CZ2012288A3 - Hybridizacní sonda pro detekci viru Y u brambor - Google Patents
Hybridizacní sonda pro detekci viru Y u brambor Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2012288A3 CZ2012288A3 CZ20120288A CZ2012288A CZ2012288A3 CZ 2012288 A3 CZ2012288 A3 CZ 2012288A3 CZ 20120288 A CZ20120288 A CZ 20120288A CZ 2012288 A CZ2012288 A CZ 2012288A CZ 2012288 A3 CZ2012288 A3 CZ 2012288A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- virus
- potato
- probe
- hybridization
- buffer
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 28
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 title claims abstract description 25
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 12
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 241000723762 Potato virus Y Species 0.000 claims description 15
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 claims description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- 241001028048 Nicola Species 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 abstract description 6
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 abstract 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 101000846901 Drosophila melanogaster Fat-body protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000710179 Potato virus S Species 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 108010064866 biozym Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Chemical group 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Hybridizacní sonda pro detekci viru Y u brambor, která má sekvenci 1 CAGATTGGTT CCATTGAATG CAAACTTCCA TACTCACCCG CTCCTTTTGG GCTAGTTGCG, 61 GGGAAACGAG AAGTTTCAAC CACCACTGAC CCCTTCGCAA GTTTGGAGAT GCAGCTTAGT, 121 GCGCGATTAC GACGGCAAGA GTTTGCAACT ATTCGAACAT CCAAGAATGG TACTTGCATG, 181 TATCGATACA AGACTGATGC CCAGATTGCG CGCATTCAAA AGAAGCGCGA GGAGAGAGAA, 241 AGAGAAGGAAT ATAATTTCCA AATGGCTGCG TCAAGTGTTG TGTCGAAGAT CACTATTGCT, 301 GGTGGAGAGC CACCTTCAAA ACTTGAATCA CAAGTGCGGA AGGGTGTTAT CCACACAACT, 361 CCAAGGATGC GCACAGCAAA AACATATCGC ACGC. Tato sekvence je komplementární k ribonukleové kyseline ceského izolátu Y viru brambor Nicola.
Description
Virové choroby v našich klimatických, geografických a půdních podmínkách jsou velmi významné, a to nejen z důvodu jejich škodlivosti, ale i proto, že jsou u nás lepší podmínky pro jejich rozšiřování, ve srovnání se severněji položenými přímořskými státy. Virové choroby jsou způsobeny rostlinnými viry, které jsou přenosné sadbou, některé mechanicky šťávou a řadou živočišných vektorů. Jednotlivé viry vytvářejí kmeny, které se vyznačují různými projevy, agresivitou i škodlivostí. S jejich vizuálním projevem se můžeme setkat zejména na nati (různé formy mozaiky, zkadeření, nekrózy, deformace, stáčení listů, inhibice růstu apod.) a v některých případech i na hlízách (nekrózy slupky, dužniny hlíz atd.). Někdy může vizuální projev chybět. Rozdíly jsou v primárních a sekundárních příznacích choroby. Virové choroby, v závislosti na odrůdě, pěstitelských podmínkách a průběhu počasí, snižují výnosy o 10 až 80 % hmotn. (Rasocha a kol., 2007)
Y - viróza bramboru se může vyskytovat ve více kmenech. Příznaky se liší podle pěstované odrůdy a podle kmenu viru, kterým je rostlina bramboru napadena, od velmi slabých symptomů lehké mozaiky až po silné symptomy projevující se výraznou mozaikou, zkadeřením a nekrózou listů. Rozdíly jsou v symptomech po primární a sekundární infekci. Lehká mozaika se nejčastěji vyskytuje po primární infekci. Projevuje se často méně zřetelnými příznaky mozaik, slabě výrazným žloutnutím částí listů. Příznaky sekundární infekce (z nemocných hlíz) bývají výraznější. Těžká mozaika a kadeřavost bramboru se projevuje výraznou mozaikou listů, které jsou většinou zkadeřeny. U řady odrůd je potlačen růst, zjišťováno je nižší nasazení stonků. Listy, především spodního patra, žloutnou, často se ulamují a opadávají.
