CZ2010297A3 - Kultivacní puda pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus a zpusob odberu steru odberovými tycinkami - Google Patents

Kultivacní puda pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus a zpusob odberu steru odberovými tycinkami Download PDF

Info

Publication number
CZ2010297A3
CZ2010297A3 CZ20100297A CZ2010297A CZ2010297A3 CZ 2010297 A3 CZ2010297 A3 CZ 2010297A3 CZ 20100297 A CZ20100297 A CZ 20100297A CZ 2010297 A CZ2010297 A CZ 2010297A CZ 2010297 A3 CZ2010297 A3 CZ 2010297A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
culture medium
bacteria
source
medium according
concentration
Prior art date
Application number
CZ20100297A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303565B6 (cs
Inventor
Matoulková@Dagmar
Kosar@Karel
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Priority to CZ20100297A priority Critical patent/CZ303565B6/cs
Priority to EP10168801.8A priority patent/EP2377919B1/en
Priority to US13/085,579 priority patent/US20110256584A1/en
Priority to JP2011090604A priority patent/JP2011224001A/ja
Publication of CZ2010297A3 publication Critical patent/CZ2010297A3/cs
Publication of CZ303565B6 publication Critical patent/CZ303565B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N2001/028—Sampling from a surface, swabbing, vaporising

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Rešení se týká kultivacní pudy pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus, která obsahuje alespon jeden zdroj uhlíku, alespon jeden zdroj dusíku, alespon jeden zdroj aminokyselin, alespon jeden zdroj vitamínu, alespon jeden zdroj síry, alespon jeden zdroj biogenních kovu, alespon jednu látku snižující redoxpotenciál, pufrující složku, a dále izo-.alfa.-kyseliny a/nebo jejich redukované hydrogenované deriváty v koncentraci 10 až 80 mg/l. Rešení se dále týká zpusobu odberu steru odberovými tycinkami s odberovou cástí, jehož podstata spocívá v tom, že pred provedením steru je odberová cást odberové tycinky namocena v roztoku sterilované destilované vody s prídavkem látky snižující redoxpotenciál v koncentraci 0,25 až 3 g/l, a po provedení steru se odebraný ster umístí do shora uvedené kultivacní pudy.

Description

Kultivační půda pro kultivaci a identifikaci bakterii rodu Pectinatus a způsob odběru stěrů odběrovými tyčinkami
Oblast techniky
Vynález se týká kultivační půdy pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus, která obsahuje alespoň jeden zdroj uhlíku, alespoň jeden zdroj dusíku, alespoň jeden zdroj aminokyselin, alespoň jeden zdroj vitamínů, alespoň jeden zdroj siry, alespoň jeden zdroj biogenních kovů, alespoň jednu látku snižující redoxpotenciál a pufrujicí složku.
Vynález se dále týká způsobu odběru stěrů odběrovými tyčinkami s odběrovou částí.
Dosavadní stav techniky
V důsledku úprav technologií pro stáčení piva, při kterých se snižuje obsah kyslíku v pivu až pod hranici 1 mg/l, rostoucí produkce některých druhů piv, které jsou ze své podstaty náchylnější k bakteriální kontaminaci, jako například piv méně chmelených, nizkoalkoholických, nealkoholických či nepasterovaných, a používání průtokové pasterizace či studené sterilizace piva, hrozí v současné době zvýšené riziko kontaminace piva anaerobními mikroorganizmy. Tyto mikroorganizmy se vyskytují převážně jako sekundární, tedy post-pasterizační kontaminanty, a tzv. „kazí“ pivo, když během svého životního cyklu produkují radu chemických sloučenin (kyselinu propionovou, kyselinu octovou, sirovodík atd.), které negativně ovlivňuji organoleptické vlastnosti piva, zvyšují jeho kyselost, a způsobují charakteristický masivní zákal a nepříjemný zápach. V krajním případě může dojít v důsledku nahromadění většího množství plynu vyprodukovaného těmito mikroorganizmy dokonce k explozi lahve.
Z tohoto hlediska patří k nejvýznamnějším anaerobním mikroorganizmům bakterie rodu Pectinatus, přičemž se odhaduje, že se v současné době podílí na více než 30% případů zkažení baleného piva. Tyto •PS3675CZ bakterie jsou tolerantní vůči alkoholu až do 4,5% (w/v), vůči sníženému pH až do hodnoty 3,7 i vůči hořkým chmelovým látkám, a i přesto, že se jedná o striktně anaerobní bakterie, jsou schopné přežívat po nějakou dobu v aerosolu - viz. např. Helander I.M., Haikara A., Sadovskaya I., Vinogradov E., SalkinojaSalonen M.S. (2004): „Lipopolysaccharides of anaerobic beer spoilage bacteria of the genus Pectinatus - lipopolysaccharides of a gram-positive genus“; FEMS Microbiol. Rev. 28: 543-552.
Přítomnost bakterií rodu Pectinatus v pivu a/nebo v pivovarském provozu či zařízeni je však jen velmi těžko zjistitelná, neboť vzhledem ke specifickým růstovým požadavkům těchto bakterií nelze pro jejich identifikaci použít konvenční membránovou filtraci. Dle článků Haikara A. (1984): „Detection of Pectinatus contaminants in beer.“ J. Am. Soc. Brew. Chem. 43 (1): 43-46, a Haikara A. (1985): „Detection of anaerobic, gram-negative bacteria in beer.“ Monats. Brauwiss. 6: 239-243 nelze bakterie rodu Pectinatus identifikovat ani při použití membránové filtrace, u které je použita předredukovaná kultivační půda, a která probíhá v atmosféře CO2.
