CZ2011424A3

CZ2011424A3 - Substrát pro kultivaci bunek a zpusob jeho výroby

Info

Publication number: CZ2011424A3
Application number: CZ20110424A
Authority: CZ
Inventors: Munzarová@Marcela; Juklícková@Martina; Floriš@Tomáš; Kubešová@Barbara; Štrajtová@Lucie; Matejková@Eva; Schurek@Lukáš; Schurek@Jakub
Original assignee: Elmarco S.R.O.; Primecell A.S.
Priority date: 2011-07-14
Filing date: 2011-07-14
Publication date: 2012-09-19
Also published as: CZ303453B6; WO2013007224A1

Abstract

Substrát pro kultivaci bunek obsahujícího vrstvu (2) nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru uloženou na nosné vrstve (1), pricemž nosná vrstva (1) je tvorena mrížkou z biologicky kompatibilního materiálu a vrstva (2) nanovláken vyplnuje prostor jejích ok. Zpusob výroby tohoto substrátu, u kterého se vrstva (2) nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru ukládá na nosnou vrstvu (1) tvorenou mrížkou z biologicky kompatibilního materiálu elektrostatickým zvláknováním polymerního systému v elektrickém poli vytvoreném mezi sbernou elektrodou a proti ní uloženou zvláknovací elektrodou protáhlého tvaru, pricemž ukládaná vrstva (2) nanovláken prekrývá také oka mrížky.

Description

Substrát pro kultivaci buněk a způsob jeho výroby

Oblast techniky

Vynález se týká substrátu pro kultivaci buněk obsahujícího vrstvu 5 nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru uloženou na nosné vrstvě.

Vynález se dále týká také způsobu výroby tohoto substrátu.

Dosavadní stav techniky

V odborné literatuře, například Anne J. Meinel: Optimization strategies 10 for electrospun silk fibroin tissue engineering scaffolds, Biomaterials 30 (2009) 3058-3067, nebo Schofer M.D., Boudriot U„ Wack C„ Leifeld I., Grábedunkel C., Dersch R., Rudisile M., Wendorff J.H., Greiner A., Paletta J.R., FuchsWinkelmann S. J.: Influence of nanofibers on the growth and osteogenic differentiation of stem cells: a comparison of biological collagen nanofibers and 15 synthetic PLLA fibers, Mater Sci Mater Med. 2009 Mar;20(3):767-74.), i v řadě patentových spisů, například US 2010233807 bylo popsáno několik variant nanovlákenných substrátů pro kultivaci buněk, které jsou dle konkrétního použitého typu buněk určeny například pro krytí povrchových ran, implantaci do těla pacienta, atd. Vzhledem k tomu, že jsou tyto substráty tvořeny pouze 20 samostatnou vrstvou nanovláken, je jejich nevýhodu nedostatečná mechanická pevnost ve všech směrech namáhání, která značně komplikuje nejen nanášení buněk a jejich kultivaci, ale zejména jakoukoliv manipulaci s těmito substráty, a tím i jejich praktické použití. Další nevýhodou pak je, že samostatná vrstva nanovláken není při použití ve vlhkém prostředí tvarově ani rozměrově stálá a 25 ihned po namočení se samovolně smršťuje a/nebo svinuje.

Pro odstraněni těchto nevýhod bylo navrženo uložení vrstvy nanovláken na nosnou vrstvu tvořenou například dle CN 101050418 membránou z dutých vláken, dle CN 101264349 tkanou textilií, či dle WO 2010136983 mikroporézní ' ’ ' > t t* * ^; 1 J ,·, ^; ' 4 * »J ‘ ' » í í ^z * i j ? j

PV 2011-424.

7 2011 PS3754CZ_2 · _{r 2} . 20.3.2012 .

vrstvou. Tato řešení sice částečně odstraňují nevýhody substrátu tvořeného samostatnou vrstvou nanovláken, avšak současně přináší jiné nevýhody. K nepodstatnějším z nich patří zejména nemožnost nedestruktivního sledování a kontroly buněk uložených na vrstvě nanovláken během jejich kultivace běžnými invertovanými, tj. optickými mikroskopy, neboť tato nosná vrstva brání průchodu světla. Jedinou možností tak v těchto případech je pouze zastavení kultivace uložených buněk, jejich usmrcení a následné sledování prostřednictvím imunohistochemických metod. Tímto způsobem však lze sledovat pouze malý vzorek substrátů, který není dostatečně reprezentativní.