Čárkovitost bramboru se projevuje sekundárními příznaky již od začátku vzcházení a ty se zvýrazňují během růstu rostlin. Nejdříve se na listech spodního patra objevují méně výrazné, později velmi zřetelné čárky nebo kroužky a tečky - nekrózy. Ty jsou nejčastěji zřetelné na nervech rubu listů. Nekrózy postupně zachvacují celý list, který žloutne, odumírá a obvykle zůstává viset na stoncích. S nekrózami ve formě čárek se můžeme později setkat i na řapících listů a stoncích. Chorobu často provází silné zvrásnění listů, různé formy mozaiky a nekróz viditelných na vrchní straně listů.
Virus Y se může vyskytovat ve více kmenech, přičemž některé, řazené do Y-NTN (vypsat i slovně), vyvolávají na hlízách mnoha odrůd onemocnění označené jako Potato tuber necrotic ringspot disease - PTNRD. To se zprvu, obvykle již při sklizni, projevuje zduřelými narůžovělými až zahnědlými kroužky, které většinou nezasahují dužninu hlíz. Tyto příznaky bývají označovány jako zduřelá kroužkovitost hlíz bramboru. Během skladování se příznaky zvýrazňují, kroužky hnědnou, nekrotizují, mírně se propadají a zasahují i do několika mm dužninu hlíz. Tento jev bývá označován jako nekrotická kroužkovitost hlíz (Rasocha a kol., 2007).
Přítomnost virů se běžně zjišťuje laboratorními metodami, nejčastěji imunoenzymatickou metodou ELISA, která není vždy přesná a citlivá. Pro doplňková zjištění existuje řada testovacích rostlin a laboratorních metod, založených na molekulární detekci nukleové kyseliny. Metody detekce založené na těchto postupech pomocí polymerázové řetězové reakce jsou řádově citlivější než metody sérologické, avšak kvůli jejich vysoké citlivosti a specifičnosti a vysoké variabilitě virové ribonukleové kyseliny viru Y bramboru však nejsou zcela spolehlivé.
I»··*** » * » S » · * * ·
Podstata vynálezu
Uvedené nedostatky odstraňuje hybridizační sonda pro detekci viru Y u brambor podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že je tvořena vláknem deoryribonukleové kyseliny, jehož sekvence je komplementární k ribonukleové kyselině českého izolátu Y viru bramboru Nicola o složení PVY sondy
CAGATTGGTT CCATTGAATG CAAACTTCCA TACTCACCCG CTCCTTTTGG GCTAGTTGCG
GGGAAACGAG AAGTTTCAAC CACCACTGAC CCCTTCGCAA GTTTGGAGAT GCAGCTTAGT
121 GCGCGATTAC GACGGCAAGA GTTTGCAACT ATTCGAACAT CCAAGAATGG TACTTGCATG
181 TATCGATACA AGACTGATGC CCAGATTGCG CGCATTCAAA AGAAGCGCGA GGAGAGAGAA
241 AGAGAGGAAT ATAATTTCCA AATGGCTGCG TCAAGTGTTG TGTCGAAGAT CACTATTGCT
301 GGTGGAGAGC CACCTTCAAA ACTTGAATCA CAAGTGCGGA AGGGTGTTAT CCACACAACT
361 CCAAGGATGC GCACAGCAAA AACATATCGC ACGC, která je uložena v GenBank pod číslem AJ890346.1.
Hybridizační sonda podle vynálezu je charakterizována tím, že obsahuje alespoň jednu neradioaktivní značku, kterou je digoxigenin.
Hybridizační sonda podle vynálezu je komplementární k ribonukleové kyselině PVY při molekulární hybridizaci, kdy se testovaný vzorek obsahující nukleové kyseliny nanese na pevný nosič (nylonová membrána), který se po firaci teplem a UV zářením inkubuje v přítomnosti hybridizační sondy při teplotě 68 °C, čímž dojde k hybridizaci této sondy na virovou ribonukleovou kyselinu, pokud je tato přítomna ve fixovaném vzorku. Následujícím krokem dojde k odmytí těch molekul sondy, které nehybridizovaly s cílovou virovou RNA, čímž se odliší vzorky pozitivní (obsahující virus) od vzorků negativních. Sonda obsahuje jako neradioaktivní značku steroid digoxigenin, nejběžnější biochemický marker, který lze detekovat imunoenzymaticky inkubací s protilátkou zkonjugovanou s enzymem alkalickou fosfatázou. Po odmytí nenavázaných protilátek se membrána inkubuje s enzymatickým substrátem. V místech, kde jsou na membráně naneseny vzorky obsahující detekovaný virus,
dochází k enzymatickému štěpení substrátu, doprovázeného (dle použitého substrátu) buď změnou barvy vzorku nebo emisí viditelného světla zachytitelného buď CCD kamerou nebo rentgenovým filmem.
