CZ302256B6

CZ302256B6 - Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu

Info

Publication number: CZ302256B6
Application number: CZ20090277A
Authority: CZ
Inventors: Ulanova@Dana; Novotná@Jitka; Smutná@Yvona; Kameník@Zdenek; Gažák@Radek; Janata@Jirí; Kopecký@Jan; Spížek@Jaroslav
Original assignee: Mikrobiologický ústav AV CR v. v. i.
Priority date: 2009-05-04
Filing date: 2009-05-04
Publication date: 2011-01-12
Also published as: CZ2009277A3; WO2010127645A2; WO2010127645A3

Abstract

Deriváty linkomycinu jsou pripravovány biotechnologickou kultivací Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen lmbJ a/nebo alespon jeden gen ze skupiny genu lmb tvorené geny lmbA, B1, B2, W, X a Y kódujícími biosyntézu 4-L-propylprolinu. V prípade zablokování biosyntézy 4-L-propylprolinu musí být do kultivacního média dodávána náhrada za tento meziprodukt. Biosyntézou tak vznikají nové, biologicky úcinné deriváty linkomycinu.

Description

Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu

Oblast techniky

Vynález se týká využití mutantních kmenů producentů linkomycinu defektních vbiosyntéze linkomycinu k výrobě hybridních látek na bázi linkosamidových antibiotik.

to Dosavadní stav techniky

V poslední době vzhledem k vysokému počtu patogenních mikroorganismů, rezistentních ke známým antimikrobiálním látkám narůstá zájem o výzkum a vývoj nových, účinných antibiotik. Jednou z možností vedoucí ke vzniku mnoha potenciálně účinných látek je kombinatomí bio15 syntéza. Tímto způsobem lze pomocí genetické úpravy již známých genů, kódujících biosyntézu účinných látek nebo celých shluků genů získat mikroorganismus, produkující sloučeniny s novou strukturou a novými vlastnostmi. Jednou z takových to biologicky účinných látek je linkomycin a jeho deriváty. Linkomycin je metabolit produkovaný různými druhy aktinomycet včetně kmenu Streptomyces lincolnensis a je využíván k léčbě infekcí způsobených grampozitivními patogeny.

Klindamycin je nejznámějším semisyntetickým derivátem linkomycinu, připravovaným z linkomycinu jeho chlorací. Antimikrobiální spektrum klindamycinu a jeho derivátů je rozšířeno o grampozitivní anaerobní bakterie a původce malárie Plasmodium falciparum, Ostatní deriváty linkomycinu byly připraveny převážně chemicky. Zároveň byly prováděny obohacovací pokusy kmenu S.lincolnensis na principu přidávání různých prekurzorů do kultivačního media vedoucí ke vzniku nových látek na bázi linkomycinu. Nové látky byly testovány in vitro a in vivo vůči různým patogenním mikroorganizmům.

V biosyntéze linkomycinu dochází k oddělené syntéze dvou prekurzorů 4-L- propylproiinu (dále PPL) a methylthiolinkosamidu (MTL), které jsou kondenzací spojeny na N—demethyl linkomycin (NDL) a ten je dále methylován na výsledný linkomycin.

V roce 1995 byla publikována sekvence shluku genů kódujících proteiny pro biosyntézu linkomycinu v nadprodukčním kmenu - Imb shluk. Tento shluk obsahuje geny pro biosyntézu obou prekurzorů, geny pro kondenzační reakci, regulační geny a geny pro rezistenci k antibiotiku.

Nedávno byla publikována sekvence linkomycinového shluku pro typový kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466.

Ke dnešnímu dni byla experimentálně prokázána a publikována pouze funkce proteinů LmbBl a B2 zodpovědných za první kroky biosyntézy PPL části molekuly. Funkce ostatních genů jsou buď neznámé, nebo byly navrženy na základě homologií s jinými geny z databáze BLAST.

Podstata vynálezu

Pro přípravu nových látek na bázi linkosamidových antibiotik lze využít soubor kmenů producentů linkomycinu defektních v jednom či více krocích v biosyntéze.