Dalším společným problémem všech dosud známých substrátů obsahujících vrstvu nanovláken je, že díky aktuálnímu stavu techniky v oblasti výroby nanovláken, dle kterého jsou nanovlákna většinou vytvářena zařízeními se zvlákňovací elektrodou tvořenou tryskou nebo kapilárou, mohou být tyto substráty vyráběny v podstatě pouze kusově nebo ve velmi malých sériích, přičemž se jednotlivé kusy od sebe poměrně značně liší rovnoměrností vrstvy nanovláken, její plošnou hmotností a dalšími parametry. Díky tomu, že tyto substráty nelze vyrábět v opakující se kvalitě a provedení, není ani možné je dostatečně testovat, srovnávat, ani je podrobit předepsaným zkouškám například pro jejich využití jako léčiva, či je dále vyvíjet a vylepšovat.

Cílem vynálezu je navrhnout substrát pro kultivaci buněk, který měl vhodné mechanické vlastnosti pro manipulaci a praktické využití, vhodné biologické vlastnosti pro kultivaci buněk, a současně by umožňoval sledování kvality a/nebo množství těchto buněk během jejich kultivace. Kromě toho je cílem vynálezu navrhnout způsob výroby takového substrátu, který by umožnil jeho výrobu v průmyslovém měřítku.

Podstata vynálezu

Cíle vynálezu se dosáhne substrátem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že vrstva nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru je uložena na nosné vrstvě tvořené mřížkou z biologicky kompatibilního materiálu, pnčemz prostor ok této mřížky je překryt a vyplněn vrstvou nanovláken. Mřížka

PV 2011-424

14.7.2011 ' t 4 β ΐ j í ;

' * ' ft 4 » í ’♦ ^ř r * Λ ' í >, * '5 ’ f ? t ¹ ' ' ¹ 4 » I X ? ·

PS3754CZ_2 20.3.2012 ' dodává substrátu požadované mechanické vlastnosti, zatímco vrstva nanovláken představuje vhodné prostředí pro uložení a následnou kultivaci buněk v podstatě libovolného typu. Díky této konstrukci lze sledovat uložené buňky během jejich kultivace nedestruktivně běžnými invertovanými 5 mikroskopy, neboť mřížka nebrání průchodu světla do vrstvy nanovláken.

V případě, že se během ukládání vrstvy nanovláken na nosnou vrstvu nedosáhne jejich dostatečně pevného a odolného spojení prostřednictvím povrchových (mezimolekulárních) sil, mohou být obě vrstvy propojeny vhodným biologicky kompatibilním pojivém.

Ve výhodném provedení substrátu je nosná vrstva tvořena monofilamentní osnovní pleteninou z nebarveného polyesterového hedvábí, která substrátu poskytuje vhodné mechanické vlastnosti, ale přitom v podstatě nijak nelimituje jeho elasticitu a tvarovou přizpůsobivost.

Pro možnost uložení a kultivace dvou různých a vzájemně oddělených 15 druhu buněk na jednom substrátu, případně pro dosažení dvojnásobného množství buněk jednoho druhu, je v jedné z variant na nosné vrstvě substrátu uložena vrstva nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru z každé její strany. Spojení obou vrstev nanovláken v místech ok nosné vrstvy povrchovými silami navíc podstatně zvyšuje pevnost a odolnost jejich uložení na nosné 20 vrstvě.

Vhodným materiálem nanovláken jsou s výhodou biologicky kompatibilní polymery ze skupiny želatina, chitosan, polyvinylalkohol (PVA), polykaprolakton (PCL), polylaktid (PLA), polyamid (PA), polyuretan (PUR), kyselina poly(laktidco-glykolová), jejich směsi nebo jejich kopolymery, neboť se jedná o polymery, 25 které jsou relativně snadno zvláknitelné.

