CZ2006605A3 - Zpusob modifikace polysacharidu - Google Patents

Zpusob modifikace polysacharidu Download PDF

Info

Publication number
CZ2006605A3
CZ2006605A3 CZ20060605A CZ2006605A CZ2006605A3 CZ 2006605 A3 CZ2006605 A3 CZ 2006605A3 CZ 20060605 A CZ20060605 A CZ 20060605A CZ 2006605 A CZ2006605 A CZ 2006605A CZ 2006605 A3 CZ2006605 A3 CZ 2006605A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mmol
acid
product
reaction
solution
Prior art date
Application number
CZ20060605A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ302856B6 (cs
Inventor
Velebný@Vladimír
Hrdina@Radim
Šuláková@Romana
Mlcochová@Petra
Holas@Tomáš
Krcmár@Martin
Original Assignee
Cpn Spol. S R. O.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cpn Spol. S R. O. filed Critical Cpn Spol. S R. O.
Priority to CZ20060605A priority Critical patent/CZ302856B6/cs
Publication of CZ2006605A3 publication Critical patent/CZ2006605A3/cs
Publication of CZ302856B6 publication Critical patent/CZ302856B6/cs

Links

Landscapes

  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Rešení se týká zpusobu modifikace polysacharidu, jako napríklad kyseliny hyaluronové, .beta.-(1,3),(1,6)-D-glukanu, .beta.-(1,3)-D-glukanu, oxycelulózy, chitinu nebo chitosanu pomocí smesných anhydridu ve vodném prostredí nebo v prostredí vhodného organického rozpouštedla v prítomnosti prídavných látek.