Pro tyto účely byly provedeny v typovém kmenu Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 mutace určitých genů pro biosyntézu linkomycinu. Byl vytvořen soubor kmenů S.lincolnensis defektních v biosyntéze PPL (geny ImbA, Bl, B2, W, Y, Y) a závěrečné methylaci (gen ImbJ).

Takto připravené kmeny jsou určeny k dalšímu testování na produkci nových látek a to i v závislosti na zvolených kultivačních podmínkách. Podle toho co kóduje konkrétní gen, který byl přípravou kmene zablokován, je do kultivačního média potřeba přidávat komponenty, které jsou schopny toto nahradit, což jsou deriváty linkomycinových prekurzorů. Biosyntéza tak není

-1 CZ 302256 Β6 zablokována a probíhá za vzniku naprosto nových látek, biologicky aktivních derivátů linkomycinu.

V těchto kmenech je biosyntéza linkomycínu kódována Imb shlukem, který obsahuje geny ImbA, Bl, B2, Ηζ X, Y kódující proteiny pro tvorbu prekurzoru 4-L-propylprolinu a gen ImbJ^ kódující závěrečnou methylaci N-demethyllinkomycinu.

Po zablokování tvorby 4-L-propylprolinu lze do kultivačního média přidávat jiný derivát prolinu, který bude mikroorganismus schopen v biosyntéze využít, a 4-L-propylprolin jím nahradit.

Po zablokování závěrečné methylace inaktivací /móJgenu je biotechnologickou kultivací Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 získán N-demethylIÍnkomycin, který je využitelný jako výchozí látka pro přípravu biologicky aktivnějších derivátů linkomycínu, například chlorací vzniká N-demethyiklindamycin.

Biotechnologickou kultivací kmenů Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, které mají současně inaktivován gen ImbJ a alespoň jeden gen ze shluku Imb kódující biosyntézu 4-L-propylprolinu a současným přídavkem prolinových derivátů do kultivačního média, jsou připravovány deriváty linkomycínu. Ty jsou dále využitelné pro přípravu aktivnějších chlorovaných derivátů na bázi klindamycinu.

Tímto způsobem lze připravit celou řadu nových derivátů linkomycínu aniž by se musely připravovat synteticky.

Přehled obrázků

Obr. 1: Primery pro syntézu inaktivačních kazet

Obr. 2: Chromatogram analýzy UPLC, detekovány jsou píky 4'-butyl-4'-depropyllinkomycÍnu a

4'-pentyl-4'-depropyllinkomycinu

Obr. 3: Struktura linkomycínu

Obr. 4: Seznam použitých kmenů E.coli včetně obsaženého plasmidu a antibiotika přítomného v jeho kultivačním médiu případně potřebná kultivační teplota

Obr. 5: Seznam použitých antibiotik včetně jejich používané zkratky a koncentrace v kultivačních médiích

Obr. 6 Seznam použitých médií včetně jejich složení

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Pro získání kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 defektního v biosyntéze linkomycínu byla provedena inaktivace jednoho z genu účastnícího se syntézy propylprolinu za použití kitu pro cílenou mutagenezi streptomycet (REDIRECT PCR targeting systém, Proč Nati Acad Sci USA. 100(4), 1541-1546,2003).

Kosmid LK6, který je uchováván v £. coli BW25113/pIJ790, pochází ze Stereptomyces lincolnensis a nese celý Imb shluk. V tomto kmeni byl gen ImbX nahrazen inaktivační kazetou

- 2 CZ 302256 B6 aac(3)JV/oriT kódující rezistenci kapramycinu. Tato inaktivační kazeta byla vytvořena PCR reakcí s pomocí primerů Xf a Xr obsahujících homologní úseky okolí genu ImbX. Jako temp lát byl použit 1383 bp fragment vzniklý štěpením plazmidu píJ773 restrikčními enzymy EcoRI a HindlII. Kmen E. coli BW25113 obsahující kosmid LK6 a plazmid pIJ790 sgeny potřebnými pro rekombinaci byl elektroporačně transformován inaktivační kazetou a selektován na rezistenci kapramycinu (50 mg/L), kanamycinu (50 mg/L) a karbenicilinu (100 mg/L) na LB médiu. Kazeta byla rekombinantně integrována do kosmidu LK6 výměnou za gen ImbX.