Metodou dot-blot RNA-DNA hybridizace pro detekci virů bramboru v infikovaných rostlinách brambor se původci zabývali pro její možnou aplikaci při testování rostlin v zemědělské praxi. Jejími hlavními výhodami jsou citlivost a specificita, která je zajištěna použitím vhodných primerů při přípravě cDNA sondy a je dána výběrem sekvence určené pro účel detekce (její variabilitou či konzervovaností) a délkou této sekvence. Nanesení vzorků na membránu metodou dot-blot umožňuje zpracování velkého množství vzorků najednou.
Hybridizaci lze provádět i s několika sondami (pro detekci různých virů) současně, což je výhodné tehdy, je-li potřeba pouze vyřadit z výběru určenému k dalšímu pěstování rostliny napadené některým zdaných virů, bez ohledu na to, kterým. To, že test není třeba provádět pro každý virus zvlášť, ušetří čas i finanční prostředky. Při hybridizaci s neradioaktivně značenou sondou (například pomocí digoxigenin-11-dUTP) není zapotřebí ani žádného speciálního vybavení, což ji činí použitelnou v zemědělské praxi. Přitom při srovnání s testy ELISA je hybridizace stejně citlivá či citlivější (Schubert a kol., 2005), a to až desetkrát. V pokusech původci prokázali, že je možné viry detekovat spolehlivě i z pouhých 0,15 pg listů při použití libovolného způsobu značení. Další výhodou je možnost kvantifikace viru na úrovni nukleové kyseliny, a proto je tato metoda nepostradatelná při hodnocení vlivu genů rezistence (např. antisense RNA) na replikaci virů (Matoušek a kol, 1996).
Hybridizační sonda podle vynálezu umožňuje citlivé a spolehlivé stanovení přítomnosti PVY v testovaném vzorku, připraveném z jakékoliv části rostliny bramboru.
Na přiložených obrázcích 1 až 3 jsou zobrazeny záznamy elektroforéz, které dokládají úspěšné použití hybridizační sondy podle vynálezu při stanovování viru Y u brambor.
Následující příklady provedení dokládají hybridizační sondu podle vynálezu, aniž by ji jakkoliv omezovaly.
• · * « » A * · • · * 9
5* * · * * * “ · · »> * í e · w • ♦ · · · · · · · · a · · · ·
Příklady provedení
Příklad 1
Příprava sondy
Pro získání DNA-RNA hybridizační diagnostické sondy specifické pro PVY byla klonována cDNA odpovídající proteinu P1 PVY cDNA viru PVYNTN o délce 394 bp a byla připravena standardními metodami s použitím kitů Gene Amp RNA PCR Kit (Perkin-Elmer) a odpovídala pozici genu pro protein P1 tohoto viru. Získaná cDNA byla amplifikována PCR s použitím Pwo polymerázy (BIOZYM, Diagnostic GmbH). Primery byly stejné jako při reverzní transkripci, tj. Y2i4-234 (5'-CCAGATTGGTTCCATTGAATG-3') a Y607-589 3 μΙ primeru Y607-589 (1 pg.mr1), 64,2 μΙ H2O a 0,8 μΙ Pwo polymerázy. Po 3 min počáteční denaturaci při 94 °C následoval 35x cyklus: 1 min denaturace při 94 °C, 1 min 20 s „annealing,, při 52 °C, 1 min 20 s prodlužování nového vlákna při 72 °C. Po kontrolní elektroforéze byl PCR produkt (označovaný dále písmenem Q) izolován z agarózového gelu pomocí soupravy Gel Extraction Kit (Qiagen). Ke klonování byla použita speciální souprava PCR-ScriptTM Amp SK(+) Clonning Kit (Stratagene). Ligaci do plasmidu předcházel „polishing,, (začištění konců) polymerázou Pfu: k10pl fragmentu Q bylo přidáno 1,3 μΙ „polishing,, pufru, 1 μΙ deoxyribonukleotidů a 1 μΙ Pfu polymerázy. Reakce probíhala 30 min při teplotě 72 °C. Po ní byla cDNA ligována T4 ligázou do plasmidu pCR-ScriptTM Amp SK(+). Ligační směs se skládala z 1 μΙ plasmidu, 1 μΙ 10χ pufru, 0,5 μΙ ATP, 6,5 μΙ „polishing,, fragmentu, 1 μΙ Τ4 ligázy a 1 μΙ Srf I. Takto upravenými plasmidy pak byly transformovány kompetentní buňky E. coli.
