CZ2018133A3

CZ2018133A3 - Přípravek na bázi interpenetrujících polymerních sítí pro hojení ran

Info

Publication number: CZ2018133A3
Application number: CZ2018-133A
Authority: CZ
Inventors: Lenka Poláková; Zdeňka Sedláková; Rafal POREBA; František RYPÁČEK
Original assignee: Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Priority date: 2018-03-15
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2019-09-25
Also published as: CZ308284B6

Abstract

Předkládané řešení poskytuje krycí přípravek s antimikrobiálním a protizánětlivým účinkem urychlující hojení ran, vyznačený tím, že obsahuje dva biokompatibilní polymery A a B ve formě interpenetrující sítě, přičemž polymer typu A je připravený radikálovou polymerací nebo polyadicí a obsahuje alespoň jeden typ strukturních jednotek odvozených od terciárních aminů, a polymer typu B je připravený radikálovou polymerací nebo polyadicí a obsahuje alespoň jeden typ strukturních jednotek odvozených od stericky stíněných aminů.

Description

Oblast techniky

Předmětem vynálezu je přípravek na bázi interpenetrujících polymerních sítí, který upravuje prostředí ran tím, že efektivně odstraňuje mikroorganismy i zánětlivé procesy v ráně, čímž významně urychluje průběh hojení rány.

Dosavadní stav techniky

V posledních desetiletích dochází k výraznému nárůstu počtu pacientů, kteří trpí chronickým poraněním kůže, nejčastěji bércovými vředy, proleženinami, dekubity. Neustále se navyšující míra prevalence v této oblasti je významnou měrou ovlivněna zejména vzrůstajícím podílem diabetických, obézních a stárnoucích jedinců v populaci, tedy především těmi skupinami pacientů, jejichž imunitní systém zpravidla bývá do určité míry narušen. Uvádí se například, že zhruba 2% obyvatel České republiky - tedy každý padesátý - onemocní v průběhu svého života bércovým vředem. Statistika dále uvádí, že v současnosti trpí chronickým poraněním kůže (otevřené rány na nohou, proleženiny, diabetická noha) až 650 000 pacientů v Německu a až 18% celkové populace ve Velké Británii. Odhaduje se, že v celé Evropě činí aktuální objem pacientů trpících tímto druhem chronického onemocnění kůže zhruba 3,5 milionu. Všechny druhy poranění významně limitují pacienty, snižují kvalitu jejich života a v krajních případech život i ohrožují.

Hojení ran je komplexní lyziologický proces, charakteristický svými čtyřmi rozdílnými, vzájemně se prolínajícími fázemi (exsudativní, proliferativní, diferenciační, remodelační). V průběhu první, zánětlivé fáze produkují buňky imunitního systému reaktivní kyslíkové sloučeniny (reactive oxygen species, ROS), které se uvolňují do extracelulámí tekutiny, exsudátu. Mezi hlavní typy ROS se řadí nejen kyslíkové radikály (např. hydroxylové, peroxylové, hydroperoxylové radikály či superoxid anion radikály), ale i kyslíkové sloučeniny elektroneutrální povahy, které jsou za určitých podmínek schopny generovat reaktivní kyslíkové radikály v důsledku své chemické dekompozice (peroxid vodíku, kyselina dusičná, kyselina chlomá). Při nízké koncentraci plní ROS v exsudativní fázi hojení velmi důležitou roli, neboť přispívají k čištění rány, zejména od mikrobiálních kontaminantů. V zasažených buňkách jsou zároveň aktivovány enzymy (proteasy), jejichž činnost spočívá mimo jiné v odstraňování odumřelých buněk a tkáně. U rány, jejíž průběh hojení nevykazuje žádné abnormality, trvá tato zánětlivá fáze zhruba 2-3 dny, během nichž systém plynule přechází do dalších fází hojení. Vlivem nadměrné reakce imunitního systému však může dojít k porušení křehké rovnováhy mezi mírou stimulace prozánětlivých mediátorů odpovědných za tvorbu ROS a aktuální koncentrací ROS v místě poranění. V důsledku této nerovnováhy dochází k masivní produkci ROS, která dramaticky převyšuje antioxidační kapacitu okolních buněk, a tím dochází ke zhoršení hojení vlivem narůstajícího oxidativního stresu. Pro přiblížení na buněčnou a molekulární úroveň, reaktivní radikály ve svém nadbytku neselektivně atakují i zdravé buňky, u nichž jsou schopny peroxide vat fosfolipidickou dvoj vrstvu, která je podstatou buněčné membrány. Toto oxidativní poškození vede až k závažnému porušení celistvosti obalu buňky, následované vytečením cytoplazmy a buněčnou smrtí. Některé radikály jsou rovněž schopny penetrovat do vnitřního prostoru buňky a nevratně poškodit její DNA. Nadměrná lokální koncentrace ROS má zásadní vliv i na mikroorganismy, které jsou přítomny v ráně, neboť ty v prostředí oxidativního stresu mohou vytvářet biofilm, který je velmi odolný proti oxidativnímu působení neustále se generujících dalších ROS. Hojení rány se tímto cyklem reakcí prakticky zastaví v první exsudativní fázi, a rána se tak stává chronickou.

Mezi nejčastější druhy patogenních mikroorganismů, schopných vytrvale kolonizovat prostředí chronických ran na kůži, patří zejména kmeny Staphylococcus aureus, Staphylococcus

- 1 CZ 2018 - 133 A3 epidermidis a Pseudomonas aeruginosa:. infekce na sliznici potom bývají způsobeny zejména patogeny Escherichia coli a Candida albicans. Jedním z důvodů vysoké odolnosti těchto jednobuněčných organismů může být zejména jejich schopnost tvořit za vnějších podmínek, které jsou pro ně nepříznivé (např. zvýšená míra oxidativního stresu vyvolaná nepřiměřenou reakcí imunitního systému hostitele), resistentní biofilm. Rezistence mikrobů v biofilmu vůči dosavadnímu způsobu léčby mikrobiální infekce bývá zpravidla jednou z hlavních příčin vleklých, chronických onemocnění kůže i sliznice.

K tradiční terapii chronických ran se řadí nejrůznější obklady s dezinfekčním účinkem, masti s antibiotiky, barevné tinktury, masti a pasty s obsahem kovů. Mnohé z těchto dermatologických prostředků mají značný senzibilizační potenciál, a mohou tak být příčinou alergických a toxických reakcí. Navíc dlouhodobá léčba chronických ran antibiotiky způsobuje, že se mikrobi stávají vůči daným antibiotikům resistentní, a je tedy nezbytné je při léčbě nahradit novými, účinnějšími. Časté užívání antibiotik může vyvolávat závažné vedlejší systémové účinky na organismus, jakými jsou např. porušení střevní mikroflóry, kolitida, alergické reakce, útlum krvetvorby, poškození ledvin. Tradiční krytí mají navíc omezenou savost a neudržují optimální vlhkost rány, která pak často vysychá nebo naopak maceruje. Rovněž jsou nutné častější kontroly rány a převazy, čímž je rána vystavována riziku další infekce, její teplota se snižuje a hojení stagnuje. Výsledek léčby s pomocí těchto tradičních krytí je tak často nejistý, proces hojení zdlouhavý, v neposlední řadě i neekonomický.

Na základě současných znalostí o procesu hojení ran a z poznatků o působení dosud známých používaných prostředků lze formulovat obecné požadavky, které by měl optimální prostředek pro léčbu a hojení ran splňovat, aby svým působením co nej efektivněji pokrýval všechny uvedené fáze hojení rány.

a) V první fázi by prostředek měl tlumit rozvinutí počátečního zánětu, zejména schopností likvidovat nadměrné množství ROS, čímž omezí jejich toxické působení na buňky a tkáně, a tím předejde řetězové reakci imunitního systému doprovázené tvorbou dalších ROS.

b) Následně by prostředek měl zabránit rozvinutí zánětlivé fáze tím, že omezí možnost průniku bakteriální infekce do rány, a to jak fyzicky mechanickým krytím rány, k čemuž musí mít vhodné materiálové a fyzikální vlastnosti, tak omezením proliferace bakterií aktivně, působením baktericidních složek.

c) Prostředek by měl podporovat a urychlovat proces hojení tím, že zajistí optimální fyziologické podmínky pro vlastní biologické procesy hojení, zahrnující enzymatickou degradaci a resorpci složek poškozené tkáně, diferenciaci buněk nové tkáně a postupnou remodelaci rány. Prostředek - kryt by proto měl mít takové fyzikální vlastnosti, aby nedocházelo k hromadění tekutiny a maceraci rány, a současně, aby rána nevysychala, nevytvářel se strup, a v ráně byla udržována optimální vlhkost zajišťující vlhké hojení.

d) V neposlední řadě je nutné, aby jakékoliv biologicky aktivní složky případně obsažené v prostředku nepronikaly otevřenou ránou do vnitřního prostředí organismu, a nemohly tak vyvolat nežádoucí systémové účinky. To se týká jak složek určených k likvidaci ROS, tak zejména látek s baktericidním účinkem, např. antibiotik, jejichž nepříznivé dopady jsou diskutovány výše.

