CZ2019243A3 - Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz - Google Patents
Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2019243A3 CZ2019243A3 CZ2019-243A CZ2019243A CZ2019243A3 CZ 2019243 A3 CZ2019243 A3 CZ 2019243A3 CZ 2019243 A CZ2019243 A CZ 2019243A CZ 2019243 A3 CZ2019243 A3 CZ 2019243A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- coated
- enzyme
- matrix pellets
- pellets
- coated spherical
- Prior art date
Links
- 239000008188 pellet Substances 0.000 title claims abstract description 94
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 65
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108010053652 Butyrylcholinesterase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102100032404 Cholinesterase Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 21
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 238000005563 spheronization Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229920003176 water-insoluble polymer Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 21
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 11
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 10
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 10
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 10
- GFFIJCYHQYHUHB-UHFFFAOYSA-N 2-acetylsulfanylethyl(trimethyl)azanium Chemical compound CC(=O)SCC[N+](C)(C)C GFFIJCYHQYHUHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- AWBGQVBMGBZGLS-UHFFFAOYSA-N butyrylthiocholine Chemical compound CCCC(=O)SCC[N+](C)(C)C AWBGQVBMGBZGLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- -1 methacrylic acid ammonium ester Chemical class 0.000 claims description 7
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 6
- 229920003151 Eudragit® RL polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 claims description 5
- 239000002824 redox indicator Substances 0.000 claims description 5
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 5
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acrylate Chemical compound CCOC(=O)C=C JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001800 Shellac Polymers 0.000 claims description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 2
- 229920003086 cellulose ether Polymers 0.000 claims description 2
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 claims description 2
- PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N pent‐4‐en‐2‐one Natural products CC(=O)CC=C PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 claims description 2
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 claims description 2
- 239000004208 shellac Substances 0.000 claims description 2
- ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N shellac Chemical compound OCCCCCC(O)C(O)CCCCCCCC(O)=O.C1C23[C@H](C(O)=O)CCC2[C@](C)(CO)[C@@H]1C(C(O)=O)=C[C@@H]3O ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N 0.000 claims description 2
- 229940113147 shellac Drugs 0.000 claims description 2
- 235000013874 shellac Nutrition 0.000 claims description 2
- PUAQLLVFLMYYJJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropiophenone Chemical compound CC(N)C(=O)C1=CC=CC=C1 PUAQLLVFLMYYJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 37
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N indoxyl Chemical group C1=CC=C2C(O)=CNC2=C1 PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 6
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N Physostigmine Natural products C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)C2C1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 229960001697 physostigmine Drugs 0.000 description 5
- PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N physostigmine Chemical compound C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)[C@@H]2[C@@]1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 4
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 4
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N Alpha-lactose monohydrate Chemical compound O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N 0.000 description 3
- 241000277305 Electrophorus electricus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 3
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 3
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 239000013037 reversible inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- NTBLZMAMTZXLBP-UHFFFAOYSA-M 2-acetylsulfanylethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CC(=O)SCC[N+](C)(C)C NTBLZMAMTZXLBP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WEQAAFZDJROSBF-UHFFFAOYSA-M 2-butanoylsulfanylethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CCCC(=O)SCC[N+](C)(C)C WEQAAFZDJROSBF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 5-mercapto-2-nitro-benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S)=CC=C1[N+]([O-])=O GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229920001730 Moisture cure polyurethane Polymers 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229920003080 Povidone K 25 Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WMGSQTMJHBYJMQ-UHFFFAOYSA-N aluminum;magnesium;silicate Chemical compound [Mg+2].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] WMGSQTMJHBYJMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- JAUGGEIKQIHSMF-UHFFFAOYSA-N dialuminum;dimagnesium;dioxido(oxo)silane;oxygen(2-);hydrate Chemical compound O.[O-2].[O-2].[Mg+2].[Mg+2].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O JAUGGEIKQIHSMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 2
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 2
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000191 poly(N-vinyl pyrrolidone) Polymers 0.000 description 2
- 229940068918 polyethylene glycol 400 Drugs 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 11-mercaptoundecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCS GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000221702 Aleuria Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122041 Cholinesterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 101000801359 Homo sapiens Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 241000978776 Senegalia senegal Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- SNAAJJQQZSMGQD-UHFFFAOYSA-N aluminum magnesium Chemical compound [Mg].[Al] SNAAJJQQZSMGQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940053198 antiepileptics succinimide derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033929 calcium caseinate Proteins 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002134 carbon nanofiber Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002575 chemical warfare agent Substances 0.000 description 1
- UUAGAQFQZIEFAH-UHFFFAOYSA-N chlorotrifluoroethylene Chemical group FC(F)=C(F)Cl UUAGAQFQZIEFAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- MPMSMUBQXQALQI-UHFFFAOYSA-N cobalt phthalocyanine Chemical compound [Co+2].C12=CC=CC=C2C(N=C2[N-]C(C3=CC=CC=C32)=N2)=NC1=NC([C]1C=CC=CC1=1)=NC=1N=C1[C]3C=CC=CC3=C2[N-]1 MPMSMUBQXQALQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical class O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007792 gaseous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001021 lactose monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical class C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000480 nickel oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- GNRSAWUEBMWBQH-UHFFFAOYSA-N oxonickel Chemical compound [Ni]=O GNRSAWUEBMWBQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007962 solid dispersion Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical class O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical class [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N tetrafluoroethene Chemical group FC(F)=C(F)F BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- ZWZVWGITAAIFPS-UHFFFAOYSA-N thiophosgene Chemical compound ClC(Cl)=S ZWZVWGITAAIFPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010456 wollastonite Substances 0.000 description 1
- 229910052882 wollastonite Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
- C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Obalené sférické matricové pelety, tvořené jádrem a obalem, obsahující imobilizovaný enzym na bázi cholinesteráz jako jsou acetylcholinesteráza a/nebo butyrylcholinesteráza, o aktivitě 1 až 100 nkat.g-1, kde enzym je v jádrech imobilizován na porézním, vodonerozpustném anorganickém materiálu, výhodně aluminiummetasilikátu, a tato jádra jsou obalena semipermeabilním obalem z vodonerozpustného polymeru výhodně na bázi derivátů akrylátů, přičemž celková koncentrace obalu činí 1 – 10 % hmotnosti sférických obalených matricových pelet a průměr výsledné velikosti obalených sférických matricových pelet se minimálně ze 75 % nachází v rozmezí velikosti 0,1 - 3,0 mm, výhodně 0,8 - 1,25 mm, přičemž jádra pelet jsou vyrobena metodou extruze-sféronizace a obal je nanesen nástřikem ve fluidním loži a výsledné obalené sférické matricové pelety se použijí k detekci inhibitorů cholinesteráz ve formě detekční trubičky obsahující uvedené obalené sférické matricové pelety.
Description
Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz
Oblast techniky
Vynález se týká obalených sférických matricových pelet, určených zejména pro detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu a/nebo butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, a obsahujících mobilizovaný enzym na bázi cholinesteráz o aktivitě 1 až 100 nkat.g1, jakož i způsobu výroby těchto pelet extruzí-sféronizací nebo rotogranulací s následným fluidním obalením, použití těchto pelet pro detekci inhibitorů cholinesteráz a detekční trubičky obsahující uvedené obalené sférické matricové pelety a určené zejména pro detekci nervově paralytických látek (NPL) v ovzduší.