Transformace probíhala následovně: 100 μΙ suspenze kompetentních buněk (skladovaných při -70 °C) se nechalo rozpustit na ledu, poté byly přidány 2 μΙ ligační směsi (obsahující zhruba 100 ng plasmidu) a směs byla min inkubována na ledu. Následoval teplotní šok (42 °C, 90 s) a 2 min v ledu. Poté byly buňky kultivovány 2 h na třepačce při 37 °C v Erlenmayerových baňkách obsahujících 0,9 ml LB media. Získaná suspenze pak byla po 200 μί rozetřena na misky s LB mediem obsahujícím ampicilin (200 ng.mr1), X-gal (4-bromo-5-chloro-3-indolyl--D-galaktosid) a IPTG (isopropyl-D-thiogalaktosid) (60 pg .ml-1). Bílé kolonie byly testovány na přítomnost požadovaného inzertu pomocí PCR následované elektroforézou v agarózovém gelu. Reakční směs při PCR s bakteriemi obsahovala: 556 μΙ H2O, 80 μΙ pufru, 48 μΙ MgCI2, 64 μΙ směsi všech nukleotidů, po 24 μΙ každého primeru (primery Y2i4-234 a Yeo7-589> viz výše) a 4 μί Taq polymerázy (Promega). Tato směs byla rozdělena po 50 μΙ do 16 mikrozkumavek a do každé z nich byly špičkou pipety přidány bakterie z jedné kolonie (do poslední směs ze všech kolonií); cyklus byl stejný jako při amplifikaci cDNA polymerázou Pwo (viz výše).
Plasmidy byly z bakterií izolovány s použitím pufrů od firmy Qiagen. Bakterie narostlé přes noc v tekutém LB mediu při teplotě 37 °C za neustálého protřepávání byly třikrát sedimentovány při 3000 rpm 5 min. Poté byly resuspendovány ve 200 μΙ pufru P1 (pufr sRNázouA) a bylo knim přidáno 200 μί pufru P2 (pufr pro alkalickou lyži buněk). Po 5 min byla směs umístěna na led a do každé se přidalo 220 μΙ pufru P3 (pro renaturaci plasmidu). Následovalo opatrné pomalé promíchání obsahu zkumavek, 10 min inkubace v ledu a centrifugace 5 min při 13500 rpm. Supernatant byl převeden do nové zkumavky a k němu byla přidána v poměru 1 : 1 směs fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu (24 :24:1). Po homogenizaci byly vzorky centrifugovány 5 min při 13000 rpm, vodná fáze byla opět přepipetována do nových zkumavek. Následovala precipitace izopropanolem, který byl přidán v množství 0,7x objem vzorku. Po homogenizaci byla směs ponechána 1 h při pokojové teplotě. Nakonec byl izopropanol důkladně odstraněn, plasmidy byly promyty 70% ethanolem, opatrně vysušeny v exikátoru a poté rozpuštěny v 50 μΙ TE-pufru (10 mM TRIS, 0,1 mM EDTA, pH 8). Takto připravené plasmidy byly použity jako templát pro reamplifikaci sekvence určené k přípravě sondy. Reamplifikace byly provedena s použitím polymerázy Pwo (BIOZYM, Diagnostic GmbH) výše uvedeným postupem.
cDNA viru PVYNTN o délce 394 bp byla připravena reverzní transkripcí izolované virové RNA a odpovídala genu pro P1 protein tohoto viru, (pozice 214 až 607 dle databáze EMBL). Po amplifikaci PCR a začištění konců byla ligována do plasmidu pCR-Script, kterým pak byly transformovány kompetentní buňky E. coli, jak znázorňuje obr. 1, kde je záznam elektroforézy PCR produktů vagarózovém gelu. Pomocí PCR bylo testováno 15 klonů E. coli transformovaných plasmidem nesoucím cDNA viru PVY. Všechny vybrané klony obsahovaly plasmid s požadovaným inzertem, neboť u všech vznikl PCR produkt správné velikosti, který délkou odpovídá prvotním fragmentům získaným při RT-PCR (vpravo).