Description

Způsob modifikace polysacharidú
Oblast techniky
Vynález se týká oblasti bio-medicínských přípravků založených na polysacharidech a modifikace funkčních skupin polysacharidú pomoci směsných anhydridů ve vodném prostředí nebo v prostředí vhodného organického rozpouštědla v přítomnosti přídavných látek.
Dosavadní stav techniky
Polysacharidy jsou biopolymery složené z jednoduchých cukerných monomerů spojených glykosidickou vazbou. Polysacharidy tvořené pouze jedním typem monomeru nazýváme homopolymery, pokud obsahují dvě a více typů monomerů, heteropolymery. Podle počtu opakujících se jednotek rozlišujeme oligosacharidy (2 až 10 jednotek) a polysacharidy (10 a více jednotek). Význam polysacharidú je obrovský. Polysacharidy plní funkci nutriční, ochrannou, stavební (celulóza, chitin) nebo zásobní (škrob). Polymery obecně jsou charakterizovány průměrnou molekulovou hmotností, protože se jedná o polydisperzní molekuly, běžně se pohybuje okolo 16.103 g.mol'1 až 16.106 g-mol'1. Počet opakujících se jednotek je dán stupněm polymerizace.
Nejrozšířenějším polysacharidem je homopolymer celulóza, chemicky p-(l,4)-D-glukopyranosa, snadno dostupný a levný. Díky vysokému stupni intra a intermolekulámích vazeb jc celulóza nerozpustná ve vodě. Je to nejčastěji modifikovaný biopolymer a její deriváty jako např. oxycelulóza mají široké uplatnění.
Obr. 1 Celulóza Obr. 2 Oxycelulóza
Zglukosových jednotek jsou také složeny extracelulámí polysacharidy hub, obecně nazývané glukany.
• · t • · i • ·· • · · ·· ·· ·· ·· • · • ··· • · · • · · ·· ··
Obr. 3 β-( 1,3)-D-glukan
Schizophyllum commune je zdrojem polysacharidu schizophylanu. Je to neutrální polysacharid tvořený p-(l,3)-D-glukosou s postranně navázanou P-(l,6)-D-glukosylovou skupinou, tvořící triple-helix. Tento polysacharid není v savčím těle degradován, je biodegradabilní, jeho molekulová hmotnost se pohybuje okolo 106 g.mol'1. Mezi jeho chemické analogy patří skleroglukan, který je produkován houbou Sclerotium rolfsii. Podobnou strukturu vykazují i lentinan, curdlan, izolovaný mikrobiální fermentací kmene Alcaligenes faecalis, grifolan etc. Tyto muco-polysacharidy disponují řadou léčivých účinků a mají imunomodulační efekt (Wakshull, hnmunopharmacology 41 (1999) 89-107)
OH
Obr. 4 Schizophylan
Dalším v přírodě hojně se vyskytujícím polysacharidem je chitin, chemicky β-( 1,4)-2-acetyl-2-deoxy-D-glucopyranosa. Je součástí endo a exoskeletu hmyzu, hub a mořských korýšů. Je nerozpustný ve vodě. Z organických rozpouštědel je rozpustný v hexafluoroisopropanolu, hexafluoroacetonu, chlorovaných alkoholech v konjugaci s vodnými roztoky minerálních kyselin a N,jV-dimethylacetamidu s obsahem 5 % lithných solí (Μ. N. V. Ravi Kumar, Reactive and Functional Polymers 46 (2000) 1-27). Deacetylovanou formou je chitosan, chemicky β-( 1,4)-2·· ····
-amino-2-deoxy-D-glucopyranosa. Řada vlastností chitosanu je dána stupněm acetylace, který uvádí, kolik skupin bylo procentuálně acetylováno. Díky své chemické struktuře je nerozpustný při pH větším než 6,5. Je rozpustný a hydrofyzovatelný v prostředí kyselém. Chitosan je také nerozpustný v řadě běžných organických rozpouštědel. Existence nukleofilních skupin zajišťuje chitosanu schopnost sorbovat kovy, jeho kladný náboj předurčuje snadnou tvorbu solí kyselin, schopnost interreagovat se záporně nabitými povrchy např. kůže a vlasů, čehož se využívá v kosmetickém průmyslu. V těle je degradován lysosymy, enzymy obsaženými v organelách buněk imunitního sytému, nebo lidskou chitinasou a A-acetyl-p-glukosamidasou.
Obr, 5 Chitin Obr. 6 Chitosan
Dalším významným polysacharidem je kyselina hyaluronová, komponovaná z opakujících se jednotek P-(l,3)-D-glukuronové kyseliny a P-(l,4)-?V-acetyl-D-glukosaminu. Vyznačuje se velkou molekulovou hmotností 5.104 až 5.106 g.mol'1, která je závislá na zdroji, ze kterého se získává. Kyselina hyaluronová, respektive její sůl hyaluronan, je nezbytnou součástí pojivových tkání, synoviální tekutiny kloubů. Kyselina hyaluronová hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako hydratace, organizace proteoglykanů, diferenciace buněk, proliferace a angiogenese. Tento značně hydrofilní polysacharid je rozpustný ve formě soli v celé šíři pH.
Obr. 7 Kyselina hyaluronová ·· ···« • · • ··· · · • · · ·· ·· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··
Kyselina hyaluronová je zástupcem skupiny glykosaminoglykanů, která zahrnuje dále chondroitin sulfát, dermatan sulfát, keratan sulfát a heparan sulfát.
Hnědé mořské řasy rodu Phaeophycaea produkují zajímavý polysacharid - kyselinu alginovou. Tento lineární polysacharid je kombinací p-(l,4)-D-manurové kyseliny a a-(l,4)-L-guloronové kyseliny, jeho rozpustnost a hydrofilita je funkcí pH, při pH nižším než pKA obou kyselin (pH = 3,5) je nerozpustný. Vápenatá sůl kyseliny alginové je rovněž nerozpustná.
HOOC
HO
HOOC
Obr. 8 Kyselina alginová
Přehled o polysacharidech lze nalézt v knize editované Severian Dimitriu, Polysaccharides, Marcel Dekker, 1998, ISBN 0824701275.
Chemie polysacharidů je značně rozsáhlá. Specifická je volba reakčních podmínek vzhledem k možné hydrolýze a řadě vedlejších reakcí.
Acylace polysacharidů je nejčastěji využívaná metoda k zavedení alkylového řetězce, který mění vlastnosti převážně hydrofilních látek na látky hydrofobní. Reakce se nejčastěji provádí působením anhydridů příslušných kyselin, chloridů kyselin nebo samotnou kyselinou za přídavku katalyzátorů. Klemann et al. (US patent 5906852; 1999) popisuje přípravu povrchově modifikované celulózy jako nízko-kalorické náhrady mouky. Připravil nízko substituované deriváty se stupněm substituce 1 až 5 %. Porovnával reaktivitu mastných kyselin a jejích chloridů. Reakce s mastnými kyselinami probíhala při teplotě 140 °C po dobu 5 hodin, reakce s chloridy za teploty místnosti trvala 2 hodiny. Do roztoku chloridu kyseliny v propyl-acetátu byla přidána celulóza. Po dvou hodinách byl bílý prášek odfiltrován a promyt acetonem. Podle Silversteina et al. (US patent 4152115; 1979) se nechá reagovat celulózy siso-propyl esterem mastných kyselin, reakce probíhá za mírných podmínek sp-toluen sulfonovou kyselinou jako katalyzátorem.
Modifikace chitosanu anhydridy kyselin ve vodném prostředí byla provedena Vanlerberghem et al. (US 3953608; 1976). Heterogenní reakční směs vznikla přídavkem anhydridů do roztoku soli chitosanu za teploty 15 °C - 30 °C. Anhydrid byl přidáván v pevné formě nebo ve formě roztoku s inertním rozpouštědlem jako dioxan, tetrahydrofuran a ethyl-acetát. I přes hydrolýzu anhydridů ve vodném prostředí na příslušné kyseliny, výtěžky ·· v··· • · • · »··· * • · · · * • · · · · • · · ··· · · • · · · • · · ·« ·· «· ·· * · 9 • · ··· • · · · • · · ·
9· ·· dosahovaly 70 %. Mezi použitými anhydridy nasycených kyselin byly anhydrid kyseliny jantarové, anhydrid kyseliny acetyl-jantarové, anhydrid kyseliny methyl-jantarové, anhydrid kyseliny diacetyl-tartarové, nebo anhydrid kyseliny diglykolové, mezi anhydridy nenasycených kyselin byly anhydrid kyseliny maleinové, itakonové a citrakonové. Anhydridy kyselin s 1 až 5 uhlíky a anhydrid kyseliny benzoové použil Itoi et al. (US patent 4996307; 1991) v prostředí vodného roztoku kyseliny nebo rozpouštědla mísitelného s vodou jako alkohol nebo aceton.
Prey et al. (US patent 3956278; 1976) připravil smíšené parciální estery polysacharidů. Nejprve se nechal reagovat substrát sacylačním činidlem - ledovou kyselinou octovou při teplotě 90 °C a potom s vyšší mastnou kyselinou (laurylová, palmitová) ve formě kyseliny nebo anhydridu v přítomnosti kyselého katalyzátoru - Lewisovy kyseliny, Branstedovy kyseliny, katexu v kyselé formě, nej častěji však s p-toluensulfonovou kyselinou.
Deriváty oligomerů kyseliny hyaluronové jsou patentovány Couchmannem et al. (US patent 4761401; 1988), kde acylace probíhá jak na hydroxylové tak amino skupině deacetylovaného hyaluronanu. Polysacharid kyseliny hyaluronové acyloval Yui et al. (US patent 6673919; 2004). O-acylace zahrnuje reakci s organickou kyselinou za přídavku kyselého katalyzátoru (minerální kyseliny, organické nebo Lewisovy kyseliny) a aktivačního činidla (Ν,Ν'-dicyklohexylcarbodiimid, 2-chlor-l-methyl pyridiniumiodid a Ν,Ν-carbonyl diimidazol) nebo se používá anhydridů a chloridů kyselin v přítomnosti báze. Michinori et al. (JP patent 7309902, 1995) připravili acylovanou kyselinu hyaluronovou reakcí s anhydridy karboxylových kyselin nebo jejich acylhalogenidy ve vodném prostředí obsahujícím s vodou mísitelné organické rozpouštědlo v přítomnosti katalyzátoru. Sapononifikací acylových skupin kyseliny hyaluronové bylo docíleno derivátů s libovolným počtem acylových skupin. Chlorid kyseliny retinové a anhydrid kyseliny máselné použili k přípravě specifických derivátů hyaluronové kyseliny i Perbellini et al. (WO 2004/056877 Al; 2004). Pro syntézu v prostředí N,N-dimethylformamidu byla použita kyselina hyaluronová ve formě tetrabutylamonných solí.
Buysch et al. (US patent 5068321; 1991) připravili deriváty polysacharidů s různými estery chlormravenčanu. Fenylester kyseliny mravenčí se postupně přidával v průběhu 3 hodin k suspenzi methylcelulózy, pyridinu a chlormethanu a nechal se promíchávat po dobu 20 hodin při 25 °C a následně po dobu 5 hodin při 45 °C.
Rizzi et al. (US patent 3963699; 1976) připravili estery mastných kyselin polyolů, jež zahrnují monosacharidy, disacharidy a cukerné alkoholy, metodou transesterifikace bez přídavku rozpouštědla. Prvním krokem bylo zahřátí směsi polyolu a nižších esterů mastných kyselin, zpravidla přírodních látek jako např. methyl ester mastných kyselin získaných ze sojových bobů, za přídavku alkalických solí mastných kyselin a bazického katalyzátoru (alkalických kovů, «· ···· hydridů a alkoholátů) a tím vytvoření homogenní směsi. Směs se zahřívala na teplotu 110°C-180 °C a tlaku kolem 0,1 - 760 mm rtuťového sloupce. Druhým krokem byl přídavek nadbytku nižších esterů mastných kyselin.
Z literatury je známo, že karboxylové kyseliny, resp. karboxylovou skupinu -COOH lze převést na tzv. asymetrický anhydrid, který je reaktivní již za normálních teplot a reaguje s nukleofilními skupinami substrátu, např. amino-skupinou za vzniku amidu, s hydroxylovou skupinou za vzniku esteru a podobně (Bulletin de la Societe Chimique de France, (5), 945-51;
1964) .
Jako reakční činidlo pro tzv. aktivaci karboxylové skupiny se používá celá škála chlormravenčanú, nejčastěji ale chlormravenčan ethylnatý (R = C2H5) (Synthesis, (12), 954-5; 1979), Či ůo-propylnatý (R = C3H7).
Tato technika byla později použita i v oblasti barvení textilních vláken (GB 1009204;
1965) .
barvivo—COOH E CICOOC2H5 +
O O barvivo-C-0-C-0C2H5 + (C2H5)3NH+C1
O O barvivo—C-O—C-OC2H5 + subs-NH2
O
-► barvivo-C-NH-subs + co2 + C2H5OH o o , II II barvivo-c-0-C-OC2H5 + subs-OH
O *· barvivo-C-O-subs + CO2 + C2H5OH
Subs = celulóza, polyamid
Využití v oblasti barvení vlny pak popsala Oliveira-Campos a kol. (EU Appl. 95670003.3; 1995).
Směsný anhydrid pro syntézu esterů a amidů karboxylových kyselin využil I. Lalezari (US patent 4780542; 1988). Estery vyšších mastných kyselin se nechaly reagovat s alkyl chlormravenčany v přítomnosti báze a takto připravený anhydrid pak s příslušným alkoholem nebo aminem. Reakce probíhaly ve vodném prostředí.
• · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· • · · • · ··· • · · · • · · · ·· ··
Podstata vynálezu
Bylo zjištěno, že pomocí směsných anhydridů lze takové polysacharidy, jako jsou například kyselina hyaluronová, β-(1,3),( 1,6)-D-glukan, P-(l,3)-D-glukan, oxycelulóza, chitin nebo chitosan, vhodně modifikovat. Reakci lze s výhodou provádět ve vodném prostředí nebo v prostředí vhodného organického v přítomnosti přídavných látek.
Vyznačený postup je následující. Ve všech případech se karboxylová kyselina R'COOH (ať už obsahuje jednu nebo více karboxylových skupin a jedná se o sloučeninu alifatického, cykloalifatického či aromatického charakteru) rozpustí v polárním, aprotickém rozpouštědle mísitelném s vodou, jako je aceton, N,N-dimethylformamid, Ν,Ν-dimethylacetamid, N-methylpyrrolidon, dimethylsulfoxid, l-methyl-2-pyrrolidon,/>-dioxan, toluen, tetrahydrofuran. Přidá se molámí ekvivalent (vztaženo na karboxylovou skupinu) organické báze pro zachycení vznikajícího chlorovodíku, například triethylamin, pyridin, apod. Po ochlazení reakční směsi na -15 °C až 15 °C se přidá molámí ekvivalent chlormravenčanu ethylnatého, /so-propylnatého a podobně (obecně chlormravenčanu alkylnatého, R = alkyl Cmó).