Ze stejných důvodů nelze použít ani kultivaci na běžných kultivačních půdách na Petriho miskách, ačkoliv řada státních i mezinárodních institucí tento postup doporučuje. Např. Evropská pivovarská konvence doporučuje použití neselektivních předredukovaných ztužených kultivačních půd typu MRS, NBB, PYF, Raka-Ray, SDA a DBA, či selektivní tekuté kultivační půdy SMMP, viz např. Analytica Microbiologica - EBC, 2005.
Nevýhodou použiti neselektivních kultivačních půd výše uvedených typů je, že tyto půdy nezabraňuji růstu dalších druhů mikroorganizmů vyskytujících se ve zkaženém pivu a/nebo v pivovarském prostřední a/nebo zařízení, přičemž tyto mikroorganizmy (kvasinky, koliformní bakterie, bakterie mléčného kvašení, apod.) na kultivační půdě bakteriím rodu Pectinatus úspěšně konkurují, potlačují jejich kultivaci a případně je inhibují produkty svého metabolizmu, změnou pH, apod. V důsledku toho není použití neselektivních kultivačních půd pro kultivaci a následnou identifikaci bakterií rodu Pectinatus dostatečně průkazné, a tedy ani vhodné pro použití v běžné pivovarské praxi.
PS3675CZ
Použiti těchto kultivačních půd je navíc doporučeno ve ztužené předredukované formě pro membránovou filtraci a kultivaci v anaerobních podmínkách, v důsledku čehož mohou spolehlivě fungovat pouze v případě, že je daná laboratoř vybavena anaerobním boxem s kontrolovanou atmosférou N2 a H2, který však není běžným vybavením pivovarských provozů.
Některé z těchto nevýhod částečně odstraňuje použití tekuté selektivní kultivační půdy typu SMMP. Při tom sice dochází díky obsahu látek snižujících redoxpotenciál a antibiotik (např. aktinon) k inhibici růstu kvasinek, avšak stanovení přítomnosti bakterií rodu Pectinatus vyžaduje sledování vyšetřovaného piva, tvorby zákalu v něm a změny zbarvení kultivační půdy po dobu 14 dní. To je doba, která je pro použití v pivovarském prostřední naprosto nevhodná. Tato kultivační půda je navíc primárně určena pouze pro kultivaci a identifikaci bakterií přímo ve zkaženém pivu, a není vhodná pro kultivaci bakterií rodu Pectinatus ze stěrů provedených na pivovarském zařízení a/nebo v pivovarském prostoru.
V článku Lee S.Y., Moore S.E., Mabee M.S.: „Selective-differential medium for isolation and differentiation of Pectinatus from other brewery microorganisms.“ Appl. Environ. Microbiol. 2: 386-387, 1981 je pro kultivaci a následnou identifikaci bakterií rodu Pectinatus navrženo použití tzv. LL-agaru, u kterého se přítomnost těchto bakterií projevuje černým zabarvením v důsledku chemické reakce bakteriemi vytvářeného sirovodíku s octanem olovnatým přítomným v kultivační půdě. Nevýhodou použití tohoto kultivačního média je nutnost použiti tzv. Leeho zkumavek s dvojitou stěnou, které nejsou běžně dostupné, a stím související vysoké pořizovací i provozní náklady. Kromě toho je tento způsob kultivace a identifikace bakterií rodu Pectinatus časově poměrně náročný na přípravu (obvykle 5 až 6 dní), a neumožňuje detekci těchto bakterií při jejich nízkém počtu ve vzorku.
Pro odstranění výše uvedených nevýhod konvenčních technik bylo v odborné literatuře a v patentových spisech, např. v JP 2004121259, JP 2005006556 či US 5869642 dále navrženo několik metod pro identifikaci bakterií rodu Pectinatus, které jsou založeny na detekci specifických oblasti DNA těchto bakterií. Tyto metody jsou však časově i finančně velmi náročné, •PS3675CZ neboť ke svému provádění vyžadují nejen odborný personál, který ovládá složité molekulární techniky, ale také specifické laboratorní vybavení. Samotné identifikaci přitom obvykle předchází kultivace a izolace bakterií, případně i další kroky, v důsledku čehož může celý proces trvat až několik dni. Výstupy těchto metod navíc nejsou ve většině případů jednoznačné, takže může dojít k falešné pozitivní/negativní identifikaci. Díky tomu jsou i tyto metody nevhodné pro použití v běžném pivovarském provozu.
Vzhledem kvýše popsaným nevýhodám se pro identifikaci bakterií rodu Pectinatus v pivu a/nebo v pivovarském provozu a/nebo zařízeni v současné době používá tzv. „forcing test“. Při tomto testu se odebraný vzorek inokuluje do piva obohaceného o látky podporující růst bakterií rodu Pectinatus, a uzavřené lahve se inkubují při teplotě 28 až 30 Ό. P řitom se po dobu 1 až 6 týdnů od inokulace sleduje tvorba zákalu, která je průvodním jevem přítomnosti bakterií rodu Pectinatus. Nevýhody tohoto postupu jsou nasnadě. Patří k nim zejména dlouhá doba potřebná pro kultivaci a identifikaci, pracnost tohoto postupu, kdy je nutné jednotlivé obohacující složky přidávat do piva sterilně, a vzhledem k velikosti pivních lahví také zvýšené nároky na objem biologických inkubátorů.