Vrstva nanovláken může dle potřeby obsahovat alespoň jednu aktivní látku, která brání průniku nežádoucích mikroorganismů z vnějšího prostředí do substrátu nebo jeho okolí, jako například antibiotikum, antiseptikum, nebo stříbro, případně látku, která podporuje kultivaci a/nebo činnost buněk

PV 2011-424'

14.7.2011 ’

PS3754CZ2

20.3.2012 uložených na vrstvě nanovláken, jako například růstový faktor, vitamín, rostlinný extrakt, hormon, kortikoid, cytokin, apod.

Pro zabránění mechanického poškození substrátu, zejména vrstvy nanovláken je výhodné, pokud je tato vrstva před použitím substrátu překryta 5 ochrannou vrstvou. Tou může být například vrstva polyetylenové (PE) fólie nebo vrstva netkané textilie typu spunbond.

Dle určení substrátu jsou na jeho vrstvě nanovláken uloženy a kultivovány například buňky ze skupiny keratinocyty, fibroblasty, epiteliální buňky, endoteliální buňky, ostecyty, mezenchymální kmenové buňky, případně 10 jejich kombinace.

Cíle vynálezu se dále dosáhne způsobem výroby substrátu podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že vrstva nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru se ukládá na nosnou vrstvu tvořenou mřížkou z biologicky kompatibilního materiálu elektrostatickým zvlákňováním 15 polymerního systému v elektrickém poli vytvořením mezi sběrnou elektrodou a zvlákňovací elektrodou protáhlého tvaru, přičemž vrstva nanovláken překrývá a vyplňuje také oka mřížky. Tento postup přitom zaručuje nejen vysokou rovnoměrnost uložené vrstvy nanovláken, ale současně umožňuje výrobu substrátu podle vynálezu v průmyslovém měřítku.

Pro další zvýšení rovnoměrnosti vrstvy nanovláken, zejména při použití nosné vrstvy s nízkou elektrickou vodivostí, je vhodné zvýšit před uložením nanovláken její elektrickou vodivost nanesením zvodivovacího prostředku na její povrch a/nebo do její struktury. Vhodným zvodivovacím prostředkem je přitom například vodný roztok NaCI, ELjNBr nebo Betainu.

!5 V případě potřeby se na nosnou vrstvu před a/nebo během a/nebo po nanesení vrstvy nanovláken nanese biologicky kompatibilní pojivo, které zajistí jejich pevné a odolné spojení.

Vhodnou nosnou vrstvou je pak monofilamentní osnovní pletenina z nebarveného polyesterového hedvábí.

PV 2011-424·

14.7.2011 ·

PS3754CZ2

20.3.2012

Přehled obrázků na výkrese

Na přiloženém výkresu je na obr. 1 fotografie vzájemně oddělených vrstev substrátu pro kultivaci buněk podle vynálezu ve variantě, kdy je nosná vrstva tvořená monofilamentní osnovní pleteninou a vrstva nanovláken je 5' překryta ochrannou vrstvou tvořenou netkanou textilií typu spunbond, a na obr. 2 řez tímto substrátem s na sobě uloženými vrstvami.

Příklady provedení vynálezu

Substrát pro kultivaci buněk podle vynálezu obsahuje vrstvu polymerních 10 nanovláken, která je uložena na nosné vrstvě tvořené mřížkou, přičemž vyplňuje prostory jejích ok. Vrstva polymerních nanovláken je vytvořena z biologicky kompatibilního, zvláknitelného polymeru, například z želatiny, chitosanu, polyvinylalkoholu (PVA), polykaprolaktonu (PCL), polylaktidu (PLA), polyamidu (PA), polyuretanu (PUR), kyseliny poly(laktid-co-glykolové) (PLGA), 15 apod., jejich směsí nebo jejich kopolymerů, a díky své struktuře, která v podstatě napodobuje mezibuněčnou strukturu živých organismů, představuje vhodné prostředí pro kultivaci lidských i zvířecích buněk. Její plošná hmotnost se před uložením buněk s výhodou nachází v intervalu od cca 0,03 do 5 g/m², kdy již těmto buňkám poskytuje dostatečnou oporu, a je relativně odolná proti 2CT otěru ci protržení, avšak ještě je prostupná pro světlo, takže umožňuje sledovaní množství a/nebo kvality uložených buněk během jejich kultivace prostřednictvím běžných invertovaných (optických, světelných) mikroskopů. V případě potřeby může být plošná hmotnost vrstvy polymerních nanovláken i větší, avšak její prostupnost pro světlo se v takovém případně značně snižuje.