Takto připravený kosmid byl konjugačně vnesen do kmene 5. lincoinensis ATCC 25466 podle protokolu KieserT., Bibb M. J., Bittner, M. J., Cháter K. F., Hopwood D. A.: Practical Streptomyces genetics, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich, Fngland. (2000) Transformace 5. lincoinensis plasmidovou DNA mezidruhovou konjugací s E. coli

Kompetentní buňky E. coli ET12567/pUZ8002 byly elektroporací transformovány kosmidem pLK6 s inaktivační kazetou a selektovány na LB médiu s apramycinem (50 pg/ml) a kabemicilinem (100 pg/ml). Jedna z kolonií byla zaočkována do 10 ml LB média obsahujícího apramycin (50 pg/ml), chloramfenikol (25 pg/ml) a kanamycin (50 pg/ml) a kultivována přes noc. 100 μΐ přes noc narostlé kultury bylo přeočkováno do 10 ml čerstvého LB média obsahujícího apramycin (50 pg/ml), chloramfenikol (25 pg/ml) a kanamycin (50 pg/ml) a inkubováno na třepačce do dosažení OD₆oo ⁼ 0,4 (cca 4 h). Antibiotika byly z kultury odstraněna dvojnásobným promytím buněk 10 ml LB média centrifugací (1000 g, 10 min, 20 °C) a buňky byly poté resuspendovány v 1 ml LB média.

K 10 μΙ sporové suspenze Streptomyces lincoinensis (10⁸ cfu) bylo přidáno 500 μΐ 2 x YT média a spory byly podrobeny tepelnému šoku v 50 °C po dobu 10 min a ochlazeny na laboratorní teplotu.

0,5 ml suspenze buněk E. coli ET12567/pUZ8002 bylo smícháno s 0,5 ml sporové suspenze Streptomyces lincoinensis a centrifugováno (10 000 g, 5 s, 20 °C). Sediment byl resuspendován v 50 μΐ reziduálního média. Ze suspenze byla připravena ředící řada od 10 ¹ do 10 ⁴ (suspenze byla ředěna sterilní destilovanou H₂O). 100 μΙ každého ředění bylo vyseto na MS agar s 10 mmol/1 MgCL bez selekce a inkubováno ve 30 °C. Po 16 až 20 h byla každá miska o průměru 8 cm rovnoměrně přelita 1 ml sterilní destilované H₂O obsahující 0,5 mg kyseliny nalidixové a 1,25 mg apramycinu a dále inkubována při 30 °C 3 až 5 dnů.

Klony S.lincoinensis obsahující inaktivační kazetu ve své DNA byly selektovány na rezistenci k apramycinu (50 mg/L) nejdříve na MS agaru, pak na DNA agaru.

Pro eliminaci vlivu inaktivační kazety na transkripci genů ve stejné transkripění jednotce bylo v kmenu E.coli DH5a provedeno v kosmidu LK6 vyštěpení kazety pomocí FLP rekombinázy, kódované genem neseným na plazmidu pBT340. FLP rekombináza odstranila centrální část inaktivační kazety a na jejím místě zanechala 81 bp dlouhý úsek DNA - Jizvu“ (teplota nutná pro indukci exprese rekombinázy je 42 °C, buňky E.coli DH5a s plazmidem BT340 a kosmidem LK6 byly proto pěstovány při této teplotě).

Mutovaný kosmid s jizvou byl pak vnesen transformací protoplastů podle protokolu Jandová Z., Tichý P,; Transformation of Streptomyqces lincoinensis protoplasts with plasmid vectors, in Folia Microbiol (Praha), 37(3), 181-7.(1992) do buněk streptomycetového kmene, které mělyjiž funkční gen ImbX nahrazen za inaktivační kazetu.

