CZ2010590A3 - Reakcní smes pro molekulární detekci standardní Waxy B1 alely pšenice - Google Patents
Reakcní smes pro molekulární detekci standardní Waxy B1 alely pšenice Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2010590A3 CZ2010590A3 CZ20100590A CZ2010590A CZ2010590A3 CZ 2010590 A3 CZ2010590 A3 CZ 2010590A3 CZ 20100590 A CZ20100590 A CZ 20100590A CZ 2010590 A CZ2010590 A CZ 2010590A CZ 2010590 A3 CZ2010590 A3 CZ 2010590A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- allele
- wheat
- reaction mixture
- microlitres
- primers
- Prior art date
Links
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 12
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 108010004047 granule-bound starch synthase I Proteins 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical class [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710095129 Granule-bound starch synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Rešení se týká reakcní smesi pro molekulární detekci standardní Wx-B1 alely pšenice polymerázovou retezovou reakcí, která je charakterizována tím, že její základní cástí jsou primery o specifické nukleotidové sekvenci, primer F: CAGGTTTTCAGGGTGTGAGG a primer R: TTGTGGATGCAGAACGCTAC.
Description
Oblast techniky
Řešení se týká reakční směsi se specifickými primery pro molekulární detekci standardní Waxy B1 (dále Wx-B1) alely u pšenice na základě polymerázové řetězové reakce (dále PCR).
Dosavadní stav techniky
Škrob se skládá z 20 až 30 % hmotn. amylosy a 70 až 80 % hmotn. amylopektinu. Poměr amylosy/amylopektinu je klíčový pro pekařskou kvalitu pšeničné mouky. Genom pšenice seté (Triticum aestivum L.) kóduje tři izoformy enzymu (Wx-A1, Wx-B1, Wx-D1) Granule-bound starch synthase l (dále GBSSI), který je odpovědný za tvorbu amylosy v endospermu pšeničných zrn. Každá izoforma enzymu může mít buď standardní alelu genu (produkuje funkční enzym GBSSI) nebo tzv. nulovou alelu genu (produkuje nefunkční enzym GBSSI). Souvislost mezi nulovými alelami GBSSI a sníženým obsahem amylosy v pšeničných zrnech byla vědecky prokázána (Miura et al. 1999, Vrinten et al. 1999). Největší vliv na snížený obsah amylosy v endospermu má právě nulová Wx-B1 alela, neboť tato alela postrádá celou transkripční oblast genu GBSSI na chromozomu 4A (Miura et al. 1999, Vrinten et al. 1999).
Nevýhodou doposud publikovaných primerů pro detekci standardní Wx-B1 alely je současná amplifikace jiných waxy alel (standardní i nulová Wx-A1, standardní i nulová Wx-D1 alela) o podobné délce PCR produktu, proto jsou hůře odlišitelné na agarosovém gelu (Nakamura et al. 2002).
·· ·· ·*·* * ·· • · ♦ ♦ · · · 4 · • · · « « « « « *
Již dříve se stalo, že primery pro detekci standardní Wx-B1 alely poskytovaly falešně negativní výsledky díky genetické variabilitě lokálních odrůd pšenice (Vanzetti et al. 2009).
Spolehlivé primery pro detekci přítomnosti standardní Wx-B1 alely na základě PCR, které byly validované na desítkách českých odrůd, jsou velice potřebné zejména pro šlechtitelské stanice, které vyvíjejí nové odrůdy s určitým požadovaným složením škrobu, které je žádané z hlediska dalšího průmyslového zpracování.
Podstata vynálezu
Uvedené nedostatky odstraňuje reakční směs pro molekulární detekci standardní Wx-B1 alely pšenice polymerázovou řetězovou reakcí, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že její základní částí jsou nové primery o specifické nukleotidové sekvenci primer F: CAGGTTTTCAGGGTGTGAGG a primer R: TTGTGGATGCAGAACGCTAC.
Reakční směs podle vynálezu je charakterizována tím, že obsahuje
12,5 mikrolitru pufru obsahující 5 milimolární koncentraci hořečnatých iontů, 4 mikrolitry deoxyribonukleotidů o koncentraci 2,5 milimolární, 1,3 mikrolitru vody pro PCR, 1 mikrolitr specifického primerů F a 1 mikroiitr specifického primerů R o koncentracích 10 mikromolární, 0,2 mikrolitru DNA polymerázy o koncentraci 5 jednotek na mikrolitr a 5 mikrolitrů DNA o koncentraci 20 nanogramů na mikrolitr.
Primery o specifické nukleotidové sekvenci primer F: CAGGTTTTCAGGGTGTGAGG a primer R: TTGTGGATGCAGAACGCTAC ···· ·· ·· ···· « ·· • · · ·· · ·· · · • · · · · * «·* jsou také podstatou vynálezu.