Dle požadavků může dále vrstva polymerních nanovláken obsahovat alespoň jednu aktivní látku, která stimuluje kultivaci a/nebo aktivitu na ní uložených buněk, jako například růstový faktor, vitamín, rostlinný extrakt, hormon, kortikoid, cytokin, či jinou látku se stejným nebo podobným účinkem, a/nebo látku která brání zanesení nežádoucích mikroorganismů do substrátu 30 nebo jeho okolí, jako například antibiotika, antiseptika, nanočástice stříbra,

PV 2011-424.

14.7.2011 PS3754CZ_2. *

20.3.2012* apod. Tato látka je přitom ve vrstvě polymerních nanovláken, uložena jako integrální součást nanovláken a/nebo jako nanočástice a/nebo mikročástice, které jsou v nanovláknech zafixovány a vystupují na jejich povrch, a/nebo jako nanočástice a/nebo nanovlákna a/nebo mikročástice a/nebo mikrovlákna uložená volně na a/nebo mezi jejími nanovlákny a/nebo k nim připojená prostřednictvím fyzikální a/nebo chemické vazby, a/nebo jako její impregnace, a/nebo vrstva a/nebo film na jejím povrchu. Pro zakomponování přímo do polymerních nanovláken se přitom tato látka a/nebo její prekurzor například dle postupu popsaného v EP 1869232 přidá, případně úplně nebo částečně rozpustí, do kapalného roztoku nebo taveníny polymeru, ze kterého se následně elektrostatickým zvlákňováním vytvářejí polymerní nanovlákna.

Nosná vrstva substrátu je tvořena mřížkou z biologicky kompatibilního materiálu. Konkrétní materiál a parametry mřížky se přitom volí dle předpokládaného použití substrátu, a pro různé aplikace tak může být mřížka vytvořena například z kovu, plastu, či textilie, resp. z textilních vláken, a to jako pravidelná nebo nepravidelná. Tato nosná vrstva pak substrátu poskytuje požadované mechanické vlastnosti, podporuje a vyztužuje vrstvu polymerních nanovláken, čímž například brání jejímu samovolnému svinutí či smrštění při zvlhčení, a přitom současně umožňuje prostřednictvím svých ok průnik světla do této vrstvy a sledování na ní uložených buněk. Ve variantách, kdy je nosná vrstva tvořena mřížkou z textilních vláken, navíc v podstatě nijak neomezuje elasticitu a tvarovou přizpůsobitelnost substrátu, a tedy ani možnosti jeho použití. Průměr ok mřížky se s výhodou pohybuje v rozmezí od 0,5 mm do 25 mm, kdy mřížka nijak neomezuje průchod světla, a vrstva polymerních nanovláken je přitom ještě dostatečně zpevněná i v prostoru jejích ok. Pro některé aplikace pak může být průměr ok mřížky i větší, avšak v takových případech je vrstva polymerních nanovláken díky své relativně velké ploše a minimálním mechanickým vlastnostem zejména v prostoru ok mřížky značně náchylná k přetržení, resp. protržení.

Při požadavku na kultivaci dvou různých a vzájemně oddělených druhů buněk na jednom substrátu, případně pro kultivaci dvojnásobného množství buněk jednoho druhu, je na nosné vrstvě substrátu uložena vrstva polymerních

PV 2011-424

14.7.2011 ’

Ρ337^ΓΖ

20.3.2012 nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru z každé její strany. Tím se současně podstatně zvýší pevnost a odolnost uložení obou vrstev polymerních nanovláken na nosné vrstvě, neboť tyto vrstvy k sobě v prostoru jejích ok přilnou a díky svému velkému povrchu se spojí relativně velkými povrchovými 5 (mezimolekulárními) silami.

Pro ochranu vrstvy polymerních nanovláken před mechanickým poškozením je výhodné, pokud je substrát alespoň z jedné své strany doplněn ochrannou vrstvou, tvořenou například průhlednou polyesterovou (PE) fólií, vrstvou netkané textilie typu spunbond, apod. Tato ochranná vrstva plní svoji 10 funkci zejména při skladování substrátu a manipulaci sním, a před uložením buněk na vrstvu polymerních nanovláken nebo před aplikací substrátu se z něj odstraní.