V odborné literatuře (L. C. Paslay, et al.·, Biomacromolecules 2012, 13, 2472-2482) jsou popsány polymemí (meth)akrylamidy obsahující ve své struktuře kovalentně vázané primární a terciární aminy vykazující antibakteriální vlastnosti. Autoři uvádějí i mechanismus antibakteriálního účinku těchto polymerů, který vychází z interakce aminových skupin na polymeru s fosfolipidickou vrstvou bakteriální buňky, jež ve výsledku vede k narušení buněčné membrány a cytolýze. Autoři článku popisují ve vodném médiu rozpustné lineární polymery o molekulové hmotnosti (M_n < 7 200 Da). Pro možnost použití takovýchto polymerů ke krytí otevřené rány je třeba brát v úvahu riziko pramenící z toho, že vodorozpustné polymery o takto nízké molekulové

-2CZ 2018 - 133 A3 hmotnosti budou nepochybně pronikat do rány a krevního oběhu, a mohou tak vykazovat nežádoucí systémové účinky mimo ránu.

Příprava hydrogelových krytí pro léčbu a prevenci při hojení ran je podstatou patentu CZ 293419 B6. Tento patent uvádí hydrofilní klasické (nikoliv interpenetrující) polymemí sítě ve formě gelu či krycí fólie, které při aplikaci na zánětlivé poranění pokožky urychlují proces hojení. Polymery tvořící síť obsahují kovalentně vázaný stericky stíněný amin, případně nitroxid či hydroxylamin, které jsou schopné vázat na sebe volné radikály a fungují v ráně jako lapače ROS (antioxidanty). Polymemí sítě mohou vedle složky s antioxidačním účinkem obsahovat i antimikrobiální složku ve formě kvartemí ammoniové soli, kterou lze připravit dodatečnou reakcí alkylhalogenidu s terciárními aminoskupinami zabudovanými do struktury polymeru. Tato dodatečná kvartemizace s sebou přináší zřejmé nevýhody, mezi které patří zejména schopnost alkylhalogenidů reagovat se stericky stíněnými aminy i jejich deriváty, čímž ve výsledné polymemí síti dochází ke snížení koncentrace aktivních skupin, které jsou schopny lapat ROS. Dále, uvedenou modifikační reakcí polymeru rovněž výraznou měrou narůstají náklady na výrobu polymeru, a to jak z hlediska ceny výchozích surovin, tak i z hlediska čistění polymeru po reakci, neboť odstraňování nezreagovaných alkylačních činidel z polymemí sítě je časově i ekonomicky náročný proces.

Kromě uvedeného, sloučeniny na bázi alkylhalogenidů vykazují značný senzibilizační potenciál, a jsou rizikové i z hlediska ekologického, neboť jsou pro organismus i životní prostředí toxické. Dalším nedostatkem polymemích přípravků dle patentu CZ 293419 B6 je i skutečnost, že rozsah, v němž lze variovat zastoupení antioxidačních/antimikrobiálních komponent polymemí sítě vzniklé jedinou radikálovou polymerizací, je výrazně omezen vzájemnou reaktivitou funkčních monomerů, tj. jejich kopolymeračními parametry.

Pro prevenci a urychlení hojení ran tak stále existuje potřeba moderního krytí zejména chronických ran, které kromě základní funkce bariéry plní i další funkce, jež se specificky uplatňují v různých fázích hojení. Ačkoliv v patentové literatuře i na trhu lze v současné době nalézt řadu moderních krytí ran přispívajících k urychlení procesu hojení chronických infikovaných ran, žádné z těchto krytí nesplňuje všechny požadavky kladené na optimální krytí. Antimikrobiální a protizánětlivé látky samostatně či současně jsou do hydrogelových krytí přidávány jako nízkomolekulámí sloučeniny nebo lineární polymery, případně dispergované malé částice, které se při aplikaci uvolňují do organismu, čímž dochází k postupnému snižování efektivní koncentrace aktivní složky v místě účinku, a současně organismus je navíc vystaven nežádoucím vedlejším efektům těchto látek.

Podstata vynálezu

Zjistili jsme nyní, že výše uvedené nedostatky dosavadního stavu techniky lze odstranit vytvořením přípravku na bázi intcrpcnctrujících sítí tvořených polymery s kovalentně navázanými biologicky aktivními funkčními jednotkami. Zjistili jsme rovněž, že další výše uvedené nevýhody dosavadního stavu techniky lze odstranit využitím strukturních jednotek polymemí sítě nesoucích terciární aminoskupinu, čímž je podle vynálezu dosaženo vynikajících antimikrobiálních vlastností přípravku bez nutnosti kvartemizace.

Předmětem vynálezu je polymemí přípravek pro krytí ran na bázi interpenetrujících sítí, určený k prevenci a hojení ran. Přípravek zahrnuje kombinaci dvou nebo více biokompatibilních polymemích sítí, které jsou interpenetrující, tj. jsou alespoň částečně propleteny, nejsou však vzájemně spojeny kovalentní vazbou. V předkládaném vynálezu alespoň jedna polymemí síť obsahuje ve své struktuře funkční složku s antimikrobiálním účinkem a alespoň jedna polymemí síť obsahuje ve své struktuře funkční složku schopnou potlačovat zánětlivé procesy v ráně (protizánětlivá, antioxidační složka). Jednotlivé funkční složky jsou kovalentně zabudované do polymemích sítí, čímž je efektivně zabráněno jejich uvolňování do organismu, které by mohlo vést k nežádoucím systémovým účinkům. Zároveň při aplikaci na ránu nedochází ke snižování

-3 CZ 2018 - 133 A3 lokální koncentrace funkční antioxidační ani antimikrobiální složky v důsledku jejich vstřebávání do organismu, čímž se, oproti přípravkům s uvolňujícími se nízkomolekulámími složkami, které se používají v jiných prostředcích pro hojení ran, významně prodlužuje doba, po kterou jsou obě funkční složky v kontaktu s chronickou ránou. Přístup využívající technologii interpenetrujících sítí umožňuje zavést antimikrobiální a protizánětlivé složky do jednotlivých polymemích sítí, přičemž koncentrace těchto složek v dílčích sítích může být kontrolována nezávisle, a může tedy být i relativně vysoká, čehož by nebylo možné dosáhnout například zabudováním všech komponent do jedné polymemí sítě, neboť obsah monomemích jednotek a jejich vzájemný poměr je omezen kopolymeračními parametry a reaktivitou výchozích komonomerů. Vzájemná interpenetrace (prostoupení) obou polymemích sítí dále zajišťuje homogenní dispergaci funkčních složek ve výsledném polymemím produktu, což rovněž příznivě ovlivňuje antimikrobiální a protizánětlivou účinnost přípravku.

Interpenetrující sítě podle předloženého vynálezu umožňují kovalentní zabudování obou funkčních složek, tj. protizánětlivých i antimikrobiálních, do struktury jednotlivých polymemích sítí, aniž by tyto musely být spolu přímo kopolymerovány. Navíc, technologie interpenetrujících sítí umožňuje připravit funkční polymemí materiál z komonomerů, které by jednou polymerační metodou vůbec kopolymerizovatelné nebyly, neboť při přípravě interpenetrujících sítí lze kombinovat i různé polymerační metody, např. lze jednu polymemí síť připravit radikálovou polymerací, a druhou polymemí síť polykondenzací/polyadicí.

Polymemí sítě mohou být obecně tvořeny řetězci polymeru jednoho strukturního typu nebo řetězci dvou či více typů, vzájemně propojených kovalentními vazbami do jedné sítě. Interpenetrující sítě (IPN) jsou systémy tvořené dvěma nebo více polymemími sítěmi, které jsou v makromolekulámím měřítku vzájemně propleteny, nejsou však vzájemně spojeny kovalentními vazbami, a není možno je od sebe oddělit bez porušení pevných chemických vazeb. Jsou-li polymemí sítě připraveny ve formě interpenetrujících sítí, vykazuje tato výsledná síť do určité míry vlastnosti obou či více jednotlivých sítí, případně může dojít až k synergickému účinku daných vlastností. Interpenetrující sítě se svými vlastnostmi a kombinací vlastností jednotlivých propletených sítí odlišují od konvenčních polymemích produktů tvořených stejnými strukturními jednotkami.

Jsou-li polymemí sítě tvořeny alespoň z části hydrofilními polymery, pak se takové sítě ve vodě nerozpouštějí, ale ve vodném prostředí přijímají mezi řetězce vodu a vodou bobtnají. Pro polymemí sítě (gely) bobtnající ve vodě se používá termín hydrogely.

Přípravek podle vynálezu obsahuje nejméně dva typy interpenetrujících polymemích sítí, vykazujících odlišné funkce v procesu hojení chronických ran. Tyto alespoň dvě polymemí sítě jsou zde označeny jako polymer typu A a polymer typu B.

