CZ2010589A3 - Reakcní smes pro molekulární detekci Waxy A1 alely pšenice - Google Patents
Reakcní smes pro molekulární detekci Waxy A1 alely pšenice Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2010589A3 CZ2010589A3 CZ20100589A CZ2010589A CZ2010589A3 CZ 2010589 A3 CZ2010589 A3 CZ 2010589A3 CZ 20100589 A CZ20100589 A CZ 20100589A CZ 2010589 A CZ2010589 A CZ 2010589A CZ 2010589 A3 CZ2010589 A3 CZ 2010589A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- microliters
- reaction mixture
- allele
- wheat
- primer
- Prior art date
Links
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract description 14
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 6
- 108010004047 granule-bound starch synthase I Proteins 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical class [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Rešení se týká reakcní smesi pro molekulární detekci Waxy A1 alely pšenice polymerázovou retezovou reakcí s následnou digescí PCR produktu restrikcní endonukleázou Hind III, která je charakterizována tím, že její základní cástí jsou primery o specifické sekvenci, primer F: CCCCAAAGCAAAGCAGGAAACC a primer R: TCGCCAGAGATTAGCTCCTCAGCA.
Description
(57) Anotace:
Řešení sc týká reakční směsi pro molekulární detekci Waxy Al alely pšenice polymerázovou řetězovou reakci s následnou digesci PCR produktu restrikčni endonukleázou Hind 111. která je charakterizována tím, že její základní částí jsou primery o specifické sekvenci, primer F: CCCCAAAGCAAAGCAGGAA ACC a primer R:
TCGCC AG A GATTAGC Ί CCIC AGC A.
CZ 2010-589 A3
PV X)40 - 5S3 • ΦΦΦ φφ ·· ···· · φφ • · φ ΦΦ φ Φ φ φ · φφφ φ φ φ φφφ φφφφφφφ φ*· ♦ · ·· φφ φ φ·· φφ
Reakční směs pro molekulární detekci WaxyAI alely pšenice
Oblast techniky
Řešení se týká reakční směsi se specifickými primery pro odlišení nulové a standardní Waxy A1(dále Wx-A1) alely u pšenice na základě polymerázové řetězové reakce (dále PCR) následované digescí vzniklého produktu PCR pomocí restrikční endonukleázy Hind III.
Dosavadní stav techniky
Škrob se skládá z 20 až 30 % hmotn. amylosy a 70 až 80 % hmotn. amylopektinu. Poměr amylosy/amylopektinu je klíčový pro pekařskou kvalitu pšeničné mouky. Genom pšenice seté (Tnticum aestivum L.) kóduje tři izoformy (Wx-A1, Wx-B1, Wx-D1) enzymu Granule-bound starch synthase I (dále GBSSI), který je odpovědný za tvorbu amylosy v endospermu pšeničných zrn. Každá izoforma enzymu může mít buď standardní alelu genu (produkuje funkční enzym GBSSI) nebo tzv. nulovou alelu genu (produkuje nefunkční enzym GBSSI). Souvislost mezi nulovými alelami GBSSI a sníženým obsahem amylosy v pšeničných zrnech byla již vědecky prokázána (Miura et al. 1999, Vrinten et al. 1999).
Dříve publikované molekulární markéry pro detekci nulové a standardní Wx-A1 alely jsou založeny na Southern hybridizaci s použitím radioaktivně značené sondy (Vrinten et al. 1999), to je ale nevýhodné z hlediska zacházení s radioaktivními látkami. Dále jsou známy specifické primery pro odlišení nulové a standardní alely Wx-A1 (Nakamura et al. 2002), které poskytují dva PCR produkty s podobnou délkou (370 párů baží u nulové alely a 389 párů baží u standardní alely), tudíž jsou na ·*·· ·« «« ··«« v • · · · · · ··*· • · · · · · · * · agarosovém gelu špatně odlišitelné a navíc tyto primery amplifikují i standardní Wx-B1 alelu s podobnou délkou produktu (410 párů baží) a standardní i nulovou Wx-D1 alelu (obé poskytují produkt o délce 408 párů baží). Výsledné produkty PCR jsou příliš blízko u sebe, tudíž jsou od sebe hůře rozeznatelné.
