CZ302256B6 - Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu - Google Patents
Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ302256B6 CZ302256B6 CZ20090277A CZ2009277A CZ302256B6 CZ 302256 B6 CZ302256 B6 CZ 302256B6 CZ 20090277 A CZ20090277 A CZ 20090277A CZ 2009277 A CZ2009277 A CZ 2009277A CZ 302256 B6 CZ302256 B6 CZ 302256B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- lincomycin
- biosynthesis
- strain
- propylproline
- Prior art date
Links
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical class CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 30
- 241000187399 Streptomyces lincolnensis Species 0.000 claims abstract description 22
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 11
- DQHUOKOFSXEEAW-MLWJPKLSSA-N (2s)-4-propylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CCCC1CN[C@H](C(O)=O)C1 DQHUOKOFSXEEAW-MLWJPKLSSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- CYXLHZVPLXEUPP-ZETCQYMHSA-N (2s)-1-propylpyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound CCCN1CCC[C@H]1C(O)=O CYXLHZVPLXEUPP-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 20
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 16
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 9
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 8
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 6
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 4
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 3
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 3
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 241001013691 Escherichia coli BW25113 Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 2
- OZKXLOZHHUHGNV-UHFFFAOYSA-N Viomycin Natural products NCCCC(N)CC(=O)NC1CNC(=O)C(=CNC(=O)N)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC1=O)C2CC(O)NC(=N)N2 OZKXLOZHHUHGNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010015940 Viomycin Proteins 0.000 description 2
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- GXFAIFRPOKBQRV-GHXCTMGLSA-N viomycin Chemical compound N1C(=O)\C(=C\NC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCCN)CNC(=O)[C@@H]1[C@@H]1NC(=N)N[C@@H](O)C1 GXFAIFRPOKBQRV-GHXCTMGLSA-N 0.000 description 2
- 229950001272 viomycin Drugs 0.000 description 2
- SMZHNCMPICENER-MQWKRIRWSA-N (2s)-4-butylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CCCCC1CN[C@H](C(O)=O)C1 SMZHNCMPICENER-MQWKRIRWSA-N 0.000 description 1
- SWBGPJIGJIFMFZ-GKAPJAKFSA-N (2s)-4-pentylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CCCCCC1CN[C@H](C(O)=O)C1 SWBGPJIGJIFMFZ-GKAPJAKFSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 101710151325 B2 protein Proteins 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010065885 aminoglycoside N(3')-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 244000000059 gram-positive pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Deriváty linkomycinu jsou pripravovány biotechnologickou kultivací Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen lmbJ a/nebo alespon jeden gen ze skupiny genu lmb tvorené geny lmbA, B1, B2, W, X a Y kódujícími biosyntézu 4-L-propylprolinu. V prípade zablokování biosyntézy 4-L-propylprolinu musí být do kultivacního média dodávána náhrada za tento meziprodukt. Biosyntézou tak vznikají nové, biologicky úcinné deriváty linkomycinu.
Description
Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu
Oblast techniky
Vynález se týká využití mutantních kmenů producentů linkomycinu defektních vbiosyntéze linkomycinu k výrobě hybridních látek na bázi linkosamidových antibiotik.
to Dosavadní stav techniky
V poslední době vzhledem k vysokému počtu patogenních mikroorganismů, rezistentních ke známým antimikrobiálním látkám narůstá zájem o výzkum a vývoj nových, účinných antibiotik. Jednou z možností vedoucí ke vzniku mnoha potenciálně účinných látek je kombinatomí bio15 syntéza. Tímto způsobem lze pomocí genetické úpravy již známých genů, kódujících biosyntézu účinných látek nebo celých shluků genů získat mikroorganismus, produkující sloučeniny s novou strukturou a novými vlastnostmi. Jednou z takových to biologicky účinných látek je linkomycin a jeho deriváty. Linkomycin je metabolit produkovaný různými druhy aktinomycet včetně kmenu Streptomyces lincolnensis a je využíván k léčbě infekcí způsobených grampozitivními patogeny.