R-COOH + C1C00R + báze -► R-C-O-C-OR + báze.HCl
Sraženinu hydrochloridu organické báze je možné odfiltrovat a roztok směsného anhydridů R^ChCC^R (v dalším textu označen také jako modifikační činidlo) se použije pro reakci s polysacharidem. Příprava směsného anhydridů RlCO2CO2R je velmi rychlá a například při 0 °C se 100% konverze výchozí kyseliny R^OOH dosáhne již za 5 minut. Delší přechovávání aktivované sloučeniny v roztoku je nežádoucí, protože vzniká symetrický anhydrid R’C(=O)-O-(C=O)R‘.
Reaktivita směsného anhydridů (modifikačního činidla) je tím vyšší, čím větší je kladný parciální náboj na uhlíku pocházejícího od karboxylové skupiny aktivované sloučeniny.
Výsledek reakce směsného anhydridů s polysacharidem je také závislý na druhu použitého polysacharidu.
V případě chitosanu je nej reaktivnější aminová skupina. Nebo-li chitosan se rozmíchá ve vodě (1 - 5 % w/w) a upraví se pH na hodnotu 2 - 8, s výhodou pak na hodnotu 5-6, kde vznikne roztok a přitom aminové skupiny nejsou ještě plně protonovány (-ΝΉ2 + H+ = -NlV). Při teplotě od 0 °C do 100 °C, výhodně za teploty místnosti, se za míchání přidá roztok
4« ·«*· • ♦ 4 • · • · • · ·· ·· · ·· ·· • · · ·
4 4 · •4 4 444 • · · • 4 44 ·4 • · 444
4 4 · • · 4 · • 4 44 směsného anhydridu (modifikačního činidla). Průběh reakce je indikován vývinem CO2. Úpravou pH do neutrální až alkalické oblasti (pH 7 - 10) se modifikovaný chitosan vysráží, případně vzniklá karboxylová sloučenina R*COOH se rozpustí a modifikovaný chitosan se odfiltruje.
o o , , 1 II II chitosan-NH2 + R-C-O-C-OR
O chitosan-NH-C-R1 + ROH + CO2
Přítomnost a množství nově vzniklých amidových skupin (-NH-C(O=)-) v modifikovaném polymeru lze prokázat pomocí infračervené spektroskopie, kde pás s maximem 1558 cm'1 odpovídá charakteristické amidové vibraci (Amid Π). Zároveň jsou patrné asymetrické (2950 - 2940 cm'1) a symetrické (2840 - 2850 cm'1) valenční vibrace methylenových skupin.
Pokud jsou reakce prováděny v neutrálním až alkalickém prostředí, probíhají v heterogenní fázi a dané reakce se účastní i hydroxylové skupiny chitosanu.
o 1II chitosan-OH + R-C-O-C-OR chitosan-O-C-R1 + ROH + C02
Přítomnost a množství nově vzniklých esterových skupin (-O-C(=O)-) v modifikovaném polymeru lze prokázat pomocí infračervené spektroskopie, kde se ve spektru objeví nové vibrace s frekvencí v oblasti 1735 - 1740 cm’1. Dalším důkazem esterových skupin je tvorba železitohydroxamového komplexu, vzniklého aminolýzou esterů v přítomnosti hydroxylaminu. Barevný produkt má charakteristickou absorbanci v rozmezí 530 - 560 nm (Samuel Patai ed., The chemistry of carboxylic acids and esters, 1969, str. 879, ISBN 471669199).
V případě glukanů reaguje hydroxylová skupina. Schizophylan se rozmíchá ve vodě (0,01-5 % w/w) a upraví se pH na hodnotu 2 - 11, s výhodou pak na hodnotu 5 - 6, za vzniku gelu. Při teplotě od 0 °C do 100 °C, s výhodou za teploty místnosti, se za míchání přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla). Když je reakce ukončena, modifikovaný schizophylan se vysráží, například přídavkem acetonu v pěti až desetinásobném přebytku, vztaženo na objem reakční směsi a vysrážený modifikovaný schizophylan se odfiltruje.
o o . . , 1 1 II II schizopnylan-OH + R-C-O-C-OR
O * schizophylan-o-C-R1 + ROH + CO2 «· ···
Přítomnost a množství nově vzniklých esterových skupin (-O-C(=O)-) v modifikovaném polymeru lze prokázat pomocí infračervené spektroskopie, nebo pomocí železitohydroxámového komplexu podobně jako v případě modifikace chitosanu.
V případě kyseliny hyaluronové a jejích solí je modifikace požadována na hydroxylové skupině. Kyselina hyaluronová, resp. její sůl se rozpustí ve vodě (0,01 - 5 % w/w) a upraví se pH na hodnotu 2 - 11, s výhodou pak na hodnotu 5 - 6 za vzniku čirého roztoku, respektive gelu. Při teplotě od 0 °C do 100 °C, s výhodou za teploty místnosti, se za míchání přidá roztok směsného anhydridu (modifíkačního činidla). Když je reakce ukončena, modifikovaný hyaluronan se vysráží, například přídavkem acetonu a odfiltruje se.
hyaluronová kyselina —OH
O O
+. Q_o-C_OR >
hyaluronová kyselina
O
O-C-R + ROH + CO2
Pomocí infračervené spektroskopie jsme zjistili, že u polysacharidů, které obsahují karboxylovou skupinu, (například hyaluronan) dojde v určité míře ke vzniku asymetrického anhydritu (polysacharíd-C^OjOC^OjR1), který následnou reakcí reaguje s funkční (-OH) skupinou modifikovaného polysacharidů.
poiy 0 0 II II i poiy
sacharid —C-O-C-R + HO— sacharid
RÍO
II c-o— poly sacharid poiy sacharid
O
II —C-OH
Ve vodném roztoku dochází také k hydrolytickým reakcím, které jsou nežádoucí a snižují výtěžek modifikace polysacharidů, a vedou ke vzniku určitého množství výchozí karboxylové kyseliny.
O O
II II , „ _
R-C-O-C-OR + H2O >·
O
R-C-OH + CO2 + ROH a na· «· ·· a· ·» • · · · · a · • ♦ · · · · ··· « · ··· · · · · · a · a · · · · • · · · · · ··
V některých případech jsme zjistili přítomnost esteru R*COOR, který vzniká následnou reakcí mezi aktivovanou sloučeninou ŘCChCChR a alkoholem ROH. Tyto vedlejší produkty lze snadno z modifikovaného polymeru vymýt organickými rozpouštědly.
Oxycelulóza se při modifikaci chová jako hyaluronan.
Popsaným postupem lze kupříkladu výše uvedené polysacharidy tzv. hydrofobizovat reakcí s aktivovanými nasycenými či nenasycenými mastnými kyselinami (kyselina palmitová, stearová, etc.). S velkou výhodou a výtěžkem lze polysacharidy modifikovat N,N-dialkylovanými aminokyselinami, takovou jako je například Ν,Ν-dihexylglycin, a podobně. Dále bylo zjištěno, že uvedeným postupem lze do molekuly polysacharidu naroubovat kyseliny obsahující thiolovou skupinu (použitím např. kyseliny thioglykolové, nebo dimerkaptojantarové). Vyznačeným postupem lze obdobně roubovat molekuly polysacharidů kyselinami obsahující sulfidické, disulfidické, až polysulfidické můstky.
Dále lze popsaný postup využít k naroubování jednoduchých nenasycených kyselin na polysacharidy, speciálně kyseliny akrylové a maleinové.
S velkou výhodou lze uvedený postup využít k síťování jednotlivých polysacharidů, případně síťování různých polysacharidů dohromady, kde se použije jako síťující Činidlo kyselina, která má dvě a více karboxylových skupin (např. kyselina malonová, jantarová, glutarová, etc.).
Uvedený postup lze využít i k roubování polysacharidů kyselinami, které mají ve své molekule reaktivní halogen, například kyselinou monochloroctovou, 2,3-dibrompropionovou, 3-jodpropionovou, a podobně.
Vyznačený postup lze použít i pro značení polysacharidů organickými luminofory a barvivý, které mají ve své molekule karboxylovou skupinu.
Modifikace polysacharidů ve vodě často vyžaduje přítomnost povrchově aktivních , sloučenin, které jednak snižují povrchové napětí polymeru a také fimgují jako fázové přenašeče t mezi jednotlivými fázemi. Jako povrchově aktivní látky lze použít vhodné komerčně dostupné „ tenzidy katonického nebo neionogenního charakteru. V případě polysacharidů s nábojem lze r použít vhodných organických solí, např. kyselina hyaluronová se připraví ve formě £ tetrabutylamonných solí (C. Ventura, J. Biol. Chem. (2004), 22, 23574-23579) a tyto TBA-sole
L hyaluronové kyseliny se pak modifikují směsným anhydridem.
Výše uvedené modifikace lze také provádět v organickém rozpouštědle, při reakčních teplotách od -20 °C do bodu varu rozpouštědla, opět s výhodou za teploty místnosti.
I* Modifikace v organickém rozpouštědle přináší výhodu v tom, že neprobíhají hydrolytické h reakce. Na druhou stranu ale bylo vysledováno, že jako hlavní vedlejší produkt vzniká
I č
• fc • · • · 999· · • ·* • · · • · « • ··· t 9 fct «I 99 • · · • · ··« « 9 9 9 · • · · * ·* symetrický anhydrid výchozí karboxylové kyseliny R‘C(=O)-O-(C=O)Rl. Tento symetrický anhydrid dále reaguje s funkčními skupinami polysacharidu, například OH skupinou a tvoří tak žádaný modifikovaný polymer (ester) a příslušné množství výchozí karboxylové kyseliny.
o o i II II i R-C-O-C-OR
V případě chitosanu se postupuje tak, že se chitosan, resp. jeho hydrochlorid rozmíchá v organickém rozpouštědle (0,01 - 5 % w/w), s výhodou v Ν,Ν-dimethylacetamidu a nebo ještě lépe v Ν,Ν-dimethylacetamidu za přídavku LiCl (0,01 - 10 % w/w), kdy se vytvoří gel při teplotě 20 °C - 100 °C, s výhodou 60 °C. Za míchání se přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla) v organickém rozpouštědle. Když je reakce ukončena, modifikovaný chitosan se vysráží, například přídavkem vody v pěti až desetinásobném přebytku, vztaženo na objem reakční směsi a modifikovaný chitosan se odfiltruje.
Glukan se rozmíchá w organickém rozpouštědle (0,01 - 5 % hmotnostních schizophylanu na celkovou hmotnost směsi), s výhodou v Ν,Ν-dimethylacetamidu a nebo ještě lépe v N,N-dimethylacetamídu za přídavku LiCl (0,01 - 10 % w/w), kdy se utváří gel za teploty 20 °C 100 °C, s výhodou 60 °C. Za míchání se přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla) v organickém rozpouštědle. Když je reakce ukončena, modifikovaný schizophylan se vysráží, například přídavkem acetonu v pěti až desetinásobném přebytku, vztaženo na objem reakční směsi, a modifikovaný schizophylan se odfiltruje.
Hyaluronan, alginát a pektin se rozpustí v organickém rozpouštědle (0,01 - 5 % w/w), s výhodou v Ν,Ν-dimethyl acetamidu za přídavku LiCl (0,01 - 10 % w/w) za teploty 20 °C -100 °C, s výhodou 40 °C - 70 °C. Za míchání se k roztoku, respektive gelu přidá roztok směsného anhydridu (modifikačního činidla). Po ukončení reakce se modifikovaný hyaluronan vysráží, například přídavkem acetonu a modifikovaný hyaluronan se odfiltruje.
Farmakologicky přijatelnou solí kyseliny hyaluronové, oxycelulózy nebo kyseliny alginové je sůl sodná, draselná, lithná, vápenatá, hořečnatá, zinečnatá, kobaltnatá a manganatá, popřípadě jejich kombinace.
·· ··· · • · · ···· · · · • · · · · · · · ··· • · · · » ··· · · · · * « · · · · · · · · ···· · ·♦ ·· ·· ··
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1. Modifikace chitosanu kyselinou hexánovou
Chitosan 0,5 g (2,87 mmol; stupeň acetylace 26 %; CAS 9012-76-4; CPN spol. s r. o.) se rozpustil přídavkem 2 cm3 1 M HC1 ve 30 ml vody a před reakcí se upravilo pH 10% vodným roztokem NaOH na hodnotu 6,5. Kyselina hexanová (0,182 cm3; 1,46 mmol; CAS 142-62-1; Merck) se aktivovala v 15 cm3 acetonu (CAS 67-64-1, Lach-Ner a.s.) působením 0,211 cm3 triethylaminu (1,52 mmol; CAS 121-44-8; Sigma-Aldrich) a 0,145 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,52 mmol; CAS 208-778-5; Merck). Aktivace probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min. Vytvořený směsný anhydrid se do suspenze chitosanu zfiltroval přes fritu č. 3. Po 15 min se reakční směs ohřála na 65 °C a posléze se míchala ještě další 2 hodiny. Před izolací produktu se finální směs ochladila na teplotu místnosti, pH se upravilo na hodnotu 7 a produkt se odfiltroval na Biichnerově nálevce. Surový produkt se třikrát promyl vodou a poté absolutním 2-propanolem. Vysušením při 45 °C se získalo 0,52 g produktu.
FTIR (KBr): 2957cm' víCHj)™ 2930 cm‘ vfCH^ , 2872 cm1 v(CH2)s, 1659 cm-1 v(OO) amid I., 1558 cm' δ(ΝΗ) amid II., 1458 cm1 dtCHJ.
Příklad 2. Modifikace chitosanu kyselinou hexánovou ,
Chitosan 0,5 g (2,87 mmol; stupeň acetylace 26 %) se rozpustil přídavkem 2 cm3 1 M HC1 ve 30 cm3 vody. K roztoku se přidal 1 cm3 Althosan MB (CAS 68989-00-4; Chemotex Děčín a.s.) a pH se upravilo 10% vodným roztokem NaOH na hodnotu 4,0. Kyselina hexanová (0,726 cm3; 5,81 mmol) se aktivovala v 10 cm3 3-methyl-2-pentanonu (CAS 565-61-7; Fisher-Scientific) působením 0,848 cm3 triethylaminu (6,11 mmol) a 0,582 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (6,11 mmol). Aktivace probíhala při teplotě 0 °C po dobu 8 min. Směs se zfilrovala do roztoku chitosanu přes fritu č. 3, reakce probíhala za intenzivního míchaní po dobu 4 hod. Po skončení reakce se pH upravilo 10% vodným roztokem NaOH na hodnotu 7,0 a směs se naředila na 200 ml. Takto vzniklá suspenze se odstředila (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 ot./min po dobu 20 minut. Promyla se 2krát 80% 2-propanolem (směs s vodou) a nakonec absolutním 2-propanolem. Produkt se sušil při teplotě 45 °C. Takto se získalo 0,64 g sypkého drivátu.
9 9 9 9 • 9 9 • ·
9 9
9 ·
999· 9 9· · · · • · · · • 9 ·♦· ·· 99
9 9
9 999
9 9 * 9 • 0 9 9 9
99 99
FT1R (KBr): 2957cm‘ vfCHJas, 2928 cm' v(CH^„ , 2872 cm1 vfCHý,, 2880 cm' v(CH2)5, 1742 cm' v(C=0), 1663 cm-I v(C=0) amid I., 1564 cm' δ(ΝΗ) amid II., 1466 cm' ófCHi).
Příklad 3. Modifikace chitosanu kyselinou palmitovou
Kyselina palmitová (0,372 g; 1,45 mmol; CAS 57-10-3; Merck) se rozpustila v 10 cm3 acetonu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,211 cm3 triethylaminu (1,52 mmol) a 0,145 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,52 mmol). Po 5 min míchání se suspenze zavedla přes fritu č. 3 do vodného roztoku chitosanu (0,5 g; 2,87 mmol; stupeň acetylace 16 %) ve vodě o pH 6,5. Během reakce se pH roztoku udržovalo 10% vodným roztokem NaOH v rozmezí 6,5 - 7,0. Prvních 15 min se reakce zahřívala na teplotu 60 °C. Reakce byla doprovázena vývinem oxidu uhličitého, po skončení reakce (3 hod) se při pH 7,0 odpařil aceton. Po ochlazení roztoku se suspenze promíchávala při pH 7,0 po dobu 20 min a zfiltrovala přes Bíichnerovu nálevku. Produkt se promyl vodou a absolutním 2-propanolem. Derivát se sušil při teplotě místnosti. Výsledný sypký produkt o hmotnosti 0,62 g měl béžovou barvu.
FHR (KBr): 2934 cm' v(CHj)„ , 2853 cm' v(CH2)s, 1659 cm' v(C=O) amidI., 1553 cm' δ(ΝΗ) amid II., 1466 cm' Ó(CH2).
Příklad 4. Modifikace chitosanu ve formě jeho hydrochloridu kyselinou palmitovou
Chitosan (5 g; 0,029 mol; stupeň acetylace 26 %) se intenzivně míchal ve 150 cm3 0,1 M HC1 po dobu 1 hodiny. Chitosan ve formě hydrochloridu se vysrážel z roztoku přídavkem 500 cm3 absolutního 2-propanolu. Chitosan hydrochlorid se odseparoval na odstředivce a promyl dvakrát 80% 2-propanolem (směs s vodou) a nakonec čistým 2-propanolem. Produkt ve formě bílého prášku se sušil při 50 °C. Takto se získalo 4,76 g chitosan-hydrochloridu ve formě bílého prášku.
Chitosan-hydrochlorid (0,5 g; 2,85 mmol) spolu s 1 g LiCl (CAS 7447-41-8; Acros Organics) se míchal po dobu 16 hod při teplotě 60 °C v 10 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu (CAS 127-19-5; Sigma-Aldrich). K takto upravené reakční směsi se přikapávala aktivovaná kyselina, Kyselina palmitová (0,330 g; 1,29 mmol) se rozpustila v 10 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu a ochladila na teplotu 0 °C. K roztoku se postupně přidalo 0,188 cm3 triethylaminu (1,36 mmol) a ♦ · *··· • 4 • · ·· ·· • 4 · · 4 · · • · · · · · ···
4 4 444 44 44 4 • 4 4 4 4 4 4
44 44 ··
0,129 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,36 mmol). Po 5 min se směs zfiltrovala do předem připraveného roztoku chitosan-hydrochloridu. Reakce probíhala při teplotě 60 °C, po 3 hodinách se směs vysrážela 30 cm3 vody a zfiltrovala na fritě, promyta vodou. Filtrační koláč se rozdispergoval v 30 cm3 vody, pH se upravilo 10% vodným roztokem NaOH na 7, pomocí Ultra-Turraxu (T25-basic, IKA-Werke) při 6500 otáčkách, po 1 hod míchání se přidalo 20 cm3 acetonu a znovu se dispergoval a zfiltroval na fritě. Takto se získalo 0,49 g derivátu.
FTIR (KBr): 2955cm‘ vfCHj)^, 2918 cm1 v(CHi)a, , 2848 cm1 vfCH^, 1738 cm‘ v(C=O), 1688 cm-1 v(OO) amidl., 1637 σηιδ(ΝΗ) amid II., 1465 cm' 5(CHi).
Příklad 5. Modifikace chitosanu kyselinou thioglykolovou
Kyselina thioglykolová (0,2078 cm3; 0,81 mmol; CAS 68-11-1; Merck) se rozpustila v 15 cm3 acetonu. Zachladu se k roztoku přidalo 0,118 cm3 triethylaminu (0,85 mmol) a 0,081 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,85 mmol). Po 10 min míchání na ledu se suspenze zavedla přes fintu č. 3 do 30 cm3 směsi chitosanu (0,3 g; 1,62 mmol; stupeň acetylace 26 %) ve vodě o pH 7,5. Během reakce se pH roztoku udržovalo 5% vodným roztokem NaOH v rozmezí 6,5 -7,0. Reakce byla doprovázena vývinem oxidu uhličitého, po skončení reakce (2 - 3 hod) se z reakční směsi odpařil aceton při teplotě 75 °C a pH 7,0. Vzniklý gel se promíchával po dobu 15 min při pH 8,0 a po přídavku 200 cm3 acetonu se přistoupilo k filtraci přes skládaný filtr. Derivát se sušil při teplotě 45 °C. Získalo se 0,32 g produktu.
FTIR (KBr): 2924 cm1 vfCH^ , 2870 cm1 vfCHjs, 1705 cm1 v(C=O), 1556 cm1 v(C=O) amid I., 534 cm'1.
Příklad 6. Modifikace chitosanu kyselinou dithiodiglykolovou
Kyselina dithiodiglykolová (0,264 g; 1,45 mmol; CAS 505-73-7; Sigma-Aldrich) se rozpustila v 10 cm3 acetonu. Po přídavku 0,422 cm3 triethylaminu (3,26 mmol) se roztok ochladil na 0 °C a po 20 min se prikapalo 0,289 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (3,26 mmol). Po 7 min míchání na ledu se suspenze zavedla přes fritu č. 3 do 30 cm3 směsi chitosanu (0,5 g; 1,82 mmol) ve vodě o pH 7,0. Reakce je doprovázena vývinem oxidu uhličitého, po skončení reakce (3 - 4 hod) se pH reakce upravilo na 7,0 a reakce se míchala 30 min při teplotě 60 °C.
·· ····
Po odpaření acetonu se gel odfiltroval na Btichnerové nálevce a promyl 3krát 30 cm3 absolutního 2-propanolu. Derivát se sušil při teplotě 40 °C. Získalo se 0,48 g produktu.
FTIR (KBr): 2922 cm1 v^H^, 1699 cm'1, 1561 cm1 v(C=O) amid I., 1597 cm1, 1558 cm'1,1419 cm'1.
Příklad 7. Modifikace chitosanu kyselinou 2,3-dibrompropanovou a následné zesíťování (crosslink)
Příprava kyseliny 2,3-dibrompropanové (CAS 600-05-5)
Kyselina akrylová (5,5 cm3; 0,08 mol; CAS 79-10-7; Acros Organics) se míchala po dobu l hodiny při teplotě místnosti s 6,15 cm3 bromu (0,12 mol; CAS 7726-95-6; Sigma Aldrich) a poté další 3 hod při teplotě 40 °C na vodní lázni. Výsledná nažloutlá sraženina se odseparovala a sušila volně na vzduchu za teploty místnosti.
FTIR (KBr): 1720 cm'1 v(C=O), 1425 cm1, 1337 cm1, 1254 cm1, 1215 cm1, 1153 cm1, 949 cm1, 906 cm'1, 825 cm'1, 662 cm'1, 631 cm'1, 509 cm'1.
Reakce s kyselinou 2,3-dibrompropanovou a následné zesíťování
Chitosan (0,5 g; 2,87 mmol) se rozpustil ve 30 cm3 vody přídavkem 2 cm31 M HC1. Před reakcí se pH upravilo 10% vodným rozotokem NaOH na hodnotu 7,0. Kyselina 2,3-dibrompropanová 0,134 g (0,58 mmol) se rozpustila v 15 cm3 acetonu, po vychlazení na 0 °C se postupně přidalo 0,084 cm3 triethylaminu (0,61 mmol) a 0,058 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,61 mmol). Aktivovaná kyselina se poté zfiltrovala přes fritu č.4 do roztoku chitosanu. Reakce probíhala 2 hod při teplotě místnosti. Poté se pH roztoku upravilo na hodnotu 8,0 přídavkem 10% vodného rozotoku NaOH a míchal se další hodinu. Teplota se postupně vždy po 1 hodině zvedla na 40 °C a na 60 °C. Produkt se vyizoloval filtrací. Získalo se 0,48 g produktu.
FTIR (KBr): navázáni kyseliny 2,3-dibromakrylové je charakterizováno píky 2922 cm'1 v(CH2)m a 2854 cm'1 víCHrfs a 1558 cm'1 v(C=O) amid I, po zesíťování se objeví pík 1703 cm'1 a zmizí výraznější píky 2922 a 2854 cm'1.
·· ·· · · · · · ·· ·· • · · ···· · · · • · · · · · · t · · · • · · · ······ ·· · • · · · ····· ···· ·· ·· ·· · ·
Příklad 8. Modifikace chitosanu kyselinou N,N-dihexyl-3-aminooctou
Příprava N,N-dihexyl-3-aminooctové kyseliny (CAS 193623-50-6)
Kyselina monochloroctová (5,5 g; 58,2 mmol; CAS 79-11-8; Nitrokémia 2000) a dihexylamin (12,34 cm3; 52,9 mmol; CAS 143-16-8; Sigma-Aldrich) se smíchali ve 20 cm3 acetonu. Směs se zahřála na 50 °C a postupně se přidalo 0,43 g NaíCCh. Reakce probíhala pod zpětným chladičem při teplotě 60 °C po dobu 30 hodin. Po negativní reakci na Ehrlichovo činidlo (důkaz nepřítomnosti aminových skupin) byla z reakční směsi odfiltrována bílá sraženina (0,7856 g), acetonový filtrát se okyselil koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 5 a produkt se vysrážel přídavkem 150 cm3 destilované vody. Výsledný lehce nažloutlý produkt (5,22 g; 21,45 mmol) se vysušil při teplotě 45 °C.
FTIR (KBr): 2959 cm1 v(CH3)as, 2930 cm1 v(CHýa» 2858 cm’ v(CH3)s, 2793 cm’ 2521 cm'1, 2440 cm'1, 1876 cm'1, 1716 cm'1 v(C-O) karboxylů, 1593 cm'1, 1462 cm1
8(CHi), 1053 cm-1, 729 cm’ mfCHj).
Vlastní modifikační reakce
Chitosan (0,5 g; 2,87 mmol; stupeň acetylace 35 %) se rozpustil ve 30 cm3 vody za přídavku 2 cm3 1 M HC1. V,.V-dihexyl-3-aminoocotová kyselina (0,141 g; 0,58 mmol) se rozpustila ve 20 cm3 acetonu a vychladila na teplotu 0 °C. Přidal se chlormravenčan ethylnatý (0,058 cm3; 0,61 mmol) a suspenze se po 5 min přidala k roztoku chitosanu o pH 6,5 (pH se upravilo přídavkem 10% NaOH). Po 6 hodinách se pH reakční směsi upravilo na 7,0 a produkt se izoloval filtrací přes Buchnerovu nálevku a promyl absolutním 2-propanolem. Výsledný produkt (0,52 g) se sušil při teplotě 45 °C.
FTIR (KBr): 2926 cm'1 vfCH^ a 2887 cm1 v(CHj)s, 1697 cm1 v(C=O) amid I, a 1528 cm1S(NH) amid II.
Příklad 9. Modifikace chitinu kyselinou palmitovou
Acetylace chitosanu - příprava chitinu (CAS 1398-61-4)
Chitosan (5 g; 0,029 mol; stupeň acetylace 16 %) se rozpustil ve 150 cm3 vody za přídavku 1 M HC1. Přídavkem 10% NaOH se pH upravilo na 6,5 za vzniku bílého gelu.
·· ···· ·· ·· · ·· « ···· ··· • · · ·· · · ···· 17 ············
A · «9 ······ ···· · ·· ·· ·· ··
Následně se střídavě po částech přidávalo 3 cm3 acetanhydridu (0,032 mol) a 10% NaOH, kterým se pH udržovalo v rozmezí 6,5 - 7,0. Po přídavku posledního množství acetanhydridu se suspenze míchala za teploty místnosti po dobu 4 hodin s občasnou kontrolou pH. Chitin se izoloval snížením pH na 5 a odstředil, promyl vodou, 80% 2-propanolem (směs s vodou) a posléze absolutním 2-propanolem. Produkt se sušil při 45 °C. Takto se získalo 4,97 g bílého sypkého materiálu, chitosanu se stupněm acetylace 100 %.
FTIR (KBr): 1660 cm' v(C=O) amid!., 1558 cm‘δ(ΝΗ) amid II.
Vlastní modifikační reakce
Chitosan (0,5 g; 2,26 mmol; stupeň acetylace 100 %) se za přídavku 0,5 g LiCl rozpustil v 15 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu. Směs se míchala po dobu 1 hod při 60 °C. K takto vytvořenému roztoku se přidalo 0,2898 g aktivované kyseliny palmitové (1,13 mmol). Kyselina palmitová se aktivovala přídavkem 0,113 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,19 mmol) a 0,165 cm3 triethylaminu (1,19 mmol) při teplotě 0 °C po dobu 5 min v 10 cm3 N,N-dimethylacetamidu. Vlastní modifikační reakce běžela 15 hod při teplotě 60 °C. Produkt se vysrážel přídavkem 30 cm3 vody, ponechal 1 minutu intenzivně míchat na dispergačním míchadle (Ultra-Turrax T25-basic, IKA-Werke) při 6500 otáčkách za minutu. Suspenze se zfiltrovala, k produktu se přidalo 50 cm3 acetonu a suspenze se míchala po dobu 1 hod za teploty místnosti a zfiltrovala. Výsledkem bylo 0,52 g produktu nahnědlé barvy. Produkt byl rozpustný v 2-propanolu.
FTIR (KBr): 2924 cm1 v(CH2)as, 2853cm!v(CH2)s a 1734 cm1 v(C=O).
Příklad 10. Modifikace hyalurononanu sodného ve formě HA-TBA-TBA kyselinou octovou
Příprava HA-TBA-TBA
Roztok tetrabutylamonium-bromidu (4,226 g; 13,124 mmol; CAS 1643-19-2, Fluka) v 250 cm3 2-propanolu (CAS 67-63-0; Merck) se za intenzivního míchání pomalu přikapal k 250 cm3 vodného roztoku sodné soli hyaluronové kyseliny (5,0 g; 12,5 mmol/disacharid; Mw = 360.103 g.mor1; CAS 9067-32-7; CPN spol. s r. o.). Po 12 hodinách míchaní se k čirému roztoku přikapal aceton (400 cm3) a vzniklá bílá sraženina se míchala další 2 hodiny. Po částečné ···· • 4 44 44 44
4444 444
4 44 4 4 4444
444 444 44 44 4
44 4 4444
44 44 44 44 dekantaci a odstředění (5000 otáček/min) se derivát sušil při 45 °C za vzniku 4,121 g tetrabutylamonné soli hyaluronové kyseliny (HA-TBA).
Jemně rozetřená bílá tetrabutylamonná sůl hyaluronové kyseliny HA-TBA (4,121 g; 6,658 mmol/disacharid) se intenzivně míchala v 50% roztoku tetrabutylamonium hydroxid triakontahydrátu (5,300 g; 6,625 mmol; CAS 2052-49-5; Fluka), Po dvou hodinách se transparentní disperze zamrazila při -18 °C a lyofylizovala za vzniku lehce nažloutlého produktu tetrabutylamonnné formy kyseliny hyaluronové HA-TBA-TBA (5,94 g).
FTIR (KBr): vmax 2959, 2945, 2875,1655,1618,1568,1464,1407,1379 cm1.
Vlastní modifikační reakce
Kyselina octová (0,100 cm3; 1,742 mmol; CAS 64-19-7; Sigma-Aldrich) se rozpustila v 1 cm3 Ν,Ν-dimethylformamidu (CAS 68-12-2, Lach-Ner) s přídavkem triethylaminu (0,242 cm3; 1,742 mmol). Roztok se ochladil na ledové lázni a za bezvodých podmínek se pomalu prikapal chlormravenčan ethylnatý (0,166 cm3; 1,742 mmol). Během několika sekund začala vypadávat z roztoku sraženina triethylamonium-chloridu. Po deseti minutách intenzivního míchání se suspenze kvantitativně přenesla k 5 - 10% suspenzi HA-TBA-TBA (0,300 g; 0,348 mmol/disacharid) v Ν,Ν-dimethylformamidu a směs se míchala 2 dny při teplotě 50 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se k reakční směsi přidalo 10 cm3 CHCfi a suspenze se homogenizovala za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s), zfiltrovala za užití Buchnerovy nálevky a sypký produkt se promyl CHCfi a rozsuspendoval v CHCfi. Tento proces extrakce lipofilních látek do CHCfi se opakoval třikrát. Poté se sraženina postupně suspendovala v 80% (směs s vodou), 80% a absolutním 2-propanolu (80 cm3) za užití dispergačního míchadla s následným odstředěním (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 otáček/min po dobu 20 minut. Po sušení při 50 °C přes noc se byl bílý produkt resuspendoval za užití dispergačního míchadla v 10 cm3 vody a pH se upravil na 7 - 8 (0,1 M NaOH). K suspenzi míchané přes noc se prikapal absolutní 2-propanol (50 cm3). Směs se odstředila (5000 otáček/min; 20 min) a výsledný ester se sušil při 50 °C. Získalo se 0,80 g HA-acetátu.
FTIR (KBr): 2893, 1736, 1654,1613,1409,1378 cm1.
4« 4444 • V 44 44 44
4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4 44«
4 44444 44 4
4 4 4 4 4 4
44 4« 44
Příklad 11. Modifikace hyaluronanu sodného ve formě HA-TBA-TBA kyselinou hexanovou
Kyselina hexanová (0,217 cm3; 1,742 mmol) se rozpustila v 1 cm3 N,N-dimethylformamidu s přídavkem triethylaminu (0,242 cm3; 1,742 mmol). Roztok se ochladil na ledové lázni a pomalu se přikapal chlormravenčan ethylnatý (0,166 cm3; 1,742 mmol). Během několika sekund začala vypadávat z roztoku sraženina triethylamonium-chloridu. Po deseti minutách intenzivního míchání se suspenze kvantitativně přenesla k 5 - 10% suspenzi HA-TBA-TBA, připravené podle příkladu 13 (0,300 g; 0,348 mmol/disacharid) vN,N-dimethylformamidu a směs se míchala 2 dny při teplotě 50 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se k reakční směsi přidalo 10 cm3 CHC13 a suspenze se homogenizovala za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s), zfiltrovala za užití Biichnerovy nálevky a sypký produkt se promyl CHC13 a suspendoval v CHCI3. Tento proces extrakce lipofilních látek do CHCI3 se opakoval třikrát. Poté se sraženina postupně resuspendovala v 80% (směs s vodou) a absolutním 2-propanolu (80 cm3) za užití dispergačního míchadla s následným odstředěním (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 otáček/min po dobu 20 minut. Po sušení při 50 °C přes noc se bílý produkt resuspendoval za užití dispergačního míchadla v 10 cm3 vody a pH se upravilo na 7 - 8 (0,1 M NaOH). K suspenzi míchané přes noc se přikapal absolutní 2-propanol (50 cm3). Směs se odstředila (5000 otáček/min; 20 min) a výsledný ester se sušil při 50 °C. Získalo se 0,90 g HA-hexanoátu.
FTIR(KBr): 2924, 2895,1734, 1654,1619,1410,1377 cm1.
Příklad 12. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou hexanovou
0,156 cm3 kyseliny hexanové (1,25 mmol) se rozpustilo ve 20 cm3 acetonu a přidalo se 0,182 cm3 triethylaminu (1,31 mmol). Acetonový roztok se vychladil na 8 °C a poté se přikapalo 0,125 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,31 mmol). Aktivace probíhala 10 min při teplotě 8 °C a směs se následně zfiltrovala. Filtrát se postupně přidával do zahřátého roztoku sodné soli kyseliny hyaluronové (0,5 g; 1,25 mmol; Mw = 398.103 g.mol'1) rozpuštěné ve 100 cm3 demineralizované vody za přídavku 1,0 cm3 Althosanu MB (CAS 68989-00-4; Chemotex Děčín, a.s.) za teploty 65 °C. Reakce probíhala při teplotě 65 °C po dobu 15 minut s následným pozvolným zchlazením na teplotu místnosti, celková doba reakce byla 4 hodiny. Po skončení reakce se přidalo 1,0 g NaCl a 250 cm3 absolutního 2-propanolu. Produkt se po sedimentaci a *
• «99 • · · · ··· • 9 ♦ 9 · · « ♦ ·» • a » * ··* « · 9 · * • « · 9 9 » 9 · • ·« ·> ·· ·» dekantaci promyl absolutním 2-propanolem (50 cm3) a sušil při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,51 g bílého produktu.
FTIR (KBr): 2915 cm1 vfCH^, 1738 cm1 v(O0), 1654 cm1.
Příklad 13. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou palmitovou
Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw = 350,4 .103 g.mol'') se míchal v 10 cm3 <VjV-dímethylacetamidu po dobu 16 hod při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,165 g; 0,64 mmol) probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min ve 10 cm3 YA-dimethylacetamidu působením 0,094 cm3 triethylaminu (0,68 mmol) a 0,064 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,68 mmol). Takto vytvořená suspenze se zfiltrovala přes fritu č.3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod při teplotě 60 °C a poté po přídavku 20 cm3 vody další 1 hod při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 0,1 g NaCl a produkt se vysrážel přídavkem 200 cm3 absolutního 2-propanolu. Produkt se po sedimentaci a dekantaci promyl absolutním 2-propanolem (50 cm3) a sušil při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,22 g bílého produktu.
FTIR (KBr): 2915 cm1 vfCH^, 1738 cm1 v(C=O), 1654 cm1.
Příklad 14. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou palmitovou
Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw = 350,4 ,103 g.mol'1) se míchal v 5 cm3 N,N-dimethylformamidu po dobu 16 hod při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,165 g;
0,64 mmol) probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min ve 10 cm3 AA-dimethylformamidu působením 0,094 cm3 triethylaminu (0,68 mmol) a 0,064 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,68 mmol). Takto vytvořená suspenze se zfiltrovala přes fritu č.3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod při teplotě 60 °C a poté po přídavku 20 cm3 vody další 1 hod při teplotě místnosti. Ke směsi bylo přidáno 0,1 g NaCl a produkt se vysrážel 200 cm3 absolutního 2-propanolu. Produkt se po sedimentaci a dekantaci promyl absolutním 2-propanolem (50 cm3) a sušil při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,28 g bílého produktu.
FTIR (KBr): 2915 cm1 1738 cm1 v(C=O) , 1654 cm1.
·· ·· ·· ·· ·· · · · · · ··· « ' ········· * · · · · ··· · · · · · · <···» ···· » ·· »· ·· ♦·
Příklad 15. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou palmitovou
Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw = 350,4 .10J g.mof1) byl míchán v 5 cm3 Ν,Ν-dimethylformamidu za přídavku 0,5 g LiCl po dobu 16 hod při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,165 g; 0,64 mmol) probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min v 10 cm3 Ν,Ν-dimethylformamidu působením 0,094 cm3 triethylaminu (0,68 mmol) a 0,064 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,68 mmol). Takto vytvořená suspenze byla zfiltrována přes fritu č.3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod při teplotě 60 °C a poté po přídavku 20 cm3 vody další 1 hod při teplotě místnosti. Ke směsi bylo přidáno 0,05 g NaCl a produkt byl vysrážen přídavkem 200 cm3 absolutního 2-propanolu. Produkt byl po sedimentaci a dekantaci promyt absolutním 2-propanolem (50 cm3) a sušen při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Bylo získáno 0,23 g bílého produktu.
FTIR (KBr): 2915 cm1 vfCH^, 1738 cm1 v(C=O), 1654 cm1.
Příklad 16. Modifikace hyaluronanu lithného kyselinou palmitovou
Hyaluronan lithný (0,15 g; 0,39 mmol; CPN spol. sr. o.) se míchal v 3 cm3 N,N-dimethylacetamidu za přídavku 0,25 g LiCl po dobu 16 hod při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,100 g; 0,39 mmol) probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min v 5 cm3 N,N-dimethylacetamidu působením 0,056 cm3 triethylaminu (0,40 mmol) a 0,039 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,40 mmol). Takto vytvořená suspenze se zfiltrovala přes fritu č.3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod při teplotě 60 °C a poté po přídavku 15 cm3 vody další 1 hod při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 0,05 g NaCl a produkt se vysrážel přídavkem 100 cm3 absolutního 2-propanolu a zfiltroval přes Bůchnerovu nálevku. Získalo se 0,12 g bílého produktu.
FTIR (KBr): 2915 cm' vfCH^, 1738 cm' v(OO) esteru , 1654 cm' v(C=O) karboxylu.
Příklad 17. Modifikace hyaluronanu lithného kyselinou palmitovou
Hyaluronan lithný (0,15 g; 0,39 mmol) se rozpustil ve 3 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu za 16 hod při teplotě 60 °C. Aktivace kyseliny palmitové (0,100 g; 0,39 mmol) probíhala při teplotě 0 °C po dobu 5 min v 5 cm3 AA-dimethylacetamidu působením 0,056 cm3 triethylaminu (0,40 mmol) a 0,039 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,40 mmol). Takto vytvořená suspenze byla •· ···· • · · ···· ··· ·· ···· ·· 999
ΛΛ 9 · 9 · · ··· · · · · · · ·· · · · · ·
9999 9 99 99 « ·· zfiltrovala přes fritu č.3 do roztoku předem připravené směsi hyaluronanu sodného. Reakce probíhala 5 hod při teplotě 60 °C a poté po přídavku 15 cm3 destilované vody další 1 hod při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 0,05 g NaCl a produkt se vysrážel přídavkem 100 cm3 absolutního 2-propanolu a zfiltroval přes Bůchnerovu nálevku. Získalo se 0,11 g bílého produktu.
FTIR (KBr): 2915 cm'1 1738 cm'1 v(C=O) esteru, 1654 cm'1 v(C-O) karboxylu.
Příklad 18. Modifikace tetrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové (HA-TBA) kyselinou palmitovou
Příprava tetrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové
Hyaluronan sodný (10 g; 0,026 mol; Mw = 3 80.103 g.mol'1) se rozpustil v 800 cm3 demineralizované vody a následně míchal se silně kyselým katexem (Amberlite H+ 120IR; Erspol s r. o.) po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Roztok se zfiltroval a míchal 6 hodin při teplotě místnosti s 9,44 g (0,0278 mol) tetrabutylamonium hydrogensíranu (CAS 32503-27-8; Sigma-Aldrich). Tetrabutylamonná sůl kyseliny hyaluronové se vysrážela přídavkem 2500 cm3 absolutního 2-propanolu a sušila při teplotě 50 °C přes noc.
Vlastní modifikační reakce
Kyselina palmitová (0,3203 g; 1,25 mmol) se rozpustila v 30 cm3 acetonu a přidalo se 0,175 cm3 triethylaminu (1,26 mmol). Acetonový roztok se vychladil na 8 °C (externě ledem) a poté se přikapalo 0,120 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,26 mmol). Aktivace probíhala 10 min při teplotě 8 °C a směs se následně filtrovala. Filtrát se postupně přidával do roztoku tetrabutylamoné soli kyseliny hyaluronové (0,5 g; 0,8 mmol) rozpuštěné v 50 cm3 dimethylsulfoxidu (CAS 67-68-5; Fisher-Scientific) za přídavku 0,175 cm3 triethylaminu (1,26 mmol). Reakce probíhala při teplotě 45 °C po dobu 5 hodin. Po skončení reakce bylo pH upraveno pomocí 0,1 M HC1 na hodnotu 4,8 a reakční směs se čistila dialýzou po dobu 3 dnů proti vodě a následně lyofilizována. Ze získaného produktu (0,5608 g) se dále odstranila tetrabutylamonná sůl pomocí katexu (Amberlite FT 120IR) vsádkovým způsobem. Po dekantaci katexu se roztok neutralizovál pomocí 0,lM NaOH a vyizolovala se suspenze vodorozpustného derivátu (0,2272 g) a nerozpustného podílu (0,0712 g). Výsledné podíly se extrahovaly (0,25%
AAAAAA 99 99 99 99 « A A · « A A AAA
A A AAAA A· ·*♦ « A A A · AAA A A A A A A A AA A A A A A
AAAA A AA AA AA AA vodný roztok, či suspenze) diethyletherem v objemovém poměru 1:1 a následně 2:1. Vodný roztok se zmrazil a lyofilizoval.
Získalo se 0,0186 g vodorozpustného derivátu a 0,0092 g ve vodě nerozpustného derivátu.
FTIR (KBr): nerozpustný podíl: 2954 víCH^, 2920 vfCHýas, 2850 cm1 v(CHi)s, 1731 cm'(C^O) ester; rozpustný podíl: píky menší intenzity: 2920 v(CH2)as, 2850 cm1 v (CHýs, 1734 cm'!(C=0) ester.
Příklad 19. Modifikace kyseliny hyaluronové ve formě HA-TBA-TBA kyselinou palmitovou
Kyselina palmitová (0,3220 g; 1,25 mmol) se rozpustila v 20 cm3 dimethylsulfoxidu a přidalo se 0,175 cm3 triethylaminu (1,26 mmol) a po dobrém rozmíchání se přidalo 0,120 cm3 chlormravenčanú ethylnatého (1,26 mmol). Reakční směs se za chlazení míchala 10 minut při teplotě 8 °C a následně zfiltrovala přes fritu č. 3 a získal se roztok směsného anhydridu.
HA-TBA-TBA připravená postupem v příkladu 13 (0,2 g) se rozpustila v 20 cm3 dimethylsulfoxidu a přidal se roztok směsného anhydridu palmitové kyseliny a reakční směs se míchala 20 h při 40 °C. Produkt se izoloval srážením 2-propanolem a následně se promýval 80% roztokem 2-propanolu (3-krát 100 cm3) a nakonec se promyl absolutním 2-propanolem. Získalo se 0,1637 g produktu. Derivát se rozpustil ve vodě v koncentraci 0,2 hmotnostních procent a převedl se přes kolonu naplněnou silně kyselým katexem v kyselé formě (Amberlite H+102 IR). Roztok převedený přes katex se neutralizoval pomocí 0,lM NaOH a lyofilizoval. Na vrstvě katexu zůstal nerozpuštěný podíl. Produkt se rozpustil (popř. suspendován) ve vodě v koncentraci 0,2 % a extrahoval se diethyletherem v objemovém poměru 1:1 a následně vodná fáze se extrahovala znovu diethyleterem v poměru 2:1. Vodná fáze se zamrazila a lyofilizovala. Získalo 0,0962 g vodorozpustného podílu a 0,0461 g vodného podílu z extrahované suspenze.
FTIR (KBr): vodorozpustný podíl: 2918 cm1 víCH^)^, 2850 ctri1 v(CH2)s, 1734 cm'1 (C=O) ester; extrahovaná suspenze: 2921 cm'1 v(CH2)a& 2852 cm'1 v(CH2)s, 1733 cm'1 (C=O) ester, 1701 cm'1 v(C=O).
• · ···· « 4 4 · 4 · 4·· » 4 4 44 4 4 444«
ΛJ ««»44 444 44 » 4 »
4 4 «4 · 4 4 4 4 • 444 4 44 44 44 4«
Příklad 20. Modifikace hyaluronanu sodného kyselinou 2,3-dibrompropanovou
Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw = 547,103 g.mol'') se spolu s 1 g LiCl rozpustil v 10 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu za míchám po dobu 16 hod při 70 °C za tvorby gelu. Kyselina 2,3-dibrompropanová připravená postupem v příkladu 7 (0,075 g; 0,32 mmol) se rozpustila v 10 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu spolu s 0,047 cm3 triethylaminu (0,34 mmol) a ochladila na 0 °C. Po 15 min míchám se k roztoku přidalo 0,032 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,34 mmol) a vzniklá suspenze se intenzívně míchala po dobu 5 min a poté zfiltrovala do předem připraveného gelu hyaluronanu sodného. Reakce probíhala po dobu 5 hod při teplotě 40 °C. Reakční směs se naředila 25 cm3 vody a po přídavku 0,1 g NaCl se produkt vysrážel přídavkem 200 cm3 absolutního 2-propanolu a zfiltroval přes skládaný filtr a promyl 3krát 30 cm3 absolutního 2-propanolu. Po usušení při teplotě 40 °C se získalo 0,24 g produktu.
FTIR (KBr): 2924 cm' 1734 cm1 v(C=O), 1622 cm1, 1434 cm1, 1377 cm1,
601 cm'1.
Příklad 21. Modifikace hyaluronanu sodného N,N-dihexyl-3-amino-octovou kyselinou
Příprava N,N-dihexyl-3 -aminooctové kyseliny (C AS 193623-50-6)
Glycin (5 g; 66,6 mmol; CAS 56-40-6; Merck) se rozmíchal spolu s 21,63 cm3 hexyljodidu (146,57 mmol; CAS 638-45-9; Sigma-Aldrich) ve 20 cm3 acetonu. Směs se zahřála na 50 °C a postupně se přidaln 1 g Na2CO3. Reakce probíhala pod zpětným chladičem při teplotě 70 °C po dobu 42 hod. Před izolací bylo pH upraveno koncentrovanou HC1 (35 %) na hodnotu 4,0 a po vysrážení přídavkem 300 cm3 acetonu se sraženina zfiltrovala přes skládaný filtr. Sraženina se potom znovu rozmíchala v acetonu (300 cm3) a znovu zfiltrovala. Výsledný produkt (6,02 g; 24,73 mmol) se sušil při teplotě 45 °C.
FTIR (KBr): 3425 cm‘, 3123 cm1, 2842 cm' v(CHi)s, 1716 cm1 v(C=O) karboxylu, 1592 cm1, 1469 cm‘1462 cm' ÓlCHý, 1407 cm1, 1336 cm1, 1254 cm1, 1128 cm1, 673 cm'.
Vlastní modifikační reakce
V 10 cm3 acetonu se rozmíchálo 0,063 g kyseliny N,N-dihexyl-3-aminooctové (0,26 mmol) a po vychlazení na 0 °C se ke směsi přidalo 0,025 cm3 chlormravenčanu ethylnatého. Po 5 min se směs přilila k 1% roztoku hyaluronanu sodného (0,5 g; 1,29 mmol) ve vodě. Za ·· ···· • « · · · · · · · · • · ···· ····· · · · · · ··· · · · · · XJ ·· »······ ··«·· ·· ·· · · · · intenzivního míchání se roztok ponechal 3 hod při teplotě místnosti. Produkt se izoloval přídavkem 0,1 g NaCl a přídavkem 200 cm3 čistého 2-propanolu. Po filtraci přes skládaný filtr se produkt znovu promyl 2-propanolem. Získalo 0,49 g produktu.
FTIR (KBr): 2957 cm1 2928 cm1 2858 cm1 v(CH^s, 1740 cm1 v(C-O), 1645 cm', 1618 cm1 δ(ΝΗ), 1580 cm1, 1469 cm’ S(CHj).
Příklad 22. Modifikace hyaluronanu sodného N,N-dihexyl-3-amino-octovou kyselinou
Ve 20 cm3 acetonu se rozpustilo 0,316 g kyseliny A,A-dihexyl-3-aminooctové (1,30 mmol) připravené postupem popsaným v příkladu 9. Po vychlazení na 0 °C bylo se ke směsi přidalo 0,130 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,36 mmol) a po 5 min intenzivního míchám se směs přilila k 1% roztoku hyaluronanu sodného (1 g; 2,57 mmol) ve vodě. Reakční směs se míchala po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. Produkt se vyizoloval přídavkem 0,1 g NaCl a 500 cm3 2-propanolu, promyl 80% 2-propanolem (vodná směs) a absolutním 2-propanolem. Produkt se dekatoval a sušil při teplotě 45 °C. Získalo se 1,29 g produktu.
FTIR (KBr): 2957 cm' v(CHi)as, 2928 cm1 vfCHJa* 2858 cm'1 v(CH2)s, 1740 cm' v(C=O), 1645 cm'1,1618 cm1 δ(ΝΗ), 1580 cm', 1469 cm1 6(CHj).
Příklad 23. Modifikace hyaluronanu sodného hyaluronové kyselinou 3-jódpropionovou
Kyselina 3-jódpropionová (0,0429 g; 0,215 mmol; CAS 141-76-4; Acros Organics) se rozpustila ve 20 cm3 acetonu. Za chladu se k roztoku přidalo 0,0313 cm3 triethylaminu (0,226 mmol) a 0,0215 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,226 mmol). Po 10 min aktivace při teplotě -5 °C se roztok vpravil do 0,5 % vodného roztoku kyseliny hyaluronové (0,5 g). Během reakce se pH roztoku udržovalo 5% roztokem NaOH v rozmezí 8,0 - 8,5. Po skončení reakce (3 hod) se k roztoku přidalo 0,1 g NaCl a 100 cm3 acetonu. Derivát se zfiltroval přes skládaný filtr a sušil při teplotě 45 °C. Derivát se poté znovu rozpustil v 50 cm3 vody a znovu se vysrážel přídavkem 100 cm3 acetonu. Produkt se vysušil při teplotě 45 °C. Získalo se 0,48 g produktu.
FTIR (KBr): 2899 cm1 v(CH2)s, 1734 cm-1 v(C=O) esteru, 1654 cm' v(C=O) karboxylu, 1558 cm1, 1375 cm1,1317 cm1. 623 cm' v(C-I).
• · ♦··· • · « · · · · · · · • · · · · · · · ··· · · · · · ·♦♦ ♦ · · · ·
2o ♦ · ♦*♦·♦·· ···· * ·· ·· ** ··
Příklad 24. Roubování chitosanu kyselinou hyaluronovou
Kyselina hyaluronová (0,2636 g; 0,72 mmol; Mw = 80,48.103 g.mol'1; CAS 9004-61-9; CPN spol. sr. o.) ve formě volné kyseliny se rozpustila ve 30 cm3 pyridinu (CAS 110-86-1; Lach-Ner) za tvorby gelu (nutno míchat 24 hodin), který se aktivoval při teplotě 0 °C přídavkem 0,0694 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,73 mmol) po dobu 10 min. Tento gel se vnesl do zahřáté suspenze 0,5% chitosanu v demineralizované vodě (0,1 g; 0,57 mmol; stupeň deacetylace 69 %) o pH 6,5 a teplotě 85 °C. Po 30 minutách míchání se reakční směs zvolna zchladila k teplotě místnosti a míchála se ještě 2 hodiny. Posléze se přidalo 500 cm3 demineralizované vody a tolik 10% roztoku NaOH, aby se z roztoku začal vylučovat polymer (pH přibližně 6,5), který se po sedimentaci promyl 3-krát 80% 2-propanolem (50 cm3; směs s vodou) a 2-krát absolutním 2-propanolem (50 cm3). Produkt se sušil při teplotě 50°C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,1135 g nažloutlého produktu.
FTIR (KBr): 2922 cm'1 v(CH2881 cm'1 vfCHJs, 1734 cm’ v(C=O), 1616 cm1, 1417 cm'1,1377 cm'1, 667 cm'1.
Příklad 25. Roubování hyaluronanu sodného kyselinou glukuronovou
Kyselina glukuronová (0,2427 g; 1,25 mmol; CAS 14984-34-0; Serva Feinbiochemica) se rozmíchala ve 20 cm3 acetonu při 8 °C (externí chlazení ledem), přidalo se 0,183 cm3 triethylaminu (1,32 mmol) a při teplotě 8 °C se aktivovala přídavkem 0,125 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,37 mmol) po dobu 10 min. Tato směs se vnesla do 0,5% roztoku sodné soli hyaluronové kyseliny v demineralizované vodě (0,5 g; 1,25 mmol; Mw = 389.103 g.mof1) o pH 7,0. Po 4 hodinách míchání se přidalo 250 mg NaCl a 250 cm3 absolutního 2-propanolu. Po sedimentaci se produkt promyl 3-krát 80% 2-propanolem (50 cm3; směs s vodou; míchání 60 minut) a 2-krát absolutním 2-propanolem (50 cm3; míchání 15 minut). Produkt se sušil při teplotě 50 °C po dobu asi 14 hodin. Získalo se 0,4512 g bílého produktu.
FTIR (KBr): 2922 cm'1 vfCH^, 2897 cm1 v(CH2)s, 1733 cm'1 v(OO), 1616 cm', 1558 • ΒΒΒ β ·· ·· ·· ·· • Β Β · · · ·
Β Β Β Β Β Β ΒΒΒ
Β · III · · · · · • · Β ΒΒΒ» β Β ΒΒ · Β ·*
Příklad 26. Roubování hyaluronanu sodného chitosanem
Hyaluronan sodný (0,25 g; 0,64 mmol; Mw = 547,103 g.rnol·1) se spolu s 1 g LiCl rozpouštěl v 10 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu po dobu 16 hod při 70 °C za tvorby gelu. Kyselina 2,3-dibromakrylová (0,075 g; 0,32 mmol) připravená postupem popsaném v příkladu 7 se rozpustila v 10 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu spolu s 0,047 cm3 triethylaminu (0,34 mmol) a ochladila na 0 °C, po 15 min se k roztoku přidalo 0,032 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (0,34 mmol) a vzniklá suspenze se intenzívně míchala po dobu 5 min a poté zfiltrovala do předem připraveného gelu hyaluronanu sodného. Reakce probíhala po dobu 5 hod při teplotě 40 °C. Chitosan (0,25 g; 1,44 mmol) se rozpustil v 15 cm3 vody za přídavku 1 cm31M HC1. Zvýšením pH na hodnotu 7,0 10 % vodným roztokem NaOH se vytvořil gel, který se přidal do reakční směsi. Reakční směs se míchala další hodinu při teplotě 60 °C. Produkt se vysrážel přídavkem 200 cm3 absolutního 2-propanolu a zfiltroval přes skládaný filtr a promyl 3krát 30 cm3 absolutního 2-propanolu. Po usušení pří teplotě 40°C se získalo 0,52 g produktu.
FTIR (KBr): 2922 cm1 vfCH^, 2881 cm1 v(CHi)s, 1734 cm1 v(C=O), 1616 cm1, 1417 cm'1, 1377 cm', 667 cm1.
Příklad 27. Modifikace schizophylanu kyselinou hexanovou
Kyselina hexanová (1,148 cm3; 9,202 mmol) se rozpustila ve 4 cm3 N,N-dimethylformamidu s přídavkem triethylaminu (1,280 ml; 9,202 mmol). Roztok se ochladil na ledové lázni a za bezvodých podmínek se pomalu přikapal chlormravenčan ethylnatý (0,876 cm3; 9,202 mmol). Během několika sekund začala vypadávat z roztoku sraženina triethylamoniumchloridu. Po deseti minutách intenzivního míchání se suspenze kvantitativně přenesla k 10% suspenzi schizophylanu (0,600 g; 1,840 mmol/disacharid; CAS 9012-72-0; CPN spol. sr. o.) v Ν,Ν-dímethylformamidu s pyridinem (0,297 cm3; 3,681 mmol) a směs se míchal přes noc při teplotě 60 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se k reakční směsi přidalo 10 cm3 CHCI3 a suspenze se homogenizovala za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s), zfiltroval za užití Buchnerovy nálevky a sypký produkt se promyl CHCI3 a suspendoval v CHCI3. Tento proces extrakce lipofilních látek do CHCI3 se opakoval třikrát. Poté se sraženina postupně suspendovala v 80%, 80% a absolutním 2-propanolu (80 cm3) za užití dispergačního míchadla s následným odstředěním (6500 otáček/min; 20 min). Výsledný ester se sušil při 50 °C přes noc. Tímto postupem se získalo 0,35 g lehce nažloutlých krystalů schizophylan-hexanoátu.
FTIR (KBr): 2957, 2932, 2874, 1736,1637,1450,1419, 1375 cm'.
·· ··*· ·· ·· ·· ·· • · · »··· ♦ · » • · · · · · · · ··· -)0 · · » · · »·· * · · · · ώΟ · · ·· ····· ·· · · · · · · · · · · ·
Příklad 28. Modifikace schizophylanu kyselinou hexanovou
Kyselina hexanová (0,172 cm3; 1,38 mmol) se rozpustila ve 30 cm3 N,N-dimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,192 cm3 triethylaminu (1,38 mmol) a 0,132 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,38 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala přes fritu č. 3 na schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) v pevném stavu. Reakce běžela po dobu 15 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se naředila 30 cm3 vody a míchala další 4 hodiny při teplotě místnosti. Produkt se vysrážel přídavkem 150 cm3 absolutního 2-propanolu a vysušil při teplotě 45 °C. Získalo se 0,52 g produktu.
FTIR (KBr): 2926 cm'1 vjCH^, 1734 cm1 v(OO), 1628 cm' v(C-O), 1512 cm1, 1454 cm'1 ó(CH2).
Příklad 29. Modifikace schizophylanu kyselinou hexanovou
Schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) se míchal 16 hod při teplotě 60 ĎC v 10 cm3 N,N-dimethylacetamidu za vzniku gelu. Kyselina hexanová (0,364 cm3; 2,78 mmol) se rozpustila v 10 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k jejímu roztoku přidalo 0,405 cm3 triethylaminu (2,91 mmol) a 0,278 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (2,91 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala přes fritu č. 3 do předem připraveného gelu schizophylanu. Reakce běžela po dobu 5 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se poté naředila 15 cm3 vody a míchala další hodinu při teplotě místnosti. Produkt se vysrážel 200 cm3 absolutního 2-propanolu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a izoloval odstředěním (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se promyl 100 cm3 absolutního 2-propanolu a opět izoloval odstředěním a sušil při 50 °C. Získalo se 0,49 g produktu.
FTIR (KBr): 2926 cm1 v(CHi)as, 1734 cm'1 v(C=O), 1628 cm'1 v(C-O), 1512 cm'1, 1454 cm’ Ó(CH2).
Příklad 30. Modifikace schizophylanu kyselinou palmitovou
Kyselina palmitová (0,356 g; 1,39 mmol) se rozpustila v 15 cm3 N,N-dimethylformamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,192 cm3 triethylaminu (1,39 mmol) a 0,132 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (1,39 mmol). Po 5 min míchání se suspenze filtrovala přes fritu č. 3 do schizophylanu (0,5 g; 2,78 mmol) rozpuštěného v 15 cm3 N,NI ·· ···· ·· ·« ·· ·· • · · · · · · ··« « · ···· · · «·· __ · · · · · ··· · · 9 ·
7<J 9 9 99 9999
9999 · ·· ·· ·· ··
-dimethylformamidu. Reakce běžela po dobu 15 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se naředila 30 cm3 vody a míchala další 2 hodiny. Produkt se vysrážel přídavkem 150 cm3 absolutního 2-propanolu. Získalo se 0,62 g produktu.
FTIR (KBr): 2918 cm' 2851 cm1 vfCH^s, 1738 cm1 v(C=O), 1628 cm‘ v(C0.1510 cm‘, 1460 cm1 č(CHz), 723 cm1 (ůfCHj).
Příklad 31. Modifikace schizophylanu kyselinou palmitovou
Schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) se míchal 16 hod při teplotě 60 °C v 10 cm3 N,N-dimethylacetamidu za vznilu gelu. Kyselina palmitová (0,712 g; 2,78 mmol) se rozpustila v 15 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,405 cm3 triethylaminu (2,91 mmol) a 0,278 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (2,91 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala přes fřitu č. 3 do předem připraveného gelu. Reakce běžela po dobu 5 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se poté naředila 15 cm3 vody a míchala další hodinu při teplotě místnosti. Produkt se vysrážel přídavkem 200 cm3 absolutního 2-propanolu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a izoloval odstředěním (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se smíchal s20 cm3 acetonu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 ot./min, max 30 s). Po přídavku 100 cm3 absolutního 2-propanolu se opět homogenizoval a odstředil. Produkt se sušil při 45 °C. Získalo se 0,67 g produktu.
FTIR (KBr): 2918 cm1 v(CH^, 2851 cm1 v(CH;)s, 1738 cm1 v(C=O), 1628 cm‘ v(CO), 1510 cm1, 1460 cm1 ó(CHi), 723 cm1 cofCHi).
Příklad 32. Modifikace schizophylanu kyselinou palmitovou
Schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) se míchal 16 hod při teplotě 60 °C v 10 cm3 N,N-imethylacetamidu za přídavku 1 g LiCl. Kyselina palmitová (0,712 g; 2,78 mmol) se rozpustila v 10 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,405 cm3 triethylaminu (2,91 mmol) a 0,278 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (2,91 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala přes fřitu č. 3 do předem připraveného gelu. Reakce běžela po dobu 5 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se poté naředila 15 cm3 vody a míchala další hodinu při teplotě místnosti. Produkt se vysrážel přídavkem 200 cm3 absolutního 2-propanolu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a • 4 44 44 ·
4 4 4 · · · • · · 4 4 4 ··· • · · 4 44 4 4 4 4 · • · 4 · · · · • 4 44 44 44 ···· izoloval odstředěním (odstředivka: Beckman J2-21) při 5000 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se smíchal s 20 cm3 acetonu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s). Po přídavku 100 cm3 absolutního 2-propanolu se opět homogenizoval a odstředil. Produkt se sušil při 45 °C. Získalo se 0,53 g produktu.
FTIR (KBr): 2918 cm‘ vlCH^, 2851 cm1 v(CHt)s, 1738 cm1 v(OO), 1628 cm1 v(CO), 1510 cm1,1460 cm' ó(CHj), 723 cm1 míCHý.
Příklad 33. Modifikace schizophylanu kyselinou thioglykolovou
Schizophylan (0,5 g; 2,78 mmol) se míchal 16 hod při teplotě 60 °C v 10 cm3 N,N-imethylacetamidu za vzniku gelu. Kyselina thioglykolová (0,396 cm3; 2,78 mmol) se rozpustila v 15 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu. Za teploty 0 °C se k roztoku přidalo 0,405 cm3 triethylaminu (2,91 mmol) a 0,278 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (2,91 mmol). Po 5 min intenzivního míchání se suspenze filtrovala přes fritu č. 3 do předem připraveného gelu. Reakce běžela po dobu 5 hodin při teplotě 60 °C. Reakční směs se poté naředila 15 cm3 vody a míchala další hodinu při teplotě místnosti. Produkt se vysrážel 200 cm3 absolutního 2-propanolu a homogenizoval za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a odstředěn (odstředivka: Beckman J2-21) pň 6500 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt byl promyt znovu homogenizován pomocí dispergačního míchadla ve 100 cm3 absolutního 2-propanolu a opět izolován odstředěním a sušen při 50 °C. Bylo získáno 0,58 g produktu.
FTIR (KBr): 2924 cm' vfCHj)^ 1738 cm1 v(C=O), 1701 cm-1, 1620 cm1 v(C-O), 1508 cm1, 1460 cm 1 5(CHi), 723 cm1 (otCHl).
Příklad 34. Modifikace schizophylanu fluorescenční sondou - pyren-l-karboxylovou kyselinou
Fluroscenční sonda, pyren-l-karboxylová kyselina (0,02 g; Mw = 246,26; CAS 1969402-1; Sigma-Aldrich), byla rozpuštěna v 10 cm3 acetonu. Za chladu bylo k roztoku přidáno 8,22 mg triethylaminu (0,081 mmol) a 8,81 mg chlormravenčanu ethylnatého (0,081 mmol). Po 10 min aktivace byl tento roztok přidán k čirému gelu tvořeného schizophyllanem (1 g; 3,56 mmol) ve 100 cm3 vody o pH 10,0. Reakční směs byla intenzívně míchána po dobu 3 hodin. Výsledný produkt byl vysrážen a několikrát promyt acetonem k odstranění nezreagované fluorescenční sondy. Fluorescenční derivát schizophylanu byl sušen na vzduchu. Derivát vykazuje silnou ·· ···· ·· ·· · ·· • · · · · · 9 ··· • · · ·· · · · · ·· • · · · ·«···» ·· · • · ·· · · · · · ···· · ·· ·· ·· ·* modrou fluorescenci s maximem excitační absorpce při 343 - 361 nm a s maximem emise při 384 - 409 nm.
Příklad 35. Modifikace schizophylanu fluorescenční sondou -4-(naftol(l,2-d)(l,2,3)-triazol-2-yl) benzoovou kyselinou
Fluroscenční sonda, 4-(naftol(l,2-d)(l,2,3)-triazol-2-yl) benzoová kyselina (0,02 g; Mw = 289,29; CAS 635727-98-9; Univerzita Pardubice), byla rozpuštěna v 10 cm3 acetonu. Za chladu bylo k roztoku přidáno 7,00 mg triethylaminu (0,069 mmol) a 7,50 mg chlormravenčanu ethylnatého (0,069 mmol). Po 10 min aktivace byl tento roztok přidán k čirému gelu tvořeného schizophyllanem (1 g; 3,56 mmol) ve 100 cm3 vody o pH 10,0. Reakční směs byla intenzívně míchána po dobu 3 hodin. Výsledný produkt byl vysrážen a několikrát promyt acetonem k odstranění nezreagované fluorescenční sondy. Fluorescenční derivát schizophylanu byl sušen na vzduchu. Derivát vykazuje silnou fluorescenci s maximem excitační absorpce při 345 - 370 nm a s maximem emise při 390 - 400 nm.
Příklad 36. Modifikace schizophylanu fluorescenční sondou -l,2-naftoylenbenzimidazol-6-karboxylovou kyselinou
Fluroscenční sonda, l,2-naftoylenbenzimidazol-6-karboxylová kyselina (0,02 g; Mw = 314,29; CAS 96840-80-1; VÚOS a.s. Pardubice), se rozpustila v 10 cm3 acetonu. Za chladu se k roztoku přidalo 6,44 mg triethylaminu (0,064 mmol) a 6,90 mg chlormravenčanu ethylnatého (0,064 mmol). Po 10 min aktivace se tento roztok přidal k čirému gelu tvořenému schizophyllanem (1 g; 3,56 mmol) ve 100 cm3 vody o pH 10,0. Reakční směs se intenzívně míchala po dobu 3 hodin. Výsledný produkt se vysrážel a několikrát promyl acetonem k odstranění nezreagované fluorescenční sondy. Fluorescenční derivát schizophylanu se sušil na vzduchu. Derivát vykazuje silnou fluorescenci s maximem absorpce při 391 - 396 nm a s maximem emise při 495 - 523 nm.
4444
44 4» ··
4 4 4 4 4 4 4 · 4 a · 4 4 4 4 · · «··
W 4 4 4 * 4 444 4 4 4 4 «
J4 · · 44 4444·
4444 4 44 44 4« 44
Příklad 37. Modifikace oxycelulózy kyselinou hexanovou
Oxycelulóza ve formě vápenaté soli (0,5 g; 2,56 mmol; CAS 52001-91-9, Aliachem a.s.) se rozpustila za přídavku 1 g LiCl v 10 cm3 AA-dimethylacetamidu, a to mícháním nejprve 20 hod při 60 °C a pak 2 hod při 100 °C. Ke směsi se přidalo 50 cm3 absolutního ethanolu, a po rozmíchání se oddestiloval ve formě azeotropu s vodou. K takto připravenému gelu se přikapala aktivovaná kyselina hexanová (0,356 cm3; 2,85 mol). Aktivace probíhala v 10 cm3 N,Ndimethylacetamidu při teplotě 0 °C přídavkem 0,419 cm3 triethylaminu (3,24 mmol) a 0,294 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (3,24 mmol). Vlastní modifikační reakce probíhala při teplotě 65 °C po dobu 5 hodin. Směs se posléze naředila 30 cm3 vody a vysrážela přídavkem 200 cm3 absolutního 2-propanolu, homogenizovala za použití dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a odstředila (odstředivka: Beckman J2-21) při 6500 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se znovu homogenizoval pomocí dispergačního míchadla v 100 cm3 absolutního 2-propanolu a izoloval odstředěním a sušil při 50 °C. Získalo se 0,45 g produktu.
FTIR (KBr): 2923 cm1 vfCH^, 1738 cm1 v(C=O) esteru , 1612 cm’ v(OO) karboxylu, 1420 cm'.
Příklad 38. Modifikace alginátu sodného kyselinou hexanovou
Kyselina alginová ve formě sodné soli (0,5 g; 2,58 mmol; CAS 9005-38-3, Sigma-Aldrich) se míchala spolu s 1 g LiCl v 5 cm3 Ν,Ν-dimethylacetamidu, a to mícháním nejprve 20 hod při 60 °C a pak 2 hod při 100 °C. Ke směsi se přidalo 50 cm3 absolutního ethanolu, a po rozmíchání se oddestiloval ve formě azeotropu s vodou. K takto připravenému gelu se přikapala aktivovaná kyselina hexanová (0,356 cm3; 2,85 mol). Aktivace probíhala v 10 cm3 N,N-dimethylacetamidu při teplotě 0 °C přídavkem 0,419 cm3 triethylaminu (3,24 mmol) a 0,294 cm3 chlormravenčanu ethylnatého (3,24 mmol). Vlastní modifikační reakce probíhala při teplotě 65 °C po dobu 7 hodin. Směs se posléze naředila 50 cm3 vody a vysrážela přídavkem 200 cm3 absolutního 2-propanolu, homogenizovala za použiti dispergačního míchadla (13500 otáček/min, maximálně 30 s) a odstředila (odstředivka: Beckman J2-21) při 6500 otáček/min po dobu 15 minut. Produkt se znovu homogenizoval pomocí dispergačního míchadla v 100 cm3 absolutního 2-propanolu a izoloval odstředěním a sušil při 50 °C. Získalo se 0,48 g produktu.
FTIR (KBr): 2923 cm1 v(CH2)as, 1740 cm1 v(C=O) esteru , 1612 cm1 v(C=O) karboxylu, 1420 cm'1.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy derivátů polysacharidů, vyznačující se tím, že polysacharid reaguje v prostředí vody nebo organického rozpouštědla se směsným anhydridem obecného vzorce I, připraveným v prostředí organického rozpouštědla za působení chlormravenčanu alkylnatého obecného vzorce Π na sloučeninu obecného vzorce ΠΙ v přítomnosti báze, za vzniku sloučeniny obecného vzorce IV.
    (Rl-C(=O)OC(=O)OR) (I) (C1C(=O)OR2) (Π) R‘-COOH(IH) -X-C(=O)R'(IV) kde R1 je zbytek alifatického, cykloalifatického, aromatického či heterocyklického charakteru s počtem uhlíků Cj-Cis obsahující jednu nebo více karboxylových skupin.
    Rz je methyl až oktadecyl
    X = NH,O, COO,S a kde báze označuje organické báze jako trialkylamin YjN nebo pyridin, kde Y = C,-C16
  2. 2. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že polysacharidy zahrnují chitosan, chitin, glukan, kyselinu hyaluronovou, kyselinu alginovou a oxycelulózu.
  3. 3. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že chitosan má molekulovou hmotnost v rozsahu 1.103 až 5.104 5 g.mol'1 a je ve formě acetylované, kde stupeň acetylace dosahuje 0-100 %, neboje ve formě hydrochloridu.
  4. 4. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová má molekulovou hmotnost v rozsahu 1.103 až 5.106 g.mol'1 a je ve formě volné kyseliny, nebo ve formě stabilní farmaceuticky přijatelné soli, nebo ve formě tetrabutylamonné soli
    HA-TBAresp. HA-TBA-TBA.
    -Μ
    A •4 ·**· • r · • · « · • 9 «··· · • · I» « · · • · 9 • »·< · • · · • 4 »· • 4 4« • · ·
    9 4 99·
    9 9· 9
    4 9 4 » • 4 ··
  5. 5. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že glukan je specifikován jako β-(l,3)-glukan, β-( 1,3),(1,6)-D-glukan, p-(l,6)*D-glukan nebo jejich karboxymethylderiváty s molekulovou hmotností v rozsahu 1.103 až 1.106 g.mol'1.
  6. 6. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že oxycelulóza je ve formě volné kyseliny nebo ve formě stabilní farmakologicky přijatelné soli.
  7. 7. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že kyselina alginová je ve formě volné kyseliny nebo ve formě stabilní farmakologicky přijatelné soli.
  8. 8. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakce polysacharidu se směsným anhydridem probíhá v prostředí vody nebo organického rozpouštědla při pH 2 -11, teplotě 0 °C - 150 °C v přítomnosti přídavných látek, koncentrace polysacharidu je 0,01 - 10 hmotn.% celkové hmotnosti směsi.
  9. 9. Způsob přípravy podle nároku 8, vyznačující se tím, že přídavné látky podle nároku 8 jsou kationické a neionogenní tenzidy a soli LiCl, tetrabutylamonium bromid, tetrabutylamonium hydrogensulfát.
  10. 10. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakce chlormravenčanu alkylnatého obecného vzorce Π se sloučeninou obecného vzorce ΙΠ probíhá při teplotě -15 °C až +15 °C po dobu 0-20 min v prostředí organického rozpouštědla.
  11. 11. Organické rozpouštědlo podle nároku 8 a 10, vyznačující se tím, že je mísitelné s vodou a zahrnuje aceton, N,N-dimethylformamid, Ν,Ν-dimethylacetamid, N-methylpyrrolidon, dimethylsulfoxid, 1,4-dioxan, pyridin, l-methyl-2-pyrrolidon, tetrahydrořuran.
CZ20060605A 2006-09-27 2006-09-27 Zpusob prípravy derivátu polysacharidu CZ302856B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20060605A CZ302856B6 (cs) 2006-09-27 2006-09-27 Zpusob prípravy derivátu polysacharidu

