CZ2007725A3 - Sterilní autologní, allogenní nebo xenogenní implantát a zpusob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Predmetem rešení je sterilní dehydratovaný acelulární implantát, který pri své rehydrataci vodou nebo telními tekutinami projevuje anizotropní expanzi a muže pusobit jako podklad pro adhezi, migraci a rust živých bunek. Kolagenové struktury transplantátu jsou alespon cástecne denaturovány pusobením tepla nebo organických rozpouštedel, jako jsou nižší alifatické alkoholy a ketony, které soucasne pusobí jako konzervacní a sterilizacní cinidla, predevším pro nekteré typy viru. Implantát je sterilizován radiacne, pricemž je v podstate v dehydratovaném stavu, a to prednostne urychlenými elektrony. Transplantát muže být odvozený z ruzných živocišných tkání, predevším savcích tkání, jako napríklad lidských nebo veprových tkání. Tkánemi vhodnými pro vynález mohou být napr. kuže, placenta, osrdecník, pobrišnice, stena streva, šlacha, céva a podobne. Implantát je vhodný pro použití v humánní a veterinární medicíne, napr. jako docasný kryt ran a popálenin, pro opravu, náhradu a regeneraci tkání, a také jako podklad pro laboratorní pestování bunek.

Description

STERILNÍ AUTOLOGNÍ, ALLOGENNÍ NEBO XENOGENNÍ IMPLANTÁT

A ZPŮSOB JEHO VÝROBY

Oblast techniky

Vynález se týká hojení ran a regenerace tkání. Konkrétně se týká sterilního dehydratovaného acelulámího implantátu (transplantátu), který při své rehydrataci vodou nebo tělními tekutinami projevuje anizotropní expanzi. Pro produkt tohoto typu se používá název jak implantát, tak i transplantát, podle kontextu a zvyklostí v tom či onom oboru. V předložené přihlášce vynálezu jsou užívány oba termíny podle kontextu; je však nutno mít na paměti, že jsou vzájemně zaměnitelné). Implantát je sterilizován radiačně, přičemž je v podstatě v dehydratovaném stavu, a to přednostně urychlenými elektrony. Implantát může být odvozený z různých živočišných tkání, především savčích tkání, jako například lidských nebo vepřových tkání, jako je např. kůže, placenta, osrdečník, pobřišnice, stěna střeva, šlacha, céva a podobně. Implantát podle vynálezu je vhodný pro použití v humánní a veterinární medicíně, např. jako dočasný kryt ran a popálenin, pro opravu, náhradu a regeneraci tkání, a jako podklad pro laboratorní pěstování buněk.

Dosavadní stav techniky

Transplantace orgánů a tkání se již dlouho běžně provádí u řady indikací. Jednou z dlouho zavedených technik je autotransplantace, při které se vlastní tkáň pacienta (např. kůže, kost, céva nebo tuková tkáň) z jednoho místa použije k náhradě tkáně na místě jiném. To však vždycky není možné a při řadě problémů se musí pacientovi transplantovat orgán (např. srdce, ledvina, rohovka a jiné) z vhodného dárce. Hlavními problémy těchto tak zvaných allotransplantací jsou odmítnutí tkání a v rostoucí míře i nedostatek dárců díky rychle rostoucí poptávce. Proto je snaha nahradit přirozené allotransplantáty různými způsoby. Tak například lze vypěstovat autotransplantáty z buněk pacienta technikami tkáňového inženýrství. Tyto autotransplantáty snadno překonávají immunitní bariéru, mají však některé nevýhody: nutnost odběru tkáně pacienta (biopsie), pracná a nákladná kultivace a dlouhý čas mezi biopsií • ·· · ·· ······ ···· ···· ·· · ··· ······ ·· ·· ·· · · · · · • · · · ♦ · ··· ····· ····· · · ·

-2a aplikací implantátu. Tato technika je běžně používaná u náhrady kůže při popáleninách

3. stupně, zatímco u jiných tkání a orgánů je tato technika dosud spíše experimentální. Tak např. patentové dokumenty US 6,878,383; 6,432,710; 5,858,390; 5,665,372 a 5,660,850 (Boss, Jr. et al.) popisují techniky a prostředky implantace autologních fibroblastů za účelem zbytnění tkání pacienta.

Autotransplantace s uměle vytvořenou epidermální vrstvou kůže se u popálenin využívá již po řadu let. V r. 1979 vyvinuli Rheinwald a Green (Green H, et al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 1979; 76: 5665-8.) metodu sériové kultivace lidských keratinocytů pro autotransplantace. Od r. 1981 jsou autologní kultivované epidermální štěpy používány v USA pro léčbu rozsáhlých popálenin (O’Connor NE, et al., Lancet 1981; 1: 75-8). Nevýhodou metody je dlouhý časový interval potřebný ke kultivaci autologních keratinocytů, dále křehkost kultivátu, nesnadná manipulace, vysoká citlivost na antibiotika, infekci a jiné stresy a nesnadné hodnocení přihojení štěpu (Navsaria HA, et al., Trends in Biotechnology 1995; 15: 91-100). Popsána jsou proto různá zlepšeni teto metody, jako například:

Patent US 4,299,819 (M.G. Eisinger) popisuje modifikovanou léčbu popálenin pomocí štěpů z uměle kultivovaných epidermálních buněk. Patent US 5,716,411 (Orgill et al.) popisuje léčebnou metodu vedoucí k regeneraci kůže po popáleninách a poraněních, používající biosyntetický kryt z matrice kolagenu a glykoaminoglykanů, který dovoluje pronikání buněk a cév z hojící se tkáně na jedné straně, a aplikaci plátu autologních keratinocytů na straně druhé. Zveřejněná přihláška WO 2006/107188 (L. Lurvink et al.) popisuje neporézní polypeptidový film vhodný pro pěstování buněk, a jeho následné použití pro léčení ran a popálenin.Nedávný přehled těchto metod lze nalézt vTISSUE ENGINEERING Vol. 12, No. 9, 2006 Update on Tissue-Engineered Biological Dressings, M. Ehrenreich a Z. Ruszczak.

Nejen autologní, ale také allogenní kultivované epidermální štěpy mají vysoké hojivé účinky na hluboké dermální popáleniny, odběrové plochy, bércové vředy a jiné kožní defekty (Bolivar-Flores J, et al., Bums 1990; 16: 3-8.; Matoušková E, et al., Bums 1993; 19: 118-23).

Úspěšnost zákroku závisí i na výběru dárcovských buněk. P. Brychta et al. v českém patentu č. 282711 popisují kultivovaný epidermální allotransplantát z embryonálních nebo fetálních buněk k léčení kožních defektů a ran, v podstatě podle postupu Reinwalda a Greena ale s allogenními buňkami, které jsou dobře přijímány pacientem.

-βίε také snaha zvýšit mechanickou odolnost a životaschopnost keratinocytů (např. kultivací na syntetickém podkladu) a vyvinout techniky, které by umožnily trvalé přihojení kultivátu na popáleniny 3. stupně. Jako substrát pro kultivaci keratinocytů se používá např. membrána na bázi hyaluronové kyseliny (Laser skin, FIBIA, Itálie), různé typy kolagenní matrice kombinované s fíbroblasty nebo též různé podložky ze syntetických polymerů (např. experimentálně pHEMA na Klinice popáleninové medicíny, FNKV v Praze 10). Pro vyplnění hlubokých popálenin jsou vyvíjeny dermální náhrady jako je Integra (kolagen v kombinaci s glykosaminoglykanchondroitin-6-sulfátem a allogenními fíbroblasty; Integra LifeSciences Corporation, Plainsboro, New Jersey, USA), Dermagraft (polygalaktin osazený dermálními allogenními fíbroblasty; Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA, USA), nebo již zmíněný AlloDerm - zmražená allogenní dermis (LifeCell Corporation, The Woodlands, TX, USA). Všechny tyto dermální náhrady však musí být při druhém kroku (po 2-3 týdenní vaskularizaci) kryty tenkým autologním dermo-epidermálním štěpem, krytí allogenními kultiváty zatím nebylo u popálenin 3. stupně úspěšné.

Jiným řešením problémů allotransplantace je použití tkání či orgánů z jiných živočišných druhů než člověk, tak zvaná xenotransplantace. V tomto případě je potřeba rovněž překonat odmítnutí cizí tkáně immunitním systémem, a rovněž je třeba zabránit možnosti přenosu choroboplodných zárodků, mikroorganismů a virů, z dárce na pacienta. Velká pozornost se věnuje zabránění možnosti přenosu prionu ze zvířete na člověka (např. známá „nemoc šílených krav“). Na druhé straně je výhoda v tom, že zvířecí tkáně a orgány jsou daleko dostupnější než lidské.

Známým příkladem xenotransplantátů jsou prasečí srdeční chlopně použité k náhradě srdečních chlopní lidských. Prasečí chlopně jsou zesítěny glutaraldehydem (např. patent US 4,076, 468, Liotta et al.; Patent US 4,247,292, W.A. Angell), kterým se docílí několik žádoucích výsledků: potlačí se odmítavá reakce organizmu, zvýší se hydrolytická a enzymatická stabilita xenotransplantátů a navíc glutaraldehyd působí jako chemické sterilizační činidlo. Jednou z nevýhod tohoto postupu je změna mechanických vlastností tkáně a v některých případech i dlouhodobé uvolňování toxického glutaraldehydu z nerozpustných póly aldehydů, které se při procesu mohou vytvořit a nedají se odstranit prostou extrakcí.

···· ···· ·· · • ·· ······

-4Značná část transplantátů se používá ve formě tak zvaných „biologických krytů“ na krytí ran a následnou podporu hojení. Podle povahy rány a jiných okolností se používají kryty biologické, syntetické a semi-syntetické. Biologické kryty jsou zpravidla považovány za nejúčinnější. Typickým biologickým krytem pro léčbu např. popálenin je savčí kůže, především pak lidská (allotransplantát) nebo prasečí kůže (xenotransplantát) v různé tloušťce odebíraná z mrtvých jedinců a skladovaná po krátkou dobu za chladu čerstvá nebo i po delší dobu zmrazená. Mnoho zkušeností bylo získáno zejména s xenotransplantáty z prasečí kůže.

„Živé“ kryty ran (tj. nezpracované allotransplantáty a xenotransplanáty obsahující všechny komponenty živé kůže) jsou velmi účinné, ale mají nevýhody v omezené skladovatelnosti a v možnosti přenosu infekcí. Určitá řešení byla navržena v řadě patentů, např. produkty AlloDerm a XenoDerm firmy LifeCell Corp., Texas, USA, založené na metodě kryoprezervace podle patentu US 4,865,871 (S. Livesey at al.). Tímto postupem lze zmrazit a případně lyofilizovat tkáně a buňky, aniž by se poškodila jejich struktura nebo funkčnost.

Další způsob je uchovávání prasečí kůže v glycerinu v přítomnosti dusičnanu stříbrného při pokojové teplotě, jak je popsáno v patentovém dokumentu CN19951010722 (Kai Cao).

Sterilizace prasečí kůže (po předchozím očištění a zpracování uhlovodíky) v roztoku chlornanu sodného či peroxidu vodíku ozářením gamma zářením z Co⁶⁰ je popsáno v dokumentu TW199901117733 (Chang Hong Chi et al).

Jiné metody pro sterilizaci prasečí kůže pro lékařské účely jsou popsány v dokumentu CN19921005926 (Guohui Li et al.), kde se popisuje buďto sterilizace kobaltovýn zářičem v mokrém stavu s následným skladováním při nízkých teplotách, nebo lyofilizace s následným skladováním v glycerinu při teplotě místnosti.

Konzervaci glycerinem doporučuje pro lidskou placentu (amnion) pro allotrasplantace také Deutsches Institut fůr Zeli- und Gewebeersatz gGmbH (Delitzscher St 141, 04129 Leipzig, SRN).

V dokumentu UA 12391U (E.Y. Fistal et al.) se popisuje léčení nekrotizovaných ran po těžkých popáleninách pomocí lyofilizované prasečí kůže.

Biologické kryty na bázi kolagenu pro hojení ran včetně popálenin popisují také patentové dokumenty RU 2 185 179 a RU 2 124 354.

-5Problém sterility a skladovatelnosti je možno zmírnit odstraněním buněk z transplantátu, který se tím stane částečně či úplně acelulární. Jeden z pokusů o řešení lze nalézt v patentovém dokumentu CN200310124306 (Hu Jie) popisujícím xenotransplantát jako biologický kryt na popáleniny a rány. Zvířecí tkáň, jako je kůže, stěna tenkého střeva nebo placenta, se dle zmíněného vynálezu zčásti zbaví buněk pomocí vody a roztoku saponátu, a to na straně, která bude v kontaktu s rannou plochou. Buněčná struktura ostatních částí, jako je epidermis, zůstane zachována. Načež se tkáň zesítí vhodným činidlem, jako je glutaraldehyd, propláchne se a uchovává se v mokrém stavu při teplotách pod 4 °C.

V jiném dokumentu, CN 20051126108 (Dong Qun Lin), se popisuje způsob odstranění buněk ze savčí kůže opakovaným působením 2N až 5N roztoku NaOH následovaným praním v roztoku detergentu a ve vodě.

V dalším dokumnetu, CN20041022506 (Dai Weihua et al.), byl popsán způsob přípravy biodegradabilní acelulární dermis kombinovaným působením enzymů, alkálií a jiných chemických látek.

Zveřejněná přihláška US 20050186286 Al (Yoshihiro Takami) popisuje způsob odstranění buněk ze savčí (např. lidské nebo prasečí) kůže pomocí kombinovaného působení proteolytických enzymů a detergentů , přičemž takto upravená kůže je určena pro použití jako allotransplantát nebo xenotransplanát při léčení popálenin. Sterilizace se provádí následně ponořením acelulární škáry do roztoku azidu.

Podobná acelulární xenodermální matrice je OASIS (výrobce AelsLife) která poskytuje trámčinu pro trojrozměrnou migraci buněk. Tento biologický kryt na rány, který dle výrobce obsahuje důležité nebuněčné sloučeniny a struktury přítomné v živé kůži, je vyroben lyofílizací vepřové dermis po odstranění buněk enzymy a saponáty.

Biosyntetický obvaz E*Z DERM (výrobce Brennen Medical lne.) používá xenograft z vepřové dermis upravený zesítěním kolagenu pomocí aldehydů.

V patentovém dokumentu JP19900247300 (Koide Mikio) se popisuje biologický kryt z matrice z denaturovaného kolagenu vzniklého z acelulární hovězí dermis zesítěním a tepelnou denaturací kolagenových struktur. Tato struktura je dle původce vhodná pro vysetí autologními keratinocyty pro vyšší účinnost hojení.

Dalšími pokusy o řešení byly různé polosyntetické náhražky kůže, např. trámčina z rekonstituovaného hovězího kolagenu osídlená lidskými fibroblasty (e.g., shora uvedená INTEGRA dressing).

Jiným příkladem kombinovaného transplantátu je „rekombinovaná kůže“ (RK) podle českého patentu č. 281176 (E. Matoušková). RK je připravovaná kultivací lidských keratinocytů na bezbuněčné prasečí dermis (Matoušková E, Vogtová D, Konigová R. A recombined skin composed of human keratinocytes cultured on cell-free pig dermis. Bums 1993; 19: 118-23). Na usušené dermis se kultivují lidské keratinocyty a po kultivaci se dermis s vrstvou keratinocytů (tedy RK) od misky odlepí a aplikuje se na ránu. RK se aplikuje keratinocyty směřujícími do rány, dermis vně (vzhůru nohama). Výhodou proti jednoduchým kultivovaným epidermálním štěpům je větší odolnost, uvolnění z misky bez enzymatického působení a snadná manipulace. Výhodou proti kulturám keratinocytů na syntetických podkladech a gelech na bázi kolagenu je konsistence RK podobná kůži a z toho vyplývající vynikající adheze k ráně a hemostatický efekt. Lze vyrábět RK jak s autologními, tak i allogenními keratinocyty. Keratinocyty jsou pěstovány na epidermální straně dermis, t.j. na místě bazální membrány oddělující dermis od epidermis. Autorka zmiňuje možnost sterilizace suché bezbuněčné dermis gamma zářením pro lepší skladovatelnost při pokojové teplotě a zvýšení bezpečnosti. Nevýhodou sterilizace takto upravené dermis pomocí gamma záření je však její částečná degradace a ztráta pevnosti v mokrém stavu.

Podobný kombinovaný biologický kryt popálenin se popisuje v patentovém dokumentu TW20000118374 (Yang Mei-Ru et al.), kde se kombinují živé lidské fibroblasty v acellulámí prasečí dermis s lidskými keratinocyty pěstovanými na straně bazální membrány acelulámi matrice.

Obecný problém, zabraňující podstatnému rozšíření použití těchto biologických materiálů je nemožnost použít rutinní a spolehlivý sterilizační proces. Dalším konkrétním problémem znemožňujícím širší využití uvedených materiálů je jejich omezená nebo obtížná skladovatelnost, a v neposlední řadě též vysoká výrobní cena. Závažným problémem je u dehydratovaných materiálů izotropní botnání při rehydrataci, tj. shodné (relativně) zvětšování všech rozměrů transplantátů při rehydrataci. Řešení výše naznačených problémů přináší předkládaný vynález.

··· · · · · · · · ··· ······ ·· ·· · · ··· · · ··· ··· ··· ····· ····· · · ·

-7Podstata vynálezu

Původci vynálezu zjistili, že pro hojení ran a regeneraci tkání není vždy nutná přítomnost transplantovaných allogenních nebo autoíogních buněk, pokud je přítomen vhodný materiál, který stimuluje, podporuje a řídí množení, diferenciaci a migraci vlastních buněk pacienta. Tímto materiálem je dle předloženého vynálezu speciálně zpracovaná acelulámí kolagenní matrice z autologního, allogenního nebo i xenogenního biologického materiálu. Matrice podle vynálezu se skládá převážně z kolagenu a příbuzných proteinů, jako je elastin, fibrin nebo keratin. Tyto složky matrice a jejich koncentrace se mění v závislosti na původu výchozí tkáně a způsobu zpracování, a budou pro zjednodušení nazývány souhrnným názvem „kolagen“, neboť kolagen tvoří v každém případě hlavní složku matrice. Matrice kromě proteinů („kolagenu“) obsahuje určité množství lipidů a lipoproteinů (až 20 % hmotn.), určité množství cukerných složek (polysacharidů, glykoproteinů a glykoproteoglykanů) a solí. Obsah proteinů je typicky mezi 70 % (hmotn.) a 95 % (hmotn.), přednostně mezi 80 % a 90 % (hmotn.)

Acelulámí matrice podle vynálezu se vyznačuje především tím, ze je v podstatě dehydratovaná a sestává z převážné části z kolagenu, jehož fíbrily jsou v podobném strukturálním uspořádání jako byly ve výchozí tkáni, ale jsou navíc částečně denaturovány a alespoň v dehydratovaném stavu jsou přednostně orientovány v určitém zvoleném směru či směrech. Částečná denaturace je výhodná proto, že zvyšuje odolnost proti biodegradaci, takže fíbrily poskytují více času pro migraci a přichycení buňkám hostitele během hojení. Příliš rychlá degradace implantátu může ponechat zánětlivé ložisko, které se hojí obtížně a případně vede ke zjizvení. Částečná denaturace kolagenních fíbril dále zvyšuje mechanickou pevnost v mokrém stavu.

Orientace kolagenních fíbril také dodává implantátu vyšší pevnost ve zvoleném směru a usměrňuje migraci a šíření buněk podél povrchu implantátu spíše než jejich pronikání dovnitř implantátu. To je dále podporováno tím, ze acelulámí matrice podle vynálezu má přednostně nízkou porozitu v dehydratovaném stavu v porovnání s lyofílizovanými biologickými kryty, které mají zpravidla porozitu vyšší než 75 % (obj.). U implantátu podle vynálezu je porozita nižší než 70 % (obj.), výhodně nižší 60 % (obj.), a ještě výhodnější nižší než 50 % (obj.). Nízká porozita a vhodná orientace fíbril jsou důležité především u implantátů použitých jako biologické kryty při hojení ran, např. popálenin, které se po ·· · ·· ······ ·· ···· ·· · «· ······

-8ukončení hojivého procesu mají samovolně oddělit. Regenerace epidermálni vrstvy vyžaduje migraci keratinocytů z okraje rány do míst hojení, tedy na rozhraní mezi ranou a povrchem implantátu. Pronikání buněk do struktury implantátu by nebylo výhodné, neboť by mohlo způsobit přihojení transplantátu k ráně. Pokud je implantát např. v podkoží, migrace buněk podél jeho povrchu způsobí vytvoření jemného vazivového pouzdra, které jev mnohých případech žádoucí.

Zachování orientace kolagenu v dehydratovaném stavu navíc zmenšuje příčnou tuhost implantátu (příčnou směrem k orientaci fibril), takže i dehydratovaný implantát je ohebnější a méně křehký než podobný implantát anisotropní. To má značnou praktickou výhodnost v tom, ze se dehydratovaný implantát obejde i bez změkčovadel a nevznikají v něm praskliny a mikrotrhliny, které by mohly způsobit nekontrolované pronikání buněk do implantátu, jeho rozpad a případně i jeho kalcifikaci.

Dalším důležitým důsledkem anisotropického uspořádání kolagenních fibril je anisotropie botnání při rehydrataci implantátu. Implantát podle vynálezu při rehydrataci expanduje různě v různých směrech. Tak např. pokud jsou kolagenní struktury přednostně orientovány podle nejdelšího rozměru (např. délky šlachy), pak většina expanze hydratací se projeví zvětšením průřezu implantátu, zatímco délka se mění jen málo nebo může zůstat stejná, mírně vzrůst nebo se i zmenšit, podle poměrů mezi strukturní anizotropií a botnáním. U plošného implantátu, jako je například kryt na popáleninu, může být orientace fibril upřednostněna ve směrech kolmých na normálu k hlavnímu povrchu implantátu. V tom případě se hydratační expanze projeví především nebo výhradně zvětšením tloušťky, zatímco půdorys zůstane v podstatě nezměněn. Anizotropie botnání má kromě shora uvedených výhod i další praktickou přednost, a sice tu, že umožňuje chirurgovi lépe přizpůsobit tvar a rozměr implantátu požadavkům konkrétního pacienta. Tak například, pokud má být pokryta rána určitého tvaru, stačí vystřihnout odpovídající tvar a velikost z dehydratovaného implantátu, a ten pak zůstane nezměněn po rehydrataci. U isotropního dehydratovaného implantátu by musely být dehydratované rozměry přiměřeně menší, aby se kompenzoval vliv hydratační expanze. Výhodou také může být, že dehydratovaný implantát fixovaný k tkáni si zachová po hydrataci svůj rozměr a tím i okolní tkáň své žádoucí napětí, jak bylo nastaveno chirurgem při operaci. U isotropního implantátu by okolní tkáň své původní napětí ztratila v důsledku hydratační expanze implantátu.

-9Významné je také to, že anisotropie expanze dovolí snadné odlišení implantátu podle vynálezu od jiných implantátů podobného původu a určení.

Anizotropii botnání lze vyjádřit jako poměry mezi lineárními expanzními koeficienty ve třech zvolených směrech. Například směr zvolený ve směru osy z může být tloušťka t a její lineární expanzní koeficient C_z = (th_ydrat.)/(tdehydrat.),- Podobně můžeme zvolit délku I jako rozměr ve směru osy x a definovat lineární expanzní koeficient jako C_x = (lhydrat.)/(ldehydrat.)· A konečně jako rozměr ve směru osy y můžeme zvolit šířku w a definovat lineární expanzní koeficient C_y = (wh_ydrat.)/(wdehydrat.), kde index „hydrát.“ označuje velikost (rozměr) po hydrataci a index „dehydrat.“ označuje velikost v původním dehydratovaném stavu.

V izotropním dehydratovaném materiálu vždy platí C_x/C_y = C_x/C_z = C_y/C_z = 1, ať již jsou hodnoty C_x, C_y a C_z jakékoliv. Anizotropní expanze při hydrataci se projeví tím, že alespoň jeden z poměrů C_x/C_y, C_x/C_z a C_y/C_z má hodnotu rozdílnou od hodnoty 1 a alespoň jeden z lineárních expanzních koeficientů C_x, C_y a C_z má hodnotu nižší než ostatní a jeho hodnota může být i nižší než 1. Alespoň jeden z lineárních expanzních koeficientů C_x, C_y a C_z má naopak hodnotu výrazně vyšší než ostatní, zpravidla alespoň o 10% a výhodně o více než 30%. Tak např. lineární expanzní koeficienty C_x, a C_y mohou mít hodnotu nižší než 1,1 zatímco C_z má hodnotu vyšší než 1,2 a výhodně vyšší než 1,5.

V anizotropním dehydratovaném implantátu podle vynálezu jsou kolagenní fibrily orientovány přednostně do směru nejmenšího lineárního expanzního koeficientu, případně v rovině kolmé na směr, ve kterém je hodnota expanzního koeficientu nejvyšší.

Kolagenní fibrily mohou být přednostně orientovány v určitém směru i v plně hydratovaném stavu. Tato orientace může být dosažena částečnou denaturací kolagenu v orientovaném stavu, nebo zesítěním kolagenu (což je také forma denaturace). Orientace kolagenních fibril pak zůstane v podstatě zachována i po hydrataci implantátu. Tuto orientaci lze využít pro řízení migrace a proliferace buněk v určitém směru, což je výhodné například při hojení popálenin.

Zesítění kolagenu může být dosaženo různými známými způsoby, např. působením aldehydů, jako je např. formaldehyd nebo glutaraldehyd, nebo polyvalentních kationtů, jako je např. Ca²⁺, Mg²⁺, A1^J+ nebo Cr³⁺. Zesítění navíc snižuje botnání a zvyšuje pevnost a hydrolytickou odolnost kolagenní matrice. Toto iontové zesítění je v implantovaném stavu částečně nestálé a postupné snižování síťové hustoty pak vede k postupnému růstu botnavosti • ·· · ·· ·· ···· • · · · ···· ·· · ··· ······

-10a ke změně lineárních expanzních faktorů a jejich vzájemných poměrů. Kinetika těchto procesů je kontrolovatelná a proto lze těchto procesů využít např. k vyvolávání řízeného tlaku nebo tahu na hojící se tkáně.

Acelulámí matrice podle vynálezu je výrazně hydrofilní a její objem se zvětšuje hydratací. Hydratace je nej častěji definována váhovým zlomkem vody v hydratovaném stavu nebo obsahem vody v % hmotnostních. Obsah vody v plně hydratovaném implantátu podle vynálezu je vyšší než 33 % (hmotn.) a výhodně vyšší než 50 % (hmotn.) Koeficient objemové expanze je definován jako:

C_v=C_x*C_y*C_z = (hydratovaný objem)/(dehydrátovaný objem) > 1.

Acelulámí matrice podle vynálezu mají C_v > 1,1 a výhodně C_v > 1,5. Tím se liší od v podstatě hydrofobních porézních struktur, které mohou vzniknout např. kovalentním zesítěním tkání pomocí např. aldehydů, nebo být vytvořeny ze syntetických polymerů, jako jsou např. polyuretany. V tom případě voda při hydrataci zaplňuje póry a zvyšuje hmotnost implantátu, ale jeho objem se výrazně nezmění a C_v je blízký nebo v podstatě rovný 1.

Z výše uvedeného vyplývá, v kontextu s následujícím popisem a příklady, že předmětem vynálezu tedy je především acelulámí sterilní, v podstatě dehydratovaná a alespoň částečně denaturovaná matrice, odvozená z živočišné tkáně a obsahující převážně kolagen, jehož fibrily jsou v podobném strukturálním uspořádání jako byly ve výchozí tkáni, určená jako dočasný implantát v lidském nebo veterinárním lékařství, kterážto matrice při hydrataci projevuje anizotropní změny svých rozměrů.

Ve výhodném provedení acelulámí matrice podle vynálezu při anizotropní změně rozměrů během hydratace zůstávají její dva největší rozměry v podstatě konstantní nebo se zmenšují, zatímco její nej menší rozměr se při zvětšování objemu matrice zvětšuje.

V dalším výhodném provedení má dočasný implantát podle vynálezu v podstatě plošný tvar, jehož půdorys je definován dvěma největšími rozměry, zatímco jeho tloušťka je definována jeho nejmenším rozměrem.

V jiném výhodném provedení acelulámí matrice podle vynálezu během hydratace dva její menší rozměry se zvětšují, zatímco její největší rozměr zůstává v podstatě konstantní nebo se zmenšuje.

V ještě dalším výhodném provedení má dočasný implantát v podstatě protáhlý tvar, jako je např. hranol nebo válec, jehož průřez je definován dvěma nejmenšími rozměry, jako je např. průměr, zatímco jeho délka nebo výskaje definována jeho největším rozměrem.

Výhodná matrice podle vynálezu má v dehydratovaném stavu porozitu menší než 70 % (obj.), výhodně nižší než 60 % (obj.) a nejvýhodněji nižší než 50% (obj.).

Ve výhodném provedení acelulámí matrice podle vynálezu jsou kolagenní fibrily alespoň v dehydratovaném stavu přednostně orientovány ve směrech, ve kterých má lineární expanzní koeficient hydratace nej nižší hodnotu, a v podstatě kolmo na směr, ve kterém má lineární expanzní koeficient hydratace hodnotu nejvyšší.

Výhodně má acelulámí matrice podle vynálezu v dehydratovaném stavu obsah vody nižší než 20 % (hmotn.), výhodně nižší než 10 % (hmotn.)a přednostně nižší než 5 % (hmotn.).

V některých výhodných provedeních matrice podle vynálezu může navíc obsahovat změkčující, konzervační či baktericidní příměsi. Výhodné baktericidní příměsi obsahují stříbro, výhodně vkoloidním stavu a výhodněji ve formě proteinátu stříbra. Výhodné změkčující či konzervační příměsi obsahují s vodou mísitelné sloučeniny, jako je DMSO nebo polyhydroxysloučeniny vybrané ze skupiny glykolů, glycerinu a jeho derivátů, trietanolaminu a cukrů.

Výhodná je taková acelulámí matrice podle vynálezu, která je při styku s vodnými kapalinami schopna objemové expanze s objemovým expanzním faktorem větším než 1,1, výhodněji větším než 1,5. Dále je výhodná acelulámí matrice při styku s vodnými kapalinami schopna hydratace do stavu, ve kterém obsahuje více než 33 % (hmotn.) vody, výhodně více než 50 % (hmotn.) vody.

U výhodné acelulámí matrice podle vynálezu je největší z lineárních expanzních koeficientů o více než 10 % větší, výhodně o více než 30 % větší než nejmenší z lineárních expanzních koeficientů. Výhodné jsou acelulámí matrice, u kterých největší lineární expanzní koeficienty mají hodnotu vyšší než 1,2, výhodně vyšší než 1,5, zatímco nejmenší lineární expanzní koeficienty mají hodnotu nižší než 1,1, výhodně nižší než 1,05.

V dalším výhodném provedení pevná hmota (sušina) acelulámí matrice podle vynálezu sestává z vetší části z proteinů, přičemž výhodně proteiny obsahují převážně kolagen.

• · · · ···· ·· · ··· ······ ·· · · · · ··· · · ··· · · · ··· ··· ·· ··· ·· ·· ·

U výhodnější acelulámí matrice pevná hmota (sušina) obsahuje 70 % (hmotn.) až 95 % (hmotn.), výhodně 80 % (hmotn.) až 90 % (hmotn.) proteinů typu kolagenu. Výhodně pevná hmota (sušina) matrice obsahuje kromě proteinů také menší část lipidických sloučenin včetně lipoproteinů a fosfolipidů.

Výhodná je acelulámí matrice podle vynálezu, jejíž proteinová složka je alespoň zčásti denaturována. V jiném výhodném provedení je alespoň proteinová složka acelulámí matrice podle vynálezu zesítěna následkem reakce s aldehydy nebo polyvalentními kationty.

Výhodná acelulámí matrice podle vynálezu je odvozena ze živočicha, kterým je savec, výhodněji je savce vepř. Výhodnou živočišnou tkání pro acelulámí matrici podle vynálezu pak je kůže, placenta, osrdečník (perikard), tvrdá plena (důra mater), střevo, šlacha nebo chrupavka.

Dočasný implantát, tvořený acelulámí matricí podle nároku vynálezu, je výhodně kryt ranné plochy, výhodněji kryt popáleniny.

V jiném výhodném provedení acelulámí matrice podle vynálezu obsahuje navíc kultivované savčí buňky. Ve výhodnějším provedení je živočich vepř a kultivované savčí buňky jsou lidské autologní nebo allogenní keratinocyty.

Dalším výhodnou acelulámí matricí podle vynálezu je matrice, která po ukončení své funkce samovolně zaniká biodegradací.

Způsob výroby implantátů podle vynálezu, jak byly výše popsány, zahrnuje několik zásadních kroků:

1) Odběr implantátu, např. prasečího kruponu nebo lidské šlachy. Tento krok se provádí v podstatě podobně jako u dosud běžných odběrů, ale s tou významnou výhodou, že odběr implantátu podle vynálezu není tak náročný na přepravní podmínky a rychlé další zpracování jako u implantátů obsahujících buňky. Kolagenní struktury, které se stanou konečným implantátem, jsou totiž stálejší než buněčné struktury.

- 13 * ·· 44 4444

444 · 4 · ·

4 4 4 · 4 ·

44 44 444 4 4

444 44« • 4 44444 ·· ·

2) Odstranění buněk, U implantátů dle vynálezu lze použít různé způsoby decelularizace (odstranění buněk) včetně způsobů, popsaných v dosavadním stavu techniky. To zahrnuje odstranění buněk pomocí povrchově aktivních látek, jako jsou detergenty, chemických činidel, jako jsou kyseliny a alkalie, nebo enzymů., jak bylo popsáno v následujících patentových dokumentech, které jsou tímto formou odkazu zahrnuty do předložené přihlášky: CN200310124306 (Hu Jie); CN20051126108 (Dong Qun Lín);. CN20041022506 (Dai Weihua et al.); US 20050186286 Al (Yoshihiro Takami); JP19900247300 (Koide Mikio) a český patent č. 281176 (E. Matoušková).

Podle vynálezu je výhodný dvoustupňový způsob, při němž v prvním krokuje odebraná tkáň vystavena vhodnému proteolytickému enzymu, jako je trypsin nebo papain, a v druhém kroku je tkáň s případnými zbytkovými buňkami vystavena silně hypotonickému roztoku, přednostně pak přebytku destilované či deionizované vody. Deionizovaná voda odstraní zbytkové buňky tím, že je vystaví osmotickému šoku, který způsobí rupturu jejich membrány. Tento druhý decelularizační krok je současně mnohostupňovou extrakcí zbytkového enzymu (např. trypsinu) a dalších složek. Kromě odstranění zbytků enzymu se rovněž odstraní rozpustné peptidy, póly sacharidy, glykoproteiny a jiné složky s předpokládanou biologickou aktivitou. Odstranění složek rozpustných ve vodě je o to účinnější, že hypotonický roztok přebotnává tkáň a tak zlepšuje difúzi extraktů. Zjistili jsme však, že ani důkladná extrakce neodstraňuje tyto ve vodě rozpustné složky úplně a nové organické složky lze na konci každého kroku detekovat pomocí UV spektroskopie. To ukazuje, že stále nové složky, jako např. polypeptidy nebo glykoproteiny, se neustále uvolňují z kolagenní struktury, takže určitá biologická aktivita zůstává zachována.

3) Dehydratace. Dehydratace se provádí odstraněním alespoň podstatné části vody buďto odpařováním vody přítomné v acelulámí struktuře nebo její extrakcí vhodným rozpouštědlem, jako je například ethanol. „Podstatnou částí vody“ se zde míní tak zvaná „volná voda“, což jest ta část vody, která má strukturu a termodynamické vlastnosti kapalné vody (např. bod tání, tenzi par nebo tepelnou kapacitu). To je zpravidla převážné část vody v tkáni až na posledních asi 20 % (hmotn.), která je vodou více či méně silně vázanou ke kolagenní matrici či jiným hydrofilním složkám implantátu. Tato takzvaná „vázaná voda“ má jiné termodynamické vlastnosti než volná voda a funguje jako plastifikátor kolagenu. Vázanou vodu je obtížné zcela odstranit. „Dehydratovaným implantátem“ se rozumí

implantát, který neobsahuje žádno volnou vodu a má zbytkový obsah vlhkosti pod 20 % (hmotn.), výhodně pak pod 10 % (hmotn.). Pro zvýšenou skladovatelnost produktu je pak obzvláště výhodné udržovat vlhkost v produktu pod 5 % (hmotn.). Pokud se provádí extrakce rozpouštědlem s vodou mísitelným, dochází současně i k částečné denaturaci kolagenu již v tomto kroku. Aby byla částečná denaturace účinná, rozpouštědlo na konci extrakce vody my mělo mít vyšší koncentraci organické látky než 50 % (hmotn.), výhodně vyšší než 70 % (hmotn.). Extrakce vody se může provádět v několika stupních, s postupně rostoucí koncentrací organického rozpouštědla. Vhodnými rozpouštědly jsou nižší alifatické alkoholy Ci až C4, nižší alifatické ketony, jako je aceton, ethery, jako je dimetylether, diethylether, dioxan nebo tertahydrofůran, glykoly jako je ethylenglykol, 1,2-propylenglykol, diethylenglykol nebo triethylenglykol, a podobně. Nejvýhodnější je ethylalkohol, který je nejen účinným denaturačním činidlem pro kolagen a další proteiny, ale i konzervačním a sterilizačním činidlem účinným např. i proti retrovirům. Jeho výhodou je také relativně nízká toxicita, dostupnost a možnost dokonale odstranit jeho zbytky odpařením. Pokud je zvolené rozpouštědlo netěkavé, odstraní se extrakcí těkavým rozpouštědlem, jako je methanol, ethanol, aceton nebo voda.

4) Částečná denaturace kolagenu. Denaturace se provádí buďto tepelně nebo užitím vhodných organických činidel, jako jsou např. alkoholy, aldehydy, ketony nebo jejich vhodná kombinace. Možná je také denaturace částečným zesítěním kolagenu, např. pomocí polyvalentních kationtů, jako jsou Ca , Mg , Ar nebo Cr . Zesítěním lze zvýšit odolnost proti biodegradaci a prodloužit tak funkční životnost implantátu.

Částečná denaturace biologických krytů tepelným zpracováním, síťováním nebo jejich kombinací je popsána v následujících patentových dokumentech, které jsou tímto formou odkazu zahrnuty do předložené přihlášky: JP19900247300 (Koide Mikio) a US 4,076,468 (Liotta et al.); U.S 4,247,292 (W.A. Angell).

Denaturaci kolagenu je možno provádět výhodně v kombinaci s dehydratací, oba kroky však lze také provádět odděleně v jakémkoliv pořadí. Jednou z výhodných metod je dehydratace odpařením vody s následovanou denaturaci v dehydratovaném stavu, například tepelným zpracováním. Denaturace organickým rozpouštědlem se dá provádět i pokropením nebo rozprášením příslušného organického činidla na dehydratovaný implantát. Denaturace

-15·· «··· rozpouštědly se může kombinovat i s tepelnou denaturací kontrolovaným ohřevem implantátu, např. během odpařování vody nebo rozpouštědel.

Je důležité provádět dehydrataci a denaturaci acelulámí matrice pod mechanickým napětím v jednom či dvou zvolených směrech, zpravidla ve směrech největších rozměrů. Při dehydrataci nebo i denaturaci lze napětí dosáhnout tím, že rozměry jsou v žádoucích směrech udržovány konstantní. Toho lze docílit např. upevněním nebuněčné matrice mezi svorky, napnutím pomocí pružných úchytů či kladek, upevněním na vhodný rám, přitisknutím na adhezní podložku nebo přisátím na porézní podložku pomocí vakua a podobně. Dehydratace a denaturace v napjatém stavu způsobí orientaci kolagenních struktur ve směru, ve kterých je acelulámí matrice napínána (nebo ve kterém je alespoň zabráněno jejímu smršťování během dehydratace a nebo denaturace).

Pokud je denaturace prováděna na již předem dehydratované anizotropní matrici, pak není již zpravidla nutné udržovat ji pod napětím, neboť dehydratovaná matrice je rozměrově stabilizována až do určité teploty, která se nesmí během výroby nebo i skladování překročit. Tato mezní teplota je především závislá na zbytkovém obsahu vody v matrici, která by neměla překročit 20 % (hmotn.), výhodně 10 % (hmotn.) a nejvýhodněji 5% (hmotn.), vztaženo ne celkovou hmotnost matrice. Denaturace se provádí mezi teplotami +15 °C a 90 °C, výhodně mezi 30 °C a 70 °C.

5) Sterilizace ionizujícího zářením. Pokud se denaturace podle bodu 4 provádí vhodnými rozpouštědly, jako například ethanolem, pak je sterilizace ve skutečnosti dvoustupňová. První stupeň sterilizace během výrobního procesu jednak sníží mikrobiální zatížení pro konečnou sterilizaci, jednak odstraní i takové zárodky, proti kterým by konečný stupeň sterilizace nemusel být účinný (např. retroviry).

Konečný stupeň sterilizace je proveden po zabalení do obalu neprostupného pro mikroorganismy a viry, a to radiací. Použije se s výhodou minimální radiační dávky ionizujícího záření pro danou mikrobiální zátěž, čímž se snižuje degradace výrobku. Doporučená dávka je nižší než 50 kGray, výhodně nižší než 30 kGray. To je důležité především u gamma záření. Přednost je dávána zpravidla sterilizací urychlenými elektrony (elektronovým paprskem, beta záření), které je k materiálu implantátu šetrnější a dá se přesněji dávkovat. Významný je také rozdílný mechanismus degradace kolagenu u gamma záření a u urychlených elektronů. Původci předloženého vynálezu překvapivě zjistili, že

-16implantáty sterilizované kombinací ionizačního záření, zvláště pak urychlených elektronů, a chemických sterilizačních činidel způsobujících současně denaturaci, zvláště pak ethanolu, si zachovávají výborné mechanické vlastnosti za mokra a nejsou cytotoxické ani při kontaktu s buňkami pacienta ani s buňkami kultivovanými na implantátu v laboratoři. Bez ohledu na různé teorie se původci domnívají, že příznivý účinek ionizačního záření, jako např. urychlených elektronů, je způsoben především uvolněním ve vodě rozpustných peptidových a proteoglykanových fragmentů z jinak nerozpustné matrice, což umožňuje její vyšší biologickou aktivitu.

Implantát může být také kombinován se známými baktericidními nebo bakteriostatickými činidly, jako jsou např. sulfonamidy, antibiotika, proteinové komplexy stříbra nebo koloidní stříbro rozptýlené vkolagenní matrici. To je výhodné především při implantaci do infikovaných nebo nekrotických ran. Některé přísady jsou současně změkčovadly, jako např. glycerin a jeho diacetát nebo formal, 1,2 propylenglykol, dietylenglykol, glukóza, trietalolamin nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Ty mohou působit současně jako mírná konzervační činidla, změkčovadla a slabá denaturační činidla. Jejich obsah může být až 50 % (hmotn.), přednostně nižší než 30 % (hmotn.). Tyto změkčující přísady jsou mísitelné s vodou a jsou to výhodně polyhydroxy sloučeniny, nej výhodněji glycerin nebo jeho deriváty. Mohou být použity i v kombinaci se sloučeninami stříbra, jak je popsáno např. v dokumentu CN19951010722 (Kai Cao), který je tímto zahrnut formou odkazu do předložené přihlášky.

Předmětem předloženého vynálezu tedy je, jak vyplývá z výše uvedeného, způsob výroby acelulámí sterilní, v podstatě dehydratované matrice a alespoň částečně denaturované matrice odvozené z živočišné tkáně a obsahující převážně kolagenní struktury, která již byla definována výše, přičemž způsob spočívá v tom, že se živočišná tkáň zpracuje postupem obsahujícím následující kroky:

a) odběr tkáně;

b) odstranění buněk působením enzymů, povrchově aktivních látek, kyselin, alkálií, hypotonických vodných roztoků nebo jejich kombinace, za vzniku acelulámí matrice.

c) dehydratace acelulámí matrice odstraněním podstatné části vody, přičemž se matrice udržuje pod mechanickým napětím v jednom nebo více zvolených směrech;

d) částečná denaturace kolagenních struktur v acelulámí matrici působením zvýšené teploty, organických činidel, polyvalentních kationtů nebo jejich kombinací, přičemž se matrice udržuje pod mechanickým napětím v jednom nebo více zvolených směrech; nebo se rozměry matrice ve zvolených směrech udržují v podstatě konstantní;

e) sterilizace v podstatě dehydratované a alespoň částečně denaturované matrice ionizujícím zářením.

Výhodný je takový způsob výroby acelulámí sterilní matrice podle vynálezu, kdy se částečná denaturace kolagenních struktur matrice provádí pomocí organických látek mísitelných s vodou vybraných ze skupiny zahrnující alifatické alkoholy Ci až C4, alifatické aldehydy včetně formaldehydu a glutaraldehydu, alifatické ketony včetně acetonu a ethery včetně dimetyletheru, dietyletheru, dioxanu a tetrahydrofuranu.

Ve výhodném způsobu podle vynálezu se částečná denaturace kolagenních struktur provádí při teplotách 15 °C až 90 °C, výhodněji při 30 ⁰ až 70 °C .

Původci zjistili a ověřili, že implantát podle vynálezu je výhodně využitelný jako biologický kryt na popáleniny, bércové vředy, odběrové plochy a jiné kožní defekty. Dehydratovaný implantát lze přiložit přímo na krvácející či mokvající ráno, čímž se implantát hydratuje in šitu bez výrazného zvětšení plochy krytu a přispěje k redukci krvácení a mokvání rány. K tomu se hlavně hodí implantáty změkčené vhodnými přísadami, jako např. glycerinem. Sterilní implantát může být také před použitím hydratován ve sterilním fyziologickém roztoku, případně s přídavkem vhodných baktericidních přípravků (jako např. furantoin, borová voda nebo vodný roztok proteinátu stříbra), a přiložen na ránu. Jeho velkou výhodou je, že výborně kopíruje povrch ranné plochy, snižuje bolestivost rány a je hemostatický. Další velkou výhodou je, že celé hojení probíhá bez výměny krytu, které je u jiných krytů nutné, často nákladné a zejména velmi traumatické pro pacienta (u těžkých popálenin se dokonce musí provádět v narkóze). Další výhodou oproti jiným biologickým obvazům je to, že nezáleží, kterou stranou je kryt přiložen na ránu. Acelulámí dermální krýt chrání ránu a urychluje hojení tím, že podporuje biologickou aktivitu související s hojením, jako je migrace a proliferace keratinocytů pacienta. Nativní keratinocyty se přichytávají k vnitřnímu povrchu implantátu (případně k fibrinu vytvořeném na implantátu po kontaktu skrví či

- 18plasmou pacienta) a migrují po něm, takže implantát se stane po dobu hojení efektivní součástí kůže. Jakmile je hojení skončeno a obnoví se epidermální vrstva na kůži pacienta, implantát vyschne a samovolně odpadne bez nutnosti chirurgického odstraňování, které je nutné u některých jiných biologických krytů, a které je pro pacienta také traumatické.

Další výhodnou vlastností sterilního acelulámího implantátu podle vynálezu je to, že je výborným substrátem pro kultivaci buněk, ať již autologních nebo allogenních. Dají se proto na jeho povrchu vypěstovat vhodné buňky, jako např. keratinocyty, čímž vznikne buněčný biologický kryt známý jako „rekombinovaná kůže“ (RK), který lze aplikovat na popáleniny a jiné ranné plochy. Hlavní předností tohoto buněčného biologického krytu je to, že kombinuje stimulační účinky kultivovaných keratinocytů s vlastnostmi membránového substrátu, tedy implantátu podle vynálezu. Podaří-li se předejít prohloubení hlubokých dermálních popálenin aplikací RK do 10 dnů po úrazu, není nutno transplantovat, podstatně se urychlí hojení a ušetří odběrové plochy a opakování operací. RK s transplantovanými allogenními keratinocyty se dočasně přihojí, keratinocyty se inkorporují do regeneruj ící se epidermis, proliferují, migrují, uzavřou ránu a stimulují hojení produkcí různých růstových faktorů. Xenodermis chrání ránu a poskytuje přirozený podklad pro migraci autologních keratinocytů. V průběhu jednoho týdne jsou allogenní keratinocyty nahrazeny keratinocyty vlastními.

Předložený vynález je dále podrobněji vysvětlen a ilustrován pomocí následujících příkladů a přiložených obrázků. Příklady slouží jako demonstrace některých výhodných provedení vynálezu a odborníkovi je zřejmé, že rozsah připojených patentových nároků není omezen pouze na tyto příklady.

Popis obrázků

Obr. 1 je mikrofotografie ukazující histologický řez prasečí epidermis s papilámí vrstvy koria.

Obr. 2 je mikrofotografie histologického řezu z implantátu po decelularizaci.

- 19Obr. 3 je mikrofotografíe ukazující histologický řez z plošně orientovaného sterilního implantátu po rehydrataci.

Obr. 4 je mikrofotografíe demonstrující barvení kolagenních struktur dle Van Giesona na histologickém řezu ze sterilního rehydratovaného implantátu podle vynálezu, zvětšení 400x.

Obr. 5 ukazuje rehydrátovaný sterilní imlantát připravený k použití jako kryt na popáleninu.

Obr. 6 demonstruje aplikaci implantátu dle vynálezu jako krytu na popáleninu 2. stupně:

Levý obrázek: Konformace a přilnutí krytu k ráně bez vnějších obvazů.

Pravý obrázek: Popálenina 2. stupně po vyhojení a samovolném odpadnutí krytu.

Obr. 7 je mikrofotografíe ukazující histologický řez ze vzorku nově tvořené tkáně na nekrektomované popálenině 3. stupně pod krytem z implantátu podle vynálezu (9 dní po aplikaci).

Obr. 8 demonstruje na mikroforgrafiích histologické preparáty rekombinované kůže (RK) tvořené laboratorně pěstovanými lidskými keratinocyty na implantátu podle vynálezu

Levý obrázek: Rekombinovaná kůže s lidskými keratinocyty pěstovanými v imerzi na prasečí acelulámí matrici dle vynálezu.

Pravý obrázek: Rekombinovaná kůže s lidskými keratinocyty pěstovanými na rozhraní mezi vzduchem a prasečí acelulámí matricí dle vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Prasečí kůže jako xenotransplantát

Dermatomem byla seříznuta 300 až 400 mikronů tlustá vrstva oholené a očištěné vepřové epidermis spapilámí vrstvou koria. Histologický řez odebrané vrstvy je na obrázku 1.

-20Odebraný pruh prasečí kůže byl ponořen 3x na 20 min při 37 °C a poté na 12 hod. při 4° do 0,25 % roztoku trypsinu, čímž se odstranila většina dermálních buněk a oddělila epidermis. Získaná dermis byla vyprána 6 x v demineralizované vodě (3x1 hod., 1x12 hod., 2 x 0,5 hod.), aby se odstranily zbytkové buňky a trypsin. Histologický řez na obrázku 2 ukazuje, že nebuněčná struktura byla zachována. Pruh dermis byl pak upevněn přilepením na skleněnou Petriho misku a usušen za laboratorní teploty do konstantní hmotnosti. V tomto stavu dermis obsahovala asi 18 % (hmotn.) vody. Takto usušená acelulámí dermis měla stejnou plochu půdorysu jako původní hydratovaná kůže, ale její tloušťka byla méně než poloviční. Napjatá acelulámí dermis byla pak zalita 96% ethanolem při 15 °C po dobu 24 hodin. Poté byl ethanol vylit a dermis byla oddělena od skleněného podkladu, uchycena ze dvou protilehlých stran mezi klemy a usušena při teplotě 50°C po 1 hodinu.

Dehydratovaný acelulámí xenotransplantát při zbytkovém obsahu vody 9,5 % (hmotn.) pak byl vložen do sterilizačního sáčku schváleného pro radiační sterilizaci, který byl zataven a ozářen dávkou 25 kGy záření gamma. Sterilita byla ověřena standardním testem na sterilitu. Po rehydrataci byl odebrán histologický řez. Obrázek 3 ukazuje, že vláknitá struktura pojivové tkáně je zachována, ale je kompaktnější a vlákna jsou plošně orientována. Barvení podle Van Giesona na obrázku 4 ukazuje, že implantát je složen převážně z polymerů kolagenního typu, jako je kolagen a elastin. Povedenou analýzou bylo zjištěno, že implantát obsahuje přibližně 85 % (hmotn.) směsi převážně kolagenu s menším množstvím elastinu a fíbrinu, přičemž zbytek tvoří lipidy, polysacharidy a glykoproteiny.

Sterilní implantát měl porozitu přibližně 55 % objemu, vypočtenou z hustoty v dehydratovaném stavu. Implantát byl rehydratovan při 35 °C v izotonickem roztoku NaCl. Po rehydrataci do konstatntní hmotnosti byl obsah vody 62 % (hmotn.). Z opakovaných měření rozměrů v dehydratovaném a hydrátovaném stavu byly zjištěny (s přesností na 0,01 mm) následující hodnoty lineárních expanzních koeficientů:

Délka: C_x= 1,02+/-0,01

Šířka: C_y = 1,03+/-0,02

Tloušťka: C_z= 1,54+/-0,29

Plošný expanzní koeficient: C_a = 1,05 +/- 0,03

Objemový expanzní koeficient: C_v = 1,63 +/- 0,20

Zřetelné rozdíly v expanzních koeficientech jasně dokládají anizotropii expanze při rehydrataci implantátu. Tato anizotropie může být dále demonstrována hodnotami poměrů linámích expanzních koeficientů:

C_x/C_y = 0,98

C_z/C_x = 1,52

C_z/C_y = 1,49

Po určité době skladování byl xenotransplantát použit jako kryt na hlubokou popáleninu druhého stupně na obličeji. Implantát byl krátce namočen do sterilního fyziologického roztoku, jak je znázorněno na obrázku 5, přičemž změkl a zvláčněl beze změny plochy půdorysu. Byl pak přiložen na popáleninu, ke které dobře přilnul, jak je vidět v levé části obrázku 6. Během hojení popáleniny zůstal implantát podle vynálezu na místě, kam byl přiložen, postupně začal vysychat a po necelém týdnu se začal postupně oddělovat od zhojené tkáně. Po 11 dnech byla rána vyhojena a kryt zcela odloučen, jak ukazuje pravá část obrázku 6.

Příklad 2

Použití implantátu připraveného podle příkladu 1 na popáleninu 3. stupně

Poškozená tkáň byla opatrně seříznuta. Dehydratovaný xenotransplantát byl vyjmut ze sterilního obalu, přizpůsoben nůžkami tvaru a velikosti ošetřované plochy, přiložen na krvácející rannou plochu a postříkán sterilním roztokem antibiotika. Xenotransplantát rychle změkl a přilnul k povrchu ranné plochy, čímž se krvácení zastavilo. Implantát si zachoval svůj půdorys z dehydratovaného stavu, ale zvětšil hydratací svojí tloušťku. Tím došlo k dokonalému přilnutí k ráně. Implantát byl překryt ochrannou vrstvou mastného tylu na první 3 dny. Po 8 dnech implantát vyschl do strupovité konzistence a začal se oddělovat od nově vytvořené pokožky pod krytem. Pod implantátem se začala postupně vytvářet nová epidermis, jak ukazuje obrázku 7. Po konečném vyhojení se vytvořila zdravá a přirozeně strukturovaná kůže včetně přirozené pigmentace a bez zjizvení.

• · · ·

-22Příklad 3

Humánní chrupavka jako allotransplantát

Chrupavka vypreparovaná z kyčelního kloubu mrtvého dárce byla zbavena buněk opakovaným praním v roztoku trypsinu a v destilované vodě, pak byla vakuově přisáta svou vydutou stranou na vypuklou stranu vhodně tvarované vypuklé porézní podložky ze spékaného skla (frita). Na této podložce byla umístěna do přebytku směsi 20 dílů (hmotn.) methanolu a 5 dílů (hmotn.) dimetylsulfoxidu (DMSO) při 35 °C na dobu 48 hodin. Tím byl acelulámí implantát dehydratován a současně byl kolagen v něm obsažený částečně denaturován v plošně orientovaném stavu. Po této době byl acelulámí allotransplantát vyjmut z lázně a metanol byl odpařen za normální teploty proudem vzduchu. Na konci tohoto kroku implantát obsahoval přibližně 13 % (hmotn.) DMSO, přibližně 4 % (hmotn.) vody a méně než 0,5% (hmotn.) metanolu. Po sejmutí z porézní podložky byl implantát umístěn do vodonepropustného sterilizačního sáčku a vysterilizován sterilizační dávkou 45 kGy zářením beta z elektronového urychlovače. Sterilita byla ověřena standardním testem na sterilitu.

Takto připravený implantát je vhodný pro experimentální náhradu chrupavky kyčelního kloubu na psu, přičemž je nasazen na jeho poškozenou chrupavku a upevněn smyčkou chirurgického šicího materiálu kolem krčku hlavice. Implantát hydratuje in šitu bez změny svého půdorysu, takže je po celou dobu ve stabilní pozici vůči kloubu pacienta. Chrupavka je implantátem chráněna proti srůstu a tím i trvalému znehybnění. Implantát navíc podporuje a urychluje hojení chrupavky. Po zhojení je implantát postupně degradován aresorbován, až je přirozená chrupavka zhojena a funkce kloubu obnovena.

Příklad 4

Prasečí kůže jako matrix pro kultivaci keratinocytů (pro přípravu rekombinované kůže)

Sterilní acelulámí matrice z příkladu 1 byla vyjmuta ze sterilního obalu, položena na plastovou Petriho misku používanou pro kultivaci tkáňových kultur a opatrně přelita malým přebytkem destilované vody. Acelulámí xenodermis hydratovala bez změny svého půdorysu, pouze se hydratací zvýšila její tloušťka přibližně na dvojnásobek. Přebytek vody byl pak opatrně odsát, aby se hydratovaná dermis neshmula, a zbytek vody byl ponechán odpařit při

-23 laboratorní teplotě v laminámím boxu. Na usušené acelulámí xenodermis se pak kultivovaly lidské keratinocyty na letálně ozářených 3T3 fíbroblastech (nedělí se, ale metabolizují a produkují důležité růstové faktory), čímž vznikla tzv. rekombinovaná kůže (RK) obsahující allogenní keratinocyty vypěstované na xenogenní acelulámí dermis podle vynálezu. Struktura vrstvy keratinocytů byla determinována podmínkami kultivace, jak je patrno z obrázku 8. Pokud se kultivace prováděla na povrchu implantátu v imerzi, vznikla hladká, rovnoměrná vrstva keratinocytů. Pokud se kultivace prováděla na rozhraní mezi implantátem a vzduchem, vrstva keratitinocytů se strukturovala do formy podobné přirozené epidermis, včetně rohové vrstvy, stratům corneum, a bazální membrány, stratům basale. Takto připravená RK může být výhodně využita k léčení popálenin, bércových vředů a jiných těžko hojitelných kožních defektů.

RK se aplikuje tak, že keratinocyty směřujícími do rány, zatímco dermis vně (vzhůru nohama). Xenogenní acelulámí dermis podle vynálezu, sloužící ve fázi kultivace jako kultivační podklad, při aplikaci štěpu slouží jako podpůrná struktura pro přenos keratinocytů a posléze jako mechanický kryt, chránící ránu proti infekci, vysychání a mechanickým poškozením. Výhodou proti jednoduchým kultivovaným epidermálním štěpům je větší odolnost, uvolnění z misky bez enzymatického působení (pouze pomocí 2 pinzet) a snadná manipulace. Výhodou proti kulturám keratinocytů na syntetických podkladech a gelech na bázi kolagenu je konsistence RK podobná přirozené kůži a z toho vyplývající vynikající adheze k ráně a též hemostatický efekt. Při uvolnění z misky se štěp nesmršťuje, keratinocyty na substrátu nejsou ovlivněny jako při uvolnění enzymem. RK s allogenními keratinocyty má stimulační účinky na hojení odběrových ploch a na hojení hlubokých dermálních popálenin (stupeň 2b).

Hlavní výhodou tohoto buněčného biologického krytu je to, že kombinuje stimulační účinky kultivovaných keratinocytů s vlastnostmi biologických membrán. Podaří-li se předejít prohloubení hlubokých dermálních popálenin aplikací RK do 10 dnů po úrazu, není nutno transplantovat, podstatně se urychlí hojení a ušetří odběrové plochy a opakování operací. RK s transplantovanými allogenními keratinocyty se dočasně přihojí, keratinocyty se inkorporují do regenerující se epidermis, proliferují, migrují, uzavřou ránu a stimulují hojení produkcí různých růstových faktorů. Xenodermis chrání ránu a poskytuje přirozený podklad pro • · · · · · ······ ···· · · · · ·· ·

-24migraci autologních keratinocytů. V průběhu jednoho týdne jsou allogenní keratinocyty nahrazeny keratinocyty vlastními.

Příklad 5

Šlacha krocana

Šlacha vypreparovaná z nohy krocana byla zbavena buněk postupem podle příkladu 1, načež byla upnuta do přípravku umístěného v nádobě, ve kterém byla přes kladku lankem napínána závažím o hmotnosti 12 kg. V tomto stavu byla zalita 1% vodným roztokem chloridu hlinitého a ponechána při 37 °C po 16 hodin. Pak byl roztok 3x vyměněn za apyrogenní vodu, pak za směs 20 dílů (hmotn.) acetonu a 10 dílů (hmotn.) glycerinu a 0,05 dílu (hmotn.) dusičnanu stříbrného, ve kterém byla struktura ponechána po 24 hodin pod napětím vyvolaným působením 12 kg závaží pomocí napínacího přípravku. Poté byla struktura osušena a i s napínacím přípravkem přemístěna do vakuové sušárny vyhřáté na 70 °C, kde se během dvou hodin zbavila zbytků rozpouštědla a navíc došlo k částečné tepelné denaturaci kolagenu. Denaturační proces byl dokončen zahřátím na 88 °C po dobu 10 minut, stále pod mechanickým napětím v dusíkové atmosféře. Vysušený acelulámí implantát se zbytkovým obsahem vody 3 % (hmotn.) byl uzavřen do sterilizačního plastického obalu a sterilizován dávkou 15 kGy záření beta z elektronového urychlovače. Sterilita byla ověřena standardním testem na sterilitu.

Acelulámí implantát při rehydrataci zůstal pevný a zvětšil svůj průřez, zatímco se smrštil na délku. Po implantaci došlo k postupnému zvýšení hydratace díky snižování síťovací hustoty (která může být definována např. jako molámí zlomek skupin spojujících dva různé řetězce v polymeru). Tím došlo i k postupnému smršťování do délky a zvýšení tahu na okolní tkáně, čehož lze výhodně využít např. v rekonstrukční nebo orthopedické chirurgii.

Příklad 6

Tenké střevo prasete

Tenké střevo z čerstvě poraženého mladého prasete bylo vypreparováno, omyto vodou, obráceno naruby a opakovaně louženo v přebytku 3% roztoku dodecylsulfonanu sodného při 45 °C. Nakonec bylo střevo na jednom konci uzavřeno tlačkou a z druhé strany připojeno na zdroj demineralizované vody o tlaku 30 mm Hg (4 kPa). Přetlak byl udržován v lázni demineralizované vody při 40 °C po 24 hodin. Nato byla demineralizovaná voda vyměněna za směs izopropylalkoholu a terc-butylalkoholu (1:1, hmotn.) a udržována při 70 °C pod vnitřním přetlakem alkoholické směsi po dalších 6 hodin. Nakonec byla směs alkoholů 3x vyměněna za metanol při laboratorní teplotě. Acelulámí a dehydratovaná orientovaná membrána pak byla nafouknuta dusíkem a zevně osušena v proudu čistého vzduchu pod laminámím boxem, načež byla složena naplocho mezi dvě polypropylenové destičky a uzavřena v nepropustném sterilizačním sáčku. Byla pak sterilizována ve dvou krocích: v prvním kroku byla sterilizována zářením gamma při dávce 5 kGy a pak urychlenými elektrony při dávce 15 kGy.

Sterilní acelulámí membrána je určena k naplnění suspenzí allogenních fibroblastů a implantování do podkoží pacienta s cílem podpořit regeneraci jeho podkožního vaziva.

Claims (31)

1. Acelulámí sterilní, v podstatě dehydratovaná a alespoň částečně denaturovaná matrice, odvozená z živočišné tkáně a obsahující převážně kolagen, jehož fibrily jsou v podobném strukturálním uspořádání jako byly ve výchozí tkáni, určená jako dočasný implantát v lidském nebo veterinárním lékařství, vyznačující se tím, že při hydrataci projevuje anizotropní změny svých rozměrů.

2. Acelulámí matrice podle nároku 1, vyznačující se tím, že při anizotropní změně rozměrů během hydratace zůstávají dva největší rozměry v podstatě konstantní nebo se zmenšují, zatímco nejmenší rozměr se při zvětšování objemu matrice zvětšuje.

3. Acelulámí matrice podle nároku 2, vyznačující se tím, že dočasný implantát má v podstatě plošný tvar, jehož půdorys je definován dvěma největšími rozměry, zatímco jeho tloušťka je definována jeho nejmenším rozměrem.

4. Acelulámí matrice podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že během hydratace dva menší rozměry se zvětšují, zatímco největší rozměr zůstává v podstatě konstantní nebo se zmenšuje.

5. Acelulámí matrice podle nároku 4, vyznačující se tím, že dočasný implantát má v podstatě protáhlý tvar, jako je např. hranol nebo válec, jehož průřez je definován dvěma nej menšími rozměry, jako je např. průměr, zatímco jeho délka nebo výška je definována jeho největším rozměrem.

6. Acelulámí matrice podle nároku 1, vyznačující se tím, že matrice má v dehydratovaném stavu porozitu menší než 70 % (obj.), výhodně nižší než 60 % (obj.) a nejvýhodněji nižší než 50 % (obj.).

7. Acelulámí matrice podle nároku 1, vyznačující se tím, že kolagenní fibrily jsou alespoň v dehydratovaném stavu přednostně orientovány ve směrech, ve kterých má • ·· · ·· ······ •· · · ···· ·· · •·· ······ lineární expanzní koeficient hydratace nejnižší hodnotu, a v podstatě kolmo na směr, ve kterém má lineární hydratační koeficient hodnotu nejvyšší.

8. Acelulámí matrice podle nároku 1, vyznačující se tím, že matrice má v dehydratovaném stavu obsah vody nižší než 20 % (hmotn.), výhodně nižší než 10 % (hmotn.) a výhodněji nižší než 5 % (hmotn.).

9. Acelulámí matrice podle nároku 1, vyznačující se tím, že navíc obsahuje změkčující, konzervační či baktericidní příměsi.

10. Acelulámí matrice podle nároku 9, vyznačující se tím, že baktericidní příměsi obsahují stříbro, výhodně v koloidním stavu a výhodněji ve formě proteinátu stříbra.

11. Acelulámí matrice podle nároku 9, vyznačující se tím, že změkčující či konzervační příměsi obsahují s vodou mísitelné sloučeniny, jako je DMSO nebo polyhydroxysloučeniny vybrané ze skupiny glykolů, glycerinu a jeho derivátů, trietanolaminu a cukrů.

12. Acelulámí matrice podle nároku 1, vyznačující se tím, že matrice je při styku s vodnými kapalinami schopna objemové expanze s objemovým expanzním faktorem větším než 1,1, výhodně větším než 1,5.

13. Acelulámí matrice podle nároku 1,vyznačující se tím, že matrice je při styku s vodnými kapalinami schopna hydratace do stavu, ve kterém obsahuje více než 33 % (hmotn.) vody, výhodně více než 50 % (hmotn.) vody.

14. Acelulámí matrice podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že největší lineární expanzní koeficient je o více než 10 % větší, výhodně o více než 30 % větší než nej menší lineární expanzní koeficient.

• *4 ♦ ·· 444444

4··· 4444 44 4

15. Acelulámí matrice podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že největší lineární expanzní koeficienty mají hodnotu vyšší než 1,2, výhodně vyšší než 1,5, zatímco nejmenší lineární expanzní koeficienty mají hodnotu nižší než 1,1, výhodně nižší než 1,05.

16. Acelulámí matrice podle nároku 1,vyznačující se tím, že její pevná hmota (sušina) sestává z větší části z proteinů.

17. Acelulámí matrice podle nároku 16, vyznačující se tím, že proteiny obsahují převážně kolagen.

18. Acelulámí matrice podle nároku 16, vyznačující se tím, že její pevná hmota (sušina) obsahuje 70 % (hmotn.) až 95 % (hmotn.), výhodně 80 % (hmotn.) až 90 % (hmotn.) proteinů typu kolagenu.

19. Acelulámí matrice podle nároku 16, vyznačující se tím, že její pevná hmota (sušina) obsahuje kromě proteinů také menší část lipidických sloučenin včetně lipoproteinů a fosfolipidů.

20. Acelulámí matrice podle nároku 16, vyznačující se tím, že její proteinová složka je alespoň zčásti denaturována.

21. Acelulámí matrice podle nároku 16, vyznačující se tím, že alespoň její proteinová složka je zesítěna následkem reakce s aldehydy nebo polyvalentními kationty.

22. Acelulámí matrice podle nároku 1,vyznačující se tím, že živočich je savec.

23. Acelulámí matrice, podle nároku 4, vyznačující se tím, že savec je vepř.

24. Acelulámí matrice podle nároku 1,vyznačující se tím, že živočišná tkáň je kůže, placenta, osrdečník (perikard), tvrdá plena (důra mater), střevo, šlacha nebo chrupavka.

-29• ♦· · toto ·· ···· •» · · · · · t ♦ · · ··· · · · ··· ·· ·· toto · · · ·· ··· ··· ··· ··· ·· ··· ·· ·♦ ·

25. Acelulámí matrice, podle nároku 2, vyznačující se tím, že dočasný implantát je kryt ranné plochy, například popáleniny.

26. Acelulámí matrice podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje navíc kultivované savčí buňky.

27. Acelulámí matrice podle nároku 1, vyznačující se tím, že implantát po ukončení své funkce samovolně zaniká biodegradací.

28. Acelulámí matrice podle nároků 25 a 26, vyznačující se tím, že živočich je vepř a kultivované savčí buňky jsou lidské autologní nebo allogenní keratinocyty.

29. Způsob výroby acelulámí sterilní, v podstatě dehydratované matrice a alespoň částečně denaturované matrice, odvozené z živočišné tkáně a obsahující převážně kolagenní struktury, jak je definována v kterémkoliv z nároků laž28, vyznačující se tím, že živočišná tkáň se zpracovává postupem obsahujícím následující kroky:

a) odebrání tkáně;

b) odstranění buněk působením enzymů, povrchově aktivních látek, kyselin, alkálií, hypotonických vodných roztoků nebo jejich kombinace, za vzniku acelulámí matrice,

c) dehydratace acelulámí matrice odstraněním podstatné části vody, přičemž se matrice udržuje pod mechanickým napětím v jednom nebo více zvolených směrech;

d) částečná denaturace kolagenních struktur v acelulámí matrici působením zvýšené teploty, organických činidel, polyvalentních kationtů nebo jejich kombinací, přičemž se matrice udržuje pod mechanickým napětím v jednom nebo více zvolených směrech; nebo se rozměry matrice ve zvolených směrech udržují v podstatě konstantní;

e) sterilizace v podstatě dehydratované a alespoň částečně denaturované matrice ionizujícím zářením.

• ·♦ 0 ·< 00000*

00 0 0 00 · 0 0« 0

000 000 000

00 00 00 000 00

0 0 0 000 000

00 0 00 00 0 00 *· 0

30. Způsob výroby acelulámí sterilní matrice podle nároku 29, vyznačující se tím, že částečná denaturace kolagenních struktur se provádí pomocí organických látek mísitelných s vodou vybraných ze skupiny zahrnující alifatické alkoholy Ci až C4, alifatické aldehydy včetně formaldehydu a glutaraldehydu, alifatické ketony včetně acetonu a ethery včetně dimetyletheru, dietyletheru, dioxanu a tetrahydrofuranu.

31. Způsob výroby acelulámí sterilní matrice podle nároku 29, vyznačující se tím, že částečná denaturace kolagenních struktur se provádí při teplotách 15 °C až

90 °C, výhodně při 30⁰ až 70 °C .