Rychlý a přesný molekulární screening velkého počtu vzorků pšenice na přítomnost nulové Wx-A1 alely a tím i snížený obsah amylosy ve škrobu je velice potřebný zejména pro šlechtitelské stanice, které vyvíjejí nové odrůdy s určitým požadovaným složením škrobu, které je žádané z hlediska dalšího průmyslového zpracování.
Podstata vynálezu
Uvedené problémy odstraňuje reakční směs pro molekulární detekci Wx-A1 alely pšenice polymerázovou řetězovou reakcí a následné digesci PCR produktu restrikční endonukleázou Hind III, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že její základní částí jsou nové primery o specifické nukleotidové sekvenci primer F: CCCCAAAGCAAAGCAGGAAACC a primer R: TCGCCAGAGATTAGCTCCTCAGCA.
Reakční směs podle vynálezu je charakterizována tím, že v objemu 25 mikrolitrů je 100 nanogramů testované DNA (5 mikrolitrů DNA o koncentraci 20 nanogramů na mikrolitr), 12,5 mikrolitrů pufru obsahující 5 milimolární koncentraci hořečnatých iontů, 0,2 mikrolitrů DNA polymerázy o koncentraci 5 jednotek na mikrolitr, 4 mikrolitry deoxyribonukleotidů o koncentraci 2,5 milimolární, 1,3 mikrolitrů vody pro PCR a 1 mikrolitr ···· ·· ·« *·«* ·· • · · · · · · · · ♦ ··« · · · *·· specifického primerů F o koncentraci 10 mikromolární a 1 mikrolitr specifického primerů R o koncentraci 10 mikromolární.
Primery o specifické nukleotidové sekvenci primer F: CCCCAAAGCAAAGCAGGAAACC a primer R: TCGCCAGAGATTAGCTCCTCAGCA jsou také podstatou vynálezu.
Reakční směs podle vynálezu pro PCR se připravuje do mikrozkumavky o objemu 0,2 mililitru. PCR probíhá v termocykleru při následujícím teplotním profilu: 1 minuta při 94 °C, následuje 30 cyklů skládajících se ze tří kroků (30 sekund při 94 °C, 30 sekund při 66 °C a 2 minuty při 72 °C), nakonec je vzorek zahříván na 72 °C po dobu 5 minut pro dokončení polymerační reakce.
Produkt PCR je následně podroben působení restrikční endonukleázy Hind III. Pro reakci o výsledném objemu 50 mikrolitrů se použije 20 mikrolitrů PCR produktu (viz výše), 5 mikrolitrů pufru, 23 mikrolitrů sterilní deionizované vody a 2 mikrolitry enzymu Hind III (o koncentraci 10 jednotek na mikrolitr). Reakční směs se připravuje do mikrozkumavky o objemu 0,2 mililitru a je zahřívána v termocykleru při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin, reakce je ukončena zahřátím reakční směsi na 80 °C po dobu 20 minut.
Délka získaného produktu se rozliší na 2% agarosovém gelu pomocí délkového standardu, přičemž standardní Wx-A1 alela poskytuje produkt o délce 1155 párů baží a nulová Wx-A1 alela poskytuje produkt o délce 1331 párů baží.
Reakční směs podle vynálezu se specifickou sekvencí primerů umožňuje amplifikovat specifický úsek waxy genu na chromozomu 7A, který po následném působení restrikční endonukleázy Hind III prokáže
přítomnost nulové nebo standardní Wx-A1 alely. Oba dva PCR produkty se od sebe liší po restrikci o 176 párů baží, takže na agarosovém gelu je rozdíl mezi nulovou a standardní Wx-A1 alelou jasně patrný. Další výhodou je, že bezchybná funkčnost uvedené reakční směsi pro molekulární detekci Waxy A1 alely byla ověřena na 94 českých odrůdách pšenice při pokusech ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, v.v.i., Praha, CZ, kde pobíhal i vývoj reakční směsi pro detekci.
Následující příklady provedení technické řešení pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.