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20060605A CZ302856B6 (cs) 2006-09-27 2006-09-27 Zpusob prípravy derivátu polysacharidu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2006605A3 true CZ2006605A3 (cs) 2008-04-09
CZ302856B6 CZ302856B6 (cs) 2011-12-14

Family

ID=39262768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20060605A CZ302856B6 (cs) 2006-09-27 2006-09-27 Zpusob prípravy derivátu polysacharidu

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ302856B6 (cs)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ301555B6 (cs) * 2008-11-06 2010-04-14 Cpn S. R. O. Zpusob prípravy DTPA sítovaných derivátu kyseliny hyaluronové a jejich modifikace
CZ301899B6 (cs) * 2009-03-17 2010-07-21 Contipro C, A.S. Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové pomocí O-acyl-O´-alkylkarbonátu v prítomnosti substituovaného pyridinu
WO2014082609A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Contipro Biotech S.R.O. C6-c18-acylated derivative of hyaluronic acid, method of preparation thereof, nanomicellar composition on its basis, method of preparation thereof and method of preparation stabilized nanomicellar composition, and use thereof
US9403918B2 (en) 2009-12-11 2016-08-02 Contipro Pharma A.S. Oxidized derivative of hyaluronic acid, a method of preparation thereof and a method of modification thereof
US9434791B2 (en) 2009-12-11 2016-09-06 Contipro Pharma A.S. Method of preparation of an oxidized derivative of hyaluronic acid and a method of modification thereof
US9492586B2 (en) 2012-02-28 2016-11-15 Contipro Biotech S.R.O. Derivatives of hyaluronic acid capable of forming hydrogels
US9522966B2 (en) 2012-08-08 2016-12-20 Contipro Biotech S.R.O. Hyaluronic acid derivative, method of preparation thereof, method of modification thereof and use thereof
US10023658B2 (en) 2014-03-11 2018-07-17 Contipro A.S. Conjugates of oligomer of hyaluronic acid or of a salt thereof, method of preparation thereof and use thereof
US10414832B2 (en) 2015-06-26 2019-09-17 Contipro A.S Derivatives of sulfated polysaccharides, method of preparation, modification and use thereof
US10618984B2 (en) 2016-06-27 2020-04-14 Contipro A.S. Unsaturated derivatives of polysaccharides, method of preparation thereof and use thereof
US10617711B2 (en) 2014-06-30 2020-04-14 Contipro A.S. Antitumor composition based on hyaluronic acid and inorganic nanoparticles, method of preparation thereof and use thereof
US10689464B2 (en) 2015-03-09 2020-06-23 Contipro A.S. Self-supporting, biodegradable film based on hydrophobized hyaluronic acid, method of preparation and use thereof
US10759878B2 (en) 2015-06-15 2020-09-01 Contipro A.S. Method of crosslinking of polysaccharides using photoremovable protecting groups

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ304303B6 (cs) * 2012-11-27 2014-02-19 Contipro Biotech S.R.O. Vlákna založená na hydrofobizovaném hyaluronanu, způsob jejich přípravy a použití, textilie na jejich bázi a použití
CN103724455B (zh) * 2013-12-11 2016-07-06 四川大学 一种透明质酸衍生物及其水凝胶的制备方法
CZ2016826A3 (cs) 2016-12-22 2018-07-04 Contipro A.S. Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB487020A (en) * 1936-10-29 1938-06-14 British Celanese Improvements in or relating to the manufacture of esters of polysaccharides
JPS5930163B2 (ja) * 1981-08-13 1984-07-25 工業技術院長 Ｎ−アシル化キトサンの製造方法
US5498708A (en) * 1989-07-18 1996-03-12 Montefiore Medical Center Method of synthesizing polyesters
JP3563440B2 (ja) * 1994-05-16 2004-09-08 生化学工業株式会社 アシル化ヒアルロン酸の製造法
DE19604706A1 (de) * 1996-02-09 1997-08-14 Merck Patent Gmbh Vernetzungsprodukte von Aminogruppen-haltigen Biopolymeren
JP3975267B2 (ja) * 2002-06-03 2007-09-12 独立行政法人産業技術総合研究所 多糖物質のアシル化方法

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ301555B6 (cs) * 2008-11-06 2010-04-14 Cpn S. R. O. Zpusob prípravy DTPA sítovaných derivátu kyseliny hyaluronové a jejich modifikace
CZ301899B6 (cs) * 2009-03-17 2010-07-21 Contipro C, A.S. Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové pomocí O-acyl-O´-alkylkarbonátu v prítomnosti substituovaného pyridinu
WO2010105582A1 (en) * 2009-03-17 2010-09-23 Contipro C A.S. A method of modification of hyaluronic acid by means of (o-acyl-o'-alkyl carbonate - substituted pyridine) complex
US9403918B2 (en) 2009-12-11 2016-08-02 Contipro Pharma A.S. Oxidized derivative of hyaluronic acid, a method of preparation thereof and a method of modification thereof
US9434791B2 (en) 2009-12-11 2016-09-06 Contipro Pharma A.S. Method of preparation of an oxidized derivative of hyaluronic acid and a method of modification thereof
US9492586B2 (en) 2012-02-28 2016-11-15 Contipro Biotech S.R.O. Derivatives of hyaluronic acid capable of forming hydrogels
US9522966B2 (en) 2012-08-08 2016-12-20 Contipro Biotech S.R.O. Hyaluronic acid derivative, method of preparation thereof, method of modification thereof and use thereof
WO2014082609A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Contipro Biotech S.R.O. C6-c18-acylated derivative of hyaluronic acid, method of preparation thereof, nanomicellar composition on its basis, method of preparation thereof and method of preparation stabilized nanomicellar composition, and use thereof
US9999678B2 (en) 2012-11-27 2018-06-19 Contipro A.S. C6-C18-acylated derivative of hyaluronic acid and method of preparation thereof
US10023658B2 (en) 2014-03-11 2018-07-17 Contipro A.S. Conjugates of oligomer of hyaluronic acid or of a salt thereof, method of preparation thereof and use thereof
US10617711B2 (en) 2014-06-30 2020-04-14 Contipro A.S. Antitumor composition based on hyaluronic acid and inorganic nanoparticles, method of preparation thereof and use thereof
US10689464B2 (en) 2015-03-09 2020-06-23 Contipro A.S. Self-supporting, biodegradable film based on hydrophobized hyaluronic acid, method of preparation and use thereof
US10759878B2 (en) 2015-06-15 2020-09-01 Contipro A.S. Method of crosslinking of polysaccharides using photoremovable protecting groups
US10414832B2 (en) 2015-06-26 2019-09-17 Contipro A.S Derivatives of sulfated polysaccharides, method of preparation, modification and use thereof
US10618984B2 (en) 2016-06-27 2020-04-14 Contipro A.S. Unsaturated derivatives of polysaccharides, method of preparation thereof and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CZ302856B6 (cs) 2011-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2006605A3 (cs) Zpusob modifikace polysacharidu
US11939433B2 (en) Method for preparing acylated crosslinked glycosaminoglycans
JP5123285B2 (ja) アクリル化ヒアルロン酸
US8415326B2 (en) Pharmaceutical composition comprising chito-oligomers
Somorin et al. Studies on chitin. II. Preparation of benzyl and benzoylchitins
EP0356275B1 (fr) Glycosaminoglycanes sélectivement O-acylés
Biswas et al. Biomedical applications carboxymethyl chitosans
Feng et al. Solubility, chain characterization, and derivatives of chitin
Al-Muhanna et al. Synthesis of tailor-made polysaccharides: An overview
JP2003252905A (ja) 架橋ヒアルロン酸
JPH075642B2 (ja) キチン誘導体の製造方法
Zhang Regioselective synthesis of curdlan derivatives
Gao Regioselective Synthesis of Glycosaminoglycan Analogs
Gao Regioselective chlorination of cellulose esters

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20170927