Klindamycin je nejznámějším semisyntetickým derivátem linkomycinu, připravovaným z linkomycinu jeho chlorací. Antimikrobiální spektrum klindamycinu a jeho derivátů je rozšířeno o grampozitivní anaerobní bakterie a původce malárie Plasmodium falciparum, Ostatní deriváty linkomycinu byly připraveny převážně chemicky. Zároveň byly prováděny obohacovací pokusy kmenu S.lincolnensis na principu přidávání různých prekurzorů do kultivačního media vedoucí ke vzniku nových látek na bázi linkomycinu. Nové látky byly testovány in vitro a in vivo vůči různým patogenním mikroorganizmům.
V biosyntéze linkomycinu dochází k oddělené syntéze dvou prekurzorů 4-L- propylproiinu (dále PPL) a methylthiolinkosamidu (MTL), které jsou kondenzací spojeny na N—demethyl linkomycin (NDL) a ten je dále methylován na výsledný linkomycin.
V roce 1995 byla publikována sekvence shluku genů kódujících proteiny pro biosyntézu linkomycinu v nadprodukčním kmenu - Imb shluk. Tento shluk obsahuje geny pro biosyntézu obou prekurzorů, geny pro kondenzační reakci, regulační geny a geny pro rezistenci k antibiotiku.
Nedávno byla publikována sekvence linkomycinového shluku pro typový kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466.
Ke dnešnímu dni byla experimentálně prokázána a publikována pouze funkce proteinů LmbBl a B2 zodpovědných za první kroky biosyntézy PPL části molekuly. Funkce ostatních genů jsou buď neznámé, nebo byly navrženy na základě homologií s jinými geny z databáze BLAST.
Podstata vynálezu
Pro přípravu nových látek na bázi linkosamidových antibiotik lze využít soubor kmenů producentů linkomycinu defektních v jednom či více krocích v biosyntéze.
Pro tyto účely byly provedeny v typovém kmenu Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 mutace určitých genů pro biosyntézu linkomycinu. Byl vytvořen soubor kmenů S.lincolnensis defektních v biosyntéze PPL (geny ImbA, Bl, B2, W, Y, Y) a závěrečné methylaci (gen ImbJ).
Takto připravené kmeny jsou určeny k dalšímu testování na produkci nových látek a to i v závislosti na zvolených kultivačních podmínkách. Podle toho co kóduje konkrétní gen, který byl přípravou kmene zablokován, je do kultivačního média potřeba přidávat komponenty, které jsou schopny toto nahradit, což jsou deriváty linkomycinových prekurzorů. Biosyntéza tak není
-1 CZ 302256 Β6 zablokována a probíhá za vzniku naprosto nových látek, biologicky aktivních derivátů linkomycinu.
V těchto kmenech je biosyntéza linkomycínu kódována Imb shlukem, který obsahuje geny ImbA, Bl, B2, Ηζ X, Y kódující proteiny pro tvorbu prekurzoru 4-L-propylprolinu a gen ImbJ^ kódující závěrečnou methylaci N-demethyllinkomycinu.
Po zablokování tvorby 4-L-propylprolinu lze do kultivačního média přidávat jiný derivát prolinu, který bude mikroorganismus schopen v biosyntéze využít, a 4-L-propylprolin jím nahradit.
Po zablokování závěrečné methylace inaktivací /móJgenu je biotechnologickou kultivací Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 získán N-demethylIÍnkomycin, který je využitelný jako výchozí látka pro přípravu biologicky aktivnějších derivátů linkomycínu, například chlorací vzniká N-demethyiklindamycin.
Biotechnologickou kultivací kmenů Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, které mají současně inaktivován gen ImbJ a alespoň jeden gen ze shluku Imb kódující biosyntézu 4-L-propylprolinu a současným přídavkem prolinových derivátů do kultivačního média, jsou připravovány deriváty linkomycínu. Ty jsou dále využitelné pro přípravu aktivnějších chlorovaných derivátů na bázi klindamycinu.