Příklady provedení
Příklad 1
Pro analýzu byly použity listy pšenice. DNA byla izolována pomocí modifikované extrakční metody CTAB (Murray a Thompson 1980). Koncentrace izolované DNA byla změřena na spektrofotometru a následně naředěna vodou pro PCR na koncentraci 20 nanogramů na mikrolitr. Reakční směs měla složení: 12,5 mikrolitru pufru 2* GC Buffer I (TAKARA BIO INC., Japonsko) obsahující 5 milimolární koncentraci hořečnatých iontů, 4 mikrolitry deoxyribonukleotidů o koncentraci 2,5 milimolární, 1,3 mikrolitru vody pro PCR, 1 mikrolitr specifického příměru F a 1 mikrolitr specifického primeru R o koncentracích 10 mikromolární, 0,2 mikrolitru DNA polymerázy TaKaRa La Taq™ (TAKARA BIO INC., Japonsko) o koncentraci 5 jednotek na mikrolitr a 5 mikrolitrů DNA o koncentraci 20 nanogramů na mikrolitr. Vlastní PCR probíhala v termocykleru MJTB (MJ Research, USA) při následujícím teplotním profilu: 1 minuta při 94 °C, následuje 30 cyklů skládajících se ze tří kroků (30 sekund při 94 °C, 30 sekund při 66 °C a 2 minuty při 72 °C), nakonec ···· ·· ···· « «« **· · · · ♦« · · ··· · · · ·«· ······ *·· • · · * ♦· · ····· byl vzorek zahříván na 72 °C po dobu 5 minut pro dokončení polymerační reakce.
Následná digesce získaného produktu PCR probíhala v reakční směsi o složení: 20 mikrolitrú produktu PCR (viz výše), 5 mikrolitrů pufru R (Fermentas, Kanada) (o složení: 10 milimolární
Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 10 milimolární chlorid hořečnatý, 100 milimolární chlorid draselný a hovězí sérový albumin o koncentraci 0,1 miligramů na mililitr, pH 8,5 při 37 °C - upraveno pomocí kyseliny chlorovodíkové), 23 mikrolitrů sterilní deionizované vody a 2 mikrolitry enzymu Hind III o koncentraci 10 jednotek na mikrolitr (Fermentas, Kanada). Tato reakční směs byla připravena do mikrozkumavky o objemu 0,2 mililitru a zahřívána v termocykleru při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin, reakce byla ukončena zahřátím reakční směsi na 80 °C po dobu 20 minut.
Délka získaného produktu byla rozlišena na 2% agarosovém gelu pomocí délkového standardu 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Kanada). U standardní Wx-A1 alely byl pozorován produkt o délce 1155 párů baží a u nulové Wx-A1 alely byl pozorován produkt dlouhý 1331 párů baží.
Průmyslová využitelnost
Reakční směs pro molekulární detekci Wx-A1 alely je možné dodávat šlechtitelským stanicím a laboratořím ve formě detekčního kitu, kdy uživatel přidá pouze svůj vzorek ve formě DNA a postupuje přesně podle stanovených podmínek reakce. Může se tak hned v počátku růstu pšenice odhalit, zda bude mít vyvíjená nová odrůda snížený obsah amylosy ve škrobu a tím vytipovat její další průmyslové využití.
Použitá literatura
Miura H., Araki E., Tarui S. (1999): Amylose synthesis capacity of the three Wx genes of wheat cv. Chinese Spring. Euphytica 108: 91 - 95.
Murray H.G., Thompson W.F. (1980): Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic. Acids. Res., 8: 4321 -4325.
Nakamura T., Vrinten P., Saito M., Konda M. (2002). Rapid classification of partial waxy wheats using PCR-based markers. Genome 45: 1150 1156.
Vrinten P., Nakamura T., Yamamori M. (1999). Molecular characterization of waxy mutations in wheat. Mol. Gen. Genet. 261: 463 - 471.
Claims (3)
- NÁROKY NA OCHRANU l· &PY 2040 *··· ·· ·· ·«♦· · ·· ♦ · · · ♦ · ···« «»· · « · · * Φ «··· · · · · · · • · ·· ·» 9 999 9·1. Reakční směs pro molekulární detekci Wx-A1 alely pšenice polymerázovou řetězovou reakcí a následné digesci PCR produktu restrikční endonukleázou Hind III, vyznačující se tím, že její základní částí jsou nové primery o specifické sekvenci primer F: CCCCAAAGCAAAGCAGGAAACC a primer R: TCGCCAGAGATTAGCTCCTCAGCA.