Cílem vynálezu tak je navrhnout kultivační půdu pro kultivaci a následnou identifikaci bakterii rodu Pectinatus, která by byla použitelná v běžném pivovarském provozu bez nutnosti pořizování speciálního laboratorního vybavení, a jejíž využití by maximálně zkrátilo dobu potřebnou pro identifikaci těchto bakterií. Využití této kultivační půdy by současně nemělo být omezeno pouze na identifikaci bakterií rodu Pectinatus v kontaminovaném pivu, ale mělo by umožnit jejich identifikaci i ve sterech odebraných v pivovarském provozu a/nebo z pivovarského zařízení.
Podstata vynálezu
Cíle vynálezu je dosaženo kultivační půdou pro kultivaci a identifikaci bakterii rodu Pectinatus, která obsahuje běžné složky kultivačních půd, jako alespoň jeden zdroj uhlíku, alespoň jeden zdroj dusíku, alespoň jeden zdroj aminokyselin, alespoň jeden zdroj vitamínů, alespoň jeden zdroj síry, alespoň jeden zdroj biogenních kovů, alespoň jednu látku snižující redoxpotenciál a ’PS3K75CZ pufrující složku, jejíž podstata spočívá vtom, že dále obsahuje izo-o-kyseliny a/nebo jejich redukované hydrogenované deriváty v koncentraci 10 až 80 mg/l. Ty svou přítomnosti stimulují kultivaci bakterií rodu Pectinatus a současné úplně nebo alespoň částečně inhibují kultivaci konkurenčních mikroorganizmů. Bakterie rodu Pectinatus pak lze sledovat a identifikovat již po 24 hodinách od zaočkování, a to pouze při použití běžného mikroskopu.
Nejvhodnější koncentrace ίζο-α-kyselin a/nebo jejich redukovaných hydrogenovaných derivátů přitom byla během experimentů stanovena na 50 mg/l.
Při použití kultivační půdy podle vynálezu jako odběrové nebo transportní obsahuje tato kultivační půda dále 0,05 až 0,3 % hmotnostních agaru, který omezuje její okysličováni během manipulace a transportu.
Jako redukované hydrogenované deriváty ίζο-α-kyselin obsahuje kultivační půda podle vynálezu tetrahydroizo-a-kyseliny a/nebo dihydroizo-akyseliny a/nebo hexahydroizo-a-kyseliny.
Aby bylo při použití kultivační půdy podle vynálezu dosaženo co nejlepších výsledků, je dále výhodné, pokud je v kombinaci sní současně použit způsob odběru stěrů odběrovými tyčinkami s odběrovou částí podle vynálezu. Jeho podstata přitom spočívá vtom, že před provedením stěru je odběrová část odběrové tyčinky namočena v roztoku sterilované destilované vody s přídavkem látky snižující redoxpotenciál v koncentraci 0,25 až 3 g/l, a odebraný stěr se umístí do kultivační půdy podle vynálezu.
Jako látku snižující redoxpotenciál přitom lze použít cystein hydrochlorid, tioglykolát sodný nebo kyselinu askorbovou v koncentraci 0,25 až 1 g/l, případně směs alespoň dvou těchto látek, přičemž koncentrace žádné z nich nepřesahuje hodnotu 1 g/l.
Přehled obrázků na výkresech
Výkres ukazuje na obr. 1 snímek kultivační půdy 24 hodin po zaočkování stěru obsahujícího mj. bakterie rodu Pectinatus provedeného z pivovarského
PS3675CZ zařízení, a na obr. 2 snímek kultivační půdy podle vynálezu 24 hodin po zaočkování stejného steru z pivovarského zařízení.
Příklady provedení vynálezu
Kultivační půda podle vynálezu svým složením stimuluje kultivaci anaerobních bakterií rodu Pectinatus a současně inhibuje kultivaci konkurenčních mikroorganizmů. Při současném zaočkování bakterií rodu Pectinatus a bakterii mléčného kvašení (k čemuž v praxi běžně dochází), tak lze již po 24 hodinách sledovat prostřednictvím běžného mikroskopu typické protáhlé buňky bakterií rodu Pectinatus s charakteristickým hadovitým pohybem, a podle těchto projevů je bezpečné identifikovat. Bakterie mléčného kvašení jsou přitom složením kultivační půdy podle vynálezu zcela nebo alespoň částečně inhlbovány, takže kultivaci ani identifikaci bakterií rodu Pectinatus nijak nebrání. Kultivační půda podle vynálezu je přitom dle potřeby použitelná jako odběrová, transportní i jako diagnostická. Její složení je obecně uvedeno v Tabulce 1; její pH se přitom pohybuje v rozmezí 5,5 až 5,9.
Tabulka 1
Složka kultivační půdy podle vynálezu
a Zdroj uhlíku, dusíku, aminokyselin a vitamínů MRS
b Zdroj síry a biogenních kovů
c Pufrující složka
d Složka snižující redoxpotenclál
e lzo-a-kyseliny a/nebo jejich deriváty
Kultivační půda podle vynálezu může být snadno a levně připravena . smícháním jednotlivých složek a až e uvedených v Tabulce 1 v požadovaném poměru. Avšak vzhledem k tomu, že složky a, b a c jsou již ve vhodné koncentraci obsažené ve stávající a komerčně dostupné neselektivní kultivační
PS3B75CZ půdě typu MRS, je alespoň v některých případech výhodnější, když se tato neselektivní kultivační půda použije jako základ kultivační půdy podle vynálezu, ke kterému se pouze dodají zbývající složky d a e. Neselektivní kultivační půda typu MRS sice kromě složek a, b a c obsahuje také další složky, jako např. povrchově aktivní látku - polyoxyetylen (20) sorbitan monooleát (označovaný komerčně jako Tween 80 nebo Polysorbate 80) v koncentraci 1 g/l, a selektivní složky sloužící zároveň jako zdroj energie pro některé mikroorganizmy - směs citrátu amonného v koncentraci 2 g/l a CH3COONa v koncentraci 5 g/l, avšak jejich přítomnost nijak neovlivňuje požadovaný účinek připravované kultivační půdy podle vynálezu, ani nebrání kultivaci či identifikaci bakterií rodu Pectinatus. Tyto složky nemusí být při jiných postupech přípravy kultivační půdy podle vynálezu použity ani nahrazeny jinými látkami se stejnou nebo podobnou funkcí.