Tímto způsobem lze připravit celou řadu nových derivátů linkomycínu aniž by se musely připravovat synteticky.
Přehled obrázků
Obr. 1: Primery pro syntézu inaktivačních kazet
Obr. 2: Chromatogram analýzy UPLC, detekovány jsou píky 4'-butyl-4'-depropyllinkomycÍnu a
4'-pentyl-4'-depropyllinkomycinu
Obr. 3: Struktura linkomycínu
Obr. 4: Seznam použitých kmenů E.coli včetně obsaženého plasmidu a antibiotika přítomného v jeho kultivačním médiu případně potřebná kultivační teplota
Obr. 5: Seznam použitých antibiotik včetně jejich používané zkratky a koncentrace v kultivačních médiích
Obr. 6 Seznam použitých médií včetně jejich složení
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Pro získání kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 defektního v biosyntéze linkomycínu byla provedena inaktivace jednoho z genu účastnícího se syntézy propylprolinu za použití kitu pro cílenou mutagenezi streptomycet (REDIRECT PCR targeting systém, Proč Nati Acad Sci USA. 100(4), 1541-1546,2003).
Kosmid LK6, který je uchováván v £. coli BW25113/pIJ790, pochází ze Stereptomyces lincolnensis a nese celý Imb shluk. V tomto kmeni byl gen ImbX nahrazen inaktivační kazetou
- 2 CZ 302256 B6 aac(3)JV/oriT kódující rezistenci kapramycinu. Tato inaktivační kazeta byla vytvořena PCR reakcí s pomocí primerů Xf a Xr obsahujících homologní úseky okolí genu ImbX. Jako temp lát byl použit 1383 bp fragment vzniklý štěpením plazmidu píJ773 restrikčními enzymy EcoRI a HindlII. Kmen E. coli BW25113 obsahující kosmid LK6 a plazmid pIJ790 sgeny potřebnými pro rekombinaci byl elektroporačně transformován inaktivační kazetou a selektován na rezistenci kapramycinu (50 mg/L), kanamycinu (50 mg/L) a karbenicilinu (100 mg/L) na LB médiu. Kazeta byla rekombinantně integrována do kosmidu LK6 výměnou za gen ImbX.
Takto připravený kosmid byl konjugačně vnesen do kmene 5. lincoinensis ATCC 25466 podle protokolu KieserT., Bibb M. J., Bittner, M. J., Cháter K. F., Hopwood D. A.: Practical Streptomyces genetics, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich, Fngland. (2000) Transformace 5. lincoinensis plasmidovou DNA mezidruhovou konjugací s E. coli
Kompetentní buňky E. coli ET12567/pUZ8002 byly elektroporací transformovány kosmidem pLK6 s inaktivační kazetou a selektovány na LB médiu s apramycinem (50 pg/ml) a kabemicilinem (100 pg/ml). Jedna z kolonií byla zaočkována do 10 ml LB média obsahujícího apramycin (50 pg/ml), chloramfenikol (25 pg/ml) a kanamycin (50 pg/ml) a kultivována přes noc. 100 μΐ přes noc narostlé kultury bylo přeočkováno do 10 ml čerstvého LB média obsahujícího apramycin (50 pg/ml), chloramfenikol (25 pg/ml) a kanamycin (50 pg/ml) a inkubováno na třepačce do dosažení OD6oo = 0,4 (cca 4 h). Antibiotika byly z kultury odstraněna dvojnásobným promytím buněk 10 ml LB média centrifugací (1000 g, 10 min, 20 °C) a buňky byly poté resuspendovány v 1 ml LB média.
K 10 μΙ sporové suspenze Streptomyces lincoinensis (108 cfu) bylo přidáno 500 μΐ 2 x YT média a spory byly podrobeny tepelnému šoku v 50 °C po dobu 10 min a ochlazeny na laboratorní teplotu.