Dosavadní stav techniky
Imobilizované enzymy jsou obvykle proteázy, které jsou fyzikálně uzavřeny v omezené oblasti, aniž by ztratily svojí specifickou, enzymatickou aktivitu. Mohou být použity i opakovaně a/nebo kontinuálně. Imobilizace zde zajišťuje dostatečný kontakt reaktantů s enzymem, přičemž reaktant je obvykle obsažen v kapalné fázi, která prochází pevnou fází s imobilizovaným enzymem, případně je reaktant obsažen ve fázi plynné, která je nemísitelná s vodou. Na pevnou fázi je zde kladeno několik požadavků. Má mít velký měrný povrch, hydrofilní charakter, má být nerozpustná ve vodě a chemicky, mechanicky a teplotně stálá. Má mít rovněž vhodný tvar a velikost částic, být odolná proti mikrobiálnímu působení a dovolit opakované a/nebo kontinuální používání. V současné době se používá řada způsobů imobilizace.
Způsoby imobilizace
Enzymy na bázi cholinesteráz jsou známy v mobilizovaném stavu již řadu let. K jejich imobilizaci se používají stejné způsoby jako u ostatních proteáz. Patří sem zejména adsorpce na nerozpustný nosič, vazba na ionexy, vazba na magnetické částice, zabudování do membrán a filmů, zabudování do gelů a pěn, zesítěné agregáty, imobilizace pomocí nano-struktur, imobilizace pomocí kovalentní vazby či pomocí protilátek. Lze proto říci, že obecně se k jejich imobilizaci používají substráty a techniky, které nacházejí širší uplatnění v biochemickém průmyslu. V patentové a odborné literatuře je zachycena již řada chráněných postupů, mezi nimiž někdy nelze jednoznačně diferencovat, neboť v sobě obsahují více uvedených principů. Všechny tyto systémy se pak vyskytují, ať už jednotlivě nebo kombinovaně, v různých detekčních systémech.
Následující taxonomie je uvedena pro větší přehlednost.
a) Sorpce na nerozpustný nosič
Jedná se o nej starší způsob imobilizace, kde se mezi sorbentem a enzymem uplatňují například běžné síly koheze, adheze, vodíkové můstky, van der Waalsovy síly apod.
Patentový dokument US 3049411 (1962) uvádí u imobilizace cholinesterázy materiály, jako je například filtrační papír nebo silikagel. Daný sorbent byl impregnován 4% roztokem enzymu, do něhož byl přidán hovězí sérový albumin nebo želatina, popř. jiná „stabilizující“ bílkovina, a směs byla následně vysušena. Při zjišťování potenciální kontaminace byl disk „enzymového papírku“ zvlhčen a pak přes něj byl prosán vzduch. Po aplikaci detekčního roztoku obsahujícího indoxylacetát, neinhibovaná cholinesteráza substrát rozštěpila. Vzniklý indoxyl pak byl
CZ 2019 - 243 A3 vzduchem oxidován na indigo. Takto mobilizovaný enzym zůstával delší dobu aktivní i při relativně vysokých teplotách, pokud byl skladován v suchu.
Rovněž patentový dokument US 4241180 (1980) uvádí filtrační papír jako substrát pro butyrylcholinesterázu, kde namísto albuminu bylo s obdobnými výsledky použito roztoku 2-merkaptoethanolu.
Patentový dokument US 3666627A (1971) uvádí jako inventivní krok při impregnaci porézního skla skutečnost, že enzym byl vázán na nosič za přítomnosti substrátu. Vazbou bylo zablokováno aktivní místo enzymu, takže se skupiny aktivního místa nemohly podílet na reakci se substrátem. Získaný imobilizovaný enzym pak měl vyšší stabilitu i aktivitu.
Patentový dokument US 3802997 (1972) chrání analogický způsob mobilizace enzymů, doplněný o sušení produktu lyofílizací nebo v rozprašovací sušárně. Jednodušším způsobem je příprava enzymového papírku podle patentového dokumentu US 4120754 (1978), kde byla butyrylcholinesteráza mobilizována na filtračním papíře impregnaci roztokem enzymu v pufru obsahujícím Tergitol 15-S-12. Papírek byl použit k detekci inhibitorů organofosfátového typu.
Ze sorpce choline steráz na vybělenou bavlněnou tkaninu pak vychází patentový dokument CZ 288576 (1994) a ze sorpce na granulovanou celulózu pak patentový dokument CZ 285242 (1995).
Patentový dokument US 2008160556 (2008) chrání úpravu filtračního papíru pro mobilizaci acetylcholinesterázy určeného pro přípravu proužku pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázy. Filtrační papír byl nejprve impregnován kaseinátem vápenatým a po vysušení na něho byla nanesena směs roztoku enzymu s trehalózou a Elhnanovým činidlem. Jako další nerozpustný nosič může být využito sklo ve formě tenkých kapilár (J. Environmental Anal. Chem. 1980, 8, 277-282), polystyrénová fólie (Toxicol. Appl. Pharmacol. 1984, 73, 105-109) nebo povrch elektrody (NATO ASI Series 1988, 226, 187-194).
Jako další nerozpustný nosič k mobilizaci acetylcholinesteráz slouží i sférické pelety, ty mohou být například tvořené mikrokrystalickou celulózou bez nebo s oxidem hlinitým a koloidním oxidem křemičitým (Čes. Slov. Farm., 2012, 61, 234-239). Patent EP 3196315 (2016) pak chrání možnost imobilizace acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy za pomocí nerozpustného nosiče na bázi magnesiumaluminometasilikátu se specifickým povrchem 200 až 400 m2.g-1, který byl zpracován do sférických pelet spolu alespoň jedním sféronizačním činidlem.
b) Vazba na ionexy
Postup imobilizace cholinesterázy a její stabilizace na celulózové podložce chrání patentový dokument US4324858 (1982). Jako sorbent je zde využit iontoměničový DEAE nebo ECTEOLA papír s bazickými skupinami kovalentně navázanými na celulózu. Jako zdroj cholinesterázy byla využita plazma elektrického úhoře (Electrophorus electricus).
Podobně patentový dokument EP0176585B1 (1988) uvádí jako nosič iontoměničový papír s diethylaminoethylovými skupinami pro impregnaci cholinesterázy z platýze. Nej lepších výsledků bylo dosaženo, když byl iontoměničový papír nejprve ekvilibrován s roztokem chloridu sodného a po promytí a vysušení impregnován roztokem cholinesterázy ve fosfátovém pufru s obsahem sacharózy, dextranu a smáčedla Tween 80. Po vysušení mohl být enzymový papír přechováván v zatavených polypropylenových sáčcích při zachování minimálně poloviční počáteční aktivity po dlouhou dobu za vysoké teploty. K dosažení dobré stability byla nutná přítomnost sacharózy.
c) Vazba na magnetické částice
Magnetické částice s mobilizovanou cholinesterázou byly využity ke stanovení inhibitorů
CZ 2019 - 243 A3 cholinesterázy průtokovou injekční analýzou (FIA). Imobilizovaný protein zde byl uvolněn elektrickým impulzem (Anal. Chim. Acta 1990, 234, 113-117). K FIA je krom magnetických částic možné využít i pouhé porézní sklo (J. Chromatogr. A. 1991, 539, 47-54) případně různé methakryláty (Anal. Chim. Acta 1996, 324, 21-27).
d) Zabudování do membrán a filmů
Patentový dokument US 2475793 (1949) popisuje imobilizovanou cholinesterázu na bezbarvém krevním stromatu, které lze považovat za biologickou membránu, kde je vázána fyzikálními a iontovými vazbami. I po dalších úpravách ovšem enzym nebyl dostatečně stabilní, což vyplynulo ze snižování aktivity uvolněné cholinesterázy z nerozpustného podílu po několikadenním skladování v lednici.