Složka a - zdroj uhlíku, dusíku, aminokyselin a vitamínů, je tvořena buď jednou vhodnou látkou, nebo častěji směsí dvou či více různých látek. V případě použití neselektivní kultivační půdy typu MRS jako základu kultivační půdy podle vynálezu se jedná o směs peptonu v koncentraci 10 g/l, masového extraktu v koncentraci 10 g/l, kvasničného extraktu v koncentraci 5 g/l a glukózy v koncentraci 20 g/l. Pokud je však kultivační půda podle vynálezu připravována smícháním jednotlivých složek, lze použít peptony, masové extrakty a kvasničné extrakty v libovolné koncentraci v rozmezí 2 až 15 g/l, případně jiné látky se stejnou nebo podobnou funkcí, přičemž např. pepton může být plnohodnotně nahrazen tryptonem, enzymatickým hydrolyzátem kaseínu, apod. Glukóza přitom může být použita v libovolné koncentraci 1 až 25 g/l, případně může být nahrazena fruktózou, kyselinou mléčnou apod., atd.
Složka b - zdroj síry a biogenních kovů, je tvořena buď jednou vhodnou látkou, nebo častěji směsí dvou, případně i více různých látek. V případě použití neselektivní kultivační půdy typu MRS se jedná o směs MgSO4-7H2O v koncentraci 0,2 g/l a MnSO4-4H2O v koncentraci 0,05 g/l. Pokud je kultivační půda podle vynálezu připravována smícháním jednotlivých složek, lze použít stejné látky v koncentraci v rozmezí 0,025 až 0,25 g/l, případně jiné látky se .;.Ρ33675ΟΖ stejnou nebo podobnou funkcí, např. FeSO4.7H20 a ZnSO4.7H20 v koncentraci v rozmezí 0,005 - 0,02 g/l apod., nebo směs dvou či více vhodných látek.
Složka c - pufrující složka, je obvykle tvořena jednou látkou. V případě použití neselektivní kultivační půdy typu MRS se jedná o K2HPO4 v koncentraci 2 g/l. Pokud je však kultivační půda podle vynálezu připravována smícháním jednotlivých složek, lze použít K2HPO4 v koncentraci v rozmezí 1 až 3 g/l, případně jinou látku se stejnou nebo podobnou funkcí, např. Na2HPO4, apod., nebo směs dvou či více vhodných látek.
Složka d - složka snižující redoxpotenciál, svou přítomností v kultivační půdě podle vynálezu snižuje její redoxpotenciál, a tím umožňuje kultivaci striktně anaerobních mikroorganismů, jako jsou bakterie rodu Pectinatus. Jedná se přitom buď o jednu látku, nejčastěji cystein hydrochlorid, kyselinu askorbovou nebo tioglykolát sodný, jejíž koncentrace v kultivační půdě podle vynálezu se pohybuje v rozmezí 0,25 až 1 g/l, případně o směs těchto látek, jejíž koncentrace v kultivační půdě podle vynálezu se pohybuje od 0,25 g/t do 3 g/l, přičemž koncentrace žádné z látek nepřesahuje hodnotu 1 g/l. Kromě uvedených látek lze v dalších variantách k tomuto účelu použít také jiné látky se stejnými nebo podobnými účinky, případné směs takových látek.
Složka e - ίζο-α-kyseliny a/nebo jejich deriváty, svou přítomností dále stimuluje kultivaci bakterií rodu Pectinatus a současné úplně nebo částečně inhibuje kultivaci konkurenčních mikroorganizmů. Do této skupiny patři izo-akyseliny (jedná se o směs izomerů trans- a cis-) a jejich redukované hydrogenované deriváty, případně jejich směsi. Jako nejvýhodnější se jeví použití tetrahydroizo-a-kyselin, avšak kromě nich lze se stejnými výsledky použít také dihydroizo-a-kyseliny, nebo hexahydroizo-a-kyseliny, směsi těchto redukovaných dehydrogenovaných derivátů izo-a-kyselin, nebo libovolné směsi izo-a-kyselin a jejich redukovaných hydrogenovaných derivátů. Koncentrace této složky v kultivační půdě podle vynálezu se pohybuje v rozmezí 10 až 80 mg/l, přičemž s výhodou dosahuje 50 mg/l .
Další složkou kultivační půdy podle vynálezu, která je však využita pouze v některých jejích variantách, je agar. Jeho přítomnost v kultivační půdě podle vynálezu omezuje její prokysličování během manipulace či transportu, a tím se .:.pa?675cz podílí na vytvoření podmínek vhodných pro existenci anaerobních mikroorganizmů. Kultivační půda podle vynálezu, která je určená výhradně pro přímé použití v laboratoři však nemusí agar vůbec obsahovat.
K ověření účinnosti kultivační půdy podle vynálezu byla provedena řada 5 srovnávacích experimentů, při kterých byla použita neselektivni kultivační půda typu MRS a několik variant kultivační půdy podle vynálezu vytvořených kombinací neselektivni kultivační půdy typu MRS a složek d a e v různých koncentracích. Konkrétní složení testovaných kultivačních půd je uvedeno v Tabulce 2.