0,5 ml suspenze buněk E. coli ET12567/pUZ8002 bylo smícháno s 0,5 ml sporové suspenze Streptomyces lincoinensis a centrifugováno (10 000 g, 5 s, 20 °C). Sediment byl resuspendován v 50 μΐ reziduálního média. Ze suspenze byla připravena ředící řada od 10 1 do 10 4 (suspenze byla ředěna sterilní destilovanou H2O). 100 μΙ každého ředění bylo vyseto na MS agar s 10 mmol/1 MgCL bez selekce a inkubováno ve 30 °C. Po 16 až 20 h byla každá miska o průměru 8 cm rovnoměrně přelita 1 ml sterilní destilované H2O obsahující 0,5 mg kyseliny nalidixové a 1,25 mg apramycinu a dále inkubována při 30 °C 3 až 5 dnů.
Klony S.lincoinensis obsahující inaktivační kazetu ve své DNA byly selektovány na rezistenci k apramycinu (50 mg/L) nejdříve na MS agaru, pak na DNA agaru.
Pro eliminaci vlivu inaktivační kazety na transkripci genů ve stejné transkripění jednotce bylo v kmenu E.coli DH5a provedeno v kosmidu LK6 vyštěpení kazety pomocí FLP rekombinázy, kódované genem neseným na plazmidu pBT340. FLP rekombináza odstranila centrální část inaktivační kazety a na jejím místě zanechala 81 bp dlouhý úsek DNA - Jizvu“ (teplota nutná pro indukci exprese rekombinázy je 42 °C, buňky E.coli DH5a s plazmidem BT340 a kosmidem LK6 byly proto pěstovány při této teplotě).
Mutovaný kosmid s jizvou byl pak vnesen transformací protoplastů podle protokolu Jandová Z., Tichý P,; Transformation of Streptomyqces lincoinensis protoplasts with plasmid vectors, in Folia Microbiol (Praha), 37(3), 181-7.(1992) do buněk streptomycetového kmene, které mělyjiž funkční gen ImbX nahrazen za inaktivační kazetu.
-3 CZ 302256 B6
Příprava protoplastů S. Hncolnensis
Inokulum bylo připraveno zaočkováním 50 ml YEME média s 10% saeharózou a 5 mmol/l MgCL sporami kmene Streptomyces lincolnensis s inaktivační kazetou ze šikmého agaru a inku5 bací na třepačce při 30 °C po dobu 24 h. Poté byl I ml ínokula přeočkován do čerstvého YEME média s 10% saeharózou, 5 mmol/l MgCL a 0,5% glycinem a kultura byla inkubována na třepačce při 28 °C po dobu 16 až 17 hod. Buňky byly sklizeny centrifugací (10 min, 12 °C, 6000 g), dvakrát promyty 15 ml P pufru za týchž podmínek a resuspendovány v 10 ml P pufru s lyzozymem (2 mg/mt). Suspenze buněk byla inkubována při 30 °C s občasným promícháním, to Tvorba protoplastů byla sledována mikroskopicky. Zbytky mycelia byly odstraněny centrifugací (10 min, 20 °C, 1 000 g). Protoplasty byly přefiltrovány přes sterilní vatový filtr, centrifugovány (10 min, 20 °C, 3000 g) a dvakrát promyty P pufrem za týchž podmínek. Nakonec byly sedimentované protoplasty resuspendovány ve 200 μΙ P pufru a ihned použity pro transformaci.
Transformace protoplastů 5. lincolnensis
500 ng v objemu 5 μΐ plazmidové DNA mutovaného kosmidu s jizvou bylo smícháno s 5 μΐ 50% sacharózy a ke směsi bylo přidáno 100 μΐ suspenze protoplastů. Po promíchání bylo k suspenzi přidáno 200 μΐ T pufru, suspenze protoplastů byla opět promíchána a ihned vyseta na R2YE agar.
2o Po 16 hodinách inkubace při 30 °C byly obě misky přelity 2 ml vodného roztoku kanamycinu o koncentraci 200 pg/ml R2YE agaru a inkubována při 30 °C po dalších 7 10 dnů.