Patentové dokumenty CZ 284970 (1997) a CZ 6566 (1997) chrání platinovou elektrodu s nanesenou grafitovou vrstvou modifikovanou kobaltnatým komplexem ftalocyaninu, která byla potažena membránou s imobilizovanou cholinesterázou. Membrána byla vytvořena nanesením směsi roztoku hovězího séra albuminu, roztoku butyrylcholinesterázy a roztoku glutaraldehydu jako látky síťující bílkoviny a roztoku fosfátového pufiru o pH 7,4. Membrána pak vznikla zaschnutím nanesené vrstvy při pokojové teplotě.
Patentový dokument CN 101586100 (2012) chrání filmy obsahující imobilizovanou cholinesterázu, které jsou vytvořeny z roztoků vodorozpustných polymerů, jakými jsou polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon nebo arabská guma ve fosfátovém pufru. Dále se může jednat o kompozit obsahující kromě vodorozpustného polymeru i „lipoplast“ ve formě lipofilního polymeru. K vytvořeným roztokům se přidává enzym a hovězí sérum albumin. Enzymový film se připravuje jejich nasáknutím nebo nanesením na vhodnou podložku.
Dále existují práce, které popisují zabudování cholinesteráz do polyakrylové membrány, případně pomocí kovalentní vazby na povrch nylonových trubiček, nebo imobilizaci v lipidických membránách lipozomů (Adv. Mat. Res. 2013, 726-731, 850-853). Jsou známy také pokusy o imobilizaci v nitrocelulózovém filmu (Anal. Chim. SSSR 1990, 45, 1002-1004).
e) Zabudování do gelů
Patentový dokument US 4241180 (1980) uvádí imobilizaci cholinesterázy z koňského séra v polysacharidovém gelu na bázi škrobu, agaru nebo karagenanu, který vznikl lyofilizací tuhnoucího gelu na filtračním papíře. Imobilizovaná cholinesteráza pak rozštěpila substrát a vzniklý thiocholin zredukoval modrý 2,6-dichlorfenolindofenol na bezbarvý produkt. Byl-li k roztoku přidán inhibitor cholinesterázy, k odbarvení nedošlo. Nevýhodou takto připravovaných polysacharidových gelů je nízká mechanická pevnost.
Tuto nevýhodu odstraňuje patentový dokument DE2946642 (1988), který využívá vyšších koncentrací škrobu. Připravuje se zde škrobový extrudát, vznikající extruzí škrobové pasty. Ten se následně vysuší, rozemele a přesítuje.
Patentový dokument WO 8300345 (1987) chrání způsob navázání enzymů na kopolymemí gely, obsahující karboxylové skupiny. Nosičem enzymu byl slabě kyselý katex Akrilex C-100, což je parciálně hydrolyzovaný kopolymer akrylamidu s methylen-bis-akrylamidem. Ten ve srovnání s jinými nosiči poskytl nejlepší výsledky. Při srovnávacích experimentech byla úspěšná i imobilizace v zesítěném maleinanhydridu.
Patentový dokument BG 50904 (1992) popisuje imobilizaci cholinesterázy z hovězího, telecího a lidského séra v agarovém gelu. Enzym se na sorbentu zachytil v prostředí s nízkou iontovou silou. Adsorpční vazba enzymu byla při nízké iontové síle dostatečně silná, o čemž svědčilo vymytí balastních bílkovin při promývání roztokem chloridu sodného. Při zvýšení iontové síly se
CZ 2019 - 243 A3 však enzym uvolnil a byl vymyt.
Patentový dokument WO 2009061921 (2009) chrání způsob stabilizace cholinesterázy formou imobilizace v pórech gelu na bázi přírodních i syntetických polymerů. Vedle toho uvádí i stabilizaci ve formě liposomů a nanokompositů a v polyuretanové pěně.
Existují i odborné studie, zabývající se imobilizaci acetylcholinesteráz k analytickým účelům za pomocí fluorimetrie do škrobového gelu, naneseného na polyuretanové podložce (Anal. Chem.1965, 37, 1675-1680) nebo v enzymových polštářcích (Anal. Biochem. 1967, 19, 587592).
f) Zabudování do pěny
Patentový dokument US 6406876B1 (2002) uvádí polyuretanovou pěnu jako prostředek imobilizace cholinesteráz. Tento způsob imobilizace spočívá v reakci aminoskupiny lysinových a argininových zbytků lokalizovaných na povrchu molekuly, přičemž žádná není na vstupu do dutiny aktivního centra. Navázání enzymu proto neblokuje přístup substrátů, inhibitorů a reaktivátorů do katalytického místa. Příprava porézního nosiče zahrnuje použití pre-polymeru a povrchově aktivní látky. Výsledek imobilizace značně závisí na intenzitě míchání během polymerace. Před denaturací vlivem střižných sil chránil mobilizovaný enzym přídavek povrchově aktivních látek, jako je Pluronic C-65, popř. malé množství glycerolu. Imobilizované enzymy jsou stálé i při vyšší teplotě. Při konstrukci biosenzoru mohou být spolu s cholinesterázou koimobilizovány i další enzymy.
Patentové dokumenty US 6759220 (2004) a US 7422892 (2008) obsahují variace ve způsobu přípravy polyuretanové pěny, které ovlivňují jak její vlastnosti, tak i stupeň interakce enzymu s reaktivními skupinami pre-polymeru. Z hydrolytických enzymů zde byly imobilizovány i butyrylcholinesteráza a acetylcholinesteráza. Zařízení s těmito enzymy bylo využito pro kontinuální monitoring různých inhibitorů ve vodě i ve vzduchu.
g) Zesítěné agregáty
Patentový dokument RU 2182929 (2002) uvádí metodu zesítění bílkoviny glutaraldehydem k imobilizaci cholinesterázy z koňského séra. Předmětem ochrany je souprava pro stanovení inhibitorů cholinesteráz s použitím imobilizováného enzymu. Imobilizace byla provedena rovnoměrným nanášením roztoku cholinesterázy z koňské krve v pufiru, spolu se síťujícím činidlem, na pohybující se pás vláknitého materiálu. Nanášení enzymu a činidla probíhalo dvěma oddělenými trubicemi.
Patentový dokument RU 2386120 (2010) chrání optický biosenzor pro detekci ireverzibilních inhibitorů, který obsahuje jako aktivní prvek intenzivně fluoreskující komplex cholinesterázy s reverzibilním inhibitorem - luminogenem. Komplex je imobilizovaný na „neutrální podložce“ uzavřením v N-isopropylakrylamidovém gelu řídce síťovaném methylenbisakrylamidem. Zesítěný gel se připravuje přímo na podložce fotopolymerací.
h) Imobilizace pomocí nanostruktur
Za nový typ nosiče lze považovat uhlíková nanovlákna, která byla nejprve karboxylována a pak ultrazvukem dispergována v roztoku. Po odstranění roztoku vzniká porézní membrána, která může prostřednictvím karbodiimidu sloužit k vazbě cholinesterázy (J. Mater. Chem. B 2014, 2, 915-922).
i) Imobilizace pomocí kovalentní vazby
Při tomto druhu imobilizace se používají specifické vazebné reakce mezi enzymem a substrátem.