Na přiloženém výkrese je na obr. 1 a 2 vyfotografován substrát pro kultivaci buněk podle vynálezu v provedení, kdy je jeho nosná vrstva 1 tvořená 1,5 monofilamentní osnovní pleteninou. Konkrétně se přitom jedná o osnovní pleteninu CHS 100 vytvořenou z nebarveného polyesterovéhé hedvábí, která byla v ČR schválena Institutem pro testování a certifikaci, a.s., Zlín, ČR pro použití jako síťka pro chirurgické účely. Jejím výrobcem je Výzkumný ústav pletařský, a.s., Brno, ČR. Tato osnovní pletenina má velikost ok 1 mm, její 20 tlouštka má střední hodnotu 0,34 mm, a její pevnost při přetrhu ve směru osnovy je 230 N na 5 cm šířky. Struktura a materiál pleteniny přitom umožňují vratnou deformaci při relativním prodloužení do 5%. Vrstva 2 polymerních nanovláken je v tomto provedení tvořena nanovlákny z polykaprolaktonu (PLC) o molekulové hmotnosti 100 000, jehož dodavatelem je pod katalogovým číslem 25 1031 firma Scientific Polymer Products, lne., Ontario, USA. Její plošná hmotnost dosahuje hodnoty 0,3 g/m². Takto vytvořený substrát je dále ze strany nosné vrstvy 1 překryt ochrannou vrstvou 3 netkané textilie typu spunbond.

Aby bylo rozložení a kultivace buněk uložených na substrátu podle vynálezu rovnoměrné v celé jeho ploše, musí být dostatečně rovnoměrná i 30 vrstva 2 polymerních nanovláken. V současnosti se přitom nejvyšší rovnoměrnosti dosáhne vytvořením vrstvy polymerních nanovláken 2

PV 2011-424

14.7.2011 '

PS3754C212 20.3.2012 ’ elektrostatickým zvlákňováním polymemího systému - kapalného roztoku nebo taveniny polymeru s případným přídavkem alespoň jedné aktivní látky, která má být zakomponována do polymeru nanoviáken a/nebo jejího prekurzoru, v elektrickém poli vytvořeném mezi sběrnou elektrodou a zvlákňovací elektrodou 5 protáhlého tvaru - například válcem (viz např. EP 1673493) nebo strunou (viz např. EP 2059630 nebo EP 2173930), apod. V případě, že se polymerní nanovlákna během elektrostatického zvlákňování ukládají na elektricky nevodivý podklad, nebo na podklad s nízkou elektrickou vodivostí, je pro dosažení vyšší rovnoměrnosti jejich vrstvy dále výhodné, pokud se elektrická 10 vodivost takového podkladu před uložením polymerních nanoviáken zvýší (viz např. WO 2007054039). Díky tomu je možné z podkladu odvádět elektrický náboj nanášený na něj nabitými polymerními nanovlákny, takže nedochází kjeho koncentraci a tím k odpuzování následujících polymerních nanoviáken. Jako podklad přitom může být použita buď přímo nosná vrstva 1 substrátu, 15 nebo jiný materiál, ze kterého se uložená vrstva 2 polymerních nanoviáken sejme a přenese na nosnou vrstvu 1.

Při výrobě substrátu vyfotografovaného na obr. 1 a obr. 2 slouží nosná vrstva 1 tvořená monofilamentní osnovní pleteninou jako podklad pro uložení vrstvy 2 polymerních nanoviáken, přičemž je uložena nebo vedena 20 v elektrickém poli mezi sběrnou elektrodou a zvlákňovací elektrodou. Vzhledem k její zanedbatelné elektrické vodivosti se její elektrická vodivost před uložením vrstvy 2 polymerních nanoviáken zvýší, s výhodou na hodnotu 5,3 x 10¹⁰ Ω, nanesením vhodného zvodivovacího činidla, například vodného roztoku NaCl, EUNBr nebo Betainu, na její povrch a/nebo do její vnitřní struktury. Během 25 elektrostatického zvlákňování se pak polymerní nanovlákna ukládají přednostně na vláknech osnovní pleteniny, která představují fyzickou překážku v jejich pohybu ke sběrné elektrodě, avšak postupně zaplňují a překrývají také prostory jejích ok. Přitom se s osnovní pleteninou díky svému velkému povrchu a tím i velkým povrchovým (mezimolekulárním) silám, a případně i díky dopadu na ni 30 v ne zcela ztuhlém stavu, relativně pevně spojují. Pokud však není takto vytvořené spojení dostatečné pro uvažované použití substrátu, je možné nanášet na nosnou vrstvu 1^ před a/nebo během a/nebo po nanesení vrstvy 2