Pro přípravu sondy P1 určené k detekci viru PVY byl použit klon číslo 1, ze kterého byl izolován plasmid, jak je znázorněno na obr. 2, kde je záznam elektroforézy izolovaného plasmidu cDNA viru PVY. Vyznačené jsou dvě nejčetnější formy plasmidu. Vlevo 1 Kb marker.
Extrakce virové RNA pro DNA-RNA hybridizaci
Extrakce virové RNA byla prováděna s použitím dvou základních typů pufrů. Prvním typem byl AMESS pufr (0,5 M octan sodný o pH 6,0, 10 mM MgCI2, 3% SDS, 20% ethanol a 1 M NaCI), druhým několik variant pufru sestaveného v laboratoři molekulární genetiky ÚMBR AV ČR, který byl nazván pracovní zkratkou „E„. Složení pufru E v optimálním variantě: 0,1 M Tris-HCI, (pH 7,5), 50 mM EDTA, 5% SDS, 1% merkaptoethanol.
1. AMESS pufr
Listy brambor byly rozetřeny s pískem a AMESS pufrem (0,6 ml pufru / 0,4 g listů) v předchlazených třecích miskách. Pak bylo přidáno 0,8 ml směsi chloroformu s izoamylalkoholem v poměru 24: 1 a pokračovalo se v homogenizaci. Poté byl homogenát přelit z misky do mikrozkumavky a odstředěn (5 min, 13500 rpm). Supernatant byl přepipetován do nové zkumavky • » * * ♦»· · ** « ’ ·» » <b η
8· · * w ·> ’ - * # «- ·.
« i- » • · * · · · · · *.·»*·»·<
a přidal se k němu stejný objem směsi formaldehydu (37%) a 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M citrát sodný, pH 7,0) v poměru 2 : 3. Směs se po promíchání nechala denaturovat 15 min v lázni (60 °C). Pak se mikrozkumavka s extraktem prudce zchladila v ledu, v němž pak byla uchovávána i během nanášení vzorků na membránu.
2. pufr E
Listy brambor byly rozdrceny v třecí misce v tekutém dusíku, prášek z listů byl přesypán do nové vychlazené misky s pískem, kde k němu byl přidán pufr E (1,5 až 2 ml.g-1 listů), a homogenizace pokračovala. Takto získaný homogenát byl převeden do mikrozkumavky a sedimentován 5 min při 13500 rpm. Poté byl supernatant opatrně odpipetován do nové mikrozkumavky. Po přidání stejného objemu směsi chloroformu s izoamylalkoholem (24:1) následovala znovu centrifugace 5 min při 13500 rpm. Supernatant byl opět odpipetován do nové zkumavky a k němu přidán stejný objem směsi formaldehydu (37%) a20xSSC (3 M NaCl, 0,3 M citrát sodný, pH 7,0) v poměru 2:3. Po důkladném promíchání byla směs denaturována 15 min v lázni (60 °C). Pak byla mikrozkumavka s extraktem prudce zchlazena v ledu, v němž byla uchovávána i během nanášení vzorků na membránu.
3. Nanášení RNA na membránu
Vzorky byly metodou dot-blot naneseny na pozitivně nabitou nylonovou membránu s póry o průměru 2 pm (Nylon 66, Sigma), navlhčenou v roztoku 1x SSC (0,15 M NaCl, 15 mM citrát sodný, pH 7). Poté byla RNA kovalentně navázána na membránu působením UV záření a zapečena 30 min při 80 °C. Do dalšího použití byly membrány uchovávány uzavřené v polyethylenovém sáčku při 4 °C.