CZ 2019 - 243 A3
Patentový dokument US 3519538A (1970) uvádí jako sorbent, který poskytuje s enzymem kovalentní vazbu, silikagel, různé silikáty (bentonit, wollastonit) a oxidy kovů (hliníku, hydroxylapatitu nebo oxidu nikelnatého, jehož vrstvička byla např. získána po oxidaci sítka z niklu). Nosič byl nejprve modifikován reakcí s aminopropyltriethoxysilanem v toluenu. Primární aminoskupiny získaného produktu pak byly využity k navázání enzymů známými postupy imobilizace např. pomocí dicyklohexylkarbodiimidu. Připravený derivát s aromatickými aminoskupinami pak může být diazotován a kopulován s enzymem. Aminoskupiny modifikovaného nosiče mohou být také aktivovány reakcí s thiofosgenem za vzniku derivátu s isothiokyanátovými skupinami, které pak reagují s aminoskupinami enzymu. Nej častěji se ale využívá reakce s glutaraldehydem, kdy se enzym váže za vzniku Schiffových bází.
Předmětem patentového dokumentu DE 1768934 (1972) je mimo jiné obecný způsob imobilizace enzymů na nerozpustný polymemí nosič s kovalentně navázaným reverzibilním inhibitorem. Na ten se pak váže odpovídající enzym, který lze z afinitní vazby uvolnit změnou pH a/nebo iontové síly prostředí, případně vytěsněním kompetitivními látkami nebo substráty.
Patentový dokument US 3809616A (1974) uvádí jako nosič upravený filtrační papír s modifikovaným polyakroleinem s imobilizovanou cholinesterázou z koňského séra. Při imobilizaci cholinesterázy se na polymer (polyakrolein solubilizovaný siřičitany a následně zesítěný reakcí s alifatickým diaminem) navázalo více než tři čtvrtiny enzymu. Cholinesteráza se přitom mohla kovalentně vázat na zbytkové aldehydické skupiny modifikovaného polyakroleinu, ale také mohla být vázána nekovalentními iontovými vazbami na jeho aminoskupiny. Po impregnování roztokem N-methylindoxylbutyrátu v isopropanolu se na papíře postupně objevilo tmavě zelené zbarvení produktu oxidací indoxylu, který vznikl hydrolýzou esteru. V přítomnosti inhibitorů cholinesterázy ve vzduchu ke vzniku zbarvení nedocházelo.
Patentový dokument US 7572764 (2009) uvádí rekombinantní lidskou acetylcholinesterázu nebo purifikovanou acetylcholine sterázu z hovězího fetálního séra a butyrylcholine sterázu, navázané skrze aminoskupinu na rozpustný polymer - methoxypolyethylenglykol 5000 nebo 20 000, který byl aktivovaný sukcinimidylpropionátem. Ve srovnání s nativním enzymem konjugáty lépe odolávají působení krevních proteáz a jsou stabilnější v krevním oběhu. Mohou proto také lépe sloužit k detoxikaci organismu od organofosfátů. Princip aktivace koncových hydroxylových skupin póly etherů deriváty sukcinimidu lze využít nejen pro přípravu rozpustných konjugátů, ale pro přípravu enzymů mobilizovaných na nerozpustných nosičích s hydroxylovými skupinami. Kromě volných aminoskupin mohou být k reakci využity i thiolové skupiny cysteinových zbytků.
Ze stejného principu vychází i patentový dokument WO 2009139905, který chrání konjugáty cholinesterázy s rozpustnými nepeptidickými polymery se zlepšenými vlastnostmi.
Patentový dokument EP 1561100 (2005) uvádí specifický postup vazby acetylcholinesterázy na selektivní tranzistor z oxidu hlinitého prostřednictvím kyanurchloridu. Iontově selektivní tranzistor s mobilizovaným enzymem vytváří biosenzor, z něhož se enzym uvolňuje působením elektrického pole.
Patentový dokument W0200806495 (2008) uvádí imobilizaci acetylcholinesterázy z elektrického úhoře pomocí konjugátu s avidinem, který vznikl působením glutaraldehydu. Konjugát reagoval s biotinem, který byl navázán na povrchu plastové mikrotitrační destičky. Systému je možné využít jako biosenzoru.
Existují práce, které uvádějí vazbu cholinesterázy na piezoelektrický senzor, tvořený křemenným krystalem, povlečeným tenkými vrstvičkami zlata s navázanou monovrstvou 11-merkaptoundekanové kyseliny s derivátem kokainu inhibujícím enzym. Na takto upravený povrch je pak navázána cholinesteráza. V přítomnosti jiných inhibitorů se pak navázaný enzym uvolňuje (Anal. Bioanal. Chem. 2005, 382, 1904-1911).
CZ 2019 - 243 A3
j) Imobilizace pomocí protilátek
Patentový dokument EP O73889(B1) (2003) chrání imobilizaci cholinesterázy na fragment myší protilátky proti lidské sérové cholinesteráze, který je zde fixovaný sorpcí v jamkách polystyrénové mikrotitrační destičky. Tvorby komplexu fragmentu protilátky a cholinesterázy se využívá ke stanovení aktivity cholinesterázy v séru, která při onemocnění cirhózou nebo rakovinou jater klesá. Stanovení je založeno na afinitě další látky k cholinesteráze, a to lektinu z houby mísenky oranžové (Aleuria auratiá), na nějž byl navázán biotin. Cholinesterázy jako glykoproteiny s lektiny interagují.
V analogickém patentovém dokumentu JP 10221344A (2004) se chrání snáze dostupný lektin z čočky a značená protilátka.
Detekční systémy
Na základě výše popsaných mechanismů, uplatňujících se v imobilizaci cholinesteráz, existují detekční systémy, které využívají tyto principy ke konstrukci sofistikovaných zařízení. Ta se dají s různým úspěchem využívat při detekci inhibitorů cholinesteráz například v životním prostředí. Patentový dokument US 3689224 (1972) chrání sofistikované laminované destičkové zařízení kryté polymery monochlorotrifluoroethylenem nebo tetrafluoroethylenem, které je adjustované v hliníkové fólii. Patentový dokument US3809617A (1974) chránící kombinované detekční disky a patentový dokument WO 8504424 (1985) chrání jednoduché detektorové kity s dvěma dotykovými plochami pro detekci látek.
Zcela originálním řešením jsou detekční trubičky pro inhibitory cholinesteráz, kde byl použit lyofilizovaný preparát butyrylcholinesteráza s plnivem želatinou, která zvyšovala stabilitu enzymu (Int. J. Environ. Anal. Chem. 1979, 6, 89-94). Patentový dokument CZ 285242 (1993) popisuje detekční trubičku k indikaci bojových chemických látek na bázi inhibitorů cholinesteráz ve vzduchu a ve vodě.
