CZ2009277A3 - Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu - Google Patents
Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2009277A3 CZ2009277A3 CZ20090277A CZ2009277A CZ2009277A3 CZ 2009277 A3 CZ2009277 A3 CZ 2009277A3 CZ 20090277 A CZ20090277 A CZ 20090277A CZ 2009277 A CZ2009277 A CZ 2009277A CZ 2009277 A3 CZ2009277 A3 CZ 2009277A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- lincomycin
- strain
- gene
- biosynthesis
- inactivated
- Prior art date
Links
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical class CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 31
- 241000187399 Streptomyces lincolnensis Species 0.000 claims abstract description 23
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- DQHUOKOFSXEEAW-MLWJPKLSSA-N (2s)-4-propylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CCCC1CN[C@H](C(O)=O)C1 DQHUOKOFSXEEAW-MLWJPKLSSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 10
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 5
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001013691 Escherichia coli BW25113 Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- CYXLHZVPLXEUPP-ZETCQYMHSA-N (2s)-1-propylpyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound CCCN1CCC[C@H]1C(O)=O CYXLHZVPLXEUPP-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 2
- 108010065885 aminoglycoside N(3')-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 2
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- SMZHNCMPICENER-MQWKRIRWSA-N (2s)-4-butylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CCCCC1CN[C@H](C(O)=O)C1 SMZHNCMPICENER-MQWKRIRWSA-N 0.000 description 1
- SWBGPJIGJIFMFZ-GKAPJAKFSA-N (2s)-4-pentylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CCCCCC1CN[C@H](C(O)=O)C1 SWBGPJIGJIFMFZ-GKAPJAKFSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 101710151325 B2 protein Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 208000002476 Falciparum Malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 201000011336 Plasmodium falciparum malaria Diseases 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- OZKXLOZHHUHGNV-UHFFFAOYSA-N Viomycin Natural products NCCCC(N)CC(=O)NC1CNC(=O)C(=CNC(=O)N)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC1=O)C2CC(O)NC(=N)N2 OZKXLOZHHUHGNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015940 Viomycin Proteins 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 1
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 244000000059 gram-positive pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007373 indentation Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- GXFAIFRPOKBQRV-GHXCTMGLSA-N viomycin Chemical compound N1C(=O)\C(=C\NC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCCN)CNC(=O)[C@@H]1[C@@H]1NC(=N)N[C@@H](O)C1 GXFAIFRPOKBQRV-GHXCTMGLSA-N 0.000 description 1
- 229950001272 viomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Zpusob prípravy derivátu linkomycinu biotechnologickou kultivací kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný alespon jeden gen z lmb shluku kódujícího biosyntézu 4-L-propylprolinu. Do kultivacního média je dodávána náhrada za složku, jejíž syntéza je inaktivací zablokována. Biosyntézou tak vznikají nové, biologicky úcinné deriváty linkomycinu.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká využití mutantních kmenů producentů linkomycinu defektních v biosyntéze linkomycinu k výrobě hybridních látek na bází linkosamidových antibiotik.
Dosavadní stav techniky
V poslední době vzhledem k vysokému počtu patogenních mikroorganismů, rezistentních ke známým antimikrobiálním látkám narůstá zájem o výzkum a vývoj nových, účinných antibiotik. Jednou z možností vedoucí ke vzniku mnoha potenciálně účinných látek je kombinatomí biosyntéza. Tímto způsobem lze pomocí genetické úpravy již známých genů, kódujících biosyntézu účinných látek nebo celých shluků genů získat mikroorganismus, produkující sloučeniny snovou strukturou a novými vlastnostmi. Jednou z takových to biologcky účinných látek je linkomycin a jeho deriváty. Linkomycin je metabolit produkovaný různými druhy aktinomycet včetně kmenu Streptomyces lincolnensis a je využíván k léčbě infekcí způsobených grampozitivními patogeny. Klindamycin je nejznámějším semisyntetickým derivátem linkomycinu a jeho antimikrobiální spektrum je rozšířeno o grampozitivní anaerobní bakterie a původce malárie Plasmodium falciparum. Ostatní deriváty linkomycinu byly připraveny převážně chemicky. Zároveň byly prováděny obohacovací pokusy kmenu S.lincolnensis na principu přidávání různých prekurzorů do kultivačního media vedoucí ke vzniku nových látek na bázi linkomycinu. Nové látky byly testovány in vitro a in vivo vůči různým patogenním mikroorganizmům.