Polymer typu A se vyznačuje schopností upravovat prostředí chronických ran tím, že účinně redukuje množství patogenních mikroorganismů kontaminujících ránu, zejména kmeny Staphylococcus aureus, methicilin-resistentní Staphylococcus aureus (MRSA), Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans.

Polymer typu A obsahuje:

- alespoň jeden typ antimikrobiálních strukturních jednotek A-l odvozených od monomerů obecného vzorce:

-4CZ 2018 - 133 A3 kde R¹ je -H nebo -CH3, Z je -O- nebo -NH-, W je -(CHzjm-, kde m=l až 12, R² a R³ je -H nebo alkyl Ci až C12; a s výhodou

- alespoň jeden typ strukturních jednotek vybraných ze skupiny zahrnující jednotky odvozené od kyseliny akrylové a methakrylové a jejich solí, akrylamidu a methakrylamidu, alkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylamidů a methakrylamidů, iV-vinyl-2-pyrrolidonu, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, a/nebo polymer typu A obsahuje:

- alespoň jeden typ antimikrobiálních strukturních jednotek A-2 odvozených od monomerů obecného vzorce:

W*

R kde R⁴ je alkyl Ci až C12, W¹ a W² je -(Clkjn-X nebo -CH2-CH2-(OCH2-CH2)n-X², kde n=l až 20, X¹ a X² je -H, -OH, -NH2, -NCO a zároveň alespoň jedno z X¹, X² je -OH, -NH₂, -NCO, a s výhodou alespoň jeden typ strukturních jednotek vybraných ze skupiny zahrnující:

- strukturní jednotky odvozené od propan-1,2-diolu, 2,2-dimethylpropan-l,3-diolu, cyklohexan-

1,4-diolu, l,4-bis(hydroxymethyl)cyklohexanu, 2-(2-hydroxyethoxy)ethan-l- olu, 1,3diaminopentanu, 2,2,4-trimethylhexan-l,6-diisokyanátu, 2,4,4-trimethylhexan-l,6- diisokyanátu, isoforon diisokyanátu, cyklohexan-l,4-diisokyanátu, dicyklohexylmethan- 4,4'-diisokyanátu;

- a/nebo strukturní jednotky odvozené od monomerů obecného vzorce:

o kde o=3 až 12 a W³ je -OH, -Nil· nebo -NCO;

- a/nebo strukturní jednotky odvozené od monomerů obecného vzorce:

-5 CZ 2018 - 133 A3 wt νΚ

R

...1.. ,..z W kde p, q, r=0 až 100, W⁴ je -OH, -Nil· nebo -NCO a R⁵ je -H nebo -CH3.

Soli zde zejména zahrnují soli alkalických kovů, není-li uvedeno jinak.

Strukturní jednotky A-l v polymere typu A jsou s výhodou odvozeny od 2V-[3(dimethylamino)propyl] methakrylamidu nebo [2-(dimethylamino)ethyl]methakrylátu.

Obsah strukturních jednotek A-l v polymeru typu A je 1 až 99 molámích %, s výhodou 2 až 30 molámích %.

S výhodou jsou strukturní jednotky A-l elektroneutrální nebo ve formě soli.

Strukturní jednotky A-2 v polymeru typu A jsou s výhodou odvozeny od A,A-bis(2hydroxyethyljmethylaminu.

Obsah strukturních jednotek A-2 v polymeru typu A je 1 až 99 molámích %, s výhodou 1 až 50 molámích %.

Uvedený polymer typu A lze připravit:

a) radikálovou polymerizací monomerů obecného vzorce:

R v

0^'

X z

w k

kde R¹ je -H nebo -CH3, Z je -O- nebo -NH-, W je -(CHzjm-, kde m=l až 12, R² a R³ je -H nebo alkyl Ci až C12, a s výhodou

- monomerů vybraných z kyseliny akrylové a methakrylové a jejich solí, akrylamidu a methakrylamidu, alkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylamidů a methakrylamidů, A-vinyl-2-pyrrolidonu, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů.

nebo

b) polyadicí monomerů obecného vzorce:

-6CZ 2018 - 133 A3 $

w kde R⁴ je alkyl Ci až C12, W¹ a W² je —(Cl I2)n—X¹ nebo C l I2 C I UfOCI I2 C I Dn X², kde n=l až

20, X¹ a X² je -H, -OH, -NH2, -NCO a zároveň alespoň jedno z X¹, X² je -OH, -NH2, -NCO, a s výhodou

- monomerů vybraných z propan-1,2-diolu, 2,2-dimethylpropan-l,3-diolu, cyklohexan-l,4-diolu,

1.4- bis(hydroxymethyl)cyklohexanu, 2-(2-hydroxyethoxy)ethan-l -olu, 1,3-diaminopentanu,

2.2.4- trimethylhexan-l ,6-diisokyanátu, 2,4,4-trimethylhexan-l ,6-diisokyanátu, isoforon diisokyanátu, cyklohexan-l,4-diisokyanátu, dicyklohexylmethan-4,4'-diisokyanátu;

- a/nebo monomerů obecného vzorce:

kde o=3 až 12 a W³ je -OH, -NH₂ nebo -NCO;

- a/nebo monomerů obecného vzorce:

kde p, q, r=0 až 100, W⁴ je -OH, -NH₂ nebo -NCO a R⁵ je -H nebo -CH3.

Polymer typu B je vyznačený schopností upravovat prostředí ran tím, že obsahuje chemické skupiny schopné vázat či inaktivovat látky nepříznivě ovlivňující zánětlivé procesy v ráně (antioxidační, protizánětlivé).

Uvedený polymer typu B obsahuje:

- alespoň jeden typ strukturních jednotek B-l odvozených od monomerů obecného vzorce:

kde R⁶ je -H, -OH, kyslíkový radikál nebo alkyl Ci až C4, R⁷ až R¹⁰ je alkyl Ci až C4, Z¹ je CH/Y¹)- nebo -CH/Y^CHz-, kde Y¹ je radikálově polymerizovatelná chemická skupina

CZ 2018 - 133 A3

ch₂ kde R¹¹ je -H nebo -Cll·, a Z² je -O- nebo -NH-, a s výhodou

- alespoň jeden typ strukturních jednotek vybraných ze skupiny zahrnující jednotky odvozené od kyseliny akrylové a methakrylové a jejich solí, akrylamidu a methakrylamidu, alkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylamidů a methakrylamidů, ÍV-vinyl-2-pyrrolidonu, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, a/nebo polymer typu B obsahuje:

- alespoň jeden typ antioxidačních strukturních jednotek B-2 odvozených od monomerů obecného vzorce:

«TV γ

R'“ kde R¹² je -H, -OH, kyslíkový radikál nebo alkyl Ci až C4, R¹³ až R¹⁶ je alkyl Ci až C4, Z³ je CH(Y²)- nebo -CH(Y²)CH2-, kde Y² je -OH, -NH2, -NHC(=O)NH₂, -(CH₂)_S-W⁵, kde s=l až 6 a W⁵ je -OH nebo -NH₂, a s výhodou alespoň jeden typ strukturních jednotek vybraných ze skupiny zahrnující

- a/nebo strukturní jednotky odvozené od monomerů obecného vzorce:

W^: kde t=3 až 12 a W⁶ je -OH, -Nil· nebo -NCO; - a/nebo strukturní jednotky odvozené od monomerů obecného vzorce:

w'..

-8CZ 2018 - 133 A3 kde u, v, w=0 až 100, R¹⁷ je -H nebo -Clh a W⁷ je -OH, -Nil· nebo -NCO.

Strukturní jednotky B-l v polymeru B jsou s výhodou odvozeny od ÍV-(2,2,6,6-tetramethylazinan4-yl)methakrylamidu nebo 2,2,6,6-tetramethylazinan-4-yl-methakrylátu.

Obsah strukturních jednotek B-l v polymeru B je 1 až 45 molámích %, s výhodou 1,5 až 15 molámích %.

Strukturní jednotky B-2 v polymeru B jsou s výhodou odvozeny od 4-amino-2,2,6,6tetramethylpiperidinu, 4-amino-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1 -oxylu, 4-hydroxy-2,2,6,6tetramethylpiperidinu nebo 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1 -oxylu.

Obsah strukturních jednotek B-2 v polymeru B je 0,1 až 20 hmotnostních %.