Homologní rekombinací se inaktivační kazety vyměnila za jizvu. Dvojité rekombinanty získaného kmene Streptomyces lincolnensis SlmbX\yy\y selektovány na ztrátu apramycinové rezistence.
Buňky li. coli byly kultivovány v tekutých nebo na pevných médiích (LB, SOC) při 37 °C. Kmen BW25113/LK6/pIJ790 byl kultivován při 30 °C. Po transformaci kazetou daný kmen byl pěstován při 37 °C. Kmen DH5a obsahující plazmid pBT340 byl pěstován při 30 °C. Tekuté kultury byly inkubovány na rotační třepačce při 200 RPM.
5«
Buňky Streptomyces lincolnensis byly kultivovány v tekutých nebo na pevných médiích (R2YE, MS, DNA, YT) při 28 až 30 °C. Tekuté kultury byly inkubovány na rotační třepačce při 230 RPM a byly zakládány v Erlenmayerových buňkách o objemu 500 ml, které byly opatřeny vlisy pro zabránění tvorby shluků mycelia. Pro selekci buněk nesoucích vektor byla do kultívač35 nich médií přidána odpovídající antibiotika.
Příklad 2
Kmen Streptomyces lincolnensis SlmbX defektní v biosyntéze PPL byl v koncentraci 108 spor naočkován do 50 ml inokulačního média YEME a kultivován 30 hod při 28 °C. Poté bylo do 20 ml produkčního média AVM s přídavkem 4-L-butylprolinu (100 mg/l) naočkováno 5 % inokulační kultury. Kultivace trvala 120 hod při 28 °C. Po jejím ukončení byla kultivační kapalina od narostlé kultury oddělena centrifugací a získaný supematant byl použit pro analýzu pro stano45 vení produkovaného derivátu linkomycinu - 4 -butyl—4'-depropyl linkomycinu.
Příklad 3
Kmen Streptomyces lincolnensis \lmbX defektní v biosyntéze PPL byl v koncentraci 108 spor naočkován do 50 ml inokulačního média YEME a kultivován 30 hod při 28 °C. Poté bylo do 20 ml produkčního média AVM s přídavkem 4—L-pentylprolinu (100 mg/l) naočkováno 5% inokulační kultury. Kultivace trvala 120 hod při 28 °C. Po jejím ukončení byla kultivační kapali-4 CZ 302256 B6 na od narostlé kultury oddělena centrifugací a získaný supematant byl použit na analýzu pro stanovení produkovaného derivátu linkomycinu - 4'-pentyM'-depropyllinkomycinu.
Příklad 4
Pro analýzu 4'-butyM'-depropyl linkomycinu (dále BuLIN) byl použit Acquity UPLC systém (Waters, Milford, Massachusetts) s 2996 PDA detektorem nastaveným na 194 nm. Výsledky byly zpracovány pomocí počítačového programu Empower 2 (Waters). Supematant kultivačního i» média byl přečištěn pomocí SPE Oasis HLB 3cc extrakčních kolonek. Vzorek (4 ml) byl nanesen na kolonku předem kondicionovanou a ekvilibrovanou methanolem (3 ml) a vodou (3 ml). Část matrice vzorku byla vymyta vodou (3 ml) a 10% methanolem (v/v, 1 ml). Frakce obsahující deriváty linkomycinu byly vymyty 80% methanolem (v/v, lml), odpařeny do sucha a znovu rozpuštěny ve 200 μΐ methanolu. Vzorky byly analyzovány na chromatografické koloně BEH Cl8 column (50 x 2,1 mm, průměr částic 1,7 pm, Waters); mobilní fáze byla složena ze složky A, 1 mmol/1 mravenčan amonný (pH 9,0), a složky B, acetonitril; izokratická eluce (24 % B); průtoková rychlost; 0,4 mi min1, teplota kolony; 35 °C, rychlost sběru dat: 20 pts s dávkovaný objem: 5 μΙ, čas analýzy: 3,5 min. Po každé analýze následoval výplach kolony (100% acetonitrilem, 1 min) a její ekvilibrace (1,5 min). Eluent za kolonou obsahující BuLIN (retenční čas
5,05 min) byl odebrán, vysušen do sucha a použit pro MS analýzu, která přítomnost 4'-butyl-4'depropyllinkomycinu ve vzorku potvrdila.
