mol až 2 000 000 g/mol, stupeň substituce je v rozmezí 1 % až 10 %, a jeho koncentrace je v rozsahu 10 až 50 mg/ml, a zároveň roztok A a/nebo B obsahuje triclosan a hydroxypropyl-βcyklodextrin, načež se roztok A smíchá s roztokem B za vzniku hydrogelů obsahujícího kovalentně zesíťený hydroxyfenylový derivát hyaluronanu, který je určený k prevenci pooperačních komplikací vybraných ze skupiny obsahující rozpad kolorektální anastomózy, anastomický průsak, šíření infekce.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu je aktivita křenové peroxidázy v rozsahu 0,5 až 1,5 U/ml, s výhodou 0,9 až 1,35 U/ml, výhodněji 0,8 až 1,2 U/ml, koncentrace peroxidu vodíku je v rozmezí 1 až 6 mmol/1, s výhodou 3 až 5 mmol/1, hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I má hmotnostně střední molámí hmotnost v rozmezí 60 000 g/mol až 2 000 000 g/mol, s výhodou 100 000 g/mol až 1 000 000 g/mol, výhodněji 200 000 g/mol až 400 000 g/mol; stupeň substituce v rozmezí 1 % až 10 %, s výhodou 1 % až 5 %, výhodněji 2 % až 4 % a koncentraci 10 až 50 mg/ml, s výhodou 15 až 25 mg/ml, výhodněji 20 mg/ml; a koncentrace triclosanu je v rozmezí 0,2 až 2,2 mg/ml, s výhodou 1 až 2,2 mg/ml, výhodněji 2 mg/ml a koncentrace hydroxypropyl-β-cyklodextrinu je v rozmezí 4 až 100 mg/ml, s výhodou 25 až 80 mg/ml, výhodněji 60 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-βcyklodextrinu je v rozmezí 1 : 4 až 1 : 10, s výhodou v rozmezí 1 : 5 až 1 : 8.

-6CZ 2020 - 263 A3

Podle ještě dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu roztok A obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 60 000 g/mol až 2 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 1 % až 10 %, přičemž je v koncentraci 10 až 50 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 1,5 U/ml, • Triclosan, který je v koncentraci 0,2 až 2,2 mg/ml, • Hydroxypropyl-P-cyklodextrin, který je v koncentraci 4 až 100 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-β-cyklodcxtrinii je v rozmezí 1 : 4 až 1 : 10.

a roztok B obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 60 000g/mol až 2 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupňem substituce v rozmezí 1 % až 10 %, v koncentraci 10 až 50 mg/ml, • Peroxid vodíku, přičemž je v rozmezí koncentrace 1 až 6 mmol/1.

Podle ještě dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu roztok A obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 100 000 g/mol až 1 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 1 % až 5 %, přičemž je v koncentraci 15 až 25 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,9 až 1,35 U/ml, • Triclosan, který je v koncentraci 1 až 2,2 mg/ml, • Hydroxypropyl-P-cyklodextrin v koncentraci 25 až 80 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-β-cyklodextrinu se pohybuje v rozmezí 1 : 5 až 1 : 8.

a roztok B obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 100 000 g/mol až 1 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 1 % až 5 %, přičemž je v koncentraci 15 až 25 mg/ml, • Peroxid vodíku, který je v rozmezí koncentrace 3 až 5 mmol/1.

Podle ještě dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu roztok A obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 200 000 g/mol až 400 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 2 % až 4 %, v koncentraci 20 mg/ml,

-7CZ 2020 - 263 A3 • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,8 až 1,2 U/ml, • Triclosan, který je v koncentraci 2 mg/ml, • Hydroxypropyl-β-cyklodextrin, který je v koncentraci 60 mg/ml.

a roztok B obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 200 000 g/mol až 400 0000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 2 % až 4 %, přičemž je v koncentraci 20 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Podle ještě dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu se roztok A s roztokem B smíchá v objemovém poměm 1:1.

Ještě dalším provedením podle vynálezu je hydrogel připravitelný způsobem podle vynálezu, jak je uvedeno výše, který obsahuje:

kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát v koncetraci 10 až 50 mg/m, který vznikl zesítěním hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I

kde n je v rozmezí 2 až 5000, M je H⁺ nebo kation farmaceuticky přijatelné soli vybraný ze skupiny obsahující kation alkalického kovu, kovu alkalických zemin, a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHRiArOH obecného vzorce II,

NH Au 'OH

R :

ΝΗ' ~ (Π), kde Ar je feny len a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž po smísení alespoň dvou roztoků A a B dosahuje bodu gelace v rozmezí 5 až 70 s, s výhodou 15 až 60 s, výhodněji 25 až 50 s, přičemž nejdéle do 3 min po smísení roztoků dosahuje hodnota jeho elastického modulu 100 až 1000 Pa, s výhodou 100 až 600 Pa, výhodněji 100 až 500 Pa, a po dokončení procesu solidifikace je jeho elastický modulus v rozmezí 500 až 2000 Pa, s výhodou 600 až 1300 Pa, výhodněji 700 až 1200 Pa.

-8CZ 2020 - 263 A3

Kation farmaceuticky přijatelné soli je s výhodou vybrán ze skupiny obsahující Na⁺, K⁺, Mg²⁺nebo Lit

S výhodou hydrogel podle vynálezu obsahuje:

• Kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát 10 až 50 mg/ml, • Křenovou peroxidázu 0,25 až 0,75 U/ml, • Triclosan 0,1 až 1,1 mg/ml, • Hydroxypropyl-β-cyklodextrin 2 až 50 mg/ml.

Výhodněji se molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-β-cyklodextrinu (poměr TCS : ΗΡ-β-CD) pohybuje v rozmezí 1 : 4 až 1 : 10, přičemž po smísení roztoků A a B dosahuje bodu gelace v rozmezí 5 s až 70 s, dále nejdéle do 3 min po smísení roztoků dosahuje hodnota jeho elastického modulu 100 až 1000 Pa a po dokončení procesu solidifikace je jeho elastický modulus v rozmezí 500 až 2000 Pa.

Výhodněji hydrogel podle vynálezu obsahuje:

• Kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát v koncetraci 15 až 25 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,45 až 0,675 U/ml, • Triclosan o koncentraci 0,5 až 1,1 mg/ml, • Hydroxypropyl-β-cyklodextrin o koncentraci 12 až 38 mg/ml.

Ještě výhodněji se molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-β-cyklodextrinu (poměr TCS : ΗΡβ-CD) pohybuje v rozmezí 1 : 5 až 1 : 8, přičemž po smísení roztoků A a B dosahuje bodu gelace v rozmezí 15 s až 60 s, dále nejdéle do 3 min po smísení roztoků dosahuje hodnotajeho elastického modulu 100 až 600 Pa a po dokončení procesu solidifikace je jeho elastický modulus v rozmezí 600 až 1300 Pa

Ještě výhodněji hydrogel podle vynálezu obsahuje:

• Kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát v koncetraci 20 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,4 až 0,6 U/ml, • Triclosan o koncentraci 1 mg/ml, • Hydroxypropyl-β-cyklodextrino koncentraci 30 mg/ml.

Ještě výhodněji po smísení roztoků A a B dosahuje bodu gelace v rozmezí 25 s až 50 s, dále nejdéle do 3 min po smísení roztoků dosahuje hodnota jeho elastického modulu 100 až 500 Pa a po dokončení procesu solidifikace je jeho elastický modulus v rozmezí 600 až 1200 Pa.

Podle ještě dalšího výhodného provedení vynálezu se hydrogel podle vynálezu použije jako materiál pro výplň okolí kolorektální anastomózy k prevenci rozevření kolorektální anastomózy, anastomického průsaku a šíření infekce v důsledku anastomického průsaku.

Hydrogel vzniklý použitím sady podle vynálezu obsahuje antiseptickou látku, a slouží jako bariéra růstu bakterií v oblasti malé pánve a tím pomáhá předcházet pooperačním komplikacím vznikajících následkem anastomického průsaku a rozevření kolorektální anastomózy.

Hydrogely patří mezi viskoelastické materiály, jejichž komplexní reologické chování, tedy chování látek, které v sobě zahrnuje částečně jak viskózní, tak elastickou složku, lze vyjádřit tzv. komplexním modulem G*. V reologii se elastická složka deformace vyjadřuje tzv. elastickým (paměťovým) modulem (G') a viskózní složka tzv. viskózním (ztrátovým) modulem (G ). Matematicky lze tedy vyjádřit komplexní modul jako komplexní číslo skládající se z reálné a imaginární složky:

-9CZ 2020 - 263 A3

G* = G'+ iG a vzájemný vztah mezi G', G a G* je dán rovnicí:

|G*| = Vg'² + G²

Proces vzniku gelu je označován jako gelace. V popisovaném případě dochází ke vzniku hydrogelu z prekurzového roztoku polymeru, který obsahuje lineární řetězce polysacharidu. Probíhající chemickou reakcí dochází ke vzniku příčných vazeb mezi jednotlivými řetězci polymerů a tím ke vzniku polymemí sítě. Bodem gelace nazýváme okamžik, v němž se v systému právě objeví nekonečná trojrozměrná síť. Slovo „nekonečná“ je třeba chápat tak, že rozměry vzniklé sítě jsou totožné s rozměry makroskopické gelové fáze. Váhový podíl sítě je v bodě gelace ještě nepatrný, ale v dalším průběhu se rychle zvětšuje (hmotnost gelového podílu roste na úkor hmotnosti podílu rozpustného), což se projevuje postupným nárůstem elastického modulu vznikajícího hydrogelu.