Byly používány tři různé postupy neradioaktivního značení cDNA sond: 1. DIG High Prime Labeling
2. DIG Chern-Link Labeling
3. PCR DIG Probe Synthesis
Pokusy původců prokázaly použitelnost všech tří postupů přípravy cDNA sond pro DNA-RNA hybridizaci i na bázi RT-PCR produktů. První dvě we-'* • * · * * « » · * q * * « e - * * e · e e · < · * ·» *·»«· * metody využívají značení cDNA sondy buď pomocí digoxigenin-11-dUTP metodou „random primed“ nebo pomocí speciálního produktu na bázi cisplatiny, vytvářející nekovalentní (koordinační) komplex s DNA přes N7 pozici guanosinových a adenosinových baží. Třetí postup využívá přímé značení DNA fragmentů v PCR reakci zabudováním DIG-11-dUTP. Těmito postupy byla značena hybridizační sonda podle vynálezu. Pracovní postupy jsou podrobně popsány v těchto komerčních soupravách firmy Roche, proto zde již nejsou uvedeny.
Hybridizace s neradioaktivně značenou sondou
Membrány s navázanou RNA byly inkubovány 2 h při 50 °C v preprehybridizačním roztoku (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM Na2EDTA, 0,1% SDS) o objemu odpovídajícímu velikosti membrány (0,3 ml.cm2). Prehybridizace se prováděla 2 h při 50 °C v roztoku o složení: 5x SSC, 50% deionizovaný formamid, 0,1% N-laurylsarcosin, 0,02% SDS a 1/5 objemu blokovacího roztoku (10xSSC, 0,15 M citrát sodný, 1,5 M NaCl, pH 7,0, 10% SDS). Vlastní hybridizace s čerstvě denaturovanou (2 min při 98 °C) sondou probíhala přes noc za stejných podmínek a v roztoku o stejném složení jako prehybridizace. Objem hybridizačního roztoku byl 0,025 ml.cm2 membrány. Po hybridizaci byly membrány promyty roztoky: nejprve 2x SSC, 0,1%SDS při teplotě 18 až 23 °C po dobu 15 min (dvakrát), pak 1xSSC, 0,1% SDS při 50 °C 15 min (rovněž dvakrát) a na závěr byly opláchnuty (3 min) v pufru 1 (0,1 M kyselina maleinová, 0,15 M NaCl, adjustovaný na pH 7,5 při 20 °C krystalickým NaOH).
Při imunologické detekci byla membrána inkubována 30 min při teplotě 18 až 23 °C v pufru 2 (směs blokovacího roztoku a pufru 1 v poměru 1:10) (použitý objem odpovídal 1 ml.cm2 membrány). Dalším krokem byla inkubace (30 min) v roztoku s protilátkami (150 mil.ml1, použitý objem: 1 ml.cm2), připraveném rozpuštěním koncentrovaného roztoku anti-DIG-AP konjugátu v pufru 2 (1 :5000). Poté následovalo promytí pufrem 1 (2x 15 min v objemu odpovídajícímu 0,2 ml.cm2) a inkubace (5 min) v pufru 3 o složení: 0,1 M φ * · . - «« « — · · ·· · : ·..· . .......
Tris-HCI, 0,1 Μ NaCI, 50 mM MgCI2, pH 9,5 (20 °C). Následně byla membrána umístěna do čerstvě připraveného roztoku NBT/BCIP (200 μΙ koncentrovaného roztoku NBT/BCIP rozpuštěného v 10 ml pufru 3), v němž bez přístupu světla probíhala barevná reakce (použitý objem: 0,1 ml.cm-2). Po dosažení požadované intenzity zbarvení byla reakce zastavena pětiminutovým promytím membrány vTE-pufru (10mM TRIS, 1mM EDTA, pH 8,0). Membrány byly foceny pomocí scaneru ASTRA 610 S (Umax).