PV 2011-424 '

14.7.2011 ·

PSZTMČZž 20.3.2012 polymerních nanovláken vhodné biologicky kompatibilní pojivo, případně obě vrstvy propojit jiným vhodným postupem, například dle CZ PV 2010-373.

Substrát podle vynálezu se přitom buď vyrábí přímo v požadované velikosti nebo tvaru, nebo se připraví textilní kompozit obsahující nosnou vrstvu 5 1 a vrstvu 2 polymerních nanovláken například v podobě pásu, ze kterého se jednotlivé substráty v požadované velikosti a tvaru vyseknou, vyříznou, či jinak oddělí.

Díky dlouhodobě stabilnímu a rovnoměrnému procesu elektrostatického zvlákňování při použití technologie Nanospider™ společnosti Elmarco je možné 10 oběma těmito způsoby, na rozdíl od řešení známých ze stavu techniky, připravovat substráty pro kultivaci buněk opakovatelně ve stejné kvalitě, provedení a se stejnou plošnou hmotností vrstvy 2 polymerních nanovláken. Díky tomu je možné tyto substráty nejen vyrábět v průmyslovém měřítku či je podrobit potřebným testům pro použití jako léčivo, ale také vzájemně srovnávat 15 jejich různé varianty a dále je vyvíjet.

Substrát podle vynálezu je možné použít pro kryti povrchových ran, přičemž je výhodné, pokud jsou na jeho vrstvě nanovláken uloženy keratinocty (tzv. hlavní pokožkové buňky), fibroblasty (buňky vazivové tkáně), mezenchymální kmenové buňky, apod., případně kombinace těchto buněk.

Kromě toho je možné použít tento substrát také jako implantát pro implantaci do těla příjemce, přičemž v tomto případ je výhodné, pokud jsou na jeho vrstvě nanovláken uloženy osteocyty (základní buňky kostí), endoteliální buňky, mezenchymální kmenové buňky, apod., případně jejich kombinace, přičemž tyto buňky mohou být jak autologní, kdy je jejich dárcem příjemce implantátu, 25 tak alogenní, kdy je jejich dárcem jiná osoba. Kromě toho může být substrát využit také bez předem uložených buněk, kdy představuje prostor pro osídlení buňkami pacienta. Před jeho aplikací a případně před uložením buněk je přitom nezbytné, aby se substrát vhodným způsobem, který nevyvolá degradaci materiálu nosné vrstvy 1 a/nebo vrstvy nanovláken 2 a/nebo v ní uložené □0 aktivní látky, sterilizoval, a to například UV zářením, gama zářením, případně jiným způsobem.

PV 2011-424'

147.2011

PS3754(X2 ~

20.3.2012 10

V provedení substrátu podle vynálezu s nanesenými buňkami probíhá nanášení buněk na vrstvu 2 polymerních nanovláken například ve formě jejich suspenze v živném roztoku vhodného typu, která se pipetou rovnoměrně nakape na povrch vrstvy 2 polymerních nanovláken. Po uložení přilnou tyto 5 buňky k polymerním nanovláknům a kopírují strukturu vrstvy nanovláken 1, přičemž se dle své povahy a způsobu kultivace formují do jedné nebo více vrstev. Typ uložených buněk ani koncentrace, ve které jsou nanášeny, přitom nejsou limitovány žádnými parametry substrátu, ale pouze předpokládaným účelem jeho použití. Použité materiály přitom zajišťují, že během kultivace a při 10 použití substrátu se z něj neuvolňují žádné látky, které by ovlivňovali kultivaci uložených buněk, s výjimkou látek cíleně zakomponovaných do vrstvy 2 polymerních nanovláken, nebo zatěžovali organismus pacienta. Před aplikací substrátu je výhodné, pokud se buňky uložené na vrstvě 2 polymerních nanovláken kultivují v požadovaném kultivačním médiu s definovanými 15 podmínkami, čímž se podpoří a/nebo ověří jejich životaschopnost po aplikaci substrátu. Délka kultivace je přitom volí podle toho, zda je předpokládaným využitím substrátu požadováno, aby se buňky na vrstvě 2 polymerních nanovláken dále množily, či nikoliv. Kultivační médium s výhodou odpovídá typu použitých buněk, přičemž lze postupně použít několik různých médií. Před 20 použitím substrátu podle vynálezu je pak výhodné, pokud se z něj přebytečné kultivační médium/média nechá odkapat.