PS3675CZ
kultivační půdy v 1000 ml destilované vody u. 10,0 g 10,0 g 5,0 g 20,0 g 1,0g 2,0 g 5,0 g : 0,2q 0,05 g 2,0g___ 0,5 g 0,5 g 50 mg 0,1-0,2%
LU 10,0 g 10,0 g 5,0 g 20,0 g 1,0g 2,0 g 5,0 g 0,2 g 0,05 g 1 2,0 g 0,25 g 0,25 g 50 mg 0,1-0,2 %
Q 10,0 g cm o o x— 5,0 g 20,0 g 1.0 g 2,0 q 5,0 g ! 0,2 g 0,05 g 2,0 g 0,25 g 0,25 g 35 mg 0,1-0,2 %
O 10,0 g 10,0 g m o 20,0 g 1,0 g _ 2,0α____I 5,0 g 0.2 g 0,05 g 2,0 g 0,25 g 0,25 g 10 mg 0,1-0,2 %
Množství složek I to 10,0 g 10,0 g 5,0 g 20,0 g 1,0 g 2,0 g 5,0 q 0,2 g 0,05 q 2,0 g 0,25 g 0,25 g 0,1-0,2 %
A (MRS) 10,0 g 10,0g 5,0 g 20,0 g 1.0 g 2.0 g 5,0 g 0,2 g 0,05 g 2,0 g i 1 i 1
Látka Pepton Masový extrakt Kvasničný extrakt Glukóza Tween 80 (Polyoxyetylen (20) sorbitan monooleát) Citrát amonný i π z O o o I o O CM I o ω cn 2 O CN I o ω c 2 K2HPO4 Cystein hydrochlorid Tioglykolát sodný Tetra h yd roizo-a-kysel i ny Agar
Složka co 1 1 -Q 0 T3 u 1
PS3675CZ
Nejprve byl sledován vliv různé koncentrace složek d a e v kultivační půdě podle vynálezu na kultivaci nejběžnějších kmenů bakterií rodu Pectinatus.
Příklad 1
Složky kultivační půdy ve variantách A až F dle Tabulky 2 byly rozmíchány v 1000 ml destilované vody a výsledný roztok byl po 10 ml rozlit do bakteriologických zkumavek, které byly následně sterilizovány v autoklávu při teplotě 121 Ό po dobu 15 minut. Po vychladnutí bylo do všech variant kultivační půdy v bakteriologických zkumavkách zaočkováno 0,1 ml husté suspenze tří sbírkových kmenů bakterií rodu Pectinatus, konkrétně Pectinatus frisingensis DSM 20465, Pectinatus frisingensis CCM 6217 a Pectinatus sp. RIBM 2-86. Po 24 hodinách inkubace při teplotě 28 Ό byla vyhodnocena tvorba zákalu a sedimentu, a provedena mikroskopie každé varianty kultivační půdy A až F.
U kultivační půdy ve variantě A (MRS) nebyl pozorován žádný zákal. Při mikroskopii byla jen náhodně sledována přítomnost velmi malého počtu bakterií rodu Pectinatus.
U kultivační půdy ve variantě B byl pozorován silný zákal, který je průvodním jevem přítomnosti bakterií rodu Pectinatus. Při mikroskopii byla potvrzena dobrá kultivace těchto bakterii, které byly bez dalšího snadno a bezpečně identifikovatelné na základě svého typického hadovitého tvaru a pohybu.
U kultivační půdy ve variantách C až F byl také pozorován silný zákal. Mikroskopie potvrdila velmi dobrou kultivaci bakterií rodu Pectinatus, které byly snadno a bezpečně identifikovatelné na základě svého typického hadovitého tvaru a pohybu.
Následně byl sledován vliv různé koncentrace složek d a e v kultivační půdě podle vynálezu na kultivaci nejběžnějších kmenů bakterií mléčného kvašení.
PS3675CZ
Příklad 2
Varianty kultivační půdy A až F byly připraveny stejným způsobem jako v přikladu 1. Do všech variant kultivační půdy bylo zaočkováno 0,1 ml husté suspenze 25 sbírkových kmenů nejběžnějšich bakterií mléčného kvašení. V daném případě se jednalo o kmeny bakterií rodu Lactobacillus ze sbírky VÚPS. Po 24 hodinách inkubace při teplotě 28 *C byla vyhodnocena tvorba zákalu a sedimentu, a provedena mikroskopie každé varianty kultivační půdy A až F.
U kultivační půdy ve variantě A (MRS) byl pozorován silný zákal, který je průvodním jevem přítomnosti bakterii mléčného kvašení. Při mikroskopii pak byla potvrzena velmi dobrá kultivace všech kmenů bakterií mléčného kvašení.
U kultivační půdy ve variantě B byl také pozorován silný zákal. Při mikroskopii byla potvrzena dobrá kultivace všech kmenů bakterií mléčného kvašení.
U kultivační půdy ve variantě C byl pozorován silný zákal v 19 zkumavkách. Při mikroskopii pak byla potvrzena kultivace 19 kmenů bakterií mléčného kvašení. Ve srovnání s kultivační půdou ve variantě A a B bylo tedy složením kultivační půdy podle vynálezu inhibováno 6 kmenů bakterií mléčného kvašení.