Uvedený polymer typu B lze připravit:

a) radikálovou polymerizací monomerů obecného vzorce:

kde R⁶ je -H, -OH, kyslíkový radikál nebo alkyl Ci až C4, R⁷ až R¹⁰ je alkyl Ci až C4, Z¹ je

-Cl KY¹)- nebo -CH(Y¹)CH₂-, kde Y¹ je radikálově polymerizovatelná chemická skupina

R'' kde R¹¹ je -H nebo -CH3 a Z² je -O- nebo -NH-, a s výhodou

- monomerů vybraných z kyseliny akrylové a methakrylové a jejich solí, akrylamidu a methakrylamidu, alkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylamidů a methakrylamidů, iV-vinyl-2-pyrrolidonu, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, nebo

b) polyadicí monomerů obecného vzorce:

CZ 2018 - 133 A3

R

R-

kde R¹² je -H, -OH, kyslíkový radikál nebo alkyl Ci až C4, R¹³ až R¹⁶ je alkyl Ci až C4, Z³ je CH(Y²)- nebo -CH(Y²)CH2-, kde Y² je -OH, -Nil·, -NHC(=O)NH², -(CH2)_S-W⁵, kde s=l až 6 a W⁵ je -OH nebo -NH₂, a s výhodou

2.2.4- trimethylhexan-l ,6-diisokyanátu, 2,4,4-trimethylhexan-l ,6-diisokyanátu, isoforon diisokyanátu, cyklohexan-l,4-diisokyanátu, dicyklohexylmethan-4,4'-diisokyanátu; - a/nebo monomerů obecného vzorce:

kde t=3 až 12 a W⁶ je -OH, -NH₂ nebo -NCO;

- a/nebo monomerů obecného vzorce:

kde u, v, w=0 až 100, R¹⁷ je -H nebo -CH3 a W⁷ je -OH, -NH₂ nebo -NCO.

Hmotnostní poměr polymerů typu A : polymerů typu B v přípravku podle vynálezu se nachází v rozmezí 0,1 až 10, přičemž vhodným nastavením tohoto poměru v rámci uvedeného intervalu je umožněno optimalizovat rozsah vlastnosti, které jsou kladeny na výsledný polymemí přípravek pro hojení ran.

Polymery typu A a polymery typu B jsou ve formě interpenetrujících sítí, tedy nejsou vzájemně propojeny kovalentní vazbou, ale jsou propleteny tak, že bez porušení kovalentních vazeb v polymerech je nelze oddělit. Typicky se interpenetrující sítě získávají tak, že se nejprve vytvoří první polymemí síť, ta se následně impregnuje monomery pro tvorbu druhé polymemí sítě, které se pak podrobí polymeraci. Tento postup lze opakovat dále, je-li žádoucí vytvořit více interpenetrujících sítí.

IPN tak představují praktickou možnost přípravy, resp. výroby produktu s optimálními fýzikálněchemickými vlastnostmi, kterých zpravidla nelze docílit pouhou kopolymerací různých funkčních monomerů do jednoho polymemího řetězce, nebo směsí kopolymerů, kopolymemích a terpolymemích sítí, blokových kopolymerů či roubovaných polymerů. Výhodou technologie IPN je možnost v již existující polymemí síti připravené jedním polymerizačním procesem syntetizovat druhou nebo další polymemí síť odlišným polymerizačním procesem, využívajícím jiný mechanismus polymerace. Například v polymemí síti vytvořené z monomerů radikálovou polymeraci lze připravit polymemí síť z monomerů polymerujících adiční polymeraci nebo polykondenzací. To umožňuje vytvořit výslednou interpenetrující síť (IPN) obsahující strukturní jednotky odvozené od různých monomerů, které by jinak, vzhledem ke své chemické struktuře a reaktivitě, spolu polymer netvořily.

- 10CZ 2018 - 133 A3

Podle předkládaného vynálezu tak lze nastavit obsah funkčních skupin aktivních při vázání ROS (antioxidačních, protizánětlivých) nezávisle na obsahu strukturních jednotek s antimikrobiálním účinkem, a to v širokém rozsahu jejich koncentrací, přičemž obě tyto biologicky aktivní složky jsou kovalentně pevně vázány k polymemí síti, nemohou se vstřebávat do krevního oběhu a nežádoucím způsobem působit systémově, a jejich účinek je tak výhradně lokální na povrchu rány.

Antimikrobiálního či baktericidního účinku polymemího přípravku podle vynálezu může být dosaženo zabudováním strukturních jednotek obsahujících terciární aminy, případně kvartemí amoniové sole. Tyto struktury jsou ionogenní a při fyziologickém pH nesou náboj. Přítomnost ionogenních skupin v jednoduché polymemí síti zvyšuje její bobtnání ve vodném prostředí, a tím může negativním způsobem ovlivnit i její mechanické vlastnosti. Podle předkládaného vynálezu lze tento vliv ionogenních skupin ve výsledném přípravku kompenzovat volbou struktury interpenetrující sítě tím, že další síť obsahuje strukturní jednotky příznivě podporující dobré mechanické vlastnosti, jako jsou pevnost, pružnost a houževnatost. To umožňuje dosáhnout příznivých mechanických vlastností přípravku i při vyšším obsahu ionogenních baktericidních složek.

Polymemí přípravek dle předkládaného vynálezu určený k prevenci a hojení ran může být s výhodou aplikován na postižené místo ve formě krycí fólie, suspenze, emulze, gelu či masti. Vytvořené ochranné krytí rány je elastické, prodyšné, případně i průhledné, umožňující průběžnou vizuální kontrolu rány.

Přípravek je chemicky stabilní v mikroprostředí rány, nepodléhá chemické degradaci v přítomnosti sekretu z rány. Při kontaktu s exsudátem přípravek bobtná, a umožňuje tak odvádění exsudátu z rány. Interpenetrující polymemí síť, která je základem přípravku, obsahuje ve své struktuře funkční složky, které jsou schopny z exsudátu vázat škodliviny v něm obsažené, čímž pozitivně přispívá k procesu hojení.

Pro iniciaci radikálové kopolymerizace se použijí iniciátory, jejichž výběr nejlépe koresponduje se zvoleným polymerizačním postupem, a z něj vyplývajícími podmínkami polymerizace. Mezi nejběžnější druhy radikálových iniciátorů patří například iniciátory termické (azoiniciátory, diacylperoxidy a jiné typy peroxosloučenin), UV iniciátory, které generující radikály vlivem UV záření, nebo redoxní iniciátory, které generují radikály na základě oxidačně-redukčních reakcí. Iniciace se však nemusí omezovat jen na uvedené typy iniciátorů.

Pro přípravu síťovaných polymerů radikálovou kopolymerizací lze použít jako síťovadlo monomery vybrané ze skupiny zahrnující ethylenglykol-diakrylát a dimethakrylát, oligo(ethylenglykol)-diakryláty a dimethakryláty, MM-iiicthylcnbisakrylainid a bismethakrylamid, MM-cthylcnbisakrylamid a bismethakrylamid, l,r-divinyl-3,3'-(ethan-l,rdiyl)bis(2-pyrrolidinon), 2,3-dihydroxybutan-l,4-diyl-diakrylát nebo dimethakrylát, případně jiná síťovadla, jež se běžně používají v tomto oboru.

Pro urychlení polyadiční reakce v laboratorním i průmyslovém měřítku lze použít katalyzátory, přičemž při jejich výběru by mělo být zohledněno složení výchozí polymerační směsi i struktura výsledného polymeru. Mezi vhodné typy katalyzátorů patří organické báze, organické kyseliny a organometalické sloučeniny, zahrnující zejména l,4-diaza-bicyklo[2,2,2]oktan, 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en, l,5,7-triaza-bicyklo[4,4,0]dec-5-en, A,A,A',A'-tetramethyl-2,2’oxybis(ethylamin), M/V-di methyl-/V-hcxadccy 1ani i η, /V,/V-di methyl-Mcy klohexy 1ami n,

M/Vdimethyl- Mbcnzylainin, A,A-bis(2-dimethylaminoethyl)-A-methylamin, M/V-dicyklohcxyl/Vniethylaniin, difenylfosfát, methansulfonová kyselina, trifluormethansulfonová kyselina, acetylacetonát železitý, dibutylcíndilaurát, dibutylcíndichlorid, triethylendiamin. Katalýza se však nemusí omezovat jen na konkrétně uvedené typy katalyzátorů. Použití i jiných typů

- 11 CZ 2018 - 133 A3 katalyzátorů známých odborníkům v oblasti adičních reakcí je v souladu s předkládaným vynálezem.

Pro přípravu síťovaných polymerů polyadicí lze použít jako síťovadlo látky vybrané ze skupin polyfunkčních alkoholů nebo polyfunkčních aminů, zahrnujících například nízkomolekulámí propan-l,2,3-triol, 2,2-bis(hydroxymethyl)propan-l,3-diol, bis(2-hydroxyethyl)amin, tris(2hydroxyethyljamin, 2-(hydroxymethyl)-2-ethylpropan-l,3-diol, případně jiná síťovadla, která se běžně používají v tomto oboru. S výhodou lze použít jako síťovadla rovněž -OH, -NH2 nebo NCO terminované polymemí prekurzory na bázi blokových a hvězdicovitých kopolymerů ethylenglykolu a propylenglykolu, jejichž funkčnost je vyšší než 2.

Termín „oligo“ označuje 2 až 20 opakujících se strukturních jednotek.