Z dosavadního stavu techniky vyplývá, že v současné době jsou velmi progresivním způsobem detekce inhibitorů cholinesteráz v terénu tzv. detekční trubičky. Patentový dokument CZ 285242 (1993) uvádí takový detekční systém s obsahem cholinesterázy (acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy). Enzymy mohou být imobilizované na celulózových granulích o rozměrech 0,8 - 1,2 mm, případně na nosičích ve formě sférických pelet o velikosti 0,8 1,25 mm, připravených metodou extruze-sferonizace (Ces. Slov. Farm. 2012, 61, 234-239). Granulát i pelety jsou adjustovány ve skleněných trubičkách. Granule a pelety v tomto detekčním systému však poskytují poměrně málo syté zbarvení a poměrně málo zřetelný a uniformní barevný přechod při enzymatické kolorimetrické reakci, ať už s použitím chromogenních činidel a substrátů nebo samotných chromogenních substrátů. Tento stav se snažil zlepšit patent EP 3196315 (2016), který popisuje možnost imobilizace acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy za pomocí nerozpustného nosiče na bázi magnesiumaluminometasilikátu, který byl zpracován do sférických pelet o rozměrech 0,8 do 1,25 mm a kterými byly detekční trubičky vyplněny. Zde sice docházelo k sytému zabarvení pelet, ale tato barva se postupem času vyplavovala do reakčního prostředí, které rovněž zbarvila, což mohlo způsobit problém v identifikaci barevného přechodu. Tento nedostatek eliminoval vynález CZ 306803 (2016), který spočívá v tom, že enzym acetylcholinesteráza a/nebo butyrylcholinesteráza je imobilizován na povrchu peletových jader ve formě pevné disperze v hydrofilním polymeru, tvořícím primární obal peletových jader, který je následně překryt sekundárním semipermeabilním obalem z vodonerozpustného polymeru. Tak nedochází k vyplavení vzniklé barvy do reakčního prostředí a zkreslení identifikace výsledného zbarvení pelety. Zavření enzymu v obalové vrstvě však vede ke snížení detekční rychlosti a proces dvojitého obalování je zdlouhavý a nákladnější. Tento nedostatek eliminuje řešení popsané v tomto vynálezu.
CZ 2019 - 243 A3
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou obalené sférické matricové pelety, určené pro detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu a/nebo butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru, nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu. Obalené sférické matricové pelety obsahující imobilizovaný enzym na bázi cholinesteráz o aktivitě 1 až 100 nkat.g1, jejichž podstata spočívá v tom, že enzym je v peletách imobilizován na porézním, vodonerozpustném anorganickém materiálu, majícím specifický povrch v rozmezí 200 - 400 m2.g-1, výhodně rovný 300 m2.g-1, sypnou hustotu v rozmezí 0,05 - 0,25 g.l-1, výhodně rovnou 0,15 g.l1 a hodnota pH vodného výluhu se nachází rozmezí 6-8, výhodně je rovna 7,4. Obal je tvořen semipermeabilní membránou, dovolující prostupu vody, zatímco obal sám je vodonerozpustný a zůstane po celou dobu testování na peletě. Výsledné obalené sférické matricové pelety mají průměr velikosti ze 75 % v rozmezí velikosti 0,1 - 3,0 mm, výhodně 0,8 1,25 mm.
Podíl mobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz na porézním, vodonerozpustném organickém materiálu tvoří 0,01 až 1 % hmotnosti, vztaženo na celkovou hmotnost jader obalovaných sférických matricových pelet, což je dostatečné k zajištění výsledné aktivity v rozmezí 1 -100 nkat.g1. Enzym na bázi cholinesterázy tvoří acetylcholinesteráza a/nebo butyrylcholinesteráza, případně jejich směs v jakémkoliv poměru, výhodněji je zde obsažena butyrylcholinesteráza samotná.
Výhodně je porézní, vodonerozpustný anorganický materiál tvořen aluminiummetasilikátem spolu s alespoň jednou sféronizační pomocnou látkou, kterou výhodně tvoří mikrokrystalická celulóza. Obsah porézního, vodonerozpustného anorganického materiálu ve směsi s alespoň jedním sféronizačním činidlem tvoří 1 - 90 % hmotnosti, výhodněji 5 - 50 % hmotnosti jádra obalené sférické matricové pelety.
Obal sférických matricových pelet je tvořen deriváty akrylátu, estery a étery celulózy, šelakem, polyvinylacetátem, případně jejich směsí v libovolném poměru v celkové koncentraci od 0,1 do 15 % hmotnosti obalené sférické matricové pelety. Výhodně je tvořen směsí kopolymeru ethylakrylátu, methylmethakrylátu a esteru amonné soli methakrylové kyseliny (použita pod komerčním názvem Eudragit® RL, Evonik, Německo). Prostupnost vody obalem lze z časového hlediska zvýšit přísadou ve vodě rozpustných látek, které v obalu vytvoří póry, umožňující rychlý přístup činidla k jádru pelety s obsahem imobilizovaného enzymu. Mezi tyto vodorozpustné látky patří polyethylenglykol a/nebo polyvinylpyrrolidon, případně jejich směs. Výhodný hmotnostní poměr Eudragit® RL : polyethylenglykol : polyvinylpyrrolidon činí 1,5-6,5 : 0,5-1,7 : 0,1-0,5, přičemž celková koncentrace obalu činí 1 - 10 % hmotnosti obalené sférické matricové pelety. Obal je nanesen z lihového roztoku na sférické matricové peletové jádra podle uvedeného příkladu 4.
Jádra obalených sférických matricových pelet se vyrábějí metodou extruze-sféronizace nebo rotogranulace podle příkladu 1, přičemž cholinesteráza se na jádra aplikuje ponořením peletových jader do impregnační suspenze dle příkladu 3, a po vysušení dojde k její imobilizaci. Impregnovaná jádra se dále obalují nástřikem rozpuštěných, resp. dispergovaných, komponent obalu ve fluidním loži, přičemž obal se rovnoměrně vytváří na jejich povrchu, aniž by po ukončení nástřiku bylo nutné další tepelné úpravy obalu, jak je uvedeno v příkladu 4. Uvedené příklady přitom dané řešení nad rámec popisu vynálezu nikterak neomezují. Obalené sférické matricové pelety se adjustují do skleněných detekčních trubiček v množství nezbytném k dosažení aktivity imobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz od 0,1 do 100 nkat, výhodně 3 nkat, v jedné detekční trubičce.
Předmětem vynálezu je rovněž detekční trubička pro detekci inhibitorů chlolinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu a/nebo butyrylthiocholinu za vzniku
CZ 2019 - 243 A3 odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje výše definované obalené sférické matricové pelety, substrátový acetylthiocholin a/nebo butyrylthiocholin a chromogenní činidlo.
Z výše uvedeného je zřejmé, že se vynález týká složení sférických matricových obalených pelet s obsahem imobilizovaného enzymu acetylcholinesterázy, resp. butyrylcholinesterázy, (případně jejich směsi v jakémkoliv poměru) o aktivitě 1 až 100 nkat.g1, které jsou adjustovány ve formě skleněných detekčních trubiček. Trubičky s adjustovanými peletami slouží pro detekci nervově paralytických látek v potencionálně kontaminovaném prostředí.
Trubička obsahuje dvě vrstvy a dvě skleněné ampulky s roztoky. Indikační vrstva obsahuje pelety s imobilizovanou acetylcholinesterázou a/nebo butyrylcholinesterázou. Další vrstva obsahuje drcené sklo impregnované substrátovým acetylthiocholinem a/nebo butyrylthiocholinem a chromogenním činidlem - kyselina 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoová), Ellmanovo činidlo. Obě ampulky jsou plněny roztokem pufiru o pH 6-9.