Kontrolní hybridizace s radioaktivně značenou sondou
Membrána s navázanými vzorky RNA virů byla nejprve inkubována 2 h při 50 °C v pre-prehybridizačním roztoku (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 M NaCI, 1 mM Na2EDTA, 0,1% SDS). Následovala prehybridizace v roztoku o složení: 50% formamid, 50 mM fosfátový pufr (pH 7,4), 5 mM Na2EDTA, 750 mM NaCI, 0,1% SDS, 0,3% PVP (polyvinylpyrrolidon), 0,3% BSA (hovězí sérový albumin), 0,3% Ficoll, 200 pg.ml-1 RNA opět 2 h při 50 °C. Vlastní hybridizace s čerstvě zdenaturovanou (2 min při 98 °C) sondou probíhala přes noc za stejných podmínek jako prehybridizace. Objem hybridizačních roztoků byl 0,3 ml.cm-2 membrány. Po hybridizaci byly membrány promyty roztoky: nejprve 2x SSC, 0,1% SDS při 50 °C po dobu 5 min, 1xSSC, 0,1% SDS při 55 °C 10 min, 0,5x SSC, 0,1% SDS při 60 °C 5 až 10 min, v některých pokusech ještě navíc promytí 0,1x SSC, 0,1% SDS při 60 °C 5 min.
Membrány pak byly exponovány (většinou přes noc) na přístroji STORM (Molecular Dynamics), z něhož byly pomocí programů Phosphor Imager a Image QuaNT získány obrázky i konkrétní naměřené hodnoty. Hodnoty radioaktivního signálu jsou udávány v jednotkách „spot volume“, které vyjadřují součin absorbance a plochy v mm2.
K odstraňování bílkovin byla používána směs chloroformu s izoamylalkoholem (24 : 1), dále byla testována účinnost dalších dvou činidel, a to jednak roztoku fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu (24 :24 : 1), jednak samotný fenol. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 3. Detekce viru PVYNTN (horní tři řady) a PVY° (spodní tři řady) u rostlin bramboru byla provedena pomocí dot• · « ·»*· ♦· 11 · · <#·.-**>*·· * · 1 1 ' « · · ·' ···· · ·· · ······· blot molekulární hybridizace s cDNA sondou. K extrakci virové RNA byl použit pufr E, k odstranění proteinů fenol (1. a 4. řada), roztok fenolu s chloroformem a izoamylalkoholem (IAA) 24:24:1 (2. a 5. řada) nebo roztok chloroformu s IAA v poměru 24 : 1 (3. a 6. řada). A - membrána hybridizovaná s radioaktivně značenou sondou (expozice 6 h), B - membrána hybridizovaná se stejnou sondou značenou digoxigeninem. 1 μΙ extraktu byl získán z 0,25 pg listů.
Ačkoliv se původci nezabývali přímo kvantifikací virů v rostlinách, může být takto rozpracovaná metoda detekce virů bramboru použitelná i pro relativní porovnávání množství uvedených virů v infikovaných rostlinách.
Hybridizační sonda podle vynálezu byla s úspěchem ověřena v praxi ve Výzkumném ústavu bramborářském v Havlíčkově Brodě, CZ.
Průmyslová využitelnost
Hybridizační sondu pro diagnostiku Y viru bramboru je možno dodávat subjektům zabývajícím se detekcí rostlinných patogenů. Je možné též uživatelům (šlechtitelé, množitelé) dodávat membrány, na něž uživatelé nanesou své vzorky z testovaných rostlin a tuto membránu následně zašlou do laboratoře, kde bude pomocí hybridizační sondy provedena vlastní detekce.
-uPoužitá literatura
Matoušek, J., Trněná, L, Dědič, P., Ptáček, J. and Krejčová, J.: PCR amplification and analysis of potato virus S (PVS) coat protein region as a source for anti-PVS antisense RNA system. Vědecké práce, Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 12: 43-52, 1996.
Rasocha, V., Hausvater, E., Doležal, P.: Virové choroby brambor a možnosti jejich omezení. Havlíčkův Brod, Výzkumný ústav bramborářský 2007. 8 s.
Schubert, 1, Matoušek, J., Supp, P.: Stability of pathogen-derived Potato virus Y resistance in potato under field conditions and some aspects of their ecological impact. - In: Wesseler J. Η. H. (ed.): Environmental Costs and Benefits of Transgenic Crops, pp. 63-78, Springer Dordrecht, The Netherlands, 2005.
PV loW- IBB
- 4V
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Hybridizační sonda pro detekci viru Y u brambor, vyznačující se t í m, že je tvořena vláknem deoxyribonukleové kyseliny, jehož sekvence je komplementární k ribonukleové kyselině českého izolátu Y viru bramboru Nicola o složení PVY sondy1 CAGATTGGTT CCATTGAATG CAAACTTCCA TACTCACCCG CTCCTTTTGG GCTAGTTGCG61 GGGAAACGAG AAGTTTCAAC CACCACTGAC CCCTTCGCAA GTTTGGAGAT GCAGCTTAGT121 GCGCGATTAC GACGGCAAGA GTTTGCAACT ATTCGAACAT CCAAGAATGG TACTTGCATG181 TATCGATACA AGACTGATGC CCAGATTGCG CGCATTCAAA AGAAGCGCGA GGAGAGAGAA241 AGAGAGGAAT ATAATTTCCA AATGGCTGCG TCAAGTGTTG TGTCGAAGAT CACTATTGCT301 GGTGGAGAGC CACCTTCAAA ACTTGAATCA CAAGTGCGGA AGGGTGTTAT CCACACAACT361 CCAAGGATGC GCACAGCAAA AACATATCGC ACGC, která je uložena v GenBank pod číslem AJ890346.1.
- 2. Hybridizační sonda podle nároku, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu neradioaktivní značku digoxigenin.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120288A CZ2012288A3 (cs) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | Hybridizacní sonda pro detekci viru Y u brambor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120288A CZ2012288A3 (cs) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | Hybridizacní sonda pro detekci viru Y u brambor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2012288A3 true CZ2012288A3 (cs) | 2013-11-06 |
Family
ID=49510624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20120288A CZ2012288A3 (cs) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | Hybridizacní sonda pro detekci viru Y u brambor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2012288A3 (cs) |
-
2012
- 2012-04-27 CZ CZ20120288A patent/CZ2012288A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102863727B1 (ko) | Ssdna를 절단하고 표적 dna를 검출하기 위한 v형 crispr/cas 효과기 단백질 | |
| Bonfiglioli et al. | Tissue and intra‐cellular distribution of coconut cadang cadang viroid and citrus exocortis viroid determined by in situ hybridization and confocal laser scanning and transmission electron microscopy | |
| US20100143909A1 (en) | Method for detection of apple mosaic virus, primer set for the detection, and kit for the detection | |
| US20100041035A1 (en) | Identification of centromere sequences and uses therefor | |
| US20100203500A1 (en) | Method for detection of hop latent virus, primer set for the detection, and kit for the detection | |
| AU681081B2 (en) | Procedure for the detection and identification of viral and subviral pathogens | |
| WO2021095798A1 (ja) | 未分化マーカー遺伝子高感度検出法 | |
| Schoft et al. | SYBR Green-activated sorting of Arabidopsis pollen nuclei based on different DNA/RNA content | |
| CN104862317B (zh) | 一种肝癌细胞特异性的适配子及其制备方法 | |
| CZ2012288A3 (cs) | Hybridizacní sonda pro detekci viru Y u brambor | |
| Zhang et al. | FISH on plant chromosomes | |
| CZ23929U1 (cs) | Hybridizační sonda pro detekci viru Y u brambor | |
| Wei et al. | Detection of five viruses infecting dormant bulbs by TaqMan-based real-time RT-PCR | |
| CN105039347B (zh) | 一种与草甘膦特异结合的核酸适配体及应用 | |
| JP2006254750A (ja) | コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）の検出法 | |
| Owari et al. | Subcellular localization of minicircle DNA in the dinoflagellate A mphidinium massartii | |
| KR101493910B1 (ko) | 딸기잠재원형반점 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| JP2017163861A (ja) | ユリ類病害の病原菌検出用プライマーセットおよび検出方法 | |
| EP3617325B1 (en) | Rna-guided endonuclease dna labeling | |
| Stanton et al. | In situ localization of citrus exocortis viroid RNA using an optimized RNAscope™ assay | |
| KR20120029733A (ko) | 유전자 변형 옥수수 ｍｏｎ８６３ 및 ｍｏｎ８１０ 검출용 키트 | |
| JP2007189991A (ja) | 遺伝子の検出方法 | |
| JP2006101766A (ja) | 遺伝子の発現レベルを指標とした穀物の食味判定方法 | |
| KR101510450B1 (ko) | 담배둥근무늬 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| CN119799942A (zh) | 一种小麦抗秆锈病基因连锁分子标记、检测引物及应用 |