Polymemí přípravek dle předloženého vynálezu může kromě interpenetrující polymemí sítě obsahovat další farmaceuticky přijatelné přídavné látky v závislosti na konečné formě přípravku, kterou podle konkrétní aplikace může být tekutina (suspenze, emulze), polotuhý přípravek (mast, krém, gel, pasta), tuhý jednodávkový přípravek (čípky, globule, tablety), krycí fólie (pro aplikaci v suchém stavu nebo ve zbotnalém stavu), součást multivrstevnatého krytí. Takovými pomocnými látkami jsou například stabilizátory, emulgátory nebo látky zvyšující viskozitu, dále také parafiny, rostlinné oleje, živočišné tuky, syntetické acylglyceroly, vosky, polyalkylsiloxany, mastné oleje s koloidním oxidem křemičitým, škrob, deriváty celulózy, karbomery a křemičitany hořečnato-hlinité, želatina, povrchově aktivní látky, kluzné látky, látky s adsorpčními vlastnostmi, voda, glycerol. Typy pomocných látek vhodných pro příslušné aplikační formy jsou všeobecně známé v obora farmaceutických přípravků. Dále může přípravek obsahovat plnivo, které absorbuje zápach z chronické rány, s výhodou aktivní uhlí.

IPN podle předkládaného vynálezu mohou být realizovány v různých aplikačních formách. Jednou z vhodných forem jsou částice tvořené IPN, které ve vhodném médiu bobtnají a vytvářejí suspenzi měkkých mikrogelů. Vhodným médiem pro tvorbu takových suspenzí jsou voda, vodné roztoky solí a ve vodě rozpustné, nebo s vodou mísitelné fyziologicky kompatibilní látky. Podle obsahu a bobtnavosti částic IPN se může konzistence suspenzí měnit v široké škále od volně tekoucích tekutin, aplikovatelných např. stříkáním, přes roztíratelné gely až po polotuhé pasty. Velikost částic IPN v těchto suspenzích může být v rozmezí od mikrometrů až po několik milimetrů. Částice IPN pro tyto účely mohou být připraveny již v procesu polymerace sítě, např. postupy disperzní nebo srážecí polymerace, nebo mohou být získány mechanickou dezintegrací vysušeného gelu mletím či drcením.

Jinou vhodnou aplikační formou IPN jsou plošné polymemí kryty, např. filmy nebo fólie. Fólie mohou být připraveny polymerací sítí v tenké vrstvě, která může být vytvořena například litím, nebo polymerizací ve formě o vhodné geometrii. Dílčí polymemí sítě tvořící IPN ve fólii mohou být bi-kontinuální, nebo jedna z dílčích sítí může tvořit diskrétní domény v další kontinuální síti. Fólie IPN tvořená bi-kontinuálními sítěmi může být například připravena prosycením fólie tvořené polymerem A polymerizační směsí pro polymer B a následnou polymerizací směsi. Fólie IPN obsahující diskrétní domény jedné z dílčích sítí může být například vytvořena dispergací a zbobtnáním částic sítě polymeru A v polymerizační směsi pro polymer B a následnou polymerací směsi ve vhodné formě.

Různé alternativní technologie přípravy aplikačních forem jsou známé v obora přípravy krytů pro rány, a jejich přiměřené použití je v souladu s podstatou předkládaného vynálezu.

Přípravky podle vynálezu mohou dále obsahovat další farmaceuticky účinné složky, například složky určené pro lokální uvolnění z polymemí matrice. Může se jednat například o analgetika, látky urychlující hojení rány, růstové faktory, vitamíny (zejména C a E), kosmetika, apod. Tyto látky mohou být do polymemí matrice tvořené interpenetrovanou sítí alespoň jednoho polymeru typu A a alespoň jednoho polymeru typu B vneseny známými způsoby, například impregnací či

- 12CZ 2018 - 133 A3 adsorpcí, a mohou být v matrici vázány nekovalentními interakcemi, nebo vazbami závislými na pH či vlhkosti, což usnadní jejich žádoucí lokální uvolnění v místě aplikace přípravku.

Průmyslová využitelnost předkládaného vynálezu se odvíjí od klíčových vlastností produktu. Antimikrobiální funkční skupiny likvidující bakterie, anebo chránící ránu před bakteriální infekcí, a protizánětlivé funkční skupiny potlačující rozvoj zánětlivých procesů v ráně jsou pevně zabudované do polymemího materiálu přípravku, čímž je účinně zabráněno jejich uvolňování do krevního oběhu a případným nežádoucím systémovým účinkům. Tohoto zabudování se docílí kovalentní vazbou.

Interpenetrující síť ve formě nejméně dvou kovalentně síťovaných polymerů specifikovaných v popisu vynálezu není vstřebávána kůží ani sliznicí, nevstupuje do krevního oběhu, ani nepodléhá rozkladu na nízkomolekulámí látky, které by mohly být organismem vstřebávány. Polymery jsou chemicky neutrální a nepodléhají degradaci v prostředí rány.

Struktura interpenetrujících sítí umožňuje, aby polymemí přípravek vykazoval vysokou bobtnavost v exsudátu chronických ran. Při aplikaci přípravku na ránu tak při kontaktu s exsudátem nedochází k vysychání rány, a zároveň, biologicky aktivní strukturní jednotky A-l a B-l zabudované do struktury IPN zůstávají v přímém kontaktu s činiteli ovlivňujícími průběh hojení, zejména ROS a infikujícími mikroorganismy.

Objasnění výkresů

Obr. 1 Časová závislost relativní intensity fluorescence fluoresceinu v přítomnosti in šitu generovaných peroxylových radikálů a různé koncentrace IPN připravené podle Příkladu 1 (3 1 mg, o 2 mg, · 5 mg; slepý vzorek).

Obr. 2 Fotodokumentace antimikrobiálního účinku IPN dle Příkladu 4 proti Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis (A, C). Polyurethanová matrice byla zvolena jako reference (B, D).

Obr. 3 Viabilita lidských fibroblastů po 24 h inkubaci při 37 °C s extraktem z IPN dle Příkladu 4 při různých stupních ředění.

Obr. 4 Scavenging aktivita IPN ve formě fólie dle Příkladu 7 proti in šitu generovaným superoxid anion radikálům v závislosti na koncentraci vzorku v reakční směsi.

Obr. 5 Scavenging aktivita IPN, terpolymeru a směsi dvou sítí proti in šitu generovaným peroxylovým radikálům po 60 min reakce v závislosti na koncentraci vzorků v reakční směsi.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Směs 16,0 g 2-hydroxyethyl-methakrylátu, 1,0 g A-(2,2,6,6-tetramethylazinan-4yl)methakrylamidu, 120 mg ethylenglykol-dimethakrylátu a 100 mg 2,2’-azobis(2methylpropionitril) u byla rozpuštěna ve 200 ml toluenu. Polymerizační reakce probíhala po dobu 24 h při 70 °C. Výsledný polymer ve formě částic polymemí sítě byl poté odfiltrován, opakovaně extrahován horkým toluenem a vakuově vysušen. 10,0 g polymemí sítě bylo nabobtnáno ve směsi 45 g toluenu, 1,2 g A-[3-(dimethylamino)propyl]methakrylamidu, 3,8 g 2hydroxyethylmethakrylátu, 54 mg ethylenglykol-dimethakrylátu a 148 mg 2,2'-azobis(2-methylpropionitril)u. Polymerizace probíhala 24 h při 70 °C. Vzniklá IPN byla za horka odfiltrována, promývána směsí toluen : aceton (2:1) při 50 °C a vakuově vysušena.

- 13 CZ 2018 - 133 A3

Příklad 2

Antioxidační aktivita IPN z Příkladu 1 byla testována proti peroxylovým radikálům. Generace těchto reaktivních kyslíkových radikálů probíhala termickým rozpadem 2,2'-azobis(2methylpropionamidin) dihydrochloridu (AAPH), přičemž in šitu vznikající peroxylové radikály jsou schopny oxidovat fluorescein, což vede k poklesu intensity jeho fluorescence v měřeném roztoku. Přítomnost peroxylových radikálů i antioxidantu lze tedy detekovat fluorimetricky. Experiment byl proveden dle následujícího postupu. Do šesti zkumavek s příslušným množstvím polymeru bylo nadávkováno 1,4 ml fosfátového pufru (PBS, 20 mM; pH = 6,8) a 300 μΐ roztoku fluoresceinu v PBS (2,4 x ΙΟ^-5 M). Vzorky byly temperovány v termobloku 60 min při 37 °C. Generace peroxylových radikálů byla odstartována přídavkem 100 μΐ roztoku 2,2’-azobis(2methyl-propionamidin) dihydrochloridu v PBS (0,46 Μ). V určených časových intervalech byla, po odfiltrování polymeru, změřena intensita fluorescence filtrátu. Pro každý vzorek bylo měření opakováno dvakrát. Z výsledků je zřejmé (Obr. 1) že IPN vykazuje vysokou, koncentračně závislou efektivitu proti in šitu generovaným peroxylovým radikálům.