Reologicky je tato změna vyjádřena takto: v bodu gelace viskozita kapaliny limitně směřuje do nekonečna, zatímco modul pružnosti nabývá nenulové hodnoty, jak je patrné z obr. 9. V bodě gelace mají elastický a viskózní modul stejnou hodnotu. Po dosažení bodu gelace není proces vzniku gelu dokončen. Jak pokračuje chemická reakce dochází k nárůstu polymemí sítě a ke zvyšování její rigidity, což se projevuje i nárůstem G . Po určité době však síťovací reakce ustane (např. z důvodů vyčerpání reaktantů) a polymemí síť se stabilizuje, dojde k dokončení procesu solidifikace gelu. Tento bod označujeme jako solidifikace a dobu k jeho dosažení označujeme v tomto textu jako T_soiid. Velikost elastického modulu po dokončení procesu tvorby gelu v tomto textu označujeme jako G'_s.

Předětem vynálezu je sada pro přípravu biodegradabilního hydrogelu na bázi hyaluronanu obsahujícího antibakteriální látku triclosan ve formě inkluze s hydroxypropyl-P-cyklodextrinem.

Sada podle vynálezu obsahuje alespoň dva vodné roztoky A a B, z nichž jeden obsahuje křenovou peroxidázu (roztok A) a dmhý peroxid vodíku (roztok B), přičemž alespoň jeden z roztoků obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu, a zároveň alespoň jeden z prekurzorových roztoků obsahuje triclosan ve formě inkluze s hydroxypropyl-P-cyklodextrinem. Smísením roztoků A a B popisovaného prostředku v poměru 1 : 1 vzniká hydrogel na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu (crossHA-TA), který se vyznačuje tím, že nejdéle do 3 min po smísení roztoků dosahuje hodnota jeho elastického modulu 100 až 1000 Pa a po dokončení procesu solidifikace je jeho elastický modul v rozmezí 500 až 2000 Pa. Hydrogel vzniká v místě aplikace (in situ) a podstupuje přechod sol-gel za fýziologických podmínek. Hydrogel je určen pro použití během chirurgického zákroku, kdy je schopen, bezezbytku vyplnit prostor malé pánve v bezprostřední blízkosti vytvořené kolorektální anastomózy. Rychlost solidifikace popisovaného prostředku umožňuje aplikaci dostatečného množtsví gelotvomé směsi do oblasti malé pánve, dokonalé vyplnění místa aplikace a vznik homogeně zesítěného hydrogelu v časovém úseku, který nadměrně neprodlužuje provedení chirurgického výkonu. Vzniklý hydrogel poskytuje dostatečnou mechanickou oporu vytvořené kolorektální anastomóze, ale zároveň nebrání peristaltickým pohybům střevní stěny.

Použití sady podle vynálezu umožňuje, aby použitý hydrogel byl schopen vyplnit ideálně celý prostor malé pánve a obklopit tak vytvořenou anastomózu. K tomuto účelu je vhodné využít hydrogely, které jsou schopny podstupovat přechod sol-gel přímo v místě aplikace za fýziologických podmínek. Rychlost procesu vzniku hydrogelu v místě aplikace, homogenita zesítění vznikajícího hydrogelu a jeho finální viskoelastické vlastnosti jsou důležitými parametry, které se podílejí na efektivitě prostředku. Příliš rychlý vznik hydrogelu nemusí vést k dokonalému vyplnění anatomicky členité oblasti malé pánve a homogenímu zesítění materiálu. Nehomogenní ze štítění může způsobit únik části materiálu z místa aplikace a omezit bariérovou fúnkci prostředku. Naopak pomalý vznik gelu může zbytečně zdržovat průběh chirurgického zákroku.

- 10CZ 2020 - 263 A3

Nedostečné zesítění hydrogelu, které se projeví jako nízká tuhost hydrogelu, může vést k selhání jeho bariérové funkce, protože může dojít kjeho migraci z místa aplikace. Naopak příliš silně zesítěné hydrogely, vykazující vysokou tuhost, mohou bránit přirozeným peristaltickým pohybům střeva, a narušovat tak jeho funkci. Sada podle vynálezu tedy umožňuje vznik hydrogelu, který homogeně vyplňuje prostor malé pánve, obklopuje vytvořenou anastomózu a nejdéle do 3 min po aplikaci dosahuje hodnota jeho elastického modulu 100 až 1000 Pa a po dokončení procesu solidifikace je jeho elastický modul v rozmezí 500 až 2000 Pa. Tyto podmínky mohou splnit hydrogely připravené z hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu obecného vzorce I, jak jsou specifikovány výše, které je možné zesítit prostřednictvím křenovou peroxidázou katalyzované reakce, a to i přesto, že bylo zjištěno, že přítomnost hydroxyproyl-β-cyklodextrinu zpomaluje rychlost gelace a efektivitu síťovací reakce (viz příklad 16, obr . 8).

Pro dosažení požadovaných vlastností bylo proto nutné zvolit vhodnou kombinaci koncentrace derivátu hyaluronanu, jeho molekulové hmotnosti, stupně substituce, koncentrace peroxidu vodíku a aktivity křenové peroxidázy. Reakce je iniciována přídavkem peroxidu vodíku, takže přípravu hydrogelu lze provést smísením dvou roztoků hydroxyfenylvého derivátu hyaluronanu obecného vzorce I, jak jsou specifikovány výše, kdy jeden z nich obsahuje peroxid vodíku a druhý křenovou peroxidázu. Při zajištění dostatečného promísení obou prekurzorových roztoků (např. využitím statického mixéru) lze připravit i velké objemy homogeně zesítěného hydrogelu.

Hydrogely obecně samy o sobě nemusí představovat efektivní bariéru proti šíření infekce, protože je obecně známo, že některé typy hydrogelů jsou používány jako vhodné substráty pro kultivaci bakterií [52, 53], Kolonizace hydrogelu bakteriemi by fakticky vedla k selhání funkce prostředku, protože by nebránil rozvoji infekce v oblasti malé pánve a jejímu případnému rozšíření do peritonea. Kolonizaci hydrogelu lze předcházet kombinací s vhodnými antibakteriálními látkami [54], V tomto případě byl jako antimikrobiální látka zvolen triclosan ve formě inkluze s 2hydroxypropyl-β-cyclodextrinem. Experimenty in vitro prokázaly, že hydrogely obsahující triclosan ve formě inkluze vykazují in vitro antimikrobiální účinky a že nedochází k jejich osídlení mikroorganismy.

Vstřebatelnost (biodegradabilita) materiálu je v oblasti vývoje medicínských prostředků určených pro implataci do organismu pacienta považována za technicky výhodné řešení [55], I v tomto případě je výhodné, aby se hydrogel po splnění svého účelu vstřebal a nevyžadoval další operační zákrok nutný kjeho odstranění. Tuto vlastnost vykazují i hydrogely na bázi enzymaticky zesítěných hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu podle vynálezu.

Na druhou stranu hydrogel podle stávajícího vynálezu má po dobu několika dnů (2 až 6 dní, popř. i více dní po operačním zákroku [1]) působit jako bariéra pro šíření infekce v oblasti malé pánve, kde je, v případě průsaku střevního obsahu mimo lumen trávicí trubice nebo při dehiscenci anastomózy, vystaven působení střevní mikroflóry. Ta produkuje řadu různých typů enzymů (proteázy[56], gylkosidázy - heparinázy, chondroitinázy, hyaluronidázy), které mohou působit degradaci biopolymerů včetně glykosaminglykanů, mezi než patří i hyaluronan [57], Předčasná degradace hydrogelu v místě aplikace by vedla ke ztrátě jeho bariérové funkce a ztrátě jeho účinku. Působení enzymů střevní mikroflóry nezabrání ani využití kombinace s antibakteriálně působícími láktami, protože ty samy osobě nebrání působení bakteriálních hydroláz, které mohou do postižené oblasti pronikat z poškožené trávicí trubice. Během vývoje hydrogelu podle vynálezu bylo prokázáno, že odolnost vyvíjeného materiálu vůči působení hydrolytických enzymů (např. hyaluronidázy) atedy i rychlost jeho degradace lze řídit hustotou zesítění polymerní sítě hydrogelu. Bylo zjištěno, že s rostoucím elastickým modulem G', jehož hodnata odráží hustotu zesítění gelu, roste odolnost připravených hydrogelů vůči působení hydrolytických enzymů (např. hyaluronidázy) a prodlužuje se doba jejich degradace. Dále bylo zjištěno, že přítomnost inkluze TCS/HPT-CD v hydrogelu dále zvyšuje odolnost hydrogelů vůči působení hydrolytických enzymů (např. hyaluronidázy) oproti hydrogelům srovnatelného stupně zesítění (srovnatelné G' a koeficinet bobtnání Q) bez obsahu TCS/HP^-CD. Jedná se výhodnou vlastnost, protože

-11CZ 2020 - 263 A3 prodlužuje dobu, po kterou hydrogel může plnit svoji bariérovou funkci i u hydrogelů s relativně nižším G', jejichž konzistence nebrání peristaltickým pohybům střeva.