V biosyntéze linkomycinu dochází k oddělené syntéze dvou prekurzorů 4-L-propylprolinu (dále PPL) a methylthiolinkosamidu (MTL), které jsou kondenzací spojeny na Ndemethyllinkomycin (NDL) a ten je dále methylován na výsledný linkomycin.
V roce 1995 byla publikována sekvence shluku genů kódujících proteiny pro biosyntézu linkomycinu v nadprodukčním kmenu - Imb shluk. Tento shluk obsahuje geny pro biosyntézu obou prekurzorů, geny pro kondenzační reakci, regulační geny a geny pro rezistenci k antibiotiku. Nedávno byla publikována sekvence linkomycinového shluku pro typový kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466.
Ke dnešnímu dni byla experimentálně prokázána a publikována pouze funkce proteinů LmbB 1 a B2 zodpovědných za první kroky biosyntézy PPL části molekuly. Funkce ostatních genů jsou buď neznámé, nebo byly navrženy na základě homologií s jinými geny z databáze
BLAST.
Podstata vynálezu
Pro přípravu nových látek na bázi linkosamidových antibiotik lze využít soubor kmenů producentů linkomycinu dcfektních v jednom či více krocích v biosyntéze.
Pro tyto účely byly provedeny v typovém kmenu Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 mutace určitých genů pro biosyntézu linkomycinu. Byl vytvořen soubor kmenů S.lincolnensis defektních v biosyntéze PPL (geny ImbA, Bl, B2, W, X, T) a závěrečné methylaci (gen ImbJ).
Takto připravené kmeny jsou určeny k dalšímu testování na produkci nových látek a to i v závislosti na zvolených kultivačních podmínkách. Podle toho co kóduje konkrétní gen, který byl přípravou kmene zablokován, je do kultivačního média potřeba přidávat komponenty, které jsou schopny toto nahradit, což jsou deriváty linkomycinových prekurzorů, biosyntéza tak není zablokována a probíhá za vzniku naprosto nových látek, biologicky aktivních derivátů linkomycinu.
V těchto kmenech je biosyntéza linkomycinu kódována Imb shlukem, který obsahuje geny ImbA, Bl, B2, JF, X, Y kódující proteiny pro tvorbu prekurzoru 4-L-propylprolinu a gen ImhJ. kódující závěrečnou methylaci N-demethyllinkomycinu. Zablokováním tvorby 4-Lpropylprolinu lze do kultivačního média přidávat jiný derivát prolinu, který bude mikroorganismus schopen v biosyntéze využít a 4-L-propylprolin jím nahradit. Tímto způsobem lze připravit celou řadu nových derivátů linkomycinu aniž by se musely připravovat synteticky.
Přehled obrázků
Obr. 1: Primery pro syntézu inaktivačních kazet
Obr.2: Chromatogram analýzy UPLC, detekovány jsou píky butyllinkomycinu a pentyllinkomycinu
Obr. 3: Struktura linkomycinu
Obr. 4: Seznam použitých kmenů E.coli včetně obsaženého plasmidu a antibiotika přítomného v jeho kultivačním médiu případně potřebná kultivační teplota
Obr. 5: Seznam použitých antibiotik včetně jejich používané zkratky a koncentrace
v kultivačních médiích
Obr.6: Seznam použitých médií včetně jejich složení
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Pro získání kmene Slreplomyces lincolnensis ATCC 25466 defektního vbiosyntéze linkomycinu byla provedena ínaktivace jednoho z genu účastnícího se syntézy propylprolinu za použití kitu pro cílenou mutagenezi streptomycet (REDIRECT PCR targeting systém, Proč Nati Acad Sci USA. 100(4), 1541-1546. 2003).