Příklad 3

Protimikrobní účinnost IPN připravené podle Příkladu 1 byla testována následujícím způsobem. 10,0 g IPN bylo nabotnáno ve směsi 55 ml poly(ethylenglykol)u (průměrná M_n = 300) a 45 ml vody. Mikrobiální kmeny Staphylococcus aureus MRSA, Pseudomonas aeruginosa a Candida albicans byly sterilně zaočkovány přímo do gelu, a metodou počítání živých zárodků na pevných půdách (colony forming units, cfu) v daných časových intervalech byla následně stanovena účinnost gelu proti jednotlivým kmenům. Z výsledků uvedených v Tabulce 1 je zřejmé, že IPN vykazovala vysokou efektivitu proti uvedeným mikrobiálním kmenům.

Tabulka 1 Protimikrobní účinnost gelu obsahujícího IPN z Příkladu 1.

Očkovaný drah mikroorganismů	Aplikovaná dávka cfii/1 ml	Nález počtu kolonii v 1 ml přípravku
0. den	6. hod	12. hod	24. hod	36. hod	48. hod
S. ai/reiis MRSA	4,6 x 10⁶	5.5 x 10“	5,6 x 1(F	1,1 x Hť	3 x 10²	<1 x Hř
P. aeruginosa CCM1961	2,5 x 10®	• 1 s. 10¹	<1 x I0¹	<1 x IG^!	<1 x 10¹	<4 x i 0¹
C. albicans CCM 8215	5,6 x 10⁵	7,6 x 10“	8,0 x 10²	<1 x 10^s	l x IO^:	<1 x fit

Příklad 4

Směs 1,3 g [2-(dimethylamino)ethyl]methakrylátu, 0,9 g poly(ethylenglykol)methylethermethakrylátu (průměrná M_n = 500), 54 mg ethylenglykol-dimethakrylátu a 120 mg 2,2’-azobis(2- methyl-propionitrilju byla rozpuštěna ve 29 ml toluenu. Polymerizace probíhala 24 h při 70 °C. Po ukončení reakce byl výsledný polymer (polymer A) izolován filtrací, promýván toluenem za horka a vakuově vysušen. 25,0 g polymemí sítě A bylo homogenně dispergováno ve směsi 150 g poly(ethylenglykol)u (M_n = 600) a 50 g acetonu. Poté bylo přidáno 0,9 g propan1,2,3-triolu, 9,0 g A,A,A',A'-tetramethyl-2,2’-oxybis(ethylamin)u a 56,8 g //-hexan-1,6diisokyanátu ve 200 g acetonu. Směs byla probublána dusíkem a ponechána reagovat 1 h při 50 °C. K prepolymeru bylo následně přidáno 30,0 g roztoku 2,2,6,6-tetramethyl-4-aminopiperidinu v acetonu, a reakce pokračovala další 2 h při 50 °C. Takto připravená směs byla nalita na teflonovou podložku; po úplném odpaření rozpouštědla vznikl homogenní, průhledný, flexibilní film tvořený IPN polymeru A v polyuretanové síti (polymer B).

- 14CZ 2018 - 133 A3

Příklad 5

IPN dle Příkladu 4 byla testována na antimikrobiální účinek proti kmenům Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis. Bakteriální kultury byly sterilně dispergovány v kapalném médiu, přičemž 100 μΐ této suspenze bylo rovnoměrně vyseto na kolečko z krevního agaru o průměru 2 cm. Kolečko bylo ihned překryto testovací fólií. Pro srovnání byla analogickým způsobem testována také samotná polyurethanová matrice (B), neobsahující polymemí síť A se zabudovanou antimikrobiální složkou. Po 24 h inkubace při 37 °C byl fotograficky dokumentován růst bakteriálních kolonií. Z výsledků je zřejmé, že zatímco samotná matrice polymeru B neobsahující polymer A je podrostlá v obou případech bakteriálními kulturami (Obr. 2B, D), pod krytem IPN z Příkladu 4 k bakteriální kolonizaci nedochází (Obr. 2A, C).

Příklad 6

Cytotoxicita IPN ve formě fólie dle Příkladu 4 byla stanovena na buněčné linii lidských fibroblastů postupem vycházejícím z normy ISO 10993-5:2009 (Testy in vitro cytotoxicity). Viabilita buněk po 24 h inkubaci s extrakty obou vzorků při 37 °C byla vyhodnocena pomocí testu Alamar Blue™ Cytotoxicity Assay, který je standardní procedurou doporučovanou EURLECVAM databází (The European Union Reference Laboratory for altematives to animal testing). Střední hodnota fluorescence negativní kontroly reprezentující 100% viability byla použita pro výpočet míry viability buněčných kultur po inkubaci s testovaným vzorkem. Experiment byl opakován třikrát. Výsledky jsou přehledně shrnuty v Obr. 3. Z výsledků je zřejmé, že extrakty z IPN jsou při koncentracích, daných uvedenou ISO normou, pro buňky lidských fibroblastů netoxické.

Příklad 7

Směs 1,0 g l-methyl-2,2,6,6-tetramethylazinan-4-yl-methakrylátu, 10,5 g 2methoxyethyhnethakrylátu, 64 mg ethylenglykol-dimethakrylátu a 151 mg 2,2'-azobis(2-methylpropionitrilju byla rozpuštěna v 72 ml toluenu. Polymerizace probíhala 24 h při 70 °C. Po ukončení reakce byl polymer izolován filtrací, opakovaně promýván toluenem a vysušen. 43,0 g připravené polymemí sítě a 106 g poly(ethylenglykol)u (ůn = 600) bylo mícháno 2 h za laboratorní teploty. Poté bylo přidáno 9,9 g V-methyldiethanolaminu, 0,9 g propan-1,2,3-triolu, 42,0 poly(propylenglykol)u a, ω-terminováného tolylen-diisokyanátem (A7n = 2 300) a 60,0 g nhexan-l,6-diisokyanátu. Směs byla evakuována z důvodu odstranění vzduchových bublin. Po vytemperování na 40 °C byla nalita na několik teflonových forem. Vytvrzovací reakce probíhaly v inertní atmosféře 8 h při 60 °C. Po skončení reakce vznikly průhledné flexibilní fólie o různé tloušťce.

Příklad 8

IPN ve formě fólie připravená dle Příkladu 7 byla testována na antioxidační aktivitu proti in šitu generovaným superoxid anion radikálům. Do vialek na 5 ml bylo odváženo příslušné množství fólie, přidáno 800 μΐ Tris-HCl pufru, 200 μΐ roztoku hypoxanthinu a 2 ml roztoku tetrazolium nitroblue. Reakce byla odstartována přídavkem 20 μΐ suspenze enzymu xanthin oxidázy. Reakční směsi byly míchány po dobu 20 minut za laboratorní teploty. Byla změřena hodnota absorbance roztoků při vlnové délce 572 nm. Všechny koncentrace vzorku byly proměřeny třikrát pro zajištění reprodukovatelnosti experimentu. Z výsledků je zřejmé (Obr. 4), že za daných podmínek měření IPN vykazuje již při relativně nízkých koncentracích vysoké hodnoty scavenging aktivity proti in šitu generovaným superoxid anion radikálům.

- 15 CZ 2018 - 133 A3

Příklad 9

Směs 150 g poly(ethylenglykol)u (M_n = 600), 0,9 g propan-l,2,3-triolu, 9,0 g Ν,Ν,Ν',Ν'tetramethyl-2,2’-oxybis(ethylamin)u, 56,8 g //-hexan-1,6-diisokyanátu a 250 g acetonu byla probublána dusíkem a ponechána reagovat 1 h při 50 °C. K prepolymeru bylo následně přidáno 30,0 g roztoku l-ethyl-2,2,6,6-tetramethyl-4-aminopiperidinu v acetonu, a reakce pokračovala další 2 h při 50 °C. Takto připravená směs byla nalita na teflonovou podložku; po úplném odpaření rozpouštědla vznikl průhledný, flexibilní film. 10,0 g této fólie bylo následně 5 h homogenně a v inertní atmosféře botnáno v roztoku [2-(dimethylamino)ethyl]methakrylátu, poly(ethylenglykol)-methakrylátu (průměrná M_n = 360), 2-hydroxypropyl-methakrylamidu, ethylenglykol-dimethakrylátu a kyseliny 4,4‘-azobis(4-kyanovalerové) ve vodě. Polymerace probíhala UV ozářením reakční směsi při 350 nm po dobu 30 minut. Vzniklá IPN byla poté důkladně promývána vodou pro odstranění nezreagovaných komponent a rozpustných oligomemích podílů. Po vysušení vznikl transparentní, flexibilní film.