Příklad 5
Pro analýzu 4'-pentyl-4'-depropylIinkomycinu (dále PeLIN) byl použit Acquity UPLC systém (Waters, Milford, Massachusetts) s 2996 PDA detektorem nastaveným na 194 nm. Výsledky byly zpracovány pomocí počítačového programu Em power 2 (Waters). Supematant kultivačního média byl přečištěn pomocí SPE Oasis HLB 3cc extrakčních kolonek. Vzorek (4 ml) byl nanesen na kolonku předem kondicionovanou a ekvilibrovanou methanolem (3 ml) a vodou (3 ml). Část matrice vzorku byla vymyta vodou (3 ml) a 10% methanolem (v/v, 1 ml). Frakce obsahující deriváty linkomycinu byly vymyty 80% methanolem (v/v, lml), odpařeny do sucha a znovu rozpuštěny ve 200 μΙ methanolu. Vzorky byly analyzovány na chromatografické koloně BEH Cl 8 column (50 x 2,1 mm, průměr částic 1,7 μιη, Waters); mobilní fáze byla složena ze složky A,
1 mmol/1 mravenčan amonný (pH 9,0), a složky B, acetonitril; lineární gradientova eluce min/%
B: 0/5, 10/52,5; průtoková rychlost: 0,4 mi min“1, teplota kolony: 35 °C, rychlost sběru dat: 20 pts-s dávkovaný objem: 5 μΐ, čas analýzy: 3,5 min. Po každé analýze následoval výplach kolony (100% aceton itr i lem, 1 min) a její ekvilibrace (1,5 min). Eluent za kolonou obsahující PeLIN (retenční čas 7,10 min) byl odebrán, vysušen do sucha a použit pro MS analýzu, která přítomnost 4'-penty 1-4'-depropyllinkomycinu ve vzorku potvrdila.
Příklad 6
Pro získání kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 defektního vbiosyntéze propylprolinu a v závěrečné methylaci N-demethyllinkomycinu byla současně provedena inaktivace genů ImbX a ImbJ za použití křtu pro cílenou mutagenezi streptomycet (REDÍRECT PCR targeting systém, Proč Nati. Acad Sci USA. 100(4), 1541-1546, 2003). V kosmidu LK6 nesoucím celý Imb shluk byl gen ImbX nahrazen inaktivační kazetou aac(3)IV/oriT kódující rezistencí k apramycinu (50 mg/L). Tato inaktivační kazeta byla vytvořena PCR reakcí s pomocí primerů Xf a Xr (tab. 2.) obsahujících homologní úseky okolí genu ImbX. Jako templát byl použít 1383 pb fragment vzniklý štěpením plazmidu pIJ773 restrikěními enzymy EcoRl a HindlII. Další gen ImbJ byl nahrazen ve stejném kosmidu kazetou vph. kódující rezistenci k viomycinu (30 mg/L). Tato inaktivační kazeta byla vytvořena PCR reakcí s pomocí primerů Jf a Jr obsahujících homo-5 CZ 302256 B6 logní úseky okolí genu ImbJ. Jako templát byl použít 1622 bp fragment vzniklý štěpením plazmidu plJ781 restrikčními enzymy EcoRl a HindlII. Kmen E. coli BW251 13 obsahující kosmid LK6 a ptazmid pIJ790 s geny potřebnými pro rckombinaci byl postupně transformován inaktivačními kazetami. Kazety byly rekombinačně integrovány do kosmidu LK6 výměnou za geny ImbX a ImbJ. Takto připravený kosmid byl konjugačně vnesen do kmene S. lincolnensis ATCC 25466. Klony S.lincolnensis obsahující kazety byly selektovány na rezistenci k apramycínu a víomycinu. Pro eliminaci vlivu inaktivačních kazet na transkripci genů ve stejné transkripční jednotce bylo provedeno vy štěpení kazet pomocí FLP rekombinázy, kódované gene neseným na plazmidu pBT340, FLP rekombínáza odstranila centrální Části inaktivačních kazet a zanechala 81 bp dlouhé úseky DNA - Jizvy“. Mutovaný kosmid sjizvami byl pak vnesen do buněk streptomycetového kmene, který měl již geny ImbX a J nahrazeny za inaktívační kazety. Homologní rekombinací se inaktívační kazety vyměnily za jizvy. Kultivační, selekční a transformační podmínky byly shodné s podmínkami uvedenými v příkladu 1.
Průmyslová využitelnost
Nově připravené deriváty línkomycinových antibiotik jsou využitelné pro vývoj nových účinných látek proti infekcím patogenních mikroorganismů. Tedy ve farmaceutickém průmyslu, lékařství.
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu, vyznačující se tím, že pro kultivaci je použit kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbJ a/nebo alespoň jeden gen ze skupiny genů Imb tvořené geny ImbA, Bl, B2, W, X a Y kódujícími biosyntézu 4 L propylprolinu, přičemž v případě blokace bíosyntézy 4-L-propylprolinu, musí být do kultivačního média za 4—L-propylprolin dodána náhrada.
- 2. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro kultivaci je použit kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbX.
- 3. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro kultivaci je použit kmen Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbJ.
- 4. Způsob biotechnologické přípravy derivátů linkomycinu podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jako náhrada za 4-L-propylprolin je do média přidáván derivát prolinu.
- 5. Použití kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbJ a/nebo alespoň jeden gen ze skupiny genů Imb tvořené geny ImbA, Bl, B2, W, X a Y kódujícími biosyntézu 4-L-propylprolinu, pro biotechnologickou přípravu biologicky aktivnějších derivátů linkomycinu.
- 6. Použití podle nároku 5 kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466, který má inaktivovaný gen ImbX.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090277A CZ302256B6 (cs) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu |
| PCT/CZ2010/000057 WO2010127645A2 (en) | 2009-05-04 | 2010-05-04 | The method of biotechnological preparation of lincomycin derivatives and its using |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090277A CZ302256B6 (cs) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2009277A3 CZ2009277A3 (cs) | 2010-11-18 |
| CZ302256B6 true CZ302256B6 (cs) | 2011-01-12 |
Family
ID=43050536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20090277A CZ302256B6 (cs) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ302256B6 (cs) |
| WO (1) | WO2010127645A2 (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105566411B (zh) | 2014-11-07 | 2020-11-13 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 林可霉素生物合成中间产物及其制法和用途 |
| CZ307305B6 (cs) | 2017-03-10 | 2018-05-23 | Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i. | Linkosamidy, jejich příprava a použití |
| CN107881190B (zh) * | 2017-11-15 | 2021-02-09 | 安徽大学 | 通过改造林可链霉菌slcg_2919基因提高林可霉素产量的方法 |
| CN111117942B (zh) * | 2020-01-16 | 2021-05-25 | 华东理工大学 | 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN114540212B (zh) * | 2020-11-26 | 2023-11-03 | 浙江珲达生物科技有限公司 | 一种链霉菌及其发酵产来普霉素b的方法 |
| CN119799607B (zh) * | 2025-01-07 | 2025-07-22 | 合肥师范学院 | 通过改造林可链霉菌slcg_3904基因提高林可霉素产量的方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3674647A (en) * | 1970-10-07 | 1972-07-04 | Upjohn Co | Preparation of lincomycin analogues |
-
2009
- 2009-05-04 CZ CZ20090277A patent/CZ302256B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-05-04 WO PCT/CZ2010/000057 patent/WO2010127645A2/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3674647A (en) * | 1970-10-07 | 1972-07-04 | Upjohn Co | Preparation of lincomycin analogues |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Hola a kol. (2003) Lett. Appl. Microbiol. 36, 470-474 * |