Kosmid LK6, který je uchováván v E. coli BW25113/pIJ790, pochází ze Streptomyces lincolnensis a nese celý Imb shluk. V tomto kmeni byl gen ImbX nahrazen inaktivační kazetou aac(3)IV/oriT kódující rezistenci k apramycinu. Tato inaktivační kazeta byla vytvořena PCR reakcí s pomocí příměru Xf a Xr obsahujících homologní úseky okolí genu ImbX. Jako templát byl použit 1383 pb fragment vzniklý štěpením plazmidu pIJ773 restrikčními enzymy EcoRI a HindlII. Kmen E. coli BW25113 obsahující kosmid LK6 a plazmid pIJ790 s geny potřebnými pro rekombinaci byl elektroporačně transformován inaktivační kazetou a selektován na rezistenci k apramycinu (50 mg/L), kanamycinu (50 mg/L) a karbamycínu (100 mg/L) na LB médiu. Kazeta byla rekombinačně integrována do kosmidu LK6 výměnou za gen ImbX.
Takto připravený kosmid byl konjugačně vnesen do kmene X lincolnensis ATCC 25466 podle protokolu Kieser T., Bibb M.J., Bittner M.J., Cháter K.F., Hopwood D.A. : Practical Streptomyces genetics, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich, England. (2000)
Transformace S. lincolnensis plasmidovou DNA mezidruhovou konjugací s E. coli
Kompetentní buňky E. coli ET12567/pUZ8002 byly elektroporací transformovány kosmidem pLK6 s inaktivační kazetou a selektovány na LB médiu s apramycinem (50 pg/ml) a karbenicilinem (100 pg/ml). Jedna z kolonií byla zaočkována do 10 ml LB média obsahujícího apramycin (50 pg/ml), chloramfenikol (25 pg/ml) a kanamycin (50 pg/ml) a kultivována přes noc. 100 pl přes noc narostlé kultury bylo přeočkováno do 10 ml čerstvého LB média obsahujícího apramycin (50 pg/ml), chloramfenikol (25 pg/ml) a kanamycin (50 pg/ml) a inkubováno na třepačce do dosažení ODóou = 0,4 (cca 4 h). Antibiotika byla z kultury odstraněna dvojnásobným promytím buněk 10 ml LB média centrifugací (1000 g, 10 min,
20°C) a buňky byly poté resuspendovány v 1 ml LB média.
K 10 μΐ sporové suspenze Streptomyces lincolnensis (10scfu) bylo přidáno 500 μΐ 2 χ YT média a spory byly podrobeny tepelnému šoku v 50°C po dobu 10 min a ochlazeny na laboratorní teplotu.
0,5 ml suspenze buněk E. coli ET12567/pUZ8002 bylo smícháno s 0,5 ml sporové suspenze Streptomyces lincolnensis a centrifugováno (10 000 g, 5 s, 20°C). Sediment byl resuspendován v 50 μΐ reziduálního média. Ze suspenze byla připravena ředící řada od 10'1 do 104 (suspenze byla ředěna sterilní destilovanou H2O). 100 μΐ každého ředění bylo vyseto na MS agar s 10 mmol/1 MgCh bez selekce a inkubováno ve 30°C. Po 16 - 20 h byla každá miska o průměru 8 cm rovnoměrně přelita 1 ml sterilní destilované H2O obsahující 0,5 mg kyseliny nalidixové a 1,25 mg apramycinu a dále inkubována při 30°C 3-5 dnů.
Klony S.lincolnensis obsahující inaktivační kazetu ve své DNA byly selektovány na rezistenci k apramycinu (50 mg/L) nejdříve na MS agaru, pak na DNA agaru.
Pro eliminaci vlivu inaktivační kazety na transkripci genů ve stejné transkripční jednotce bylo v kmenu E.coli DH5a provedeno vkosmidu LK6 vyštěpení kazety pomocí FLP rekombinázy, kódované genem neseným na plazmidu pBT340. FLP rekombináza odstranila centrální část inaktivační kazety a na jejím místě zanechala 81 pb dlouhý úsek DNA -, jizvu“ (teplota nutná pro indukci exprese rekombinázy je 42°C, buňky E.coli DH5a splazmidem BT340 a kosmidem LK6 byly proto pěstovány při této teplotě).
Mutovaný kosmid s jizvou byl pak vnesen transformací protoplastů podle protokolu Jandová Z., Tichý P.: Transformation of Streptomyces lincolnensis protoplasts with plasmid vectors, in Folia Microbiol (Praha),37(3),181-7.(1992) do buněk streptomycetového kmene, které měly již funkční gen ImbX nahrazen za inaktivační kazetu.
Příprava protoplastů S, lincolnensis
Inokulum bylo připraveno zaočkováním 50 ml YEME média s 10 % sacharózou a 5 mmol/l MgCb sporami kmene Streptomyces lincolnensis s inaktivační kazetou ze šikmého agaru a inkubací na třepačce při 30°C po dobu 24 h. Poté byl 1 ml inokula přeočkován do čerstvého YEME média s 10 % sacharózou, 5 mmol/1 MgCh a 0,5 % glycinem a kultura byla inkubována na třepačce při 28°C po dobu 16-17 hod. Buňky byly sklizeny centrifugací (10 min, 12°C, 6000 g), dvakrát promyty 15 ml P pufru za týchž podmínek a resuspendovány v 10 ml P pufru slyzozymem (2 mg/ml). Suspenze buněk byla inkubována při 30°C s občasným promícháním. Tvorba protoplastů byla sledována mikroskopicky. Zbytky mycelia byly odstraněny centrifugací (10 min, 20°C, 1 000 g). Protoplasty byly přefiltrovány přes sterilní vatový filtr, centrifugovány (10 min, 20°C, 3000 g) a dvakrát promyty P pufrem za týchž podmínek. Nakonec byly sedimentované protoplasty resuspendovány ve 200 μΐ P pufru a ihned použity pro transformaci.
Transformace protoplastů S. lincolnensis
500 ng v objemu 5 μΐ plazmidové DNA mutovaného kosmidu s jizvou bylo smícháno s 5 μΐ 50 % sacharózy a ke směsi bylo přidáno 100 μΐ suspenze protoplastů. Po promíchání bylo k suspenzi přidáno 200 μΐ T pufru, suspenze protoplastů byla opět promíchána a ihned vyseta na R2YE agar. Po 16 hodinách inkubace při 30°C byly obě misky přelity 2 ml vodného roztoku kanamycinu o koncentraci 200 pg/ml R2YE agaru a inkubována při 30°C po dalších
7-10 dnů.
Homologní rekombinací se inaktivační kazeta vyměnila za jizvu. Dvojité rekombinanty získaného kmene Streptomyces lincolnensis XlmhX byly selektovány na ztrátu apramycinové rezistence.
Buňky E. coli byly kultivovány v tekutých nebo na pevných médiích (LB, SOC) při 37°C. Kmen BW251 l3/LK6/pIJ790 byl kultivován při 30°C. Po transformaci kazetou daný kmen byl pěstován pří 37°C. Kmen DH5a obsahující plazmid pBT340 byl pěstován při 30°C. Tekuté kultury byly inkubovány na rotační třepačce při 200 RPM.
Buňky Streptomyces lincolnensis byly kultivovány v tekutých nebo na pevných médiích (R2YE, MS, DNA, YT) při 28- 30°C. Tekuté kultury byly inkubovány na rotační třepačce při 230 RPM a byly zakládány v Erlenmayerových baňkách o objemu 500 ml, které byly opatřeny vlisy pro zabránění tvorby shluků mycelia. Pro selekci buněk nesoucích vektor byla do kultivačních médií přidána odpovídající antibiotika.
Příklad 2
Kmen Streptomyces lincolnensis klmbX defektní v biosyntéze PPL byl v koncentraci y spor naočkován do 50 ml ínokulačního média YEME a kultivován 30 hod při 28°C. Poté bylo do 20 ml produkčního média AVM s přídavkem 4-L-butyl prolinu (100 mg/1) naočkováno 5 % inokulační kultury. Kultivace trvala 120 hod při 28°C. Po jejím ukončení byla kultivační kapalina od narostlé kultury oddělena centrifugací a získaný supematant byl použit na analýzu pro stanovení produkovaného derivátu linkomycinu - butyliinkomycinu.
Přiklad 3
Kmen Streptomyces lincolnensis SlmbX defektní v biosyntéze PPL byl v koncentraci 108 spor naočkován do 50 ml inokulačního média YEME a kultivován 30 hod při 28°C. Poté bylo do 20 ml produkčního média AVM s přídavkem 4-L-pentyl prolinu (100 mg/l) naočkováno 5 % inokulační kultury. Kultivace trvala 120 hod při 28°C. Po jejím ukončení byla kultivační kapalina od narostlé kultury oddělena centrifugací a získaný supematant byl použit na analýzu pro stanovení produkovaného derivátu linkomycinu pentyllinkomycinu.
Příklad 4
Pro analýzu butyllinkomycinu (dále BuLIN) byl použit Acquity UPLC systém (Waters, Milford, Massachusetts) s 2996 PDA detektorem nastaveným na 194 nm. Výsledky byly zpracovány pomocí počítačového programu Empower 2 (Waters). Supematant kultivačního média byl přečištěn pomocí SPE Oasis HLB 3cc extrakčních kolonek. Vzorek (4 ml) byl nanesen na kolonku předem kondicionovanou a ekvilibrovanou methanolem (3 ml) a vodou (3 ml). Část matrice vzorku byla vymyta vodou (3 ml) a 10% methanolem (v/v, 1 ml). Frakce obsahující deriváty linkomycinu byly vymyty 80% methanolem (v/v, lml), odpařeny do sucha a znovu rozpuštěny ve 200 μΐ methanolu.Vzorky byly analyzovány na chromatografické koloně BEH Cl8 column (50 x 2.1 mm, průměr částic 1.7 μτη, Waters); mobilní fáze byla složena ze složky A, 1 mmol/1 mravenčan amonný (pH 9,0), a složky B, acetonitril; izokratická eluce (24 % B); průtoková rychlost: 0,4 ml min'1, teplota kolony: 35°C, rychlost sběru dat: 20 pts s'1, dávkovaný objem: 5 μΐ, čas analýzy: 3,5 min. Po každé analýze následoval výplach kolony (100% acetonitrilem, 1 min) a její ekvilibrace (1,5 min). Eluent za kolonou obsahující BuLIN (retenční čas 5,05 min) byl odebrán, vysušen do sucha a použit pro MS analýzu, která přítomnost butyllinkomycinu ve vzorku potvrdila.
Příklad 5
Pro analýzu pentyllinkomycinu (dále PeLIN) byl použit Acquity UPLC systém (Waters, Milford, Massachusetts) s 2996 PDA detektorem nastaveným na 194 nm. Výsledky byly zpracovány pomocí počítačového programu Empower 2 (Waters). Supematant kultivačního média byl přečištěn pomocí SPE Oasis HLB 3cc extrakčních kolonek. Vzorek (4 ml) byl nanesen na kolonku předem kondicionovanou a ekvilibrovanou methanolem (3 ml) a vodou (3 ml). Část matrice vzorku byla vymyta vodou (3 ml) a 10% methanolem (v/v, 1 ml). Frakce obsahující deriváty linkomycinu byly vymyty 80% methanolem (v/v, lml), odpařeny do sucha
Ί a znovu rozpuštěny ve 200 μΐ methanolu. Vzorky byly analyzovány na chromatografické koloně BEH Cl8 column (50 x 2.1 mm, průměr částic 1.7 pm, Waters); mobilní fáze byla složena ze složky A, 1 mmol/1 mravenčan amonný (pH 9,0), a složky B, acetonitril; lineární gradientova eluce min/% B: 0/5, 10/52,5; průtoková rychlost: 0,4 ml min'1, teplota kolony: 35°C, rychlost sběru dat: 20 pts s'1, dávkovaný objem. 5 pl, čas analýzy: 3,5 min. Po každé analýze následoval výplach kolony (100% acetonitrilem, 1 min) a její ekvilibrace (1,5 min). Eluent za kolonou obsahující PeLIN (retenční čas 7,10 min) byl odebrán, vysušen do sucha a použit pro MS analýzu, která přítomnost pentyllinkomycinu ve vzorku potvrdila.
Příklad 6
Pro získání kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 defektního vbiosyntéze propylprolinu a v závěrečné methylaci N-demetyllinkomycinu byla současně provedena inaktivace genů ImbX a ImbJ za použití kitu pro cílenou mutagenezi streptomycet (REDIRECT PCR targeting systém, Proč Nati Acad Sci USA. 100(4), 1541-1546. 2003). V kosmidu LK6 nesoucím celý Imb shluk byl gen ImbX nahrazen inaktivační kazetou aac(3)IV/oriT kódující rezistencí k apramycinu (50 mg/L). Tato inaktivační kazeta byla vytvořena PCR reakcí s pomocí primeru Xf a Xr (tab. 2.) obsahujících homologní úseky okolí genu ImbX. Jako templát byl použít 1383 pb fragment vzniklý štěpením plazmidu pIJ773 restrikčními enzymy EcoRI a HindlII. Další gen ImbJ byl nahrazen ve stejném kosmidu kazetou vph, kódující rezistenci kviomycinu (30 mg/L). Tato inaktivační kazeta byla vytvořena PCR reakcí s pomocí primeru Jf a Jr obsahujících homologní úseky okolí genu ImbJ. Jako templát byl použit 1622 pb fragment vzniklý štěpením plazmidu pIJ781 restrikčními enzymy EcoRI a HindlII. Kmen E. coli BW25113 obsahující kosmid LK6 a plazmid pIJ790 s geny potřebnými pro rekombinaci byl postupně transformován inaktivačními kazetami. Kazety byly rekombinačně integrovány do kosmidu LK6 výměnou za geny ImbXa ImbJ. Takto připravený kosmid byl konjugačně vnesen do kmene S. lincolnensis ATCC 25466. Klony S.lincolnensis obsahující kazety byly selektovány na rezistenci k apramycinu a viomycinu. Pro eliminaci vlivu inaktivačních kazet na transkripci genů ve stejné transkripční jednotce bylo provedeno vyštěpení kazet pomocí FLP rekombinázy, kódované genem neseným na plazmidu pBT340. FLP rekombináza odstranila centrální části inaktivačních kazet a zanechala 81 pb dlouhé úseky DNA - Jizvy“, Mutovaný kosmid s jizvami byl pak vnesen do buněk streptomycetového kmene, který měl již geny ImbX a J nahrazeny za inaktivační kazety. Homologní rekombinaci se inaktivační kazety vyměnily za jizvy. Kultivační, selekční a transformační podmínky byly shodné s podmínkami uvedenými v příkladu 1.
Průmyslová využitelnost
Nově připravené deriváty linkomycinových antibiotik jsou využitelné pro vývoj nových účinných látek proti infekcím patogenních mikroorganismů. Tedy ve farmaceutickém průmyslu, lékařství.
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu vyznačující se tím, že pro kultivaci je použit kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný alespoň jeden gen ze sluku Imb kódující biosyntézu 4-L-propylprolinu, přičemž do kultivačního média musí být dodána náhrada za složku, jejíž syntéza je inaktivací zablokována.
- 2. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu podle nároku 1 vyznačující se tím, že inaktivovaný je gen ImbX pro biosyntézu 4-Lpropylprolinu.
- 3. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu podle nároku 2 vyznačující se tím, že jako náhrada za složku je do média přidáván derivát prolinu.
- 4. Použití kmene podle nároku 1 pro biotechnologickou přípravu biologicky aktivnějších derivátů linkomycinu.
- 5. Použití kmene podle nároku 4 který má inaktivované geny ImbJ a ImbX pro biotechnologickou přípravu biologicky aktivnějších derivátů linkomycinu.
- 6. Použití kmene podle nároku 4 který má inaktivovaný gen ImbX pro biotechnologickou přípravu biologicky aktivnějších derivátů linkomycinu.