- 2. Reakční směs podle nároku 1, vyznačující se tím, že v objemu 25 mikrolitrů je 100 nanogramů testované DNA (5 mikrolitrů DNA o koncentraci 20 nanogramů na mikrolitr), 12,5 mikrolitrů pufru, obsahující 5 milimolární koncentraci horečnatých iontů, 0,2 mikrolitrů DNA polymerázy o koncentraci 5 jednotek na mikrolitr, 4 mikrolitry deoxyribonukleotidů o koncentraci 2,5 milimolární, 1,3 mikrolitrů vody pro PCR a 1 mikrolitr specifického primeru F o koncentraci 10 mikromolární a 1 mikrolitr specifického primeru R o koncentraci 10 mikromolární.
- 3. Primery o specifické nukleotidové sekvenci
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100589A CZ2010589A3 (cs) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | Reakcní smes pro molekulární detekci Waxy A1 alely pšenice |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100589A CZ2010589A3 (cs) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | Reakcní smes pro molekulární detekci Waxy A1 alely pšenice |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010589A3 true CZ2010589A3 (cs) | 2012-02-08 |
Family
ID=45557769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20100589A CZ2010589A3 (cs) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | Reakcní smes pro molekulární detekci Waxy A1 alely pšenice |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2010589A3 (cs) |
-
2010
- 2010-07-30 CZ CZ20100589A patent/CZ2010589A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2518146B1 (en) | Method for detection and quantification of wheat endogenous gene | |
| CN101760508A (zh) | 小麦-黑麦1bl/1rs易位系的鉴定方法研究 | |
| CN105087759A (zh) | 鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法 | |
| WO2007132760A1 (ja) | コムギ内在性ｄｎａの検出・定量法、および被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率の決定方法 | |
| CN101701258B (zh) | 菜豆的pcr鉴定用引物及pcr鉴定方法 | |
| Cristina et al. | Comparison of four genomic DNA isolation methods from single dry seed of wheat, barley and rye | |
| KR102563613B1 (ko) | 표고버섯 품종 중 참아람 판별용 snp 마커 조성물 및 이의 용도 | |
| CZ2010589A3 (cs) | Reakcní smes pro molekulární detekci Waxy A1 alely pšenice | |
| JP2001238700A (ja) | 異種個体の存在割合の測定方法 | |
| CZ21274U1 (cs) | Rychloupínací přípravek pro adjustaci tlakové měřicí komůrky | |
| CN105112538A (zh) | 转基因玉米mir162双重数字pcr荧光定量检测方法 | |
| CN104388580A (zh) | 基于数字pcr鉴定纯合型或杂合型nk603的方法 | |
| KR101820077B1 (ko) | 유전자 변형 레스베라트롤 생합성 벼 검정용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검정 방법 | |
| CN105112530A (zh) | 转基因玉米bt176双重数字pcr荧光定量检测方法 | |
| CZ2011521A3 (cs) | Reakcní smes pro detekci Waxy A1 a Waxy B1 alel psenice | |
| CZ22810U1 (cs) | Reakční směs pro detekci Waxy Ala Waxy Bl alel pšenice | |
| Fu et al. | Multiplex enrichment quantitative PCR (ME-qPCR): a high-throughput, highly sensitive detection method for GMO identification | |
| CN108546737A (zh) | 一种油菜转基因成分的检测方法 | |
| Firdaus et al. | Novel nonwaxy allele variation among foxtail millet genotypes from Indonesia. | |
| Abbas et al. | Quantitative detection of CAMV-35S promoter and T-NOS terminator in genetic modified tomato from Iraqi markets | |
| CZ2010590A3 (cs) | Reakcní smes pro molekulární detekci standardní Waxy B1 alely pšenice | |
| JP2022144656A (ja) | Ｓａｒｔ－１変異を有する低アミロース形質イネ | |
| CN105112539A (zh) | 转基因玉米mon810双重数字pcr荧光定量检测方法 | |
| AU2003259589A1 (en) | Molecular markers for high molecular weight glutenin subunits | |
| CZ21275U1 (cs) | Reakční směs pro molekulární detekci standardní Waxy Bl alely pšenice |