U kultivační půdy ve variantě D byl pozorován silný zákal v 10 zkumavkách. Při mikroskopii pak byla potvrzena kultivace pouze 10 kmenů bakterií mléčného kvašení. Ve srovnání s kultivačními půdami ve variantě A a B bylo tedy složením kultivační půdy podle vynálezu inhibováno 15 kmenů bakterií mléčného kvašení.
U kultivační půdy ve variantě E a F nebyl pozorován žádný zákal. Při mikroskopii nebyla potvrzena kultivace žádného ze zaočkovaných kmenů bakterií mléčného kvašení. Všech 25 kmenů bakterií mléčného kvašení tedy bylo složením kultivační půdy podle vynálezu inhibováno.
Dále byl sledován vliv různé koncentrace složek d a e v kultivační půdě podle vynálezu na paralelní kultivaci bakterií rodu Pectinatus a bakterií mléčného kvašení, a na možnosti identifikace bakterií rodu Pectinatus při mikroskopii.
PS3675CZ
Příklad 3
Varianty kultivační půdy A až F byly připraveny stejným způsobem jako v příkladu 1. Do všech variant kultivační půdy bylo zaočkováno 0,1 ml husté suspenze kmene bakterii rodu Pectinatus sp. RIBM 2-86 dle příkladu 1, a současně 0,1 ml husté suspenze 25 sbírkových kmenů bakterií mléčného kvašeni uvedených v příkladu 2. Po 24 hodinách inkubace při teplotě 28 Ό byla vyhodnocena tvorba zákalu a sedimentu, a provedena mikroskopie každé varianty kultivační půdy A až F.
U kultivační půdy ve variantě A (MRS) byl pozorován silný zákal. Při mikroskopii pak byla potvrzena velmi dobrá kultivace všech kmenů bakterií mléčného kvašení. Bakterie rodu Pectinatus nebyly vůbec pozorovány.
U kultivační půdy ve variantě B byl pozorován silný zákal. Při mikroskopii byla potvrzena dobrá kultivace všech kmenů bakterií mléčného kvašeni, přičemž náhodně bylo možné sledovat také bakterie rodu Pectinatus.
U kultivační půdy ve variantě C až F byl také pozorován silný zákal. Při mikroskopii byly zcela zřetelně pozorovány typické buňky s hadovitým tvarem i pohybem, což jsou charakteristické znaky bakterií rodu Pectinatus, na základě nichž lze tyto bakterie zcela bezpečně identifikovat. U kultivační půdy variant C a D sice došlo současně i ke kultivaci některých kmenů bakterií mléčného kvašení, ale jejich přítomnost nebránila bezpečné identifikaci bakterií rodu Pectinatus. U variant E a F již bakterie rodu Pectinatus ve vzorku zcela převládaly.
V dalších experimentech byly používány pouze varianty kultivační půdy podle vynálezu C až F, přičemž byla testována možnost jejich použití pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus přímo ve vzorku zkaženého piva.
Přiklad 4
Kultivační půda podle vynálezu ve variantách C až F byla připravena a sterilizována stejně jako v příkladu 1. Vzhledem k tomu, že kultivace a následná
PS3675CZ identifikace bakterií rodu Pectinatus probíhala v laboratoři, neobsahovala kultivační půda podle vynálezu v žádné z variant agar.
Ode dna nádoby s pivem infikovaným bakteriemi rodu Pectinatus a dalšími mikroorganismy bylo odebráno 0,1 ml piva a pipetováno do každé ze zkumavek s 10 ml příslušné varianty kultivační půdy. Po 24 hodinách kultivace při teplotě 28 až 30 O byla provedena mikroskopie, při které byly bakterie rodu Pectinatus bezpečně identifikovány na základě přítomnosti buněk s typickým hadovitým tvarem a pohybem ve všech variantách kultivační půdy podle vynálezu. Tím byla potvrzena možnost využití kultivační půdy podle vynálezu ke kultivaci a následné identifikaci bakterií rodu Pectinatus přímo v kontaminovaném pivu.
U variant C až F kultivační půdy podle vynálezu a u varianty kultivační půdy B byla dále testována možnost kultivace a následné identifikace bakterií rodu Pectinatus ve sterech provedených přímo v pivovarském zařízení, ve kterém byla existence bakterií rodu Pectinatus předem potvrzena metodami známými ze stavu techniky.
Příklad 5
Kultivační půda podle vynálezu ve variantách C až F a kultivační půda ve variantě B, byly připraveny a sterilizovány stejně jako v příkladu 1. Stéry provedené v pivovarském prostředí byly po odběru zaočkovány do všech variant kultivační půdy a transportovány do laboratoře. Po 24 hodinách kultivace při teplotě 28 až 30 Έ byla provedena mikroskopie.
V kultivační půdě ve variantě B byly přítomny různé mikroorganizmy typické pro pivovarské prostředí, zejména kvasinky a další bakterie kulového nebo protáhlého tvaru. Některé z pohyblivých bakterií protáhlého tvaru přitom bylo možno považovat z bakterie rodu Pectinatus, ale jejich identifikace nebyla dostatečně spolehlivá, neboť tyto bakterie nevykazovaly typický hadovitý pohyb.
Na obr. 1 je pro názornost uvedena fotografie z mikroskopu při 630 násobném zvětšení.
PS3675CZ
V kultivační půdě podle vynálezu ve variantách C až F však již jasně převažovaly typické bakterie s hadovitým tvarem a pohybem, které bylo možné zcela bezpečně identifikovat jako bakterie rodu Pectinatus. Většina ostatních mikroorganizmů přitom byla inhibována, nebo svou přítomností nebránila identifikaci.
Na obr. 2 je pro názornost uvedena fotografie z mikroskopu při 630 násobném zvětšení získaná při mikroskopii kultivační půdy podle vynálezu ve variantě F.