Během experimentů prováděných na modelu dehiscence (rozevření neboli rozestup) kolorektální anastomózy prasat, bylo zjištěno, že přítomnost výše popsaného hydrogelu podle stávajícího vynálezu obklopujícího kolerektální anastómozu a vyplňujícího oblast malé pánve, brání rozvoji pooperčaních komplikací spojených s průsakem střevního obsahu mimo střevní lumen (peritonitida či rozvoj sepse), a to i v případě, že v blízkosti vytvořené anastomózy byla z experimetálních důvodů vytvořena perforace střeva simulující částečnou dehiscenci (rozpad) anastomózy. Na rozdíl od prostředků dosavadního stavu techniky (tkáňová lepidla), které jsou aplikovány za účelem zvýšení mechanické odolnosti vytvořeného spojení trávicí trubice, hydrogel podle vynálezu působí i při vzniku průsaku anastomózy či při rozvoji částečné dehiscenci (rozevření neboli rozestupu) anastomózy, protože kromě toho, že působí jako opora anastomózy a částečně brání jejímu mechanickému poškození, tak především působí jako bariéra bránící úniku střevního obsahu z lumen tračníku a jeho rozšíření v oblasti malé pánve. Přítomné antiseptikum triclosan brání kolonizaci hydrogelu a oblasti malé pánve bakteriemi střevní mikroflóry, rozvoji peritonitidy a dalších pooperačních komplikací. Stupeň zesítění popisovaného hydrogelu brání předčasné degradaci hydrogelu působením hydrolytických enzymů produkovaných bakteriemi střevní mikroflóry, nebrání však postupnému kompletnímu vstřebání hydrogelu po splnění jeho funkce.

Termínem „hyaluronan“ se míní kyselina hyaluronová, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Objasnění výkresů

Obr. 1: Graf znázorňuje rozdíly v rychlosti poklesu hmotnosti hydrogelů při degradaci hyaluronidázou v závislosti na efektivitě jejich zesítění.

Obr. 2: Antimikrobiální účinek testovaných vzorků na bakteriální kmen Staphylococcus aureus.

Obr. 3: Antimikrobiální účinek testovaných vzorků na bakteriální kmen Escherichia coli.

Obr. 4: Antimikrobiální účinek testovaných vzorků na kvasinku Candida albicans.

Obr. 5: Antimikrobiální účinek testovaných vzorků na kvasinku Clostridium sporogenes.

Obr. 6: 6A - prototyp prostředku skládajícího se z roztoku A a B; 6B - kolorektální anastomóza na modelu prasete; 6C - mála pánev prasete vyplněná hydrogelem

Obr. 7: Aplikace hydrogelu do malé pánve prasete

Obr. 8: Vliv ΗΡ-β-CD na přípravu gelů na bázi HA-TA

Obr. 9: Změna elastického a viskózního modul gelu v průběhu gelace.

Příklady uskutečnění vynálezu

DS = stupeň substituce = 100 % * molámí množství modifikovaných disacharadických jednotek hyaluronanu / molámí množství všech disacharadických jednotek derivátu hyaluronanu. Stupeň substituce byl stanoven pomocí Ή NMR spektroskopie.

Hmotnostně střední molámí hmotnost (Mw) a index polydisperzity (Pl) byly stanoveny metodou SEC-MALLS. Koncentrace triclosanu a aktivita HRP byly stanoveny spektrofotometricky.

- 12CZ 2020 - 263 A3

Kinetika gelace

Kinetika gelace byla stanovena pomocí rotačního reometru AR-G2 (TA instruments) za využití uspořádání deska-deska s vrchní geometrií o průměru 40 mm a nastavení mezery 400 pm. Prekurzorové roztoky A (250 pl) a B (250 pl) jsou nadávkovány na spodní stacionární desku a pro jejich homogenizaci je použito předmíchání (pre-shear) 2000 1/s po dobu 1 s. Kinetika gelace je stanovena metodou časové oscilace (an oscillation time sweep) při frekvenci 1 Hz a posunu 0,001 rad při 37 °C. Čas gelace je stanoven jako průsečík elastického a viskózního modulu a elastický modul pro porovnání jednotlivých vzorků mezi sebou je odečten ve 3 minutách od započetí experimentu (n = 3 až 5).

Viskoelastické vlastnosti

Pro testování byly připraveny hydrogely o celkovém objemu l,7±0,3 ml (n = 3 až 5) a ponechány zrát 1 hodinu. Viskoelastické vlastnosti hydrogelů byly stanoveny pomocí rotačního reometru ARG2 za využití „cross-hatch“ geometrie se zdrsnělým povrchem zabraňující vyklouznutí připraveného hydrogelu. Měření bylo provedeno ve „strain sweep“ módu při frekvenci 1 Hz a posunu v rozmezí 0,001 až 2 rad. Pro účely této přihlášky sloužilo měření ke stanovení elastického modulu gelů po ukončení solidifikace (G'_s).

Příklad 1 Syntéza tyraminovaného derivátu HA (HA-TA)

Příkad 1A: Syntéza 6-amino-N-[2(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamidu

6-[(terc-butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán l,l'-karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,59 g, 4,3 mmol). Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

m = 0,75 g (70 % teoretického výtěžku)

Ή NMR (D?O, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, y-CH2-hexanové kyseliny); 1,48 (m, 2 H, P-CH2-hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, ó-QE-hexanové kyseliny); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH₂-NH₂); 3,42 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, arom); 7,13 (d, 2 H, arom).

¹³C NMR(D2O. ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (β-Chexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (Cl arom); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).

Příklad 1B: Příprava aldehydického derivátu (HA-CHO)

Hylauronan (10,00 g, M_w. = 2 MDa) byl rozpuštěn v 750 ml 2,5% (w/w) roztoku Na2HPO₄ . 12 H2O. Roztok byl vychlazen na 5 °C. K vzniklému roztoku bylo přidáno 2,60 g NaBr a 0,05 g 4acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-l-oxylu. Po důkladné homogenizaci roztoku byly k reakční směsi přidány 3 ml roztoku NaClO (10 až 15 % dostupného CI2). Reakce pokračovala za

- 13CZ 2020 - 263 A3 stálého míchání 15 min. Reakce byla ukončena přídavkem 100 ml 40% roztoku propan-2-olu. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován precipitací propan-2-olem.

IČ (KBr): 3417, 2886,2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm¹.

Ή NMR (Ρ₂Ο) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 5,27 (geminální glykol -CH-(OH)2).

Příklad 1 C: Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 80 000 g/mol, DS ~ 3 %)

Aldehydický derivát HA (~ 60 kDa, DS = 9 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6amino-N-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid [meziprodukt (I)] (1,25 g, 5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při teplotě místnosti. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr):: 3425,2893,2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ-ΟΕ- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-QL- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

SEC MALLS: Mw = 83 000 g/mol; Pl = 1,61

DS (¹HNMR): 2,7 %

Příklad ID: Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 300 000 g/mol, DS » 2%)

Aldehydický derivát HA (Mw » 300 kDa, DS ~ 9 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-N-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid [meziprodukt (I)] (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při teplotě místnosti. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr): 3425,2893,2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 H, Y-CH2-aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny)l,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-QL- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H, arom).

SEC MALLS: Mw = 281 000 g/mol; Pl = 1,49,

- 14CZ 2020 - 263 A3

DS (Ή NMR): 2,3 %

Příklad IE: Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 1 000 000 g/mol, DS » 1 %)

Aldehydický derivát HA (-1500 kDa, DS = 4 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6amino-N-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid [meziprodukt (I)] (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při teplotě místnosti. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr): 3425,2893,2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny)l,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-QL- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, IH, anomer), 4,54 (s, IH anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

SEC MALLS: Mw = 1 000 000 g/mol; PI = 1,65

DS (‘HNMR): 0,9 %

Příklad 1F: Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 2 000 000 g/mol DS » 1 %)

Aldehydický derivát HA (-100 kDa, DS = 10 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6amino-N-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid [meziprodukt (I)] (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při teplotě místnosti. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr): 3425,2893,2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2-aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2-aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-QL- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, IH, anomer), 4,54 (s, IH anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

SEC MALLS: Mw = 1 800 000 kDa; PI = 1,55

DS ('HNMR): 1,0 %

Příklad 1G: Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 700 000 g/mol, DS = 3 %)

Aldehydický derivát HA (-2500 kDa, DS = 4 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6

- 15CZ 2020 - 263 A3 amino-N-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid [meziprodukt (I)] (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při teplotě místnosti. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr): 3425,2893,2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm¹.

Ή NMR (D₂O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2-aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2-aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, PI1-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-CH2-aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

SEC MALLS: Mw = 700 000 g/mol; Pl = 1,65,

DS (¹HNMR): 3,2 %.

Příklad II: Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 90 000 g/mol, DS = 7 %)

Aldehydický derivát HA (-2500 kDa, DS = 4 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6amino-N-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid [meziprodukt (I)] (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při teplotě místnosti. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr): 3425,2893,2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2-aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2-aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, PI1-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-QL- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H, arom).

SEC MALLS: Mw = 91 000 g/mol; Pl = 1,65,

DS (¹HNMR): 7,2 %.

Příklad 2: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle postupu podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce.

Roztok A HRP..........................................0,846 U/ml HA-TA.........................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin.............60 mg/ml Triclosan....................................1,44 mg/ml

Roztok B H2O2..........................3,3 mmol/1 HA-TA.........................20 mg/ml

Tabulka 1: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

-16CZ 2020 - 263 A3

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (GT min) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v tabulce 2.

HRP (U/ml)	0,423
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	30
Triclosan (mg/ml)	0,72
Tg (s)	65
G 3 min (P^-)	105
G's (Pa)	591
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 9

Tabulka2: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 3: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 3

Roztok A HRP..............................................1,2 U/ml HA-TA.........................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin.............60 mg/ml Triclosan.....................................2,04 mg/ml

Roztok B H2O2......................4,66 mmol/1 HA-TA......................20 mg/ml

Tabulka 3: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G'3 min)a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v tabulce 4.

HRP (U/ml)	0,6
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	30
Triclosan (mg/ml)	1,02
Tg(s)	28
G 3 min (Pa)	440
G's (Pa)	1118
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 6

Tabulka 4: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 4: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 5

-17CZ 2020 - 263 A3

Roztok A HRP..........................................0,835 U/ml HA-TA..........................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin.............60 mg/ml Triclosan.....................................2,0 mg/ml

Roztok B H2O2........................4,66 mmol/1 HA-TA........................20 mg/ml

Tabulka 5: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G'3 min)a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v tabulce 6.

HRP (U/ml)	0,418
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	30
Triclosan (mg/ml)	1,0
Tg (s)	38
G 3 min (P^-)	290
G's (Pa)	1051
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 6

Tabulka 6: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 5: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 7

Roztok A HRP...........................................1,08 U/ml HA-TA..........................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin.............60 mg/ml Triclosan.....................................2,02 mg/ml

Roztok B H2O2........................4,66 mmol/1 HA-TA........................20 mg/ml

Tabulka 7: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G'3 min) a po ukončení solidifikace (G's) jsou uvedeny v tabulce 8.

HRP (U/ml)	0,54
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	30
Triclosan (mg/ml)	1,01
Tg(s)	28
G 3 min (Pa)	430
G's (Pa)	1122
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 6

Tabulka 8: Složení a parametry připraveného hydrogelu

- 18CZ 2020 - 263 A3

Příklad 6: Příprava hydrogelů smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 9

Roztok A HRP............................................1,17 U/ml HA-TA..........................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin.............60 mg/ml Triclosan.....................................1,88 mg/ml

Roztok B H2O2........................4,66 mmol/1 HA-TA........................20 mg/ml

Tabulka 9: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelů

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelů včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (GT min) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v tabulce 10.

HRP (U/ml)	0,59
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	30
Triclosan (mg/ml)	0,94
Tg(s)	31
G 3 min (P^-)	394
G's (Pa)	1126
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 7

Tabulka 10: Složení a parametry připraveného hydrogelů

Příklad 7: Příprava hydrogelů smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 11

Roztok A HRP...........................................1,31 U/ml HA-TA.........................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin..............60 mg/ml Triclosan.....................................1,87 mg/ml

Roztok B H2O2............................4,66 mmol/1 HA-TA........................20 mg/ml

Tabulka 11: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelů

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelů včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (GT min) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v tabulce 12.

HRP (U/ml)	0,66
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	30
Triclosan (mg/ml)	0,94

- 19CZ 2020 - 263 A3

Tg(s)	30
G 3 min (P^-)	401
G's (Pa)	1127
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 7

Tabulka 12: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 8: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 13

Roztok A

HRP...........................................1,13 U/ml

HA-TA.........................................20mg/ml

Hydroxypropyl-β-cyklodextrin.............60mg/ml

Triclosan.....................................1,86mg/ml

Roztok B H2O2.........................4,66 mmol/1

HA-TA.........................20 mg/ml

Tabulka 13: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G'3 min) a po ukončení solidifikace (G's) jsou uvedeny v tabulce 14.

HRP (U/ml)	0,56
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	30
Triclosan (mg/ml)	0,93
Tg(s)	36
G 3 min (Pa)	293
G's (Pa)	1055
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 7

Tabulka 14: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 9: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 15

Roztok A HRP............................................1,12 U/ml HA-TA..........................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin..............60 mg/ml Triclosan.....................................2,08 mg/ml

Roztok B H2O2..........................4,66 mmol/1 HA-TA..........................20 mg/ml

Tabulka 15: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot

-20CZ 2020 - 263 A3 gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G'₃ min) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v tabulce 16.

HRP (U/ml)	0,56
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	30
Triclosan (mg/ml)	1,04
Tg (s)	28
G 3 min (P^-)	349
G's (Pa)	1110
poměr TCS : ΗΡ-β-CD	1 : 6

Tabulka 16: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 10: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 17

Roztok A HRP...........................................0,52 U/ml HA-TA..........................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin..............4 mg/ml Triclosan.....................................0,20 mg/ml

Roztok B H2O2..........................1,33 mmol/1 HA-TA.........................20 mg/ml

Tabulka 17: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G'₃ min) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v tabulce 18.

HRP (U/ml)	0,26
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	2
Triclosan (mg/ml)	0,10
Tg (s)	50
G 3 min (Pa)	488
G's (Pa)	1081
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 4

Tabulka 18: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 11: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu 1F. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 19

-21 CZ 2020 - 263 A3

Roztok A HRP.................................... HA-TA.................................	......0,72 U/ml .........10 mg/ml	Roztok B H2O2............... HA-TA............	..........2,33 mmol/1 .............10 mg/ml
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin..... Triclosan...............................	........6 mg/ml .....0,20 mg/ml

Tabulka 19: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G'₃ min) a po ukončení solidifikace (G's) jsou uvedeny v tabulce 20.

HRP (U/ml)	0,36
crossHA-TA (mg/ml)	10
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	8
Triclosan (mg/ml)	0,10
Tg (s)	43
G 3 min (P^-)	506
G's (Pa)	1060
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 6

Tabulka 20: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 12: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu 1E. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 21

Roztok A HRP.....................................0,72 U/ml HA-TA.................................10 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin........8 mg/ml Triclosan................................0,20 mg/ml

Roztok B H2O2.................................2,33 mmol/1 HA-TA.................................10 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin... .8 mg/ml Triclosan...........................0,20 mg/ml

Tabulka 21: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G'₃ min) a po ukončení solidifikace (G's) jsou uvedeny v tabulce 22.

HRP (U/ml)	0,36
crossHA-TA (mg/ml)	10
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	8
Triclosan (mg/ml)	0,20
Tg(s)	35
G 3 min (Pa)	549
G's (Pa)	994
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 8

Tabulka 22: Složení a parametry připraveného hydrogelu

-22CZ 2020 - 263 A3

Příklad 13: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA- připravený podle 5 příkladu 1G. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 21.

Roztok A HRP.........................................1,12 U/ml HA-TA......................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin...........30 mg/ml Triclosan......................................1 mg/ml

Roztok B H2O2..............................4,66 mmol/1 HA-TA..............................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin..30 mg/ml Triclosan.............................1 mg/ml

Tabulka 21: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu io Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (GT min) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v tabulce 22.

HRP (U/ml)	0,56
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	30
Triclosan (mg/ml)	1
Tg(s)	16
G 3 min (P^-)	588
G's (Pa)	1850
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 6

Tabulka 22: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 14: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (připravený podle příkladu II). Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 21.

Roztok A	Roztok B
HRP...........................1,12 U/ml	H2O2...........................2,33 mmol/1
HA-TA.........................40 mg/ml	HA-TA..........................40 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin..............40 mg/ml Triclosan.........................................2 mg/ml

Tabulka 21: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot 30 gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (GT min) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v tabulce 22.

-23CZ 2020 - 263 A3

HRP (U/ml)	0,6
crossHA-TA (mg/ml)	40
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	20
Triclosan (mg/ml)	1
Tg(s)	37
G 3 min (P^-)	830
G's (Pa)	1530
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 4

Tabulka 22: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 15: Příprava hydrogelu smísením roztoků A a B prostředku

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu 1C. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulce 21.

Roztok A HRP.............................1,12 U/ml HA-TA..........................20 mg/ml

Roztok B H2O2...............................2 mmol/1 HA-TA..........................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin..............80 mg/ml Triclosan.........................................2 mg/ml

Tabulka 21: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu

Hydrogel byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA), hydroxypropyl-β-cyklodextrin a triclosan. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (GH min) a po ukončení solidifikace (G's) jsou uvedeny v tabulce 22.

HRP (U/ml)	0,6
crossHA-TA (mg/ml)	20
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin (mg/ml)	40
Triclosan (mg/ml)	1
Tg(s)	35
G 3 min (Pa)	387
G's (Pa)	850
poměr TCS : ΗΡ-β-CD (mol/mol)	1 : 8

Tabulka 22: Složení a parametry připraveného hydrogelu

Příklad 16: Vliv hustoty zesítění hydrogelu a přítomnosti inkluze TCS/HP^-CD na rychlost jeho degradace pomocí hyaluronidázy in vitro

Byly připraveny 3 typy hydrogelů bez obsahu inkluze TCS/HP^-CD (Typ A, B, C), které se lišily svými viskoelastickými vlastnostmi a koeficientem bobtnání. Pro jejich přípravu hydrogelů byl použit hydroxyfenylový derivát hyaluronanu o Mw 281 000 g/mol a DS 2,2%. Koncentrace činidel použitých pro přípravu hydrogelů jsou uvedeny v tabule 23. Hustota zesítění a tím i viskoelastické vlastnosti hydrogelů byly regulovány koncentraci síťovacích činidel - HRP aH2O2. Dále byl, podle příkladu 8 připraven hydrogel s obsahem inkluze TCS/HP^-CD (Typ D).

-24CZ 2020 - 263 A3

Viskoelastické vlastnosti

Viskoelastické vlastnosti hydrogelů byly stanoveny pomocí rotačního reometru AR-G2 (TA Instruments) pomocí metody strain sweep při konstantní hodnotě frekvence 1 Hz a posunu (displacement) v rozmezí 10^-3 až 2 radiány při teplotě 25 °C. Aby nedocházelo k vyklouznutí připravených hydrogelů během měření, byla použita geometrie s hrubším povrchem (crosshatched). Pro stanovení byly připraveny hydrogely o průměru 17,5 mm. Hydrogely byly hodnoceny po uplynutí 60 minut od přípravy tedy poté, co dosáhly solidifikace. V následující tabulce jsou uvedeny viskoelastické vlastnosti (elastický G) hydrogelů.

Bobtnavost

Hydrogely byly ponořeny do fyziologického roztoku (0,9 % NaCl) a byly ponechány bobtnat 24 h v inkubátoru při teplotě 37° C. Hydrogely byly zváženy. Stupeň bobtnání byl stanoven na základě výpočtu dle vzorce ₌ m_s - m₀ m₀ kde Q je koeficient bobtnání, m₀ je hmotnost gelu po jeho přípravě a m_s je hmotnost gelu po rozbobtnání do rovnováhy.

	Koncentrace po smísení roztoků A a B
Typ gelu	HA-TA (mg/ml)	HRP (U/ml)	H2O2 (mmol/1)	TCS (mg/ml)	ΗΡ-β-CD (mg/ml)	Průměr θ (Pa)	m0 (mg)	ms (mg)	Q
Typ A	20	0,04	0,16	0	0	387	406	968	1,38
TypB	20	0,08	0,33	0	0	1156	427	590	0,38
TypC	20	0,16	0,65	0	0	3001	410	390	-0,05
TypD	20	0,56	2,28	1	30	1167	423	592	0,4

Tabulka 23: Hodnoty elastických modulů a stupně bobtnání připravených hydrogelů.

Rychlost degradace

Nabobtnalé gely byly přemístěny do dalších lékovek, kam bylo přidáno degradační médium (1 ml roztoku obsahujícího bovinní testikulámí hyaluronidázu o aktivitě 480 U/ml). Degradace gelů se prováděla při 37 °C za současného míchání. Během experimentu byla hmotnost hydrogelů stanovována každých 30 min do jejich úplné degradace.

Výsledky

Nejnižší hodnotu G' a nejvyšší koeficient bobtnání vykazuju hydrogel A, z čehož lze odvodit, že rovněž dosahuje nejmenšího stupně zesítění. Nejvyšší stupeň zesítění naopak vykazuje hydrogel C. Hydrogely B a D se sice liší obsahem inkluze TCS/HP-P-CD, ale na základě srovnatelných hodnot G'a Q, lze odvodit, že vykazují i srovnatelný stupeň zesítění.

Design experimentu umožňuje relativní srovnání odolnosti připravených hydrogelů vůči působení hydrolytického enzymu in vitro. Z grafů (viz obr. 1) je zřejmé, že nejrychleji podléhal enzymatické degradaci hydrogel A zatímco nejodolnější byl hydrogel C. Výsledky potvrzují, že rychlost degradace hydrogelů je závislá na hustotě zesítění hydrogelů, jejíž mírou jsou viskoelastické vlastnosti hydrogelů a stupeň jejích bobtnání. Rychlost degradace hydrogelu D byla v porovnání s hydrogelem B výrazně nižší, a to i přesto, že oba typy hydrogelů vykazovaly obdobný stupeň

-25CZ 2020 - 263 A3 zesítění. Možnou příčinou je přítomnost inkluze TCS/HP-β-CD ve struktuře hydrogelů D, která může způsobovat zpomalení enzymatické degradace hydrogelů.

Příklad 17: Vliv přítomnosti ΗΡ-β-CD na rychlost gelace a elastický modul hydrogelů připraveného z HA-TA

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulkách 24 až 27:

Roztok A	Roztok B
HRP.........................	...................0,8 U/ml	H2O2..............	........3,3. mmol/1
HA-TA.....................	....................20 mg/ml	HA-TA..........	..........20 mg/ml

Tabulka 24: Složení roztoků A a B pro přípravu hydrogelů I bez obsahu ΗΡ-β-CD

Roztok A		Roztok B
HRP.....................................	.......0,8 U/ml	H2O2...............	.........3,3 mmol/1
HA-TA.................................	.......20 mg/ml	HA-TA...........	...........20 mg/ml
Hydroxypropyl-β-cyklodextri n......	......0,6 mg/ml

Tabulka 25: Složení roztoků A a B pro přípravu hydrogelů II s obsahem ΗΡ-β-CD 0,3 mg/ml

Roztok A HRP............................................0,8 U/ml HA-TA.........................................20 mg/ml Hydroxypropyl-β-cyklodextrin..............6 mg/ml

Roztok B H2O2........................3,3 mmol/1 HA-TA.....................20 mg/ml

Tabulka 26: Složení roztoků A a B pro přípravu hydrogelů III s obsahem ΗΡ-β-CD 3 mg/ml

Roztok A HRP.....................................	......0,8 U/ml	Roztok B H2O2..............	.........3,3mmol/l
HA-TA..................................	.......20 mg/ml	HA-TA...........	............20 mg/ml
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin......	.......60 mg/ml

Tabulka 27: Složení roztoků A a B pro přípravu hydrogelů IV s obsahem ΗΡ-β-CD 30 mg/ml

Výsledky:

	I	II	III	VI
HRP (U/ml)	0,4	0,4	0,4	0,4
crossHA-TA (mg/ml)	20	20	20	20
ΗΡ-β-CD (mg/ml)	0	0,3	3	30
Tg (s)	6	6	8	22
G 3 min (P^-)	2296	2078	1708	673

Tabulka 28: Složení a parametry připravených hydrogelů I až IV vzniklých smícháním roztoků A s B dle tabulek 24 až 27, jak jsou výše.

S rostoucí koncentrací ΗΡ-β-CD v gelotvomé směsi klesá rychlost a efektivita síťovací reakce, což se projevu prodloužením Tg a G , min.

Příklad 18: Antimikrobiální působení hydrogelů obsahujících triclosan in vitro

Příprava hydrogelů pro antimikrobiální testy:

-26CZ 2020 - 263 A3

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA připravený podle příkladu ID. Koncentrace jednotlivých složek roztoku A a B jsou uvedeny v tabulkách 29 až 33:

	Roztok A HRP..................................... HA-TA..................................	.......1,13 U/ml .........20 mg/ml	Roztok B H2O2............... HA-TA...........	...........4,66 mmol/1 .............20 mg/ml
5	Tabulka 29: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu bez obsahu TCS
	Roztok A HRP..................................... HA-TA.................................. Hydroxypropyl-β-cyklodextri n...... Triclosan................................	......1,13 U/ml .......20 mg/ml .........6 mg/ml ......0,2 mg/ml	Roztok B H2O2.............. HA-TA...........	.........4,66 mmol/1 ...........20 mg/ml

Tabulka 30: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu s obsahem TCS ίο 0,1 mg/ml

Roztok A		Roztok B
HRP.....................................	......1,13 U/ml	H2O2................	...........4,66 mmol/1
HA-TA..................................	.......20 mg/ml	HA-TA............	.............20 mg/ml
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin......	........30 mg/ml
Triclosan................................	........1 mg/ml

Tabulka 31: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu s obsahem TCS 0,5 mg/ml

Roztok A		Roztok B
HRP.....................................	........1,13 U/ml	H2O2................	...........4,66 mmol/1
HA-TA..................................	........20 mg/ml	HA-TA............	.............20 mg/ml
Hydroxypropyl-β-cyklodextrin......	.........48 mg/ml
Triclosan................................	......1,6 mg/ml

Tabulka 32: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu s obsahem TCS 0,8 mg/ml

Roztok A HRP.......................................	.........1,13 U/ml	Roztok B H2O2..............	.........4,66 mmol/1
HA-TA................................... Hydroxypropyl-β-cyklodextrin....... Triclosan.................................	.........20 mg/ml .........60 mg/ml ........2,0 mg/ml	HA-TA...........	............20 mg/ml

Tabulka 33: Složení prekurzorových roztoků A a B pro přípravu hydrogelu s obsahem TCS 1 mg/ml

Hydrogely byly připraveny smísením roztoků A a B v objemovém poměru 1:1.

Test antimikrobiální aktivity

Pro testování účinnosti hydrogelů byla zvolena difúzní plotnová metoda (2D uspořádání). Ke kultivaci byla použita neselektivní půda - trypton-sójový agar. Pro kultivaci Clostridium 30 sporogenes za anaerobních podmínek byl použit krevní agar).

-27CZ 2020 - 263 A3

Vzorky gelů byly testovány na 4 mikroorganismech:

• Staphylococcus aureus (G+ koky), • Escherichia coli (G- tyčinka), • Clostridium sporogenes (G+ anaerobní tyčinka), • Candida albicans (kvasinka).

Příprava inokula:

K přípravě inokula byla použita cca 48 hodin stará kultura, ze které se připravila bakteriální suspenze 0,5 McFarlanda, což odpovídá koncentraci řádově 10⁷ až 10⁸ CFU/ml.

V případě kvasinky byla připravena suspenze 4,0 McFarlanda, což odpovídá koncentraci řádově 10⁷ CFU/ml.

Mikrobiologická analýza:

Pro samotné testování se suspenze dále naředila na přibližnou koncentraci 10⁴ CFU/ml a následně se 100 μΐ vyočkovalo na povrch tryptonsójového agaru v Petriho miskách a suspenze se rovnoměrně rozetřela po povrchu celé misky sterilní hokejkou. Přibližný počet mikroorganismů aplikovaných na misku byl řádově 10³ CFU. Po vsáknutí suspenze do agaru se na jeho povrch sterilně přenesly testované vzorky.

Misky s testovacími kmeny a vzorky byly uloženy ke kultivaci při 37 °C na dobu 24 hodin. Kultivace Clostridium sporogenes probíhala za anaerobních podmínek.

Po 24 hodinové kultivaci byly hodnoceny všechny misky s naočkovanými mikroorganismy a testovanými vzorky. Srovnání bylo provedeno proti negativní kontrole, která byla tvořena hydrogelem neobsahujícím inkluzi TCS/CD. Vzorek vykazující antimikrobiální účinek vůči testovanému mikroorganismu se projevil vytvořením inhibiční zóny v bezprostřední blízkosti s testovaným vzorkem.

Testovaný kmen Koncentrace TCS	Staphylococcus a 1 mg/ml	ureus 0,8 mg/ml	0,5 mg/ml	0,1 mg/ml
Inhibiční zóna	+ (58 mm)	+ (55 mm)	+ (40 mm)	+ (20 mm)
Testovaný kmen	Escherichia coli
Koncentrace TCS	1 mg/ml	0,8 mg/ml	0,5 mg/ml	0,1 mg/ml
Inhibiční zóna	+ (42 mm)	+ (40 mm)	+ (22 mm)	-
Testovaný kmen	Candida albicans
Koncentrace TCS	1 mg/ml	0,8 mg/ml	0,5 mg/ml	0,1 mg/ml
Inhibiční zóna	+ (24 mm)	+ (16 mm)	-	-
Testovaný kmen	Clostridium sporogenes
Koncentrace TCS	1 mg/ml	0,8 mg/ml	0,5 mg/ml	0,1 mg/ml
Inhibiční zóna	+ (17 mm)	+ (13 mm)	-	-

Tabulka 34: Přehled antimikrobiálního působení připravených gelů.

* Poznámka:

• (+) Inhibiční zóna v bezprostřední blízkosti se vzorkem/vzorek vykazuje antimikrobiální účinek

-28CZ 2020 - 263 A3 • (-) Růst mikroorganismů v bezprostřední blízkosti se vzorkem/vzorek nevykazuje antimikrobiální účinek

Antimikrobiální účinek hydrogelů na kmen Stapyhlococcus aureus byl prokázán pro všechny testované koncentrace TCS. Antimikrobiální účinek hydrogelů na kmen Escherichia coli byl prokázán od koncentrace TCS 0,5 mg/ml. Antimikrobiální účinek hydrogelů na kvasinku Candida albicans a bakterii Clostridium sporogenes byl pozorován až od koncentrace TCS 0,8 mg/ml. Žádný z hydrogelů obsahujících TCS v koncentračním rozmezí 0,1 až 1 mg/ml nebyl kolonizován bakteriemi, což potvrzuje možnost jejich využití jako bariéry proti šíření infekce.

Příklad 19: Preklinické testování na modelu dehiscence kolorektální anastomózy u prasete

In vivo studie byla rozdělena do dvou fází. V první fázi in vivo testů byl hydrogel definovaného složení implantován do oblasti malé pánve. Cílem bylo zjistit vztah mezi časem gelace (Tg) a stanoveným pomocí Teologického měření a dobou nutnou k solidifikaci (T_soiid) patřičného množství (Vgei) materiálu in vivo (viz tabulka 35). T_soiid se neshoduje s in vitro stanoveným Tg, protože nepopisuje okamžik vzniku hydrogelu, ale moment, kdy je in vivo získán makroskopicky homogenní hydrogel vyplňující oblast malé pánve. Pro tento pokus byl využit hydrogel připravený dle příkladu 2.

c HA-TA (mg/ml)	Roztok pA HRP (U/ml)	Roztok B H2O2 (mM)	TCS (mg/ml)	Tg(s)	Vgel (ml)	T solid· (min)
20	0,4	1,66	1	65	40	~5

Tabulka 35: Parametry hydrogelu implantovaného do oblasti malé pánve

Druhá fáze sledovala vliv přítomnosti hydrogelu na průběh hojení modelu dehiscence anastomózy kolorektální anastomózy, který byl vytvořen perforací střevní stěny v blízkosti anastomózy. Závažnost stavu byla simulována velikostí perforace v rozmezí 5 až 15 mm. K vyplnění oblasti malé pánve byl využity hydrogely podle příkladů 3 až 8, jejichž vlastnosti jsou shrnuty tabulce 36.

Příklad	3	4	5	6	7	8
Roztok A
HA-TA (DS%/10 3g/mol)	2,1/294	2,1/294	2,1/294	2,1/294	2,1/294	2,1/294
HA-TA (mg/ml)	20	20	20	20	20	20
Křenová eroxidáza (U/ml)	1,2	0,835 1	1,08	1,171	1,31 1	1,13
ΗΡ-β-CD (mg/ml)	60	60	60	60	60	60
Triclosan (mg/ml)	2,04	2	2,02	1,88	1,87	1,86
Roztok B
HA-TA (DS%/10 3g/mol)	2,1/294	2,1/294	2,1/294	2,1/294	2,1/294	2,1/294
HA-TA (mg/ml)	20	20	20	20	20	20
Peroxid vodíku (mmol/1)	4,66	4,66	4,66	4,66	4,66	4,66
Hydrogel
HRP (U/ml)	0,6	0,418	0,54	0,59	0,66	0,56
TCS (mg/ml)	1,02	1	1,01	0,94	0,94	0,93
G 3 min (P^-)	440	290	430	394	401	293
Tg (s)	28	38	28	31	30	36
G's (Pa)	1118	1051	1122	1126	1127	1055
T solid (min)	<5	<5	<5	<5	<5	<5

-29CZ 2020 - 263 A3

Tabulka 36: Parametry hydrogelů implantovaných do oblasti malé pánve po vytvoření modelu dehiscence kolorektální anastomózy.

Po 14 dnech od provedení zákroku byla zvířata utracena a bylo provedení hodnocení stavu hojení anastomózy. Výsledky byly hodnoceny jednak makroskopickým a histologickým vyšetřením. Pro hodnocení klinického stavu byla použita analogie s klasifikací projevů komplikací spojených s hojením kolorektální anastomózy v humánní medicíně [58]:

	Stupeň A	Stupeň B	Stupeň C
Klinický stav	Dobrý	Mírný diskomfort	Vážný stav
Symptomy	žádné	Bolest v břišní krajině Zvýšená teplota Hnisavá stolice nebo rektální či vaginální výtok (v případě vzniku rektovaginálního píštěle)	Peritonitida Sepse
Produkce rány	Serózní tekutina maximálně mírně zakalená	Zakalená tekutiny popř. obsahující hnis	Hnis obsahující výpotek
Laboratorní vyšetření	Normální	Leukocytóza, zvýšená hladina C-reaktivního proteinu	Leukocytóza, zvýšená hladina C-reaktivního proteinu V případě rozvoje sepse leukopenic
Radiologické vyšetření	Minimální průsak anastomózy	Průsak anastomózy s lokálními komplikacemi (absces v oblasti pánve).	Průsak anastomózy a generalizovanými komplikacemi (peritonitis)
Specifická léčba	Bez zásahu	Léčba antibiotiky Nutné zajistit drenáž Transanální laváž	Re-operace s cílem dostat pod kontrolu ložisko infekce

Tabulka 37: Definice stupňů závažnosti klinických projevů pooperačních komplikací spojených s hojením kolorektální anastomózy [58],

Provedená preklinická studie zahrnovala celkem 21 prasat s modelem kolorektální anastomózy s různým stupněm jejího poškození. Vznik dehiscence byl simulován perforací tračníku v blízkosti provedené anastomózy. Hydrogel (složení dle tabulky 36; 20 až 40 ml/zvíře) byl aplikován u 18 zvířat, a to na závěr zákroku. Stav zvířat byl hodnocen po dobu 14 dní, poté došlo k jejich utracení. V některých případech bylo možné i po dvou týdnech identifikovat v místě aplikace zbytky gelu. K jeho kompletnímu vstřebání dojde v době kratší než 30 dní.

Ani v jednom z 18 případů, kdy byl hydrogel aplikován, nedošlo ke klinickým projevům rozvoje sepse, případně projevům střevní obstrukce, nebo jiným vedlejším účinku použití vyvinutého hydrogelů. Klinický stav zvířat byl hodnocen klasifikací A. Naopak u dvou ze tří zvířat kontrolní skupiny, u kterých nebyl gel během operace použit, došlo ke komplikacím, kdy bylo nutné použít doplňkovou antibiotickou léčbu. Stav těchto zvířat byl klasifikován kategorií B.

-30CZ 2020 - 263 A3

Testovaná skupina
	Histologie	Klinický obraz
Sliznice	Seróza
Hydrogel	Anast.	Perfor. (mm)	Makros.	Hist	Makros.	Hist
HA-TA/TCS	ano	5	Y	Y	Y	Y	A
HA-TA/TCS	ano	5	N	N	N	Y	A
HA-TA/TCS	ano	5	Y	Y	Y	Y	A
HA-TA/TCS	ano	5	N	N	Y	Y	A
HA-TA/TCS	ano	5	Y	Y	Y	Y	A
HA-TA/TCS	ano	5	N	N	N	N	A
HA-TA/TCS	ano	10	N	N	N	N	A
HA-TA/TCS	ano	10	N	N	N	Y	A
HA-TA/TCS	ano	10	N	N	N	N	A
HA-TA/TCS	ano	10	N	N	N	N	A
HA-TA/TCS	ano	10	N	N	N	Y	A
HA-TA/TCS	ano	10	N	N	Y	Y	A
HA-TA/TCS	ano	10	N	N	N	Y	A
HA-TA/TCS	ano	15	N	N	N	N	A
HA-TA/TCS	ano	15	N	N	N	Y	A
HA-TA/TCS	ano	15	N	Y	N	Y	A
HA-TA/TCS	ano	15	N	N	N	Y	A
HA-TA/TCS	ano	15	N	N	N	Y	A
HA-TA/TCS	ano	15	Y	Y	Y	Y	A
HA-TA/TCS	ano	15	N	N	Y	Y	A
		Bez nálezu	17	16	14	6	21
		Nález	4	5	7	15	0
KONTRO1	LA
	Histologie	Klinický obraz
Sliznice	Seróza
Hydrogel	Anast.	Perfor.	Makros.	Hist	Makros.	Hist
Ne	ano	10	N	Y	N	Y	A
Ne	ano	10	N	N	N	N	B
Ne	ano	10	N	N	N	Y	B
		Bez nálezu	3	2	3	1	1
		Nález	0	1	0	2	2

Tabulka 38: Hodnocení fáze 2 preklinické studie N - bez nálezu

Y — makroskopický či histologický nález

-31 CZ 2020 - 263 A3

Odkazy

[1] Zavoral M, Grega T, Suchánek S. Komplikace léčby kolorektálního karcinomu. Onkologie. 2016;10:41-7.

[2] Miroslav Trubač ML. Chirurgická léčba karcinomu tlustého střeva a konečníku, dostupný na https://zdravieurocz/clanek/postgradualni-medicina/chirurgicka-lecba-karcinomu-tlusteho-strevaa-konecniku-478291.

[3] Gresham RD, Manzo SE, Aranyi E, Geiste RJ, Jankowski BK, Milliman K. Surgical stapling device for performing circular anastomoses US6945444B2. Google Patents; 2005.

[4] Argyra E, Polymeneas G, Karvouni E, Kontorravdis N, Theodosopoulos T, Arkadopoulos N. Sutureless Pancreatojejunal Anastomosis Using an Absorbable Sealant: Evaluation in a Pig Model. Journal of Surgical Research. 2009;153:282-6.

[5] de la Portilla F, Garcia-Cabrera AM, Pereira S, de Marco F, Molero M, Muntane J, et al. An Experimental Study on the Use of Calcium Alginate to Heal Colonic Anastomoses. Journal of Investigative Surgery. 2016;29:32-9.

[6] Gungor G, Demiral G, §enol M, Bayraktar B, Cclik Y, Bóltik S. Cyanoacrylate application on colonic anastomosis: is it safe or not? Przeglad Gastroenterologiczny. 2016;l 1:206-10.

[7] Lauto A, Mawad D, Foster LJR. Adhesive biomaterials for tissue reconstruction. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 2008;83:464-72.

[8] Vakalopoulos KA, Daams F, Wu Z, Timmermans L, Jeekel JJ, Kleinrensink G-J, et al. Tissue adhesives in gastrointestinal anastomosis: a systematic review. Journal of Surgical Research. 2013;180:290-300.

[9] Huh JW, Kim HR, Kim YJ. Anastomotic leakage after laparoscopic resection of rectal cancer: the impact of fibrin glue. The American Journal of Surgery. 2010;199:435-41.

[10] Costales AB, Patil D, Mulya A, Kirwan JP, Michener CM. 2-Octylcyanoacrylate for the prevention of anastomotic leak. The Journal of surgical research. 2018;226:166-72.

[11] Ustek S, Kismet K, Akkus MA, Ozcan AH, Aydogan A, Renda N. Effect of Povidone-Iodine Liposome Hydrogel on Colonic Anastomosis. European Surgical Research. 2005;37:242-5.

[12] Reimer K, Vogt PM, Broegmann B, Hauser J, Rossbach O, Kramer A, et al. An Innovative Topical Drug Formulation for Wound Healing and Infection Treatment: In vitro and in vivo Investigations of a Povidone-Iodine Liposome Hydrogel. Dermatology. 2000;201:235-41.

[13] Hirai K, Tabata Y, Hasegawa S, Sakai Y. Enhanced intestinal anastomotic healing with gelatin hydrogel incorporating basic fibroblast growth factor. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2016; 10.

[14] Yol S, Tekin A, Yilmaz H, Kuptikkartallar T, Esen H, Caglayan O, et al. Effects of platelet rich plasma on colonic anastomosis. Journal of Surgical Research. 2008;146:190-4.

[15] de Jonge SW, Atema JJ, Solomkin JS, Boermeester MA. Meta-analysis and trial sequential analysis of triclosan-coated sutures for the prevention of surgical-site infection. British Journal of Surgery. 2017;104:Ε118-E33.

[16] Wu X, Kubilay NZ, Ren J, Allegranzi B, Bischoff P, Zayed B, et al. Antimicrobial-coated sutures to decrease surgical site infections: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 2017;36:19-32.

[17] Nakamura T, Kashimura N, Noji T, Suzuki O, Ambo Y, Nakamura F, et al. Triclosan-coated sutures reduce the incidence of wound infections and the costs after colorectal surgery: a randomized controlled trial. Surgery. 2013;153:576-83.

[18] Rasic Z, Schwarz D, Adam VN, Sever M, Lojo N, Rasic D, et al. Efficacy of antimicrobial triclosan-coated polyglactin 910 (Vicryl* Plus) suture for closure of the abdominal wall after colorectal surgery. Collegium antropologicum. 2011;35:439-43.

[19] Baracs J, Huszar O, Sajjadi SG, Horvath OP. Surgical site infections after abdominal closure in colorectal surgery using triclosan-coated absorbable suture (PDS Plus) vs. uncoated sutures (PDS II): a randomized multicenter study. Surgical infections. 2011; 12:483-9.

[20] Justinger C, Slotta JE, Ningel S, Graber S, Kollmar O, Schilling MK. Surgical-site infection after abdominal wall closure with triclosan-impregnated polydioxanone sutures: Results of a randomized clinical pathway facilitated trial (NCT00998907). Surgery. 2013;154:589-95.

-32CZ 2020 - 263 A3

[21] SCCS S. Opinion on triclosan (antimicrobial resistance). Safety, SCoC (ed). 2010.

[22] Schweizer HP. Triclosan: a widely used biocide and its link to antibiotics. FEMS Microbiology Letters. 2001;202:1-7.

[23] Jones RD, Jampani HB, Newman JL, Lee AS. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. American Journal of Infection Control. 2000;28:184-96.

[24] Saleh S, Haddadin RNS, Baillie S, Collier PJ. Triclosan - an update. Letters in Applied Microbiology. 2011;52:87-95.

[25] Rodricks JV, Swenberg JA, Borzelleca JF, Maronpot RR, Shipp AM. Triclosan: a critical review of the experimental data and development of margins of safety for consumer products. Critical reviews in toxicology. 2010;40:422-84.

[26] Suller M, Russell A. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2000;46:11-8.

[27] Heath RJ, Yu Y-T, Shapiro MA, Olson E, Rock CO. Broad Spectrum Antimicrobial Biocides Target the Fabl Component of Fatty Acid Synthesis. Journal of Biological Chemistry. 1998;273:30316-20.

[28] Levy CW, Roujeinikova A, Sedelnikova S, Baker PJ, Stuitje AR, Slabas AR, et al. Molecular basis oftriclosan activity. Nature. 1999;398:383-4.

[29] Gilbert P, McBain AJ. Literature-based evaluation of the potential risks associated with impregnation of medical devices and implants with triclosan. Surgical infections. 2002;3:s55-s63.

[30] Carey DE, McNamara PJ. The impact of triclosan on the spread of antibiotic resistance in the environment. Frontiers in microbiology. 2015;5:780.

[31] Jug M, Kosalec I, Maestrelli F, Mura P. Analysis of triclosan inclusion complexes with βcyclodextrin and its water-soluble polymeric derivative. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2011;54:1030-9.

[32] Peila R, Vineis C, Varesano A, Ferri A. Different methods for β-cyclodextrin/triclosan complexation as antibacterial treatment of cellulose substrates. Cellulose. 2013 ;20:2115-23.

[33] Ma D, Wu T, Zhang J, Lin M, Mai W, Tan S, et al. Supramolecular hydrogels sustained release triclosan with controlled antibacterial activity and limited cytotoxicity. Science of Advanced Materials. 2013;5:1400-9.

[34] Gould S, Scott RC. 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (ΗΡ-β-CD): a toxicology review. Food and Chemical Toxicology. 2005;43:1451-9.

[35] Loftsson T, Moya-Ortega MD, Alvarez-Lorenzo C, Concheiro A. Pharmacokinetics of cyclodextrins and drugs after oral and parenteral administration of drug/cyclodextrin complexes. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2015.

[36] Park KD, Park KM, Lee YK, Hoang TTT, LE TP. Injectable tissue adhesive hydrogel including gamma-cyclodextrin and biomedical use thereof. Google Patents; 2017.

[37] Sikkink CJ, Zeebregts CJ, Reijnen MM. Hyaluronan-based antiadhesive agents in abdominal surgery: applications, results, and mechanisms of action. Surgical technology international. 2007;16:19-29.

[38] Prestwich GD. Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 2011;155:193-9.

[39] Burdick JA, Prestwich GD. Hyaluronic Acid Hydrogels for Biomedical Applications. Advanced Materials. 2011;23:H41-H56.

[40] Calabro A, Akst L, Alam D, Chan J, Darr AB, Fukamachi K, et al. Hydroxyphenyl crosslinked macromolecular network and applications thereof. United States: The Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH, US); 2008.

[41] Kurisawa M, Lee F, Chung JE. Formation of Hydrogel in the Presence of Peroxidase and Low Concentration of Hydrogen Peroxide 2009.

[42] Lee F, Chung JE, Kurisawa M. An injectable enzymatically crosslinked hyaluronic acidtyramine hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate. Soft Matter. 2008;4:880-7.

[43] Darr A, Calabro A. Synthesis and characterization of tyramine-based hyaluronan hydrogels. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2009;20:33-44.

-33CZ 2020 - 263 A3

[44] Akkara JA, Senecal KJ, Kaplan DL. Synthesis and characterization of polymers produced by horseradish peroxidase in dioxane. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 1991;29:1561-74.

[45] Shutava T, Zheng Z, John V, Lvov Y. Microcapsule modification with peroxidase-catalyzed phenol polymerization. Biomacromolecules. 2004;5:914-21.

[46] Ghan R, Shutava T, Patel A, John VT, Lvov Y. Enzyme-Catalyzed Polymerization of Phenols within Polyelectrolyte Microcapsules. Macromolecules. 2004;37:4519-24.

[47] Higashimura H, Kobayashi S. Oxidative Polymerization: John Wiley & Sons, Inc.; 2002.

[48] Veitch NC. Horseradish peroxidase: a modem view of a classic enzyme. Phytochemistry. 2004;65:249-59.

[49] Kurisawa M, Lee F, Wang L-S, Chung JE. Injectable enzymatically crosslinked hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate for drug delivery and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. 2010;20:5371-5.

[50] Tang C-L, Jayne DG, Seow-Choen F, Ng Y-Y, Eu K-W, Mustapha N. A randomized controlled trial of 0.5% ferric hyaluronate gel (Intergel) in the prevention of adhesions following abdominal surgery. Annals of surgery. 2006;243:449.

[51] Diamond MP, Bums EL, Accomando B, Mian S, Holmdahl L. Seprafilm(®) adhesion barrier: (2) a review of the clinical literature on intraabdominal use. Gynecol Surg. 2012;9:247-57.

[52] Gutiérrez MC, Garcia-Carvajal ZY, Jobbágy M, Yuste L, Rojo F, Abrusci C, et al. Hydrogel Scaffolds with Immobilized Bacteria for 3D Cultures. Chemistry of Materials. 2007;19:1968-73.

[53] Tuson HH, Renner LD, Weibel DB. Polyacrylamide hydrogels as substrates for studying bacteria. Chem Commun (Camb). 2012;48:1595-7.

[54] Li S, Dong S, Xu W, Tu S, Yan L, Zhao C, et al. Antibacterial Hydrogels. Adv Sci (Weinh). 2018;5:1700527-.

[55] Claes L, Ignatius A. Development of new, biodegradable implants. Der Chimrg; Zeitschrift fur alle Gebiete der operativen Medizen. 2002;73:990-6.

[56] Macfarlane G, Cummings J, Allison C. Protein degradation by human intestinal bacteria. Microbiology. 1986;132:1647-56.

[57] Lee H-S, Han S-Y, Ryu K-Y, Kim D-H. The Degradation of Glycosaminoglycans by Intestinal Microflora Deteriorates Colitis in Mice. Inflammation. 2009;32:27-36.

[58] Rahbari NN, Weitz J, Hohenberger W, Heald RJ, Moran B, Ulrich A, et al. Definition and grading of anastomotic leakage following anterior resection of the rectum: a proposal by the International Study Group of Rectal Cancer. Surgery. 2010;147:339-51.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sada alespoň dvou vodných gelotvomých roztoků určených pro přípravu biodegradabilního hydrogelů na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu vyznačující se tím, že obsahuje alespoň dva vodné roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, jejíž aktivita je v rozsahu 0,5 až 1,5 U/ml a roztok B obsahuje peroxid vodíku o koncentraci v rozmezí 1 až 6 mmol/1, přičemž roztok A a/nebo roztok B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I (I), kde n je v rozmezí 2 až 5000, M je H⁺ nebo kation farmaceuticky přijatelné soli vybraný ze skupiny obsahující kation alkalického kovu, kovu alkalických zemin, a kde R je OH nebo substituent NHR₂CONHRiArOH obecného vzorce II,

   0^ Λ ''Nr' Ή; ’'όη

   NH (Π), kde Ar je feny len a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri j e karboxyethylen, a R₂ j e alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž má hmotnostně střední molámí hmotnost v rozmezí 60 000 g/mol až 2 000 000 g/mol, stupeň substituce v rozmezí 1 % až 10 % a koncentraci 10 až 50 mg/ml a zároveň roztok A a/nebo roztok B obsahuje triclosan o koncentraci v rozmezí 0,2 až 2,2 mg/ml a hydroxypropyl-P-cyklodextrin o koncentraci v rozmezí 4 až 100 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-P-cyklodextrinu je v rozmezí 1 : 4 až 1 : 10.
2. 2. Sada podle nároku 1 vyznačující se tím, že aktivita křenové peroxidázy je s výhodou v rozsahu 0,9 až 1,35 U/ml, výhodněji 0,8 až 1,2 U/ml, koncentrace peroxidu vodíku je s výhodou v rozmezí 3 až 5 mmol/1, hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I, má s výhodou hmotnostně střední molámí hmotnost v rozmezí 100 000 g/mol až 1 000 000 g/mol, výhodněji 200 000 g/mol až 400 000 g/mol; stupeň substituce s výhodou v rozmezí 1 % až 5 %, výhodněji 2 % až 4 % a koncentraci s výhodou 15 až 25 mg/ml, výhodněji 20 mg/1; a koncentrace triclosanu je s výhodou v rozmezí 1 až 2,2 mg/ml, výhodněji 2 mg/ml a koncentrace hydroxypropyl-P-cyklodextrinu je s výhodou v rozmezí 25 až 80 mg/ml, výhodněji 60 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-P-cyklodextrinu je s výhodou v rozmezí 1 : 5 až 1 : 8.
3. 3. Sada podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

   -35CZ 2020 - 263 A3 • Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 60 000 g/mol až 2 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 1 % až 10 %, přičemž je v koncentraci 10 až 50 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 1,5 U/ml, • Triclosan, který je v koncentraci 0,2 až 2,2 mg/ml, • Hydroxypropyl-P-cyklodextrin, který je v koncentraci 4 až 100 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-P-cyklodextrinu je v rozmezí 1 : 4 až 1 : 10;

   a roztok B obsahuje:

   • Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 60 000 g/mol až 2 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupeňem substituce v rozmezí 1 % až 10 %, v koncentraci 10 až 50 mg/ml, • Peroxid vodíku, přičemž je v rozmezí koncentrace 1 až 6 mmol/1.
4. 4. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

   • Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 100 000 g/mol až 1 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 1 % až 5 %, přičemž je v koncentraci 15 až 25 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,9 až 1,35 U/ml, • Triclosan, který je v koncentraci 1 až 2,2 mg/ml, • Hydroxypropyl-P-cyklodextrin v koncentraci 25 až 80 mg/ml, přičemž molámí poměr triclosanu a hydroxypropyl-P-cyklodextrinu se pohybuje v rozmezí 1 : 5 až 1 : 8;

   a roztok B obsahuje:

   • Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 100 000 g/mol až 1 000 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 1 % až 5 %, přičemž je v koncentraci 15 až 25 mg/ml, • Peroxid vodíku, který je v rozmezí koncentrace 3 až 5 mmol/1.
5. 5. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

   • Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 200 000 g/mol až 400 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se stupněm substituce v rozmezí 2 % až 4 %, v koncentraci 20 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,8 až 1,2 U/ml, • Triclosan, který je v koncentraci 2 mg/ml, • Hydroxypropyl-P-cyklodextrin, který je v koncentraci 60 mg/ml;

   -36CZ 2020 - 263 A3 a roztok B obsahuje:

   • Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 200 000 g/mol až 400 000 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, se 5 stupněm substituce v rozmezí 2 % až 4 %, přičemž jev koncentraci 20 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
6. 6. Použití sady podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, pro přípravu biodegradabilního hydrogelu na ίο bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu k prevenci pooperačních komplikací souvisejících s vytvořením kolorektální anastomózy.