Reakční směs podle vynálezu pro PCR se připravuje do mikrozkumavky o objemu 0,2 mililitru a probíhá v termocykleru při následujícím teplotním profilu: 1 minuta při 94 °C, následuje 30 cyklů skládajících se ze tří kroků (30 sekund při 94 °C, 30 sekund při 66 °C a 2 minuty při 72 °C), nakonec je vzorek zahříván na 72 °C po dobu 5 minut pro dokončení polymerační reakce.
Přítomnost produktu PCR s očekávanou délkou je detekována na 2% agarosovém gelu pomoci délkového standardu, přičemž standardní Wx-B1 alela poskytuje produkt o délce 1208 párů baží a nulová Wx-B1 alela neposkytuje žádný produkt, protože celý gen je deletovaný.
Primery podle vynálezu pro detekci standardní Wx-B1 alely pomocí PCR poskytují pouze jeden PCR produkt o velikosti 1208 párů baží, tyto sekvence příměrů nebyly dosud publikovány. Funkčnost primerů podle vynálezu byla ověřena na 94 českých odrůdách pšenice při pokusech ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, v.v.i., Praha, CZ, kde probíhal i vývoj reakční směsi pro molekulární detekci standardní Wx-B1 alely.
Následující příklady provedení technické řešení pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.
Příklady provedení
Příklad 1
Pro analýzu byly použity listy pšenice. DNA byla izolována pomocí modifikované extrakční metody CTAB (Murray a Thompson 1980). Koncentrace izolované DNA byla změřena na spektrofotometru a následně naředěna vodou pro PCR na koncentraci 20 nanogramú na ···· * «« ««·* « ·· • · · · · » ···· ··· · · · «·· mikrolitr. Reakční směs měla složení: 12,5 mikrolitru pufru 2* GC Buffer I (TAKARA BIO INC., Japonsko), 4 mikrolitry deoxyribonukleotidů o koncentraci 2,5 milimolární, 1,3 mikrolitru vody pro PCR, 1 mikrolitr specifického primeru F a 1 mikrolitr specifického primeru R o koncentracích 10 mikromolární, 0,2 mikrolitru DNA polymerázy TaKaRa La Taq™ (TAKARA BIO INC., Japonsko) o koncentraci 5 jednotek na mikrolitr a 5 mikrolitru DNA o koncentraci 20 nanogramů na mikrolitr. Vlastní PCR probíhala v termocykleru MJTB (MJ Research, USA) při následujícím teplotním profilu: 1 minuta při 94 °C, následuje 30 cyklů skládajících se ze tří kroků (30 sekund při 94 °C, 30 sekund při 66 °C a 2 minuty při 72 °C) nakonec byl vzorek zahříván na 72 °C po dobu 5 minut pro dokončení polymeračni reakce.
Délka získaného produktu byla rozlišena na 2% agarosovém gelu pomocí délkového standardu 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Kanada). U standardní Wx-B1 alely byl pozorován produkt o délce 1208 párů baží a u nulové Wx-B1 alely nebyl pozorován žádný produkt.
Průmyslová využitelnost
Nové specifické primery pro molekulární detekci standardní Wx-B1 alely na základě PCR je možné dodávat šlechtitelským stanicím a laboratořím jako součást již hotové reakční směsi, kdy uživatel přidá pouze svůj vzorek ve formě DNA a postupuje přesné podle stanovených podmínek reakce. Může se tak hned v počátku růstu pšenice odhalit, zda bude mít vyvíjená nová odrůda snížený obsah amylosy ve škrobu a tím vytipovat i další průmyslové využití této pšenice.
- 5V
| «· · · • ♦ | ·· | • • | |||
| ♦ | • ♦ | • • | |||
| • · | • | ♦ | |||
| « · | ·« |
Použitá literatura
Miura H., Araki E., Tarui S. (1999): Amylose synthesis capacity of the three Wx genes of wheat cv. Chinese Spring. Euphytica 108: 91 - 95.
Murray H.G., Thompson W.F. (1980): Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic. Acíds. Res., 8: 4321 -4325.
Nakamura T., Vrinten P., Saito M., Konda M. (2002). Rapid classification of partial waxy wheats using PCR-based markers. Genome 45: 1150 — 1156.
Vanzetti L. S., Pfluger L. A., Roríguez-Quijano M., Carrillo J. M., Helguera M. (2009): Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm. Electronic Journal of Biotechnology, 12: 1 - 9.
Vrinten P., Nakamura T., Yamamori M. (1999). Molecular characterization of waxy mutations in wheat. Mol. Gen.Genet. 261: 463 - 471.