Z provedených experimentů vyplývá, že kultivační půda podle vynálezu, která obsahuje základní složky jako zdroj uhlíku, zdroj dusíku, zdroj aminokyselin, zdroj vitamínů, zdroj síry, zdroj biogenních kovů a pufrující složku doplněné o malé množství specifických složek, jako látky snižující redoxpotenciál (v daném případě směs 0,25 g cystein hydrochloridu a 0,25 g tioglykolátu sodného) a redukovaného dehydrogenovaného derivátu ίζο-α-kyselin (v daném případě 10 mg tetrahydroizoα-kyselin), je využitelná pro identifikaci bakterií rodu Pectinatus jak při přímém zaočkování čisté kultury těchto bakterií, tak i při zaočkování kultury obsahující směs různých rodů bakterií získaných ze zkaženého piva nebo ze stěrů provedených v pivovarském prostředí a/nebo na pivovarském zařízení. Identifikace bakterií rodu Pectinatus při použití kultivační půdy podle vynálezu přitom může probíhat již po pouhých 24 hodinách od zaočkování, takže je několikanásobně rychlejší než dosud používané techniky. Tento postup navíc nevyžaduje pořízení speciálního laboratorního zařízení, neboť bakterie rodu Pectinatus lze spolehlivě identifikovat při mikroskopii kultivační půdy podle vynálezu běžným optickým mikroskopem.
V dalších variantách může kultivační půda podle vynálezu obsahovat další pomocné složky, které však nejsou pro její funkci podstatné. Jedná se např. o zdroje solí, jako např. NaCl, KCI, apod. v koncentraci 1 až 3 g/l, acidobazické indikátory, jako např. chlorfenolová červeň v koncentraci 0,05 - 0,1 g/l, oxidačněredukční indikátory, jako např. methylenová modř, resazurin apod. v koncentraci 0,001 - 0,003 g/l, atd.
PS3675CZ
Pro dosažení co nejlepších výsledků při identifikaci bakterií rodu Pectinatus je dále výhodné, pokud se stěry prováděné v pivovarském provozu a/nebo zařízení, případně i jinde, provádí odběrovými tyčinkami, jejichž odběrová část se před provedením steru navlhčí ve sterilní destilované vodě s přídavkem látky 5 snižující redoxpotenciál v koncentraci v rozmezí 0,25 až 1 g/l, případně směsi několika takových látek v koncentraci 0,25 až 3 g/l, přičemž koncentrace žádné z těchto látek nepřesahuje hodnotu 1 g/l. Látkou snižující redoxpotenciál je přitom s výhodou cystein hydrochlorid, avšak použitelné jsou i jiné látky se stejným účinkem, například tioglykolát sodný, kyselina askorbová, atd. případně směs 10 takových látek. Takto odebraný stěr se ihned po odebrání umístí do kultivační půdy podle vynálezu.

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Kultivační půda pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus, která obsahuje alespoň jeden zdroj uhlíku, alespoň jeden zdroj dusíku, alespoň jeden zdroj aminokyselin, alespoň jeden zdroj vitamínů, alespoň jeden zdroj síry, alespoň jeden zdroj biogenních kovů, alespoň jednu látku snižující redoxpotenciál a pufrujicí složku, vyznačující se tím, že dále obsahuje izo-a-kyseliny a/nebo jejich redukované hydrogenované deriváty v koncentraci 10 až 80 mg/l.
  2. 2. Kultivační půda podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje izo-akyseliny a/nebo jejich redukované hydrogenované deriváty v koncentraci 50 mg/L
  3. 3. Kultivační půda podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že dále obsahuje 0,05 až 0,3 % hmotnostních agaru.
  4. 4. Kultivační půda podle libovolného z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že jako redukované hydrogenované deriváty izo-a-kyselin obsahuje tetrahydroizo-akyseliny.
  5. 5. Kultivační půda podle libovolného z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že jako redukované hydrogenované deriváty izo-a-kyselin obsahuje dihydroizo-akyseliny.
  6. 6. Kultivační půda podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že jako redukované hydrogenované deriváty izo-a-kyselin obsahuje hexahydroizo-akyseliny.
  7. 7. Způsob odběru stěrů odběrovými tyčinkami s odběrovou částí, vyznačující se tím, že před provedením stěru je odběrová část odběrové tyčinky namočena v roztoku sterilované destilované vody s přídavkem látky snižující
    PS3675CZ redoxpotenciál v koncentraci 0,25 až 3 g/l, a po provedení stěru se odebraný ster umístí do kultivační půdy podle libovolného z nároků 1 až 6.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že složkou snižující redoxpotenciál je látka ze skupiny cystein hydrochlorid, tioglykolát sodný, kyselina 5 askorbová v koncentraci 0,25 až 1 g/l, nebo směs alespoň dvou těchto látek, přičemž koncentrace žádné z nich nepřesahuje hodnotu 1 g/l.