| Koberska a kol. (2008) Folia Microbiol. 53, 395-401 * |
| Mason a Lewis (1964) Antimicrob. Agents Chemother. 10, 7-12 * |
| Spi×ek a Rezanka (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 63, 510-519 * |
| Ulanova a kol. (2010) Antimicrob. Agents Chemother. 54, 927-930 * |
| Ye a kol. (2009) Bioprocess Biosyst. Eng. 32, 521-529 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010127645A2 (en) | 2010-11-11 |
| WO2010127645A3 (en) | 2011-01-20 |
| CZ2009277A3 (cs) | 2010-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhou et al. | Genome mining‐directed activation of a silent angucycline biosynthetic gene cluster in Streptomyces chattanoogensis | |
| Ito et al. | Deciphering pactamycin biosynthesis and engineered production of new pactamycin analogues | |
| CN102219815B (zh) | 六种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 | |
| CZ302256B6 (cs) | Zpusob biotechnologické prípravy derivátu linkomycinu | |
| CN110218244B (zh) | 化合物ilamycin F及其应用 | |
| Wang et al. | Morphology engineering of Streptomyces coelicolor M145 by sub-inhibitory concentrations of antibiotics | |
| Song et al. | Cytochrome P450-mediated hydroxylation is required for polyketide macrolactonization in stambomycin biosynthesis | |
| Li et al. | Mining of a streptothricin gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0356 genome via heterologous expression | |
| Jung et al. | Bioconversion of 12-, 14-, and 16-membered ring aglycones to glycosylated macrolides in an engineered strain of Streptomyces venezuelae | |
| Wu et al. | Improving gentamicin B and gentamicin C1a production by engineering the glycosyltransferases that transfer primary metabolites into secondary metabolites biosynthesis | |
| Jian et al. | Glycodiversification of gentamicins through in vivo glycosyltransferase swapping enabled the creation of novel hybrid aminoglycoside antibiotics with potent activity and low ototoxicity | |
| Hu et al. | 1.07-Bacterial Type II Polyketide Synthases | |
| CN103215281A (zh) | 一种格瑞克霉素和p-1894b的生物合成基因簇及其应用 | |
| WO2019029408A1 (zh) | 曲张链丝菌素衍生物及其制备方法和应用 | |
| WO2025026019A1 (zh) | 大环内酯类化合物PA-46101s C-E的制备及其应用 | |
| EP2154150B1 (en) | Genes for biosynthesis of tetracycline compounds and uses thereof | |
| Limbrick et al. | Methyltransferase contingencies in the pathway of everninomicin D antibiotics and analogues | |
| Park et al. | BAC cloning and heterologous expression of a giant biosynthetic gene cluster encoding antifungal neotetrafibricin in streptomyces rubrisoli | |
| Anzai et al. | Production of rosamicin derivatives in Micromonospora rosaria by introduction of d-mycinose biosynthetic gene with Φ C31-derived integration vector pSET152 | |
| Heide et al. | Combinatorial biosynthesis, metabolic engineering and mutasynthesis for the generation of new aminocoumarin antibiotics | |
| Ni et al. | Construction of kanamycin B overproducing strain by genetic engineering of Streptomyces tenebrarius | |
| Tao et al. | Functional characterization of tlmH in Streptoalloteichus hindustanus E465-94 ATCC 31158 unveiling new insight into tallysomycin biosynthesis and affording a novel bleomycin analog | |
| CN100387609C (zh) | 新角蒽环聚酮类抗生素的制造方法 | |
| CN106432382A (zh) | 一系列新型氨基糖苷类化合物的制备与应用及其高产工程菌的构建方法 | |
| Pan et al. | Production of ramoplanin analogues by genetic engineering of Actinoplanes sp. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190504 |