Claims (3)
- NÁROKY NA OCHRANU- éř
·· • · · • • • * 9 · ·♦ · · • • • • • · • · ♦ • · 9 • « 9 • 9 · ·· • 9 99 9 9 1. Reakční směs pro molekulární detekci standardní Wx-B1 alely pšenice polymerázovou řetězovou reakcí, vyznačující se tím, že její základní částí jsou nové primery o specifické nukleotidové sekvenci primer F: CAGGTTTTCAGGGTGTGAGG a primer R: TTGTGGATGCAGAACGCTAC. - 2. Reakční směs podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje12,5 mikrolitrů pufru obsahující 5 milimolární koncentraci hořečnatých iontů, 4 mikrolitry deoxyribonukleotidú o koncentraci 2,5 milimolární, 1,3 mikrolitrů vody pro PCR, 1 mikrolitr specifického primerů F a 1 mikrolitr specifického primerů R o koncentracích 10 mikromolární, 0,2 mikrolitrů DNA polymerázy o koncentraci 5 jednotek na mikrolitr a 5 mikrolitrů DNA o koncentraci 20 nanogramů na mikrolitr.
- 3. Primery o specifické nukleotidové sekvenci
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100590A CZ2010590A3 (cs) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | Reakcní smes pro molekulární detekci standardní Waxy B1 alely pšenice |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100590A CZ2010590A3 (cs) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | Reakcní smes pro molekulární detekci standardní Waxy B1 alely pšenice |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010590A3 true CZ2010590A3 (cs) | 2012-02-08 |
Family
ID=45557770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20100590A CZ2010590A3 (cs) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | Reakcní smes pro molekulární detekci standardní Waxy B1 alely pšenice |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2010590A3 (cs) |
-
2010
- 2010-07-30 CZ CZ20100590A patent/CZ2010590A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Waxy gene haplotypes: Associations with pasting properties in an international rice germplasm collection | |
| Shimbata et al. | Mutations in wheat starch synthase II genes and PCR-based selection of a SGP-1 null line | |
| Kharabian‐Masouleh et al. | Discovery of polymorphisms in starch‐related genes in rice germplasm by amplification of pooled DNA and deeply parallel sequencing | |
| Xu et al. | PCR-based markers for identification of HMW-GS at Glu-B1x loci in common wheat | |
| Moskalets et al. | New genotypes and technological indicators of winter triticale | |
| Li et al. | A mutation in Waxy gene affects amylose content, starch granules and kernel characteristics of barley (Hordeum vulgare) | |
| Jamar et al. | NAM-1gene polymorphism and grain protein content in Hordeum | |
| Wu et al. | Analysis of the relationship between Wx gene polymorphisms and amylose content in hulless barley | |
| CZ2010590A3 (cs) | Reakcní smes pro molekulární detekci standardní Waxy B1 alely pšenice | |
| CZ21275U1 (cs) | Reakční směs pro molekulární detekci standardní Waxy Bl alely pšenice | |
| Si et al. | Variability of polyphenol oxidase (PPO) alleles located on chromosomes 2A and 2D can change the wheat kernel PPO activity | |
| Klimushina et al. | Analysis of allelic state of genes responsible for baking properties in allocytoplasmic wheat hybrids | |
| Maryami et al. | Investigation of diversity of Waxy-A1 gene using amplification in different spices in A genome wheat's | |
| Firdaus et al. | Novel nonwaxy allele variation among foxtail millet genotypes from Indonesia. | |
| CZ2011521A3 (cs) | Reakcní smes pro detekci Waxy A1 a Waxy B1 alel psenice | |
| Davoyan et al. | Allelic variants for Waxy genes in common wheat lines bred at the Lukyanenko National Grain Center | |
| CZ22810U1 (cs) | Reakční směs pro detekci Waxy Ala Waxy Bl alel pšenice | |
| CZ2010589A3 (cs) | Reakcní smes pro molekulární detekci Waxy A1 alely pšenice | |
| Park et al. | Genetic diversity and expression analysis of granule bound starch synthase I gene in the new world grain amaranth (Amaranthus cruentus L.) | |
| Khurshid et al. | Prevalence of puroindoline genes and their impact on quality traits in a diverse germplasm of wheat genotypes | |
| CZ21274U1 (cs) | Rychloupínací přípravek pro adjustaci tlakové měřicí komůrky | |
| AU2003259589A1 (en) | Molecular markers for high molecular weight glutenin subunits | |
| Ali et al. | GENETIC VARIATION AT LOCI CONTROLLING QUALITY TRAITS IN SPRING WHEAT. | |
| Kravets et al. | Correlation between ecological plasticity of elite winter wheat varieties and DNA methylation pattern polymorphism within variety | |
| Klimushina et al. | About optimization of molecular labeling of wheat Waxy-genes for MAS-selection |