PV 2011-424

14.7.2011 •'PS375*4’CŤŽ

20.3.2012

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Substrát pro kultivaci buněk obsahující vrstvu (2) nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru uloženou na nosné vrstvě (1), vyznačující 5 se tím, že nosná vrstva (1) je tvořena mřížkou z biologicky kompatibilního materiálu a vrstva (2) nanovláken překrývá a vyplňuje prostor jejích ok.
2. Substrát podle nároku 1, vyznačující se tím, že nosná vrstva (1) je s vrstvou (2) nanovláken propojena biologicky kompatibilním pojivém.
3. Substrát podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že nosná vrstva 10 (1) je vytvořena monofilamantní osnovni pleteninou z nebarveného polyesterového hedvábí.
4. Substrát podle libovolného z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že na nosné vrstvě (1) je z každé její strany uložena vrstva (2) nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru.

15 5. Substrát podle libovolného z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že vrstva (2) nanovláken je vytvořena z polymeru ze skupiny želatina, chitosan, polyvinylalkohol (PVA), polykaprolakton (PCL), polylaktid (PLA), polyamid (PA), polyuretan (PUR), kyselina poly(laktid-co-glykolová), jejich směsi nebo jejich kopolymery.

20 θ- Substrát podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že vrstva (2) nanovláken obsahuje alespoň jednu aktivní látku ze skupiny antibiotika, antiseptika, stříbrorůstové faktory, vitamíny, rostlinné extrakty, hormony, kortikoidy, cytokiny.
7. Substrát podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se 25 tím, že vrstva (2) nanovláken je z vnější strany překryta ochrannou vrstvou (3).
8. Substrát podle nároku 7, vyznačující se tím, že ochranná vrstva (3) je tvořena polyetylenovou fólií nebo netkanou textilií typu spunbond.

PV 2011-424

14.7.2011 '

PS375*4’C^

20.3.2012
10. Substrát podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že na vrstvě (2) nanovláken jsou uloženy buňky ze skupiny keratinocyty, fibroblasty, epiteliální buňky, endoteliální buňky, ostecyty, mezenchymální kmenové buňky, nebo jejich kombinace.

5
11. Způsob výroby substrátu pro kultivaci buněk podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že vrstva (2) nanovláken z biologicky kompatibilního polymeru se ukládá na nosnou vrstvu (1) tvořenou mřížkou z biologicky kompatibilního materiálu elektrostatickým zvlákňováním polymerního systému v elektrickém poli vytvořeném mezi sběrnou elektrodou a 10 proti ní uloženou zvlákňovací elektrodou protáhlého tvaru, přičemž ukládaná vrstva (2) nanovláken překrývá také oka mřížky.

_;
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že elektrická vodivost nosné vrstvy (1) se před nanesením nanovláken zvýší nanesením zvodivovacího prostředku na její povrch a/nebo do její struktury.

¹⁵ .
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že zvodivovacím prostředkem je vodný roztok NaCI, Et4NBr nebo Betainu.
14. Způsob podle libovolného z nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že před uložením vrstvy (2) nanovláken a/nebo během něj a/nebo po něm se na nosnou vrstvu (1) nanese biologicky kompatibilní pojivo.

7 ' ° 15. Způsob podle libovolného z nároků 10 až 14, vyznačující se tím, že nosná vrstva (1) je tvořena monofilamanetní osnovní pleteninou z nebarveného polyesterového hedvábí.