- 7. Použití kmene podle nároku 4 který má inaktivovaný gen hnbJ pro biotechnologickou přípravu biologicky aktivnějších derivátů linkomycinu
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090277A CZ302256B6 (cs) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu |
| PCT/CZ2010/000057 WO2010127645A2 (en) | 2009-05-04 | 2010-05-04 | The method of biotechnological preparation of lincomycin derivatives and its using |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090277A CZ302256B6 (cs) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2009277A3 true CZ2009277A3 (cs) | 2010-11-18 |
| CZ302256B6 CZ302256B6 (cs) | 2011-01-12 |
Family
ID=43050536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20090277A CZ302256B6 (cs) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ302256B6 (cs) |
| WO (1) | WO2010127645A2 (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105566411B (zh) | 2014-11-07 | 2020-11-13 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 林可霉素生物合成中间产物及其制法和用途 |
| CZ307305B6 (cs) | 2017-03-10 | 2018-05-23 | Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i. | Linkosamidy, jejich příprava a použití |
| CN107881190B (zh) * | 2017-11-15 | 2021-02-09 | 安徽大学 | 通过改造林可链霉菌slcg_2919基因提高林可霉素产量的方法 |
| CN111117942B (zh) * | 2020-01-16 | 2021-05-25 | 华东理工大学 | 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN114540212B (zh) * | 2020-11-26 | 2023-11-03 | 浙江珲达生物科技有限公司 | 一种链霉菌及其发酵产来普霉素b的方法 |
| CN119799607B (zh) * | 2025-01-07 | 2025-07-22 | 合肥师范学院 | 通过改造林可链霉菌slcg_3904基因提高林可霉素产量的方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3674647A (en) * | 1970-10-07 | 1972-07-04 | Upjohn Co | Preparation of lincomycin analogues |
-
2009
- 2009-05-04 CZ CZ20090277A patent/CZ302256B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-05-04 WO PCT/CZ2010/000057 patent/WO2010127645A2/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ302256B6 (cs) | 2011-01-12 |
| WO2010127645A2 (en) | 2010-11-11 |
| WO2010127645A3 (en) | 2011-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Enghiad et al. | Cas12a-assisted precise targeted cloning using in vivo Cre-lox recombination | |
| Luo et al. | Activation and characterization of a cryptic polycyclic tetramate macrolactam biosynthetic gene cluster | |
| Zhou et al. | Genome mining‐directed activation of a silent angucycline biosynthetic gene cluster in Streptomyces chattanoogensis | |
| Ito et al. | Deciphering pactamycin biosynthesis and engineered production of new pactamycin analogues | |
| CN102219815B (zh) | 六种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 | |
| CZ2009277A3 (cs) | Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu | |
| RU2719189C2 (ru) | Биосинтетический генный кластер карримицина | |
| Song et al. | Cytochrome P450-mediated hydroxylation is required for polyketide macrolactonization in stambomycin biosynthesis | |
| Li et al. | Mining of a streptothricin gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0356 genome via heterologous expression | |
| Wu et al. | Improving gentamicin B and gentamicin C1a production by engineering the glycosyltransferases that transfer primary metabolites into secondary metabolites biosynthesis | |
| Erb et al. | Cloning and sequencing of the biosynthetic gene cluster for saquayamycin Z and galtamycin B and the elucidation of the assembly of their saccharide chains | |
| Strobel et al. | Tracking down biotransformation to the genetic level: identification of a highly flexible glycosyltransferase from Saccharothrix espanaensis | |
| CN103215281B (zh) | 一种格瑞克霉素和p-1894b的生物合成基因簇及其应用 | |
| Greule et al. | Wide distribution of foxicin biosynthetic gene clusters in Streptomyces strains–An unusual secondary metabolite with various properties | |
| Jian et al. | Glycodiversification of gentamicins through in vivo glycosyltransferase swapping enabled the creation of novel hybrid aminoglycoside antibiotics with potent activity and low ototoxicity | |
| Hu et al. | 1.07-Bacterial Type II Polyketide Synthases | |
| Limbrick et al. | Methyltransferase contingencies in the pathway of everninomicin D antibiotics and analogues | |
| CN105002106B (zh) | 平板霉素和平板素的高产工程菌株及其发酵和分离纯化工艺 | |
| TWI601822B (zh) | Ｕｋ－２生合成基因和使用彼以改善ｕｋ－２生產率之方法 | |
| EP2308970A1 (en) | Antibiotic compositions, methods for providing the same and Streptomyces coelicolor mutants for use in such methods | |
| Heide et al. | Combinatorial biosynthesis, metabolic engineering and mutasynthesis for the generation of new aminocoumarin antibiotics | |
| Tao et al. | Functional characterization of tlmH in Streptoalloteichus hindustanus E465-94 ATCC 31158 unveiling new insight into tallysomycin biosynthesis and affording a novel bleomycin analog | |
| CN116676353A (zh) | 天蓝色链霉菌M145-chry及其在发酵生产金黄霉素中应用 | |
| Singh et al. | Precursor for biosynthesis of sugar moiety of doxorubicin depends on rhamnose biosynthetic pathway in Streptomyces peucetius ATCC 27952 | |
| CN100387609C (zh) | 新角蒽环聚酮类抗生素的制造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190504 |