Příklad 10

Směs 5,8 g 2,2,6,6-tetramethylazinan-4-yl-methakrylátů, 1,8 g 2-hydroxyethyl-methakrylamidu a 144 mg ethylenglykol-dimethakrylátu byla rozpuštěna ve 45 ml cyklohexanu. Po přídavku 112 mg 2,2’-azobis(2-methyl-propionitril)u byla směs zahřívána 18 h při 60 °C. Vzniklá polymemí síť byla poté odfiltrována, extrahována opakovaně cyklohexanem za horka a vakuově vysušena. 8,0 g připravené polymemí sítě bylo nabobtnáno ve směsi 45 ml ethanolu, 15 ml heptanu, 1,2 g [2(dimethylamino)ethyl]methakrylátů, 10,0 g poly(ethylenglykol)-methakrylátu (průměrná M_n = 360), 13,6 g 2-hydroxyethyl-methakrylátu, 327 mg ethylenglykol-dimethakrylátu a 0,41 g 2,2'azobis(2-methyl-propionitril)u. Polymerizace probíhala 24 h při 70 °C. Vzniklá IPN byla po odfiltrování opakovaně promývána heptanem za horka. Po vysušení byla následně extrahována destilovanou vodou za laboratorní teploty, odfiltrována a zlyofilizována. 10,0 g této IPN s vysokým obsahem antioxidační složky bylo nabobtnáno ve směsi 55 ml poly(ethylenglykol)u (průměrná M_n = 300) a 45 ml vody. Vzniklým hydrogelem byl ošetřován dekubit na patě, který byl kontaminován žluto-zeleným biofilmem (převážně Pseudomonas aeruginosa). Po 24 dnech léčby došlo k eliminaci infekce a tvorbě nové granulační tkáně, přerůstající lůžko rány.

Příklad 11

Směs 1,6 g 2-hydroxypropyl-methakrylamidu, 10,2 g N-[3-(dimethylamino)propyl]methakrylamidu, 120 mg W-nicthylcn-bisakrylaiiiidu a 100 mg 2,2’-azobis(2methylpropionitril) u byla rozpuštěna ve 200 ml toluenu. Polymerizační reakce probíhala po dobu 24 h při 70 °C. Výsledný polymer byl poté odfiltrován, opakovaně extrahován horkým toluenem a vakuově vysušen. 10,0 g polymemí sítě bylo nabobtnáno ve směsi 45 g heptanu, 1,5 g N(2,2,6,6- tetramethylazinan-4-yl)methakrylátu, 8,6 g 2-hydroxyethyl-methakrylátu, 54 mg ethylenglykoldimethakrylátu a 148 mg 2,2’-azobis(2-methyl-propionitril)u. Polymerizace probíhala 24 h při 70 °C. Vzniklá IPN s vysokým obsahem antimikrobiální složky byla za horka odfiltrována, promývána heptanem při 50 °C a vakuově vysušena. IPN byla dispergována v masťovém základu obsahujícího 20 % vody, makrogol 300 a cetylpalmitát. Vzniklý krém byl aplikován na zevní oblast genitálu zasaženého kvasinkovou infekcí (Candida albicans). Snížení rozsahu zánětu bylo patrné již po dvou aplikacích.

Příklad 12

Směs 10,0 g l-methyl-2,2,6,6-tetramethylazinan-4-yl-methakrylátu, 2,5 g 2methoxyethylmethakrylátu, 48 mg ethylenglykol-dimethakrylátu a 151 mg 2,2'-azobis(2-methylpropionitril)u byla rozpuštěna v 53 ml toluenu. Polymerizace probíhala 24 h při 70 °C. Po ukončení reakce byl polymer izolován filtrací, opakovaně promýván toluenem a vysušen. 5,0 g připravené polymemí sítě bylo nabobtnáno ve směsi 45 ml ethanolu, 5,2 g [2

- 16CZ 2018 - 133 A3 (dimethylamino)ethyl]akrylátu, 1,0 g 4- hydroxybutyl-akrylátu, 19 mg ethylenglykol-diakrylátu a 85 mg 2,2’-azobis(2-methylpropionitril) u. Polymerizace probíhala 24 h při 70 °C. Vzniklá IPN s vysokým obsahem antioxidační i antimikrobiální složky byla po odfiltrování promývána ethanolem za horka. IPN byla zneutralizována zředěnou kyselinou chlorovodíkovou a následně suspendována ve vodě. Tato suspenze byla opakovaně aplikována na kožní zánět na chodidlech a prstech, který byl převážně kolonizovaný kvasinkou Candida albicans. Za tři až čtyři aplikace výrazné zlepšení stavu.

Příklad 13

Antioxidační aktivita proti peroxylovým radikálům vzorku IPN z Příkladu 1 byla porovnána s antioxidační aktivitou jiných typů polymemích sítí, majících stejný obsah antioxidační i antimikrobiální složky, konkrétně se vzorkem ve formě jednoduché terpolymemí sítě (obsahující antioxidační i antimikrobiální složku v jedné síti) a vzorkem, který vznikl pouhým smícháním kopolymemí sítě obsahující antioxidant s kopolymemí sítí obsahující zabudovanou antimikrobiální složku. Polymemí sítě byly testovány na antioxidační aktivitu proti in šitu generovaným peroxylovým radikálům. Experiment byl proveden dle postupu uvedeného v Příkladu 2. Výsledky experimentu jsou shrnuty v Obr. 5, který znázorňuje závislost scavenging aktivity testovaného vzorku na jeho koncentraci v reakční směsi obsahující peroxylové radikály. Z výsledků je zřejmé, že IPN vykazuje vyšší scavenging aktivitu proti in šitu generovaným peroxylovým radikálům, než terpolymemí síť i než směs dvou kopolymemích sítí.

Příklad 14

Antimikrobiální účinnost vzorku IPN z Příkladu 1 byla rovněž porovnána s antimikrobiální účinností terpolymemí sítě a směsí dvou polymemích sítí, vykazujících analogický obsah zabudované antioxidační a antimikrobiální složky. Polymery byly nabobtnány ve směsi poly(ethylenglykol)u (průměrná M_n = 300) a 45 ml vody. Antimikrobiální aktivita připravených hydrogelů byla testována proti kmenu Gram-pozitivní bakterie Staphylococcus aureus MRSA, Gram-negativní bakterie Pseudomonas aeruginosa a kvasince Candida albicans. Do 10 ml gelu bylo za sterilních podmínek naočkováno 0,1 ml inokula obsahujícího daný počet cfu (colony forming units). Naočkovaný přípravek byl 12 hodin uchováván při teplotě 32 °C (pro bakterie) resp. 22 °C (pro kvasinky). Antimikrobiální efekt (v %) je pro jednotlivé gely přehledně uveden v Tabulce 2. Z výsledků je zřejmé, že IPN vykazuje nejvyšší účinnost proti testovaným mikrobiálním kulturám.

Tabulka 2 Antimikrobiální efekt testovaných hydrogelů proti Staphylococcus aureus MRSA, Pseudomonas aeruginosa a Candida albicans po 12i hodinách inkubace

- 17 CZ 2018 - 133 A3

Typ polymeru	Mikrobiální kmen	AntimikiObiáiní efekt (%)
teipolymer	Síapm-bcoccÍ/s a/irens (MRSA)	94,8
směs sítí	96,1
IPN	99.9
teipolymer	.Psemtomemas aerugmosa. (CCM 1961)	96,4
směs sítí	95,3
IPN	99.9
terpolymer	Cafííňí/a atbicans (CCM 8215)	91,1
směs sítí	94,6
IPN	99,9

Průmyslová využitelnost

Antimikrobiální, antioxidační i ostatní zmíněné složky přípravku se řadí mezi komerčně běžně dostupné materiály. Navrhované postupy přípravy interpenetrujících sítí využívají metody v průmyslu značně rozšířených radikálových kopolymerizací a krokových polymerizací, což významně zjednodušuje výrobu přípravku v průmyslovém měřítku, a tím i zvyšuje využitelnost vynálezu v praxi. Polymemí přípravek pro úpravu prostředí a urychlení hojení ran lze použít pro lékařské účely při ošetřování ran, s výhodou chronických infikovaných ran, např. bércových vředů, proleženin, popálenin, kde umožní zajištění optimálního procesu hojení a snadné a bezbolestné sledování hojícího procesu. Přípravek může být rovněž určen pro prevenci a léčbu antimikrobiálně kontaminované sliznice a mykotických onemocnění nehtů. Polymemí přípravek podle tohoto vynálezu může být také vhodný pro řešení v aktuálních krizových situacích vyžadujících rychlou první pomoc při ošetření zraněných osob. Možné jsou též některé aplikace ve veterinárním lékařství.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Polymemí přípravek pro krytí ran, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň dvě interpenetrující polymemí sítě, přičemž alespoň jedna polymemí síť obsahuje ve své struktuře kovalentně vázanou antimikrobiální funkční složku, a alespoň jedna jiná polymemí síť obsahuje ve své struktuře kovalentně vázanou protizánětlivou a/nebo antioxidační funkční složku.

2. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antimikrobiální funkční složkou je alespoň jedna strukturní jednotka A-l polymeru odvozená od monomeru obecného vzorce

- 18 CZ 2018 - 133 A3

R⁵

Z

W \ Š

M—R /

R kde R¹ je -H nebo -CH3, Z je -O- nebo -NH-, W je -(CFbjm-, kde m=l až 12, R² a R³ je -H nebo alkyl Ci až C12;

a/nebo alespoň jedna strukturní jednotka A-2 polymeru odvozená od monomeru obecného vzorce w¹ \

N-- W /

kde R⁴ je alkyl Ci až C12, W¹ a W² je -(Clkln-X nebo -CH2-CH2-(OCH2-CH2)_n-X², kde n=l až 20, X¹ a X² je -H, -OH, -Nil·, -NCO a zároveň alespoň jedno z X¹, X² je -OH, -Nil·, -NCO.

3. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že polymemí síť obsahující antimikrobiální funkční složku A-l dále obsahuje alespoň jeden typ strukturních jednotek vybraných ze skupiny zahrnující jednotky odvozené od kyseliny akrylové a methakrylové a jejich solí, akrylamidů a methakrylamidů, alkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylamidů a methakrylamidů, A-vinyl-2-pyrrolidonu, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů;

a/nebo polymemí síť obsahující antimikrobiální funkční složku A-2 dále obsahuje alespoň jeden typ strukturních jednotek vybraných ze strukturních jednotek:

- odvozených od propan-1,2-diolu, 2,2-dimethylpropan-l,3-diolu, cyklohexan-l,4-diolu, 1,4bis(hydroxymethyl)cyklohexanu, 2-(2-hydroxyethoxy)ethan-l -olu, 1,3-diaminopentanu, 2,2,4-trimethylhexan-l,6-diisokyanátu, 2,4,4-trimethylhexan-l,6-diisokyanátu, isoforon diisokyanátu, cyklohexan-l,4-diisokyanátu, dicyklohexylmethan- 4,4'-diisokyanátu;

- a/nebo odvozených od monomerů obecného vzorce:

_wl^_CH2^__w ³ ’ Q kde o=3 až 12 a W³ je -OH, -Nil· nebo -NCO;

- a/nebo odvozených od monomerů obecného vzorce:

- 19CZ 2018 - 133 A3

kde p, q, r=0 až 100, R⁵ je -H nebo -Cl h a W⁴ je -OH, -Nil· nebo -NCO.

4. Přípravek podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že strukturní jednotky A-l jsou odvozeny od N- [3-(dimethylamino)propyl] methakrylamidů nebo [2-(dimethylamino)ethyl]methakrylátu, a/nebo strukturní jednotky A-2 jsou odvozeny od A,A-bis(2-hydroxyethyl)methylaminu.

5. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že obsah strukturních jednotek A-l v polymemí síti je 1 až 99 molámích %, s výhodou 2 až 30 molámích %, a/nebo obsah strukturních jednotek A-2 v polymemí síti je 1 až 99 molámích %, s výhodou 1 až 50 molámích %.

6. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že protizánětlivou a/nebo antioxidační funkční složkou je alespoň jedna strukturní jednotka B-l polymeru, odvozená od monomeru obecného vzorce

kde R⁶ je -H, -OH, kyslíkový radikál nebo alkyl Ci až C4, R⁷ až R¹⁰ je alkyl Ci až C4, Z¹ je -CH/Y¹)- nebo -CH/Y^CTl·-, kde Y¹ je radikálově polymerizovatelná chemická skupina kde R¹¹ je -H nebo -CH3 a Z² je -O- nebo -NH-, a/nebo alespoň jedna strukturní jednotka B-2 polymeru, odvozená od monomeru obecného vzorce

-20CZ 2018 - 133 A3 kde R¹² je -H, -OH, kyslíkový radikál nebo alkyl Ci až C4, R¹³ až R¹⁶ je alkyl Ci až C4, Z³ je -CH(Y²)- nebo -CH(Y²)CH2-, kde Y² je -OH, -NH2, -NHC(=O)NH², -(CH2)S-W⁵, kde s=l až 6 a W⁵ je -OH nebo -NH2.

7. Přípravek podle nároku 6, vyznačující se tím, že polymemí síť obsahující protizánětlivou a/nebo antioxidační funkční složku B-l dále obsahuje alespoň jeden typ strukturních jednotek vybraných ze skupiny zahrnující jednotky odvozené od kyseliny akrylové a methakrylové a jejich solí, akrylamidu a methakrylamidu, alkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylátů a methakrylátů, hydroxyalkyl akrylamidů a methakrylamidů, iV-vinyl-2-pyrrolidonu, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylátů a methakrylátů, hydroxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, alkyloxy terminovaných (polyoxyethylen) akrylamidů a methakrylamidů, a/nebo polymemí síť obsahující protizánětlivou a/nebo antioxidační funkční složku B-2 dále obsahuje alespoň jeden typ strukturních jednotek vybraných ze skupiny zahrnující strukturní jednotky

-strukturní jednotky odvozené od propan-1,2-diolu, 2,2-dimethylpropan-l,3-diolu, cyklohexan-1,4-diolu, 1,4-bis(hydroxymethyl)cyklohexanu, 2-(2-hydroxyethoxy)ethan-1 -olu, 1,3-diamino-pentanu, 2,2,4-trimethylhexan-l ,6-diisokyanátu, 2,4,4-trimethylhexan-1,6diisokyanátu, isoforon diisokyanátu, cyklohexan-1,4-diisokyanátu, dicyklohexyl-methan4,4 ’-diisokyanátu;

- a/nebo strukturní jednotky odvozené od monomerů obecného vzorce:

' t.

kde t=3 až 12 a W6 je -OH, -NH₂ nebo -NCO;

- a/nebo strukturní jednotky odvozené od monomerů obecného vzorce:

kde u, v, w=0 až 100, R¹⁷ je -H nebo -CH3 a W⁷ je -OH, -NH₂ nebo -NCO.

8. Přípravek podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že strukturní jednotky B-l jsou odvozeny od iV-(2,2,6,6-tetramethylazinan-4-yl)methakrylamidu nebo 2,2,6,6-tetramethylazinan4-ylmethakrylátu, a/nebo strukturní jednotky B-2 jsou odvozeny od 4-amino-2,2,6,6tetramethylpiperidinu, 4-amino-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1 -oxylu, 4-hydroxy-2,2,6,6tetramethyl-piperidinu nebo 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-l-oxylu.

9. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8, vyznačující se tím, že obsah strukturních jednotek B-l v polymemí síti je 1 až 45 molámích %, s výhodou 1,5 až 15 molámích %, a/nebo obsah strukturních jednotek B-2 v polymemí síti je 0,1 až 20 hmotnostních %.

-21 CZ 2018 - 133 A3

10. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr polymemí sítě nesoucí antimikrobiální funkční složku : polymemí síti nesoucí protizánětlivou a/nebo antioxidační funkční složku je v rozmezí 0,1 až 10.

11. Způsob přípravy přípravku podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se polymerizací připraví první polymemí síť, a ta se poté impregnuje monomery druhé polymemí sítě, které se následně podrobí polymerizací; přičemž polymerizace jsou s výhodou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující radikálové polymerizace, polyadice a polykondenzace; ve výhodném provedení se polymemí síť obsahující antimikrobiální strukturní jednotky A-l připraví radikálovou polymerizací, s výhodou se polymemí síť obsahující antimikrobiální strukturní jednotky A-2 připraví polyadicí, s výhodou se polymemí síť obsahující protizánětlivé a/nebo antioxidační strukturní jednotky B-l připraví radikálovou polymerizací, s výhodou se polymemí síť obsahující protizánětlivé a/nebo antioxidační strukturní jednotky B-2 připraví polyadicí.

12. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje polymemí přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, a dále pomocné látky vybrané ze skupiny zahrnující stabilizátory, emulgátory, látky zvyšující viskozitu, parafiny, rostlinné oleje, živočišné tuky, syntetické acylglyceroly, vosky, polyalkylsiloxany, mastné oleje s koloidním oxidem křemičitým, škrob, deriváty celulózy, karbomery a křemičitany hořečnato-hlinité, želatinu, povrchově aktivní látky, kluzné látky, látky s adsorpčními vlastnostmi, vodu, glycerol, aktivní uhlí; s výhodou je farmaceutický přípravek ve formě vybrané ze suspenze, emulze, masti, krému, gelu, pasty, čípků, globulí, tablet, multivrstevnatého krytí, krycích fólií.

13. Polymemí přípravek podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 pro použití při hojení ran, zejména pro potlačení mikrobiální infekce a pro potlačení rozvoje zánětlivých procesů v ráně.

14. Polymemí přípravek podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 pro použití při léčbě onemocnění kůže, nehtů a sliznice, zejména způsobených mikrobiální infekcí a/nebo zánětlivým procesem.