-3 CZ 302256 B6

Příprava protoplastů S. Hncolnensis

Inokulum bylo připraveno zaočkováním 50 ml YEME média s 10% saeharózou a 5 mmol/l MgCL sporami kmene Streptomyces lincolnensis s inaktivační kazetou ze šikmého agaru a inku5 bací na třepačce při 30 °C po dobu 24 h. Poté byl I ml ínokula přeočkován do čerstvého YEME média s 10% saeharózou, 5 mmol/l MgCL a 0,5% glycinem a kultura byla inkubována na třepačce při 28 °C po dobu 16 až 17 hod. Buňky byly sklizeny centrifugací (10 min, 12 °C, 6000 g), dvakrát promyty 15 ml P pufru za týchž podmínek a resuspendovány v 10 ml P pufru s lyzozymem (2 mg/mt). Suspenze buněk byla inkubována při 30 °C s občasným promícháním, to Tvorba protoplastů byla sledována mikroskopicky. Zbytky mycelia byly odstraněny centrifugací (10 min, 20 °C, 1 000 g). Protoplasty byly přefiltrovány přes sterilní vatový filtr, centrifugovány (10 min, 20 °C, 3000 g) a dvakrát promyty P pufrem za týchž podmínek. Nakonec byly sedimentované protoplasty resuspendovány ve 200 μΙ P pufru a ihned použity pro transformaci.

Transformace protoplastů 5. lincolnensis

500 ng v objemu 5 μΐ plazmidové DNA mutovaného kosmidu s jizvou bylo smícháno s 5 μΐ 50% sacharózy a ke směsi bylo přidáno 100 μΐ suspenze protoplastů. Po promíchání bylo k suspenzi přidáno 200 μΐ T pufru, suspenze protoplastů byla opět promíchána a ihned vyseta na R2YE agar.

2o Po 16 hodinách inkubace při 30 °C byly obě misky přelity 2 ml vodného roztoku kanamycinu o koncentraci 200 pg/ml R2YE agaru a inkubována při 30 °C po dalších 7 10 dnů.

Homologní rekombinací se inaktivační kazety vyměnila za jizvu. Dvojité rekombinanty získaného kmene Streptomyces lincolnensis SlmbX\yy\y selektovány na ztrátu apramycinové rezistence.

Buňky li. coli byly kultivovány v tekutých nebo na pevných médiích (LB, SOC) při 37 °C. Kmen BW25113/LK6/pIJ790 byl kultivován při 30 °C. Po transformaci kazetou daný kmen byl pěstován při 37 °C. Kmen DH5a obsahující plazmid pBT340 byl pěstován při 30 °C. Tekuté kultury byly inkubovány na rotační třepačce při 200 RPM.

5«

Buňky Streptomyces lincolnensis byly kultivovány v tekutých nebo na pevných médiích (R2YE, MS, DNA, YT) při 28 až 30 °C. Tekuté kultury byly inkubovány na rotační třepačce při 230 RPM a byly zakládány v Erlenmayerových buňkách o objemu 500 ml, které byly opatřeny vlisy pro zabránění tvorby shluků mycelia. Pro selekci buněk nesoucích vektor byla do kultívač35 nich médií přidána odpovídající antibiotika.

Příklad 2

Kmen Streptomyces lincolnensis SlmbX defektní v biosyntéze PPL byl v koncentraci 10⁸ spor naočkován do 50 ml inokulačního média YEME a kultivován 30 hod při 28 °C. Poté bylo do 20 ml produkčního média AVM s přídavkem 4-L-butylprolinu (100 mg/l) naočkováno 5 % inokulační kultury. Kultivace trvala 120 hod při 28 °C. Po jejím ukončení byla kultivační kapalina od narostlé kultury oddělena centrifugací a získaný supematant byl použit pro analýzu pro stano45 vení produkovaného derivátu linkomycinu - 4 -butyl—4'-depropyl linkomycinu.