Při detekci se ampulka u indikační vrstvy rozbije kovovým bodcem a její obsah se setřepe na pelety. Do trubičky se nasaje ekvivalentní objem vzduchu. Poté se rozbije druhá ampulka a její obsah se setřese přes drcené sklo až na pelety. Hodnotí se změna zabarvení vrstvy s obsaženými peletami. Pokud dojde ke žlutému zabarvení, ovzduší neobsahuje NPL. V opačném případě zůstane vrstva beze změny, případně dochází ke žlutému zbarvení až po delší době. Jedno z možných provedení uvedené detekční trubičky je znázorněno na obr. 1, kde 1 je ampulka s tlumivým roztokem, 2 jsou vymezovací a těsnící tělíska, 3 je indikační vrstva s peletami a 4 je vrstva drceného skla se substrátem a indikátorem, případně jen s chromogenním substrátem.
Principem detekce NPL je enzymatická kolorimetrická reakce, kdy v nepřítomnosti NPL dochází k hydrolýze acetylthiocholinu, resp. butyrylthiocholinu, cholinesterázou na příslušnou kyselinu a thiocholin. Thiocholin dále reaguje s kyselinou 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoovou) za vzniku kyseliny 2-nitro-5-thiobenzoové (viz obr. 2). Kyselina 2-nitro-5-thiobenzoová pak způsobí žluté zabarvení detektoru, které lze vyhodnotit pouhým okem nebo spektrofotometricky při 412 nm. Pokud ke změně barvy nedojde, jedná se o kontaminaci ovzduší NPL, kdy NPL inhibuje enzym a nedochází k uvolnění thiocholinu a následné barevné reakci. Detekční trubičku lze využít i pro zjištění přítomnosti NPL ve vodě.
Kromě kyseliny 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoové) lze k detekci NPL využít i jiná chromogenní činidla nebo chromogenní substráty, např. indoxylacetát, kdy hydrolýzou indoxylacetátu vzniká indoxyl a kyselina octová. Indoxyl se poté samovolně přeměňuje na indigo a roztok se zbarvuje do modra (obr. 3). Postup práce s trubičkou je zde obdobný.
Dosavadní řešení imobilizace enzymů ve vodorozpustných membránách CN101586100 (2012) nebo pelet adjustovaných ve formě trubiček s obsahem pelet EP3196315 (2016) mají tu nevýhodu, že při testování dochází k vyplavení zabarvení do vnějšího prostředí, čímž se snižuje intenzita zbarvení samotných pelet. V případě EP3196315 (2016) se z těla pelet uvolňuje zabarvení do vnějšího, tekutého prostředí, které pak zhoršuje sledovat intenzitu zabarvení samotných pelet. Tuto nevýhodu odstranila řešení chráněné vynálezem CZ306803, který popisuje imobilizaci enzymu na povrchu pelet ve vodorozpustné membráně ve formě primárního obalu, který je obalen ještě další vodonerozpustnou (sekundární obal), avšak semipermeabilní membránou. Sekundární obal nerozpustný ve vodě dovolí prostupu vody s činidlem k primárnímu obalu. Zde pak dojde k barevné reakci. Obal, který zůstává zachován, pak zpomalí odplavení vzniklého barviva do vnějšího prostředí. To se viditelně projeví i v intenzitě zabarvení tohoto prostředí, jejíž intenzita je přímo úměrná koncentraci uvolněného barviva. Řešení popsané ve vynálezu ovšem podstatně snižuje rychlost detekce a citlivost (viz obr. 4).
Současné řešení ve formě obalených sférických matricových pelet má pak oproti stavu techniky
CZ 2019 - 243 A3
CZ306803 tu výhodu, že zde nedochází ke snížení rychlosti detekce a citlivosti díky zabudování enzymu v matricovém jádru pod nerozpustnou vrstvou (jednotlivé hodnoty jsou uvedeny v příkladu 10 - tabulce 4). Je zde využito synergického jevu, kdy magnesiumaluminiummetasilikát díky vysokému měrnému povrchu a výhodnému pH udržuje enzym/y aktivní po delší dobu. Zároveň je přítomností vnější nerozpustné semipermeabilní membrány zabráněno vyplavování enzymu do detekčního roztoku, což vede ke vzniku intenzivnějšího žlutého zbarvení v případě nepřítomnosti NPL. Díky absenci dvojitého obalu se zde i výrazněji uplatní osmotický efekt jádra, které rychleji příjme vodu s obsahem potenciálně přítomného organofosfátu, což urychlí reakci. Redukce obalových vrstev ze dvou na jednu podstatně zjednodušuje a zkracuje i proces přípravy obalených sférických matricových pelet. Obalová vrstva pak výhodně umožní detekci NPL i ve vodních zdrojích, jelikož pelety se ve vodném prostředí nerozpadnou a zůstanou ve formě nerozpustné matrice. Proto se mluví obalených sférických matricových peletách. Schéma vyobrazené na obr. 4 umožňuje obecné porovnání výhod popsaného řešení se současným stavem techniky.
Objasnění výkresů:
Obr. 1 je příklad konstrukce detekční trubičky.
Obr. 2 je reakční schéma Ellmanovy reakce.
Obr. 3 je reakční schéma s indoxyacetátem.
Obr. 4 je schéma vývoje nosičů na bázi pelet s principy a výhodami jednotlivých provedení.
Příklady uskutečnění vynálezu
Způsob přípravy podle vynálezu je objasněn následujícími příklady provedení, aniž by jimi byl rozsah vynálezu omezen.
Příklad 1
Tab. 1 Složení pelet v hmotnostních dílech
| Neusilin® US2 | Avicel® PH 101 | Avicel® RC581 | Pharmatose® 200 M | Kollidon® 90 |
| 39,15 | 28,27 | 7,09 | 12,48 | 13,01 |
• Laktózu monohydrát (Pharmatose® 200 M), Neusilin® US2, Avicel® PH 101 a Avicel® RC 581 smísíme po dobu pěti minut v rychloběžném mixéru (Stephan UMC 5, A. Stephan u. Sóhne GmbH & Co., Německo) až vznikne homogenní suchá směs.
• Kollidon® 90 za stálého míchání rozpustíme ve fosforečnanovém pufiru o pH 7,4 (dle Ph. Eur.) na elektromagnetické míchačce, čímž získáme pojivový roztok.
• K suché směsi postupně přilijeme roztok pojivá a mísíme 5 minut v rychloběžném mixéru (Stephan UMC 5, A. Stephan u. Sóhne GmbH & Co., Německo) do vzniku vlhké disperze.
• Vlkou hmotu extrudujeme sítem o velikosti otvoru 1,00 mm na extrudéru (PharmTex 35T, Wyss and Probst Engineering, Švýcarsko) při rychlosti 60 rpm.
• Extrudát sféronizujeme na sferonizéru (PharmTex 35T, Wyss and Probst Engineering, Švýcarsko) při rychlosti 1000 rpm po dobu 20 minut.
• Vzniklé pelety vysušíme při teplotě 30 °C po dobu 72 hod. (Horo 038A, Dr. Ing. A.
CZ 2019 - 243 A3
Hoffman GmbH, Německo) do vlhkosti pod 0,5 %.
Příklad 2
Tab. 2 Relativní četnost sítových frakcí v % hmotnosti
| Velikost sít [mm] | Frakce [hmota. %] |
| >2,00 | 0,72 |
| 2,00 - 1,25 | 30,27 |
| 1,25 - 1,00 | 46,84 |
| 1,00-0,80 | 19,47 |
| 0,80-0,50 | 2,68 |
| 0,50 - 0,25 | 0,02 |
| <0,25 | 0,00 |
| Střední průměr pelet | 1,23 mm |
Pro další zpracování (impregnaci - viz následující příklad 3) se provede sítové třídění tak, aby se minimálně 75 % pelet nacházelo v rozmezí 0,8 - 1,25 mm.