CZ20100297A 2010-04-16 2010-04-16 Kultivacní puda pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus a zpusob odberu steru odberovými tycinkami CZ303565B6 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100297A CZ303565B6 (cs) 2010-04-16 2010-04-16 Kultivacní puda pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus a zpusob odberu steru odberovými tycinkami
EP10168801.8A EP2377919B1 (en) 2010-04-16 2010-07-08 Method for identification of bacteria of the genus Pectinatus and culture medium therefor
US13/085,579 US20110256584A1 (en) 2010-04-16 2011-04-13 Culture medium for cultivation and identification of bacteria of genus pectinatus and method for taking swab samples
JP2011090604A JP2011224001A (ja) 2010-04-16 2011-04-15 ペクチネータス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）属菌の培養及び識別のための培地並びに綿棒サンプルの採取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100297A CZ303565B6 (cs) 2010-04-16 2010-04-16 Kultivacní puda pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus a zpusob odberu steru odberovými tycinkami

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2010297A3 true CZ2010297A3 (cs) 2011-10-26
CZ303565B6 CZ303565B6 (cs) 2012-12-12

Family

ID=42617437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20100297A CZ303565B6 (cs) 2010-04-16 2010-04-16 Kultivacní puda pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus a zpusob odberu steru odberovými tycinkami

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20110256584A1 (cs)
EP (1) EP2377919B1 (cs)
JP (1) JP2011224001A (cs)
CZ (1) CZ303565B6 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5781720B2 (ja) 2008-12-15 2015-09-24 ルネサスエレクトロニクス株式会社 半導体装置及び半導体装置の製造方法
US8563265B2 (en) 2011-04-21 2013-10-22 Mocon, Inc. Analytical instrument and method for evaluating microbial contamination of an object
FR2997091B1 (fr) * 2012-10-22 2016-05-06 Fond Mediterranee Infection Utilisation d'un compose antioxydant pour la culture de bacteries sensibles a la tension en oxygene
FR3020069B1 (fr) * 2014-04-16 2018-01-12 Universite D'aix-Marseille Procede et milieu liquide de transport et conservation de bacteries
EP3280821B1 (en) 2015-04-07 2023-12-06 Polyskope Labs Detection of one or more pathogens
JP7294855B2 (ja) * 2019-04-04 2023-06-20 アサヒビール株式会社 ペクチネイタス属菌を検出可能な培地、ビール混濁性有害菌の検出方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7639196A (en) 1995-11-28 1997-06-19 Asahi Breweries, Ltd. Detection of bacterium belonging to the genus pectinatus
JP2004121259A (ja) 1995-11-28 2004-04-22 Asahi Breweries Ltd ペクチネータス属菌の検出
FI103056B (fi) * 1996-08-16 1999-04-15 Orion Yhtymae Oy Menetelmä ja testipakkaus näytteenottopinnan esikäsittelemiseksi
JP2005006556A (ja) 2003-06-19 2005-01-13 Asahi Breweries Ltd ビール有害菌の検出方法
CA2544488A1 (en) * 2006-05-01 2007-11-01 Chemisch Biochemisch Onderzoekscn Use of hop polyphenols in beer
EP2055766A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-06 Inbev S.A. Process for bittering a fermented beverage with hops

Also Published As

Publication number Publication date
US20110256584A1 (en) 2011-10-20
CZ303565B6 (cs) 2012-12-12
EP2377919B1 (en) 2015-03-25
JP2011224001A (ja) 2011-11-10
EP2377919A1 (en) 2011-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Parveen et al. Evaluation of growth based rapid microbiological methods for sterility testing of vaccines and other biological products
Zuehlke et al. Impact of sulfur dioxide and temperature on culturability and viability of Brettanomyces bruxellensis in wine
Jeon et al. Microbiological diversity and prevalence of spoilage and pathogenic bacteria in commercial fermented alcoholic beverages (beer, fruit wine, refined rice wine, and yakju)
CZ2010297A3 (cs) Kultivacní puda pro kultivaci a identifikaci bakterií rodu Pectinatus a zpusob odberu steru odberovými tycinkami
EP2789692B1 (en) Method for measuring cells, and reagent for cell measurement
Patynowski et al. Yeast viability during fermentation and sur lie ageing of a defined medium and subsequent growth of Oenococcus oeni
WO2000075285A1 (en) Selective media for recovery and enumeration of campylobacters
JP6975701B2 (ja) 枯草菌の単離方法、その枯草菌、枯草菌を含む微生物製剤、枯草菌単離用培地セット
CN111088181B (zh) 短双歧杆菌菌株bk55及在抑制艰难梭菌中的应用
CN113308510A (zh) 一种用于快速检测细胞制品中真菌的培养基及其制备方法和应用
Jäger et al. Cork‐borne bacteria and yeasts as potential producers of off‐flavours in wine
US20200270670A1 (en) Culture medium for selectively isolating bacteria of genus clostridium
Matoulková et al. Rapid, simple, and specific cultivation-based method for detection of Pectinatus spp. in brewery samples
US20130330757A1 (en) Cultivation Plate System And Method For The Improved Detection Of Microorganisms Which Contaminate Food Products
US6037140A (en) Selective media for the culture and isolation of gram bacteria, antibiotic composition
Kim et al. Changes in the microbial composition of microbrewed beer during the process in the actual manufacturing line
Bittner et al. Adhesion of anaerobic beer spoilage bacteria Megasphaera cerevisiae and Pectinatus frisingensis to stainless steel
Przybyt et al. Application of biosensors in early detection of contamination with lactic acid bacteria during apple juice and concentrate production
Campbell Microbiological methods in brewing analysis
CN106167771B (zh) 一种巨大芽孢杆菌d122及其菌剂和菌剂制备方法
Torrella et al. Survival of indicators of bacterial and viral contamination in wastewater subjected to low temperatures and freezing: application to cold climate waste stabilisation ponds
US20230313260A1 (en) Selective media for detection of zygosaccharomyces
RU2460801C1 (ru) Способ выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах
JP5476054B2 (ja) セレウス菌グループ検出用培地
Kubizniaková et al. Brewing microbiology–Lactic acid bacteria and cultivation methods of detection–part II