Příklad 3

Kmen Streptomyces lincolnensis \lmbX defektní v biosyntéze PPL byl v koncentraci 10⁸ spor naočkován do 50 ml inokulačního média YEME a kultivován 30 hod při 28 °C. Poté bylo do 20 ml produkčního média AVM s přídavkem 4—L-pentylprolinu (100 mg/l) naočkováno 5% inokulační kultury. Kultivace trvala 120 hod při 28 °C. Po jejím ukončení byla kultivační kapali-4 CZ 302256 B6 na od narostlé kultury oddělena centrifugací a získaný supematant byl použit na analýzu pro stanovení produkovaného derivátu linkomycinu - 4'-pentyM'-depropyllinkomycinu.

Příklad 4

Pro analýzu 4'-butyM'-depropyl linkomycinu (dále BuLIN) byl použit Acquity UPLC systém (Waters, Milford, Massachusetts) s 2996 PDA detektorem nastaveným na 194 nm. Výsledky byly zpracovány pomocí počítačového programu Empower 2 (Waters). Supematant kultivačního i» média byl přečištěn pomocí SPE Oasis HLB 3cc extrakčních kolonek. Vzorek (4 ml) byl nanesen na kolonku předem kondicionovanou a ekvilibrovanou methanolem (3 ml) a vodou (3 ml). Část matrice vzorku byla vymyta vodou (3 ml) a 10% methanolem (v/v, 1 ml). Frakce obsahující deriváty linkomycinu byly vymyty 80% methanolem (v/v, lml), odpařeny do sucha a znovu rozpuštěny ve 200 μΐ methanolu. Vzorky byly analyzovány na chromatografické koloně BEH Cl8 column (50 x 2,1 mm, průměr částic 1,7 pm, Waters); mobilní fáze byla složena ze složky A, 1 mmol/1 mravenčan amonný (pH 9,0), a složky B, acetonitril; izokratická eluce (24 % B); průtoková rychlost; 0,4 mi min¹, teplota kolony; 35 °C, rychlost sběru dat: 20 pts s dávkovaný objem: 5 μΙ, čas analýzy: 3,5 min. Po každé analýze následoval výplach kolony (100% acetonitrilem, 1 min) a její ekvilibrace (1,5 min). Eluent za kolonou obsahující BuLIN (retenční čas

5,05 min) byl odebrán, vysušen do sucha a použit pro MS analýzu, která přítomnost 4'-butyl-4'depropyllinkomycinu ve vzorku potvrdila.

Příklad 5

Pro analýzu 4'-pentyl-4'-depropylIinkomycinu (dále PeLIN) byl použit Acquity UPLC systém (Waters, Milford, Massachusetts) s 2996 PDA detektorem nastaveným na 194 nm. Výsledky byly zpracovány pomocí počítačového programu Em power 2 (Waters). Supematant kultivačního média byl přečištěn pomocí SPE Oasis HLB 3cc extrakčních kolonek. Vzorek (4 ml) byl nanesen na kolonku předem kondicionovanou a ekvilibrovanou methanolem (3 ml) a vodou (3 ml). Část matrice vzorku byla vymyta vodou (3 ml) a 10% methanolem (v/v, 1 ml). Frakce obsahující deriváty linkomycinu byly vymyty 80% methanolem (v/v, lml), odpařeny do sucha a znovu rozpuštěny ve 200 μΙ methanolu. Vzorky byly analyzovány na chromatografické koloně BEH Cl 8 column (50 x 2,1 mm, průměr částic 1,7 μιη, Waters); mobilní fáze byla složena ze složky A,

1 mmol/1 mravenčan amonný (pH 9,0), a složky B, acetonitril; lineární gradientova eluce min/%

B: 0/5, 10/52,5; průtoková rychlost: 0,4 mi min“¹, teplota kolony: 35 °C, rychlost sběru dat: 20 pts-s dávkovaný objem: 5 μΐ, čas analýzy: 3,5 min. Po každé analýze následoval výplach kolony (100% aceton itr i lem, 1 min) a její ekvilibrace (1,5 min). Eluent za kolonou obsahující PeLIN (retenční čas 7,10 min) byl odebrán, vysušen do sucha a použit pro MS analýzu, která přítomnost 4'-penty 1-4'-depropyllinkomycinu ve vzorku potvrdila.