Příklad 3
Impregnace peletových jader enzymem • Připraví se suspenze obsahující enzym butyrylcholinesterázu (Sigma-Aldrich, USA) se specifickou aktivitou 62,5 nkat.ml1, 5 % dextranu a 0,5 % Spolaponu 247 ve fosfátovém pufru o pH 7,6.
• K impregnaci 100 g pelet bylo použito 80 ml suspenze.
• Pelety zůstaly ponořeny v suspenzi po dobu 15 min s následným 24hodinovým sušením při teplotě 35 °C.
Příklad 4
Tab. 3 Složení obalů určených pro potah peletových jader
| Složení na 100 g peletových jader | |||
| Šarže | a | b | c |
| Obal [%] | 1,500 | 2,500 | 5,000 |
| Eudragit® RL [g] | 1,125 | 1,875 | 3,750 |
| Polyethylenglykol 400 [g] | 0,300 | 0,500 | 1,000 |
| Kollidon® 25 [g] | 0,075 | 0,125 | 0,250 |
| Ethanol 96% [g] | 7,880 | 13,130 | 26,250 |
| Celkem [g] | 9,375 | 15,625 | 31,250 |
CZ 2019 - 243 A3 • Eudragit® RL se na elektromagnetické míchačce rozpustí v ethanolu 96% a do roztoku se za stálého míchání přidá polyethylenglykol 400, případně Kollidon® 25, a směs se míchá až do úplného rozpuštění přidaných látek.
• Roztok se poté nastříkne na povrch pelet s již ukotveným enzymem ve fluidním zařízení ΜΙ 00 (Medipo, Česká republika) při teplotě 40 °C, velikosti trysky 1 mm a tlaku vzduchu 1-2 bar. Obalené pelety se následně dosuší při 25 °C po dobu 24 hodin.
• Pro další zpracování (adjustaci do detekčních trubiček - viz následující příklad 5) je možné provést sítové třídění tak, aby se minimálně 75 % obalených pelet nacházelo v rozmezí 0,8 1,25 mm.
Příklad 5
Kompozice detekční trubičky
Trubička obsahuje (ve směru proudění kontaminovaného vzduchu):
• Ampulku s roztokem pufru (objem 0,03 ml).
• Vrstvu drceného skla impregnovaného substrátem a indikátorem (případně jenom substrátem), délka vrstvy 10 mm, hmotnost vrstvy asi 0,1 g.
• Vrstvu sférických obalových matricových pelet s imobilizovaným enzymem (vždy jednotlivě a, b, nebo c - dle příkladu 4), délka vrstvy 10 mm, hmotnost asi 0,05 g.
• Ampulku s roztokem pufru (objem 0,03 ml).
Vrstvy jsou upevněné a vzájemně oddělené vymezovacími tělísky z polyethylenu, propouštějícími plyn i kapalinu (ve tvaru hvězdiček).
Příklad 6 • Obě ampule obsahují fosfátový pufir o hodnotě pH 8,0.
• Drcené sklo o změní 0,7-0,9 mm je impregnované methanolovým roztokem obsahujícím 2 % acetylthiocholin jodidu a 0,2 % kyseliny 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoové).
• Vzorek obalených matricových pelet s imobilizovaným enzymem acetylcholinesterázou o aktivitě 10 nkat/g nosiče.
• Indikační efekt - funkční enzym - žluté zabarvení vrstvy, po inhibici zůstává bílá.
Příklad 7 • Obě ampule obsahují fosfátový pufir o hodnotě pH 7,4.
• Drcené sklo o změní 0,7-0,9 mm je impregnované methanolovým roztokem obsahujícím 2,5 % butyrylthiocholin jodidu a 0,15 % 2,6-dichlorfenolindofenolu.
• Vzorek obalených matricových pelet s imobilizovaným enzymem butyrylcholine sterázou o aktivitě 30 nkat/g nosiče.
• Indikační efekt - fúnkční enzym - dochází k odbarvení modré vrstvy, po inhibici zůstává modrá.
CZ 2019 - 243 A3
Příklad 8 • Obě ampule obsahují fosfátový pufir o hodnotě pH 8,2.
• Drcené sklo o změní 0,7-0,9 mm je impregnované 2% methanolovým roztokem indoxylacetátu.
• Vzorek obalených matricových pelet s imobilizováným enzymem butyrylcholine sterázou o aktivitě 30 nkat/g nosiče.
• Indikační efekt - funkční enzym - dochází ke vzniku modrého zabarvení, po inhibici zůstává bílá.
Příklad 9 • Obě ampule obsahují fosfátový pufir o hodnotě pH 7,4.
• Drcené sklo o změní 0,7-0,9 mm je impregnované methanolovým roztokem obsahujícím 1 % acetylthiocholin jodidu, 1 % butyrylthiocholin jodidu a 0,15 % 2,6dichlorfenolindofenolu.
• Vzorek obalených matricových pelet s imobilizovanou směsí enzymů acetylcholinesterázy a butyrylcholinesterázy o aktivitě 20 nkat/g nosiče (u obou).
• Indikační efekt - funkční enzym - dochází k odbarvení modré vrstvy, po inhibici zůstává modrá.
Obecné schéma provedení detekční trubičky a jej i náplně je znázorněno na obr. 1.
Příklad 10 • Pro simulaci inhibice enzymu nervovými látkami byl použit roztok fýzostigminu (reverzibilního inhibitoru) v množství 0,2 ml, který byl použit k navlhčení pelet namísto čištěné vody.
• Inkubační doba byla 10 minut.
• Následně bylo přidáno 0,2 ml testovacího roztoku (směs příslušného substrátu a Ellmanova činidla) a po následujících 120 sekund byl vzorek vizuálně hodnocen.
• Plně inhibovaný vzorek si během této doby zachoval původní bílou barvu. Použitím různých předem definovaných koncentrací (0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0 a 8,0 pg fýzostigminu na 1 ml) testovacích roztoků fýzostigminu byla zjištěna minimální inhibiční koncentrace fýzostigminu (citlivost).
Tab. 4 Srovnání citlivosti (limitů detekce) a rychlosti detekce
| Sledované parametry | Patent CZ306803 | Předmět vynálezu Kompozice a, b, c dle příkladu 4 |
| Citlivost (fyzostigmin) | 8 pg/ml | 0,5 pg/ml |
| Rychlost detekce | >45 s | 10-15 s |
CZ 2019 - 243 A3
Postup práce s trubičkou • Rozdrtíme vrchní ampulku a setřepeme její obsah na vrstvu pelet s enzymem.
• Provedeme odběr vzorku kontaminovaného vzduchu (ruční nebo elektrickou pumpičkou, objem 1 litr vzduchu).
• Počkáme 2 minuty (doba inkubace).
• Rozdrtíme spodní ampulku a její obsah setřepat přes vrstvu drceného skla až na vrstvu pelet (smýt impregnovaná činidla).
• Vyhodnotíme změnu zabarvení vrstvy pelet. Pokud vzduch není kontaminován, systém pracuje normálně a dochází k redukci chromogenního činidla nebo hydrolýze chromogenního substrátu, což je doprovázeno barvenou změnou (zabarvení nebo odbarvení indikační vrstvy). V přítomnosti kontaminantů se zabarvení indikační vrstvy po určitou dobu nemění. Na základě délky této doby lze určit koncentraci kontaminantů v ovzduší.
Průmyslová využitelnost
Obalené sférické matricové pelety by mohly mít uplatnění v průmyslové výrobě detekčních trubiček k zjišťování inhibitorů cholinesteráz, zejména nervově paralytických bojových chemických látek a dalších vojensky významných sloučenin s podobným mechanismem toxického účinku. Jednoduché detekční prostředky tohoto typu jsou standardní součástí technické výbavy vojenských chemických jednotek a chemických specialistů v oblasti ochrany obyvatelstva.
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Obalené sférické matricové pelety určené pro detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu a/nebo butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenniho substrátu a obsahující imobilizovaný enzym na bázi cholinesteráz o aktivitě 1 až 100 nkat.g1 vyznačené tím, že enzym je v peletách imobilizován na porézním, vodonerozpustném anorganickém materiálu o specifickém povrchu v rozmezí 200 400 m2.g-1, výhodně 300 m2.g-1, o hodnotě pH vodného výluhu v rozmezí 6-8, výhodně 7,4, přičemž tyto pelety jsou obaleny semipermeabilním obalem z vodonerozpustného polymeru, kde celková koncentrace obalu činí 0,1 - 15 % hmotnosti sférických obalených matricových pelet a průměr výsledné velikosti obalených sférických matricových pelet se minimálně ze 75 % nachází v rozmezí velikosti 0,1 - 3,0 mm, výhodně 0,8 - 1,25 mm.
- 2. Obalené sférické matricové pelety podle nároku 1, vyznačené tím, že enzym na bázi cholinesterázy je acetylcholinesteráza a/nebo butyrylcholinesteráza, výhodně butyrylcholinesteráza, přičemž podíl imobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz v porézním, vodonerozpustném organickém materiálu je roven 0,01 až 1 % hmotnosti, vztaženo na celkovou hmotnost obalených sférických matricových pelet, k zajištění výsledné aktivity imobilizovaného enzymu v rozmezí 1-100 nkat.g1.
- 3. Obalené sférické matricové pelety podle nároků 1-2, vyznačené tím, že porézní, vodonerozpustný anorganický materiál je aluminiummetasilikát, jehož obsah je v rozmezí 1-90 % hmotnosti, výhodně 5 - 50 % hmotnosti jádra obalené sférické matricové pelety.
- 4. Obalené sférické matricové pelety podle nároků 1-3, vyznačené tím, že semipermeabilní, vodonerozpustný polymer je tvořen deriváty akrylátů, estery a étery celulózy, šelakem, polyvinylacetátem v celkové koncentraci od 0,1 do 15 % hmotnosti obalené sférické matricové pelety, výhodně směsí kopolymeru ethylakrylátu, methylmethakrylátu a esteru amonné soli methakrylové kyseliny pod komerčním názvem Eudragit® RL ve směsi s polyethylenglykolem a/nebo póly viny Ipyrrolidonem v jejich vzájemném poměru 1,5-6,5 : 0,5-1,7 : 0,1-0,5.
- 5. Obalené sférické matricové pelety podle nároků 1-4, vyznačené tím, že se peletové jádra s obsahem imobilizovaného enzymu určená k nanášení obalu vyrobí metodou extruze-sféronizace nebo rotogranulace a obal se nanese nástřikem ve fluidním loži.
- 6. Obalené sférické matricové pelety podle nároků 1-5, vyznačené tím, že se sférické obalené matricové pelety adjustují do skleněných detekčních trubiček v množství nezbytném k dosažení aktivity imobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz v rozmezí 1 - 10 0 nkat, výhodně 3 nkat v jedné detekční trubičce.
- 7. Detekční trubička pro detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu a/nebo butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenniho substrátu vyznačená tím, že obsahuje obalené sférické matricové pelety podle nároků 1-6, substrátový acetylthiocholin a/nebo butyrylthiocholin a chromogenní činidlo, případně jen chromogenní činidlo.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-243A CZ308597B6 (cs) | 2019-04-17 | 2019-04-17 | Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-243A CZ308597B6 (cs) | 2019-04-17 | 2019-04-17 | Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2019243A3 true CZ2019243A3 (cs) | 2020-10-29 |
| CZ308597B6 CZ308597B6 (cs) | 2020-12-23 |
Family
ID=73015424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2019-243A CZ308597B6 (cs) | 2019-04-17 | 2019-04-17 | Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ308597B6 (cs) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL3196315T3 (pl) * | 2016-01-19 | 2020-07-13 | Oritest Spol. S R.O. | Kuliste pelety, proces produkcyjny takich peletów, zastosowanie oraz rurka detekcyjna zawierająca takie pelety |
| CZ2016311A3 (cs) * | 2016-05-26 | 2017-07-12 | Oritest Spol. S R.O. | Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz |
-
2019
- 2019-04-17 CZ CZ2019-243A patent/CZ308597B6/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ308597B6 (cs) | 2020-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240011011A1 (en) | Biocatalytical composition | |
| Liang et al. | Co-immobilization of multiple enzymes by metal coordinated nucleotide hydrogel nanofibers: improved stability and an enzyme cascade for glucose detection | |
| Tukel et al. | Immobilization and kinetics of catalase onto magnesium silicate | |
| Chiou et al. | Immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan with activation of the hydroxyl groups | |
| Broun | [20] Chemically aggregated enzymes | |
| US6048546A (en) | Immobilized lipid-bilayer materials | |
| Kawamura et al. | Stability of immobilized α‐chymotrypsin | |
| Kayastha et al. | Pigeonpea (Cajanus cajan L.) urease immobilized on glutaraldehyde-activated chitosan beads and its analytical applications | |
| Ghanem et al. | Immobilization of glucose oxidase in chitosan gel beads | |
| Kim et al. | Immobilization methods for affinity chromatography | |
| Kang et al. | The properties of covalently immobilized trypsin on soap‐free P (MMA‐EA‐AA) latex particles | |
| Cao et al. | PEI-crosslinked lipase on the surface of magnetic microspheres and its characteristics | |
| CA1223382A (en) | Immobilization of proteins on polymeric supports | |
| Othman et al. | Kinetic and thermodynamic study of laccase cross-linked onto glyoxyl Immobead 150P carrier: characterization and application for beechwood biografting | |
| CA2082496A1 (en) | Controlled release vehicle | |
| JP2548240B2 (ja) | 固定化リグニン複合体およびその利用 | |
| CZ2019243A3 (cs) | Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz | |
| CZ2016311A3 (cs) | Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz | |
| EP0176585B1 (en) | Enzyme paper for the indication of cholinesterase-inhibitors, the preparation and use thereof | |
| EP3196315B1 (en) | Spherical pellets, manufacturing process of such pellets, use, and a detection tube comprising such pellets | |
| Zhang et al. | Immobilization of hemoglobin on chitosan films as mimetic peroxidase | |
| AU2002303565A1 (en) | Positive response biosensors and other sensors | |
| Schandl et al. | The role of Na+ and Ca+ ions on the action of pancreatic lipase studied with the help of immobilisation techniques | |
| Yu et al. | Microencapsulation of tannase by chitosan–alginate complex coacervate membrane: synthesis of antioxidant propyl gallate in biphasic media | |
| JPH0757760B2 (ja) | 生体由来物質の固定化方法 |