Příklad 6

Pro získání kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 defektního vbiosyntéze propylprolinu a v závěrečné methylaci N-demethyllinkomycinu byla současně provedena inaktivace genů ImbX a ImbJ za použití křtu pro cílenou mutagenezi streptomycet (REDÍRECT PCR targeting systém, Proč Nati. Acad Sci USA. 100(4), 1541-1546, 2003). V kosmidu LK6 nesoucím celý Imb shluk byl gen ImbX nahrazen inaktivační kazetou aac(3)IV/oriT kódující rezistencí k apramycinu (50 mg/L). Tato inaktivační kazeta byla vytvořena PCR reakcí s pomocí primerů Xf a Xr (tab. 2.) obsahujících homologní úseky okolí genu ImbX. Jako templát byl použít 1383 pb fragment vzniklý štěpením plazmidu pIJ773 restrikěními enzymy EcoRl a HindlII. Další gen ImbJ byl nahrazen ve stejném kosmidu kazetou vph. kódující rezistenci k viomycinu (30 mg/L). Tato inaktivační kazeta byla vytvořena PCR reakcí s pomocí primerů Jf a Jr obsahujících homo-5 CZ 302256 B6 logní úseky okolí genu ImbJ. Jako templát byl použít 1622 bp fragment vzniklý štěpením plazmidu plJ781 restrikčními enzymy EcoRl a HindlII. Kmen E. coli BW251 13 obsahující kosmid LK6 a ptazmid pIJ790 s geny potřebnými pro rckombinaci byl postupně transformován inaktivačními kazetami. Kazety byly rekombinačně integrovány do kosmidu LK6 výměnou za geny ImbX a ImbJ. Takto připravený kosmid byl konjugačně vnesen do kmene S. lincolnensis ATCC 25466. Klony S.lincolnensis obsahující kazety byly selektovány na rezistenci k apramycínu a víomycinu. Pro eliminaci vlivu inaktivačních kazet na transkripci genů ve stejné transkripční jednotce bylo provedeno vy štěpení kazet pomocí FLP rekombinázy, kódované gene neseným na plazmidu pBT340, FLP rekombínáza odstranila centrální Části inaktivačních kazet a zanechala 81 bp dlouhé úseky DNA - Jizvy“. Mutovaný kosmid sjizvami byl pak vnesen do buněk streptomycetového kmene, který měl již geny ImbX a J nahrazeny za inaktívační kazety. Homologní rekombinací se inaktívační kazety vyměnily za jizvy. Kultivační, selekční a transformační podmínky byly shodné s podmínkami uvedenými v příkladu 1.

Průmyslová využitelnost

Nově připravené deriváty línkomycinových antibiotik jsou využitelné pro vývoj nových účinných látek proti infekcím patogenních mikroorganismů. Tedy ve farmaceutickém průmyslu, lékařství.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu, vyznačující se tím, že pro kultivaci je použit kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbJ a/nebo alespoň jeden gen ze skupiny genů Imb tvořené geny ImbA, Bl, B2, W, X a Y kódujícími biosyntézu 4 L propylprolinu, přičemž v případě blokace bíosyntézy 4-L-propylprolinu, musí být do kultivačního média za 4—L-propylprolin dodána náhrada.
2. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro kultivaci je použit kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbX.
3. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro kultivaci je použit kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbJ.
4. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jako náhrada za 4-L-propylprolin je do média přidáván derivát prolinu.
5. Použití kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbJ a/nebo alespoň jeden gen ze skupiny genů Imb tvořené geny ImbA, Bl, B2, W, X a Y kódujícími biosyntézu 4-L-propylprolinu, pro biotechnologickou přípravu biologicky aktivnějších derivátů linkomycinu.
6. Použití podle nároku 5 kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbX.