CZ200624A3

CZ200624A3 - Zpusob implantace bunek

Info

Publication number: CZ200624A3
Application number: CZ20060024A
Authority: CZ
Inventors: Osther@Kurt
Original assignee: Interface Biotech A/S
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2004-06-11
Publication date: 2006-05-17
Also published as: CA2528399A1; ZA200509983B; NO20056222L; WO2004110512A3; JP2006527032A; US20070077236A1; EP1635887A2; AU2004246749A1; WO2004110512A2

Abstract

Endoskopická metoda osetrování defektu chrupavky nebo kosti zivocichu, zahrnují kroky: (i) identifikace polohy defektu, (ii) aplikaci bunek vybranýchze skupiny sestávající z chondrocytu, chondroblastu, osteocytu a osteoblastu a jejich kombinací do defektu chrupavky nebo kosti. Vynález se týká zejména zpusobu artroskopiclé nebo endoskopické implantace homologních nebo autologních bunek do defektuzivocisného tela, zahrnujícího krok i) artroskopické nebo endoskopické aplikace tekutiny do dutiny nebo na povrch obsahující defekt a kroky ii) aplikace bunek na defekt v podstate soucasne s nosným materiálem, pricemz aplikace se provádí na defektu pokrytém tekutinou, (iii) smísení bunek a nosného materiálu, (iv) tuhnutí nosného materiálu tak, ze defekt je pokrýván smesí bunek a nosného materiálubez významného mnozství tekutiny a (v) poprípade odstranení tekutiny z dutiny nebo povrchu drenází nebo odsátím.

Description

(57) Anotace:

Endoskopická metoda ošetřování defektů chrupavky nebo kosti živočichů, zahrnují kroky: (i) identifikace polohy defektu, (ii) aplikaci buněk vybraných ze skupiny sestávající z chondrocytů, chondroblastů, osteocytů a osteoblastů ajejich kombinací do defektu chrupavky nebo kosti. Vynález se týká zejména způsobu artroskopiclé nebo endoskopické implantace homologních nebo autologních buněk do defektu živočišného těla, zahrnujícího krok i) artroskopické nebo endoskopické aplikace tekutiny do dutiny nebo na povrch obsahující defekt a kroky ii) aplikace buněk na defekt v podstatě současně s nosným materiálem, přičemž aplikace se provádí na defektu pokrytém tekutinou, (iii) smísení buněk a nosného materiálu, (iv) tuhnutí nosného materiálu tak, že defekt je pokrýván směsí buněk a nosného materiálu bez významného množství tekutiny a (v) popřípadě odstranění tekutiny z dutiny nebo povrchu drenáží nebo odsátím.

CQ <

Tř

CM

CO o

o

CM

N

O

ZPŮSOB IMPLANTACE BUNĚK

Oblast techniky

Předložený vynález se týká způsobu implantace nebo transplantace buněk zahrnující použití artroskopu nebo endoskopu. Způsob dává možnost artroskopické a/nebo endoskopické implantace buněk a je snadnou, bezpečnou a levnou metodou.

Dosavadní stav techniky

Mats Brittberg a spol. ukázali, že fibrinové adhezivum jako Tisseel®, spolu s růstovým hormonem nebo bez něho, nemá chondrogenní efekt na nevyzrálé chondrocyty, a proto není vhodné jako výztuž pro podporu reparování chondrálních nebo osteochondrálních defektů (Brittberg M., Sjógren-Jansson, Lindahl A., Peterson L.: The influence of fibrin sealant on Osteochondral Defect Repair in the Rabbit Knee; z disertační práce Matse Brittberga: Cartilage Repair. On cartilaginous tissue engineering with the emphasis on chondrocyte transplantation, Department of Orthopedics, Institute of Surgical Science and Department of Clinical Chemistry, Institute of Laboratory Medicine, Goteborg University, Švédsko, 1996).

Lazovic a Messner [Lazovic D. a spol., Acta Ortop. Scand. 64, 583-586 (1993)] zkoumali využití fibrinového adheziva (Tisseel®) při pokusu zlepšit léčení přetnutého předního křížového vazu u psů a zjistili, že vazy, které byly reparovány za použití adheziva, vykazovaly nízký stupeň vývoje kolagenu oproti pouhému sešití vazu, které ve skutečnosti poskytovalo mnohem vyšší obsah kolagenu. Předpokládali, že fibrinové adhezivum chemicky zvyšuje proliferaci buněk, avšak utvořená reparovaná tkáň měla nízkou kvalitu. Při experimentech podle Brittberga a spol., kteří používali Tisseel® pro reparování osteochondrálních defektů u králíků, zjistili, že ve skupině, kde byl aplikován Tisseel®, bylo reparované tkáně méně, avšak reparovaná tkáň byla stejné fibrózně-fibrokartilaginní kvality bez ohledu na to, zda Tisseel® byl anebo nebyl použit. Dospěli k přesvědčení, že Tisseel® nezlepšuje nápravu osteochondrálního defektu, zatímco autologní nebo homologní sraženina fibrinu použitá jako výztuž, jak * · se zdá, vykazovala blahodárný efekt, dostačující, aby si zasloužil další zkoušení in vivo.

Brittberg a spol. zjistili dále, že experimenty, kde byly spolu s Tisseelem® aplikovány chondrocyty, žádnou toxickou reakci nevykazovaly, ale chondrocyty narůstaly pouze na povrchu sraženiny Tisseelu®, což ukazuje, že Tisseel® by mohl být použit jako bariéra, například při utěsňování obvodu překryvu, jako je například periostální štěp, používaný u ACI. Avšak experimenty zahrnující homologní fibrinové sraženiny prokázaly plné „zarůstání“ jak králičích tak lidských chondrocytů, což ukazuje, že tento typ sraženiny účinkuje na buňky ve smyslu „vedení výztuže“.

Při experimentech s Tisseelem® spolu s injekcí růstového hormonu (GH) vůbec nebyl zesílen výztužný efekt, ale došlo spíše k efektu hemostatické bariéry, přičemž se zdálo, že homologní (a autologní) fibrin podporuje infiltraci a růst chondrocytů do sraženiny fibrinu což naznačuje, že tento typ fibrinu může projevovat výztužný efekt. Proto je možné, že homologní (nebo autologní) fibrin může projevovat na chondrocyty efekt podporující růst a zvýšenou migraci do fibrinu.

Vyvinutí vhodné artroskopické metody pro implantaci chondrocytů, konkrétně autologní implantaci chondrocytů, stejně jako pro metody implantace buněk - kromě oprav chondrálních lézl - teoreticky použitelné k nápravě osteochondritidy, osteoartritidy, nazývané také osteoartróza, a chondromalacie kolenní čéšky atd., by významně snížilo náklady v porovnání s ACI (Autologous Chondrocyte Implantation), některými autory nazývanou také ACT (Autologous Chondrocyte Transplantation), prováděnou během chirurgie na otevřeném koleně. Implantace chondrocytů a implantace dalších buněk by učinila technologii ACI, jakož i jiné technologie implantace buněk v oboru ortopedie, přístupnější - kromě kolenních kloubů - i u jiných kloubů. Dále by v podstatě každá ortopedická klinika, která provádí artroskopické intervence, získala přístup k využívání ACI technologie a tím by mohlo být více pacientů ošetřováno pomocí ACI při nápravě defektů chrupavky (a později, až se implantace buněk stane dostupná pro jiná ortopedická onemocnění, staly by se i tyto techniky předmětem rozvíjení artroskopicky řízených ošetření).

• · • ·

Existuje tedy potřeba pro rozvíjení artroskopické metody pro umožnění plnějšího využívání technologie implantace buněk v oboru ortopedické chirurgie.

Metody využívající výztužných technologií v různých formách, kde výztuž (spolu s buňkami rostoucími ve výztuži nebo bez nich) se vkládá do defektu, trpěly nesnázemi při provádění procedury implantace buněk vedené pouze artroskopií.

Podstata vynálezu

Účelem vynálezu je poskytnout způsob artroskopického ACI ošetření kloubové chrupavky, kostních defektů nebo kombinace chrupavky a kosti (osteoartritis) v různých kloubech lidského těla nebo u zvířat. Metoda poskytuje techniku, při níž je přes portál („klíčovou dírku“) aplikována suspenze buněk do kloubového spoje, jež vede k sedimentaci kultivovaných buněk a adhezi buněk k subchondrální kosti a/nebo chrupavce. Předložený vynález se tedy týká endoskopického způsobu ošetřování defektů chrupavky nebo kosti subjektu, přičemž tento způsob zahrnuje kroky:

(í) Identifikace polohy defektu, (ii) aplikace buněk vybraných ze skupiny sestávající z chondrocytů, chondroblastů, osteocytů a osteoblastů a jejich kombinací, do defektu chrupavky nebo kosti.

Je-li k identifikaci polohy defektu v kroku (i) použit artroskop a je použit k řízení injekce kultivovaných autologních nebo homologních buněk v kroku (ii) nazývá se způsob artroskopickou ACI.

V kontextu předkládané přihlášky a vynálezu platí následující definice:

Artroskopické autologní implantace buněk (artroskopické ACI) je lékařský postup pro ošetřování defektů chrupavky nebo kosti, pomocí něhož jsou kultivované buňky implantovány do defektu jehlou, jako je například jehla s tupým hrotem nebo katétr. Tento implantační postup se vizualizuje a řídí artroskopem.

• 4 * · ·· ·

Suspenze se vytváří, když je v rozpouštědle dispergována nerozpustná složka. V tomto konkrétním vynálezu vzniká suspenze, když se buňky, které mají být aplikovány na defekt, smísí s vodným prostředím. Suspenze se pak aplikuje na defekt. Termínem „oblast defektu“ nebo „dutina defektu“ se myslí poškozená kloubní chrupavka, defekt kloubní chrupavky až na kost a/nebo zahrnující kost (osteoartritis), kombinace defektu chrupavky a kosti, nebo kost, která je obklopena normální chrupavkou nebo kostí.

Endoskop je zařízení, které může být použito k náhledu na povrch kosti nebo chrupavčité tkáně, aniž by bylo zapotřebí chirurgického otevření (tj. skrze portál v kůži subjektu). Artroskop je speciální druh endoskopu, který se používá při vyšetřování kloubů.

Artroskop podle předloženého vynálezu je instrument (druh endoskopu), který je vkládán do kloubu kvůli vizuálnímu vyšetření. Artroskop obvykle obsahuje artroskop trubici obsahující optická vlákna, čočku a světelný zdroj a umožňuje vyšetřovat klouby bez chirurgického otevření.

Termínem „portál“ je míněna malá operační procedura, při níž se do kůže vytváří menší otvor, aby se do kloubového spoje dal zavést artroskop, jakož i artroskopická zařízení.

Termínem „explantát chrupavky“ se míní část savčí kloubní chrupavky, která byla explantována ze savce za pomoci vhodného nástroje. Explantát může obsahovat více než jeden druh tkáně, např. při explantaci tkáně z kolena může explantát obsahovat tkáň chrupavky stejně jako tkáň kosti.

V konkrétním provedení vychází předložený vynález vstříc shora zmíněným požadavkům poskytnutím způsobu artroskopické nebo endoskopické implantace homologních nebo autologních buněk do defektu v těle živočichů, přičemž tento způsob zahrnuje ·

9

9 · · • 9 9·· • 9 9 9 I

9 9 «

9 9 9 (i) aplikaci tekutiny do dutiny nebo povrchu obsahujícího defekt pomocí artroskopu nebo endoskopu k lokalizování oblasti defektu, který má být reparován, nebo zacílení oblasti pro transplantaci buněk, (ii) aplikaci buněk na defekt v podstatě současně s nosným materiálem působícím jako vazebná výztuž, koagulační výztuž nebo gelující výztuž, (iii) smísení buněk a nosného materiálu, (iv) ztuhnutí nosného materiálu tak, že defekt nebo cílová oblast jsou pokryty směsí buněk a nosného materiálu a (v) popřípadě odstranění tekutiny z dutiny nebo povrchu drenáží nebo odsátím.

Tekutinou používanou v kroku (i) může být kapalina, jako je fysiologicky vhodný roztok chloridu sodného, Ringerova soluce, medium buněčné kultivace nebo podobné, anebo to může být plyn, jako např. sterilní vzduch obsahující CO₂v koncentraci, která je kompatibilní s tkání, o kterou se jedná (kloub nebo orgán živočišného těla; jako je např. tělo savce jako člověka). Vhodná koncentrace CO₂ je normálně kolem 5 %. Takové tekutiny jsou normálně používány během artroskopie a endoskopie a jsou odborníkům známy. V konkrétním provedení vynálezu je tekutinou kapalina. Důvodem použití tekutiny (např. kapaliny) je rozšířit defekt, aby se umožnila jeho vizualizace artroskopem. Vzhledem k tomu nesmí samotná tekutina obsahovat buňky, které jsou do defektu implantovány. Nadto dále v defektu přítomná tekutina umožňuje aplikovat buňky pod horní hladinu tekutiny (tj. vedením jehly nebo katétru dolů do nejnižšího místa defektu a injekcí do defektu takovým způsobem, že okamžité gelovatění nebo koagulace defekt přímo zasáhne), to prováděno pod tekutinou. Navíc, jak se níže popisuje, je tekutina vhodným prostředím pro míšení dvou požadovaných směsí totiž (i) buňky, např. ve formě suspenze buněk a (ii) nosného materiálu, např. ve formě směsi obsahující nosný materiál. Jak se popisuje níže, míšení buněk s nosným materiálem je důležité, aby in šitu imobilizovalo buňky v defektu. Jakmile jsou naneseny, musí být nosný materiál a buňky v podstatě homogenně promíseny předtím, než nosný materiál ztuhne nebo gelovatí, a tak udrží buňky v nosném materiálu.

» 9

-- · · • 9 · · · · · • · · · 4

V předloženém kontextu je termín „tkáň“ užíván v širokém slova smyslu, aby pokrýval měkkou tkáň (orgány atd.) stejně jako tvrdou tkáň (kosti, klouby atd.).

Jakmile je defekt vizualizován, je možné aplikovat buňky. Buňkami jsou homologní nebo autologní buňky a jsou typu vhodného pro použití k reparaci defektu, o který se jedná. V předloženém kontextu je termín „homologní buňky“ míněn tak, že buňky jsou kompatibilní stkáni, do které jsou aplikovány. Termín „autologní buňky“ značí, že buňky pocházejí od téhož subjektu, kterému jsou buňky aplikovány. V dalším je diskutováno např. použití chondrocytů a/nebo osteoblastů (osteocytů). Aplikované buňky se normálně vyskytují v suspenzi, tj. buňky jsou suspendovány ve vhodném mediu, jako je např. Dulbeccovo minimální Eaglovo médium/F12, DMEM/F12, obsahující případně sérum (např. fetální telecí sérum nebo homologní nebo autologní sérum) a/nebo růstové faktory, a dobu aplikace, smíseny s nosným materiálem. Suspenze buněk může být uchovávána pouze se samotným mediem a pak míšena se složkami, které budou tvořit sraženinu, z dalšího injekčního systému; nebo může být suspenze buněk spolu s jednou nebo více složkami umístěna do zásobníku, kde se nesráží buňky v zásobníku samotném, ale po smísení se složkou/složkami, vyvolávajícími gelovatění nebo koagulaci, přicházejícími z druhého zásobníku dvojité injekční stříkačky, přičemž směšování začíná potom, co jsou oba zásobníky například pomocí „Y“ nástavce spojeny do jednoho vedení, kde se iniciuje proces gelovatění a koagulace za účasti buněk a složek, a sice, když procházejí injekční jehlou nebo katétrem. Následující tabulka uvádí příklady některých složek, které mohou být použity, ale není to na ně omezeno.

• 9 • 9

9 4

9 • * 9 9 • 9 · •·99 9 9 ·

Obsah v zásobníku 1 a v zásobníku 2 dvojité injekční stříkačky (nebo jakékoliv jiné vhodné soupravy pro použití při způsobu podle vynálezu)

Kombinace	Rozmezí složek v zásobníku 1	Buňky obsažené v zásobníku 1	Buňky obsažené v zásobníku 2	Rozmezí složek v zásobníku 2
Kolagen III plus jiné kolageny s krátkým řetězcem	Kolagen III: 0,5-20 mg/ml; s krátkým řetězcem: 0,520 mg/ml plus	2x10⁵-6x10⁶buněk na ml	Bez buněk	'Trombin (jakéhokoliv původu) 0,5 až 1000 lU/ml a CaCI₂
Kolagen III plus jiné kolageny s krátkým řetězcem	Kolagen III: 0,5-20 mg/ml; s krátkým řetězcem: 0,520 mg/ml plus	Bez buněk	2x10⁵-6x 10⁶buněk na ml	Trombin (jakéhokoliv původu) 0,5 až 1000 lU/mla CaCI₂
Fibrinogen, jakéhokoliv typu nebo druhu a v některých případech aprotinin	Fibrinogen: 1-20 mg/ml	2x10⁵-6x10⁶buněk na ml	Bez buněk	Trombin (jakéhokoliv původu) 0,5 až 1000 lU/ml a CaCI₂
Fibrinogen, jakéhokoliv typu nebo druhu a v některých případech aprotinin	Fibrinogen: 1-20 mg/ml	Bez buněk	2x10⁵-6x 10⁶buněk na ml	Trombin (jakéhokoliv původu) 0,5 až 1000 lU/ml a CaCI₂
Fibrinogen, komerčně dostupný	Ve stupni koncentrace odpovídajícím množství užívanému u komerčních produktů fibrinogenu	2x10⁵-6x 10⁶buněk na ml	Bez buněk	‘Trombin (jakéhokoliv původu) 0,5 až 1000 lU/mla CaCI₂
Fibrinogen, komerčně dostupný	Ve stupni koncentrace odpovídajícímu množství užívanému u komerčních produktů fibrinogenu	Bez buněk	2x10⁵-6x 10⁶buněk na ml	‘Trombin (jakéhokoliv původu) 0,5 až 1000lU/ml a CaCI₂

*Trombin jakéhokoliv původu může být od jakéhokoliv živočišného druhu, rekombinantní nebo připravený jako peptid z trombinu, který má schopnost indukovat ·· ·· • ♦ • · koagulaci nebo gelovatění; v některých případech se přidává aprotinin jako v komerčních kombinacích, například odpovídajících Tisseel nebo v Beriplast. Přidává se kalcium chlorid v množství používaném například v komerčních kombinacích. Koncentrace použitého trombinu je normálně od asi 0,5 do asi 10 IU, i když v některých komerčních soupravách je koncentrace trombinu 1 000 IU nebo více.

Jak je shora zmíněno, buňky jsou do defektu aplikovány v podstatě současně, přednostně současně, s nosným materiálem. Aplikace takového nosného materiálu je nezbytná, protože buňky, aplikované např. v kapalině, jak je popsáno shora, nemohou přilnout k povrchu defektu, a proto mohou být opatřeny jiné prostředky, aby se zajistilo, že buňky se uvedou ve styk nebo budou udržovány v blízkosti defektu. Nosným materiálem je materiál, který je po aplikaci na defekt schopen koagulovat nebo tuhnout. Ve výhodném provedení se koagulace, tuhnutí nebo tvorba gelu vyvolá kontaktem nosného materiálu s trombinem nebo s materiálem podobným trombinu, popřípadě v přítomnosti iontů jako např. iontů vápníku nebo hořčíku. Nosný materiál, poté co ztuhnul in šitu, by tedy měl fungoval jako těsnící obal vyplňující defekt, který přiléhá k defektu nebo cílové oblasti, a měl by umožnit, aby byly buňky udržovány v defektu nebo v cílové oblasti. Buňky jsou tudíž přítomny nejen na povrchu defektu, ale v celém ztuhlém nebo koagulovaném nosném materiálu, tj. buňky existují v oblasti defektu ve více vrstvách. Proto je možné aplikovat množství buněk, které je podstatně větší, než kdyby měl být povrch defektu pokryt jen jednou vrstvou buněk. Navíc má obal dále funkci ochrany ošetřovaného defektu nebo cílové oblasti před vlivem lokálního prostředí. Jak je popisováno v některých příkladech níže, mohly by nad promísenými koagulovanými, sraženými (adherentními) a/nebo gelujícími buňkami/nosným materiálem být další obalovou vrstvou také i komerčně dostupné fibrinové těsnící materiály jako například Tisseel (Baxter) a/nebo Beriplast (AventisBehring), aby nad koagulovanými buňkami s nosným materiálem vytvářely ještě jeden utěsňující obal, který pokryje a vyplní celý defekt.

Nosným materiálem, ve kterém jsou buňky promíseny nebo dispergovány, je obecně koagulující, adherentní, vázající, gelující/nebo těsnící produkt. Před aplikací do defektu nebo cílové oblasti pomocí vhodného zařízení může být nosný materiál • · · • · · to 9 9 9 • · · 999999 9 9 ředěn vhodným mediem. Směs obsahující nosný materiál může obsahovat vhodné materiály jako např. fibrin, kolagen typu I, III, II apod., například společně s inzulínovým růstovým faktorem (IGF) a/nebo jinými růstovými faktory. Směsi používané jako kolagenová výplň, které mohou být v současnosti podávány jako roztok, jsou směsi, které na trhu existují jako želatina, kolagen typu III, kolagen typu I, kolagen typu II (ve vývoji u Fibrinogen, California), jakož i kolageny s krátkým řetězcem (některé z nich jsou komerčně dostupné). Koagulaci indukující látkou by bal, jak už bylo dříve v souvislosti s horní tabulkou popsáno, trombin v té či oné formě. V oblasti krevních produktů pro koagulaci by to byl jakýkoliv fibrinogen (jakýkoli druh, ale přednostně lidský v té čí oné formě), čistý nebo nečištěný (obsahující jiné proteiny jako například proteiny, které jsou součástí kryoprecipitátu); trombin nebo jakýkoliv derivát s trombinu podobným efektem vyvolávajícím koagulaci nebo gelovatění. Všechny tyto látky, používané pro tento účel, musejí být pro buňky netoxické.

Je důležité, aby se obě rozdílné kapaliny [tj. i) medium s buňkami a ii) směs obsahující nosný materiál] aplikovaly v podstatě současně. Tekutost nosného materiálu umožňuje potřebné promísení buněk a nosného materiálu v defektu nebo v cílové oblasti a zajišťuje stejnoměrnou distribuci buněk v nosném materiálu předtím, než ztuhne nebo koaguluje. Alternativně nebo dodatečně může být místo toho aplikován přítok, tekutiny nebo plynu (např. také pomocí artroskopu).

Vynález zahrnuje využití buď implantace buněk současně s nosným materiálem, do něhož se buňky vmísí během aplikace - v první části vynálezu -, prováděné buď pod ochranou tekutiny, za použití obecné aplikace artroskopu, kde se používá tekutina, aby se kloub pro vizualizaci udržoval otevřený, nebo, jako druhá část vynálezu, také v kombinaci s artroskopem, který zajišťuje určitý tlak uváděného sterilního vzduchu nebo mírný přetlak napomáhající chirurgovi zviditelnit ošetřovanou oblast, tak jak se například používá u jiných endoskopů, například při břišních vyšetřeních atd., kde je vzduch dodáván pod určitým tlakem, tak jako například kombinace atmosférického vzduchu spolu s CO2, v koncentraci dobře snášené smíšenými buňkami a koagulujícím nosným materiálem. V této druhé části vynálezu • · • · • · · ·· I • · • · · ·· je použit „obal“, pod který může být směs buňky/koagulující nosný materiál umístěna pod vzduchovým polštářem, a kde může být tlak kolem 20 až 30 mm Hg.

Třetí část vynálezu se týká vrstvy koagulující substance (nosného materiálu), který je aplikován buď pod tekutinou nebo pod nafukovaným vzduchem. Tento nosný materiál je sám o sobě prostý buněk, je však s buňkami smíchán in šitu předtím, než ztuhne.

Tloušťka ztuhlé vrstvy závisí na velikosti defektu a konkrétním živočišném druhu. U člověka je tloušťka obvykle 2 až 6 mm.

Tato první část vynálezu se týká využití přítomnosti tekutiny, možnosti změny tlaku tekutiny v kloubu (a popřípadě tlaku sterilního vzduchu) během artroskopicky nebo endoskopicky vedené procedury, spojené s kontrolováním implantace kapalné substance, smísené s buňkami, jako jsou například chondrocyty pro reparování defektů chrupavky, využitím tlaku k udržení nosného materiálu, například smíšeného s buňkami, v místě, například na spodku defektu chrupavky nebo jiných cílových oblastí, zatímco materiál smísený s buňkami - nebo v nejhorším případě bez buněk, když je přes buňky/nosný materiál uložena další vrstva krycího fibrinu nebo jiného těsniva neobsahujícího buňky - koaguluje, sráží se nebo gelovatí. Tato metoda využívá rozdílu v rozpustnosti nosného materiálu ve dvou různých prostředích, totiž i) tekutině aplikované do defektu pro vizualizaci defektu (obalová tekutina) a ii) mediu užitého pro aplikaci nosného materiálu pomocí artroskopu. Nosný materiál se volí takový, že tuhne nebo koaguluje a přilne na defekt navzdory přítomnosti tekutiny použité jako kapalný obal.

Aplikace tlaku ovládá lokalizaci směsi obsahující nosný materiál bez míšení s kapalným obalem. Jinými slovy, nosný materiál nebo směs obsahující nosný materiál jsou nerozpustné v sousedící tekutině přítomné v kloubu během aplikace, tj.nosný materiál bude udržován v oblasti aplikace (např. spodku kloubu), kde tuhne a přilne na oblast aplikace. Současná aplikace buněk umožňuje, aby se nosný materiál zabudoval nebo obalil buňky tak, že buňky jsou rovněž udržovány v oblasti aplikace. Buňky začnou v příštích 48 hodinách nebo později produkovat matrici samy a tato • ·

• · 999 • · · 9 • 9 · · • · ·9 matrice nakonec jak napomůže přilnutí, tak později bude adherentní matricí chrupavky a nosný materiál nakonec velmi pravděpodobně po kratší nebo delší době absorbován.

Tento způsob spojující přítomnost tekutiny nebo zvýšeného tlaku, alternativně jako přetlaku (vůči tlaku v kloubu), poskytuje chirurgovi dostatečnou vizualizací pro provádění aplikace buněk/nosného materiálu, fibrinového těsnicího materiálu (například komerčního produktu), neobsahujícího buňky, avšak překrývajícího buňky/nosný materiál a tak bránícího, aby aplikovaný materiál unikl do kloubu, pokles tlaku a/nebo odstranění tlaku, když je tuhnutí a přilnavost dostatečná, aby udržela implantát v místě defektu, je novou technologií, když aplikuje substanci spolu s buňkami nebo bez nich a měnění tlaku tekutiny (nebo je-li používán plynný vzduch, měnění tlaku plynu) podle potřeby, bez překročení tlaku, který by ohrozil implantované buňky. Schopnost určitých fibrinů umožňovat proliferaci a migraci chondrocytů popisuje Mats Brittberg, jak uvedeno výše. Avšak tato procedura uváděná Brittbergem není prováděna jako dvoufázový systém např. za použití tekutiny nebo plynu pro vizualizaci.

Jiným aspektem vynálezu je, že popsaný způsob, zahrnující umístění buněk smíšených s nosným materiálem pod tekutinu nebo pod tlak vzduchu, může být použit také pro aplikaci více než jednoho druhu buněk, například chondrogenních buněk (chondrocytů/chondroblastů nebo jiných chondrogenních buněk) a osteogenních buněk, jako jsou osteoblasty, osteocyty, nebo jiných buněk, atd., aby umožnil dvoustupňovou proceduru, kde se například spodní část osteoartritické léze nejprve ošetří směsí osteogenních buněk a nosného materiálu, což se provádí pod tekutinou a/nebo tlakem vzduchu, a na to se přes první buňky/nosný materiál (vrstva 1) pod tekutinou nebo tlakem vzduchu převrství směs chondrogenních buněk a nosného materiálu.

Dalším aspektem vynálezu je dodat do kloubu granulát hydroxyapatitu (např. Bio-Oss, Geistlich Biomaterials, Wolhusen, Švýcarsko), obsahující buď kultivované osteogenní buňky nebo dodávaný spolu s osteogenními buňkami, vše ve směsi aplikované okamžitě společně s nosným materiálem pod tekutinou nebo tlakem ♦ · • · • ·« • 4 vzduchu do defektu, jako je osteoartritický defekt v kloubu. Potom se na spodní vrstvu tvořenou granulátem hydroxyapatitu převrství vrstva směsi chondrogenních buněk/nosného materiálu .

V každé ze shora popisovaných částí vynálezu, v nichž je umísťována směs buněk a vhodného nosného materiálu, nebo buněk, hydroxyapatitu a nosného materiálu, například během nebo pomocí artroskopického zásahu, se bude nanášet obalová vrstva, kterou je vrstva fibrinu bez buněk, jako například biologické lepidlo Tisseel® (do kterého například nebudou migrovat chondrocyty, které v tomto případě budou koagulovat s malým počtem nebo žádnými buňkami v horní obalující vrstvě). Jak během přítomnosti přetlaku v kloubu, tak bez přetlaku, pokud má chirurg zásadný přehled po oblasti, kde těsnící prostředek aplikuje.

Obalová vrstva buď fibrinu, jako je kompozit Tisseel®, může být míšena s jiným proteinem (např. kolagenem (jako je kolagen typu I)) jako rozpustná substance smísená s fibrinem, nebo s Tisseelem®, k zesílení obalu, který bude obrácen k povrchu kloubu tangenciálně k obklopující zdravé chrupavce. To může být učiněno během artroskopíe například pod tlakem kapaliny nebo vzduchu.

Obalem může být též membrána vyříznutá do velikosti defektu (např. membrána z kolagenu typu l/lll) se stranou, která bude obrácena k buňkám/koagulujícímu nosnému materiálu, pokrytou čerstvým, vysoce koncentrovaným homologním nebo nosným materiálem nebo čerstvým Tisseelem®, aby se zabránilo, aby z buněk/koagulujícího nosného materiálu unikaly buňky do obalu, a aby se současně buňky/koagulující nosný materiál upevnily. Membrána může také sama o sobě přilnout k buňkám/koagulujícímu nosnému materiálu.

Jestliže se použije artroskopické metody, je tedy nezbytné, aby byla dána možnost uskutečnit aplikaci chondrocytů, jako například autologních chondrocytů, spolu s nosným materiálem, kde je možno kontrolovat aplikaci chondrocytů v nosném materiálu, který bude vytrvávat (ulpívat) v oblasti, ve které mají být buňky udržovány, navzdory přítomnosti (sterilního) fysiologického solného roztoku nebo • · • · 4 4 • 4 4

4 4 výživného media v kloubu, kvůli použití artroskopu jako vedení pro provedení implantace autologních chondrocytů.

Metoda vyvinutá přítomným vynálezcem je považována za novou díky novému pojetí umísťování substance obsahující chondrocyty do kontrolované oblasti například v defektu chrupavky, jako je chondrální defekt, osteochondrální defekt, nebo také, jestliže se aplikují buňky jako osteoblasty/osteocyty v substanci, např. jako je hydroxyapatit, jako tenká spodní vrstva do kloubu trpícího osteoartritidou a pak je možno aplikovat druhou vrstvu chondrocytů/substance, stejně jako když se aplikují buňky prostřednictvím endoskopické procedury do cílového orgánu nebo cílové oblasti, jako například jater, srdce atd. Substance má být toho druhu, že současně je vůči buňkám netoxická a v případě chondrocytů, substance aplikovaná pod tekutinou nemá být toxická vůči chondrocytům nebo může i podporovat chondrocyty ve stadiu růstu a/nebo zrání, ve kterém buňky produkují i strukturu matrice, která končí vznikem nové chrupavky.

Součástí tohoto vynálezu jsou různé hladiny koncentrace vhodného nosného materiálu použitého pro směs a obměny koagulace, adheze a/nebo doby gelovatění, stejně jako obměny objemu a koncentrace buněk, které mají být míšeny s nosným materiálem. Navíc mohou být buňky a/nebo nosný materiál míšeny s adekvátními růstovými faktory, jako například IGF-1, který může napomáhat k udržování diferencované morfologie chondrocytů ve fibrinu [Fortier, LA a spol., Am. J. Vet. Res. 63(2), 301-305 (2002)].

Jak je shora popsáno, integrální součástí vynálezu také je vytvořit shora popisovaný obal buď jako povlak z fibrinu nebo Tisseel®, nebo jednoho z těchto činidel aplikovaných spolu s jiným proteinem, který může vytvořit hladký povrch s poměrně silnější pevností v tahu (jako je například rozpustný kolagen), nebo případně smíšeným s různými složkami, jako je například rozpustný kolagen, a s jinými substancemi poskytujícími hladký povrch reparované oblasti chrupavky atd., vytvořením prodlouženého výstupu, který při použití umožní chirurgovi aplikovat fibrin na konvexní nebo konkávní povrch kloubu, ve kterém se defekt nalézá, jak je ukázáno na následujícím obrázku. Během artroskopie může být napnutím přes • · • 9 • ··· • · · • · 9 povrch chrupavky umístěna dočasná perforovaná membrána potahující a omezující směs fibrinu a buněk a obalu zfibrinu, když se injektuje pod kapalinou nebo tlakem vzduchu. Membrána musí být snadno propustná pro použitou tekutinu (nebo vháněný vzduch) během artroskopie. Potom se membrána zjednoho ze vpichů odstraní, když směs fibrinu a buněk a fibrinový obal v místě koagulují.

Ostatní aspekty vynálezu se jeví z následujících bodů a přiložených patentových nároků. Vždy když jsou relevantní, týkají se zde popisované detaily a jednotlivosti mutatis mutandis těchto aspektů.

Konkrétněji se vynález vztahuje na tyto body:

1. Endoskopický způsob ošetřování defektů chrupavky nebo kosti u živočichů, přičemž způsob zahrnuje kroky:

(í) identifikace polohy defektu, (ii) aplikace buněk vybraných ze skupiny sestávající z chondrocytů, chondroblastů, osteocytů a osteoblastů a jejich kombinaci do defektu chrupavky nebo kosti.

2. Způsob podle bodu 1 pro artroskopickou nebo endoskopickou implantaci homologních nebo autologních buněk do defektu živočišného těla, přičemž způsob zahrnuje krok (i) artroskopické nebo endoskopické aplikace tekutiny do dutiny nebo na povrch obsahující defekt a kroky (ii) aplikace buněk na defekt v podstatě současně s nosným materiálem, přičemž aplikace je prováděna na defektu pokrytém tekutinou, (iii) smísení buněk a nosného materiálu, (iv) ztuhnutí nosného materiálu tak, že defekt je pokryt směsí buněk a nosného materiálu bez významného množství tekutiny, a • ··· • · 1 • · 4 ► ·* • · • ···· (v) popřípadě odstranění tekutiny z dutiny nebo povrchu drenáží nebo odsáváním.

3. Způsob podle bodu 2, ve kterém krok i) předchází krokům íi) až v).

4. Způsob podle bodu 2, ve kterém aplikace tekutiny v kroku i) je v podstatě současná s aplikací buněk v kroku ii) a nosného media v kroku iii).

5. Způsob podle bodu 4, ve kterém tekutinou je plyn.

6. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících bodů, ve kterém je živočichem savec, jako například člověk.

7. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících bodů, ve kterém defektem je defekt kloubu nebo kosti.

8. Způsob podle bodu 8, ve kterém defektem je defekt chrupavky.

9. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících bodů, ve kterém buňky jsou původu vhodného pro cílení do vhodné tkáně, kde se vizualizace provádí endoskopem.

10. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících bodů, ve kterém buňkami jsou chondrocyty, osteocyty nebo osteoblasty.

11. Způsob podle bodu 10, ve kterém buňkami jsou chondrocyty.

12. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících bodů, ve kterém buňkami jsou homologní a/nebo autologní chondrocyty.

13. Způsob podle kteréhokoli z bodů 2, 3, 5 až 12, ve kterém tekutinou v kroku i) je kapalina.

·· • · • · ·· ·« • · • · · 9 • · · • · · • · ··

14. Způsob podle bodu 13, ve kterém kapalinou je fysiologicky přijatelné vodné medium vybrané ze skupiny, kterou tvoří roztok chloridu sodného, Ringerova soluce, medium pro kultivaci buněk, pro buňky příznivá kapalina a podobně.

15. Způsob podle kteréhokoli z bodů 2 až 14, ve kterém nosný materiál v kroku ii) je volen ze skupiny, kterou tvoří rozpustné kolageny, fibrinogeny a aprotininy.

16. Způsob podle bodu 15, ve kterém je nosný materiál aplikován ve formě vodné směsi.

17. Způsob podle bodu 16, ve kterém vodná směs dále obsahuje jedno nebo více adhezi podporujících činidel a/nebo jeden nebo více fysiologicky přijatelných iontů, například iontů vápníku nebo hořčíku.

18. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících bodů, ve kterém jsou buňky v kroku ii) aplikovány ve formě buněčné suspenze.

19. Způsob podle bodu 18, ve kterém jsou buňky suspendovány ve vhodném mediu jako např. vhodném mediu pro růst, popřípadě obsahujícím jeden nebo více růstových faktorů.

20. Způsob podle bodu 18 nebo 19, ve kterém buněčná suspenze dále obsahuje jednu nebo více koagulujících složek, které iniciují tuhnutí nosného materiálu po kontaktu nosného materiálu a koagulující složky.

21. Způsob podle kteréhokoli z bodů 18 až 20, ve kterém buněčná suspenze dále obsahuje jedno nebo více adhezi podporujících činidel a/nebo jeden nebo více fysiologicky přijatelných iontů, například iontů vápníku nebo hořčíku.

22. Způsob podle bodu 20 nebo 21, ve kterém koagulující složkou je trombin nebo složka podobná trombinu.

• 4 » · ··« » · 4 » · · • 9 94

23. Způsob podle kteréhokoli z bodů 2 až 22, ve kterém tuhnutí nosného materiálu je výsledkem interakce mezi nosným materiálem a trombinem nebo složkou podobnou trombinu a tuhnutí obaluje buňky ve ztuhlém materiálu.

24. Způsob podle bodu 18 nebo 19, ve kterém buněčná suspenze zahrnuje nosný materiál, přičemž způsob dále zahrnuje krok aplikace roztoku obsahujícího koagulující činidlo.

25. Způsob podle kteréhokoli z bodů 2 až 23, ve kterém míšení buněk s nosným materiálem v kroku iii) se provádí aplikováním nosného materiálu a/nebo buněk pod přetlakem.

26. Způsob podle bodu 24, ve kterém suspenze obsahující buňky a nosný materiál se mísí s koagulujícím činidlem aplikováním roztoku obsahujícího koagulující činidlo pod přetlakem.

27. Souprava pro použití při způsobu definovaném v kterémkoli z předcházejících bodů, zahrnující dvě oddělené nádoby, přičemž první nádoba zahrnuje buňky a druhá nádoba zahrnuje nosný materiál.

28. Způsob podle bodu 27, ve kterém buňky v první nádobě jsou ve formě buněčné suspenze.

29. Souprava podle bodu 28, ve které jsou buňky suspendovány ve vhodném mediu jako např. vhodném mediu pro růst, obsahujícím popřípadě jeden nebo více růstových faktorů.

30. Souprava podle bodu 28 nebo 29, ve které buněčná suspenze dále zahrnuje jednu nebo více koagulujících složek, které iniciují tuhnutí nosného materiálu po kontaktu mezi nosným materiálem a koagulující složkou.

·· ·· ·· •

ΦΦ φ φ

Φ φ • · ·*· ···· • ·

ΦΦ • ΦΦ • ··· • 9 · • Φ Φ

ΦΦ

31. Souprava podle kteréhokoli z bodů 28 až 30, ve které buněčná suspenze dále zahrnuje jedno nebo více adhezi podporujících činidel a/nebo jeden nebo více fysiologicky přijatelných iontů, například iontů vápníku nebo hořčíku.

32. Souprava podle bodu 30 nebo 31, ve které koagulující složkou je trombin nebo složka podobná trombinu.

33. Souprava podle kteréhokoli z bodů 27 až 32, dále zahrnující třetí nádobu, zahrnující koagulující složku.

34. Souprava pro použití při způsobu definovaném v kterémkoli z předcházejících bodů, zahrnující dvě oddělené nádoby, přičemž první nádoba zahrnuje buňky a druhá nádoba zahrnuje koagulující činidlo.

35. Souprava podle bodu 34, ve které první nádoba zahrnuje nosný materiál.

36. Souprava podle bodu 34 nebo 35, dále zahrnující třetí nádobu, zahrnující nosný materiál.

37. Souprava podle kteréhokoli z bodů 27 až 36, ve které je souprava ve formě injekční stříkačky obsahující dvě oddělené komory, přičemž první komora obsahuje buňky a druhá komora obsahuje nosný materiál nebo koagulující činidlo.

38. Souprava podle bodu 37, ve které injekční stříkačkou je dvojitá injekční stříkačka nebo podobně.

39. Souprava podle kteréhokoli z bodů 27 až 38, dále zahrnující návod k použití soupravy.

40. Způsob podle kteréhokoli z bodů 1 až 26, dále zahrnující aplikaci hydroxyapatitu např. ve formě granulátu hydroxyapatitu.

• ·

41. Použití hydroxyapatitu jako kultivačního media pro buňky, jako jsou osteoblasty/osteocyty.

42. Použití roztoků kolagenu jako kultivačního media pro buňky, které mají být artroskopicky transplantovány.

43. Použití roztoků kolagenu jako kultivačního media pro buňky, které mají být endoskopicky transplantovány.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou míněny pro osvětlení vynálezu, aniž by měly za účel jej nějakým způsobem omezovat.

Příklad 1

Kloub pocházející od zvířete, například kolenní kloub od vepře nebo koně anebo jiných zvířat, se podrobí artroskopii a vyplní se tekutinou, jako je 0,9% sterilní solný roztok, nebo plynem, aby byla vizualizována oblast vybraná za cíl artroskopického reparování oblasti, jako je defekt chrupavky, pro umožnění aplikace nosného materiálu smíšeného s buňkami takovým způsobem, že buňky/nosný materiál se nesmísí s tekutinou nebo plynem aplikovaným prostřednictvím artroskopu a schopnost adheze k cílové oblasti zůstává zachována.

Eventuelně mohou být buňky anebo buňky smísené nebo kultivované v suspenzi hydroxyapatitu (např. Bio-Oss) dodány injekční stříkačkou a míšeny u výstupu z injekční stříkačky do oblasti, která má být ošetřena.

Příklad 2

V tomto příkladu může být před implantací buněk umístěn nosný materiál pod tlakem jiné kapaliny. V tomto případě může být nosný materiál umísťován pod tuto kapalinu, například udržovanou v místě pod tlakem vyvíjeným pomocí artroskopu až do ztuhnutí. Buňky se potom vpraví kdykoliv po umístění kapalné substance, nebo

poté, když nastalo tuhnutí, jednoduchým injektováním buněk do nosného materiálu udržovaného v místě tlakem kapaliny.

Příklad 3

Artroskopická implantace autologních chondrocytů, preklinická, kombinovaná s druhým utěsněním fibrinem

První chirurgický artroskopicky zákrok

K preklinickému pokusu se použije pěti koz. Kozy se podrobí dvěma (2) chirurgickým zákrokům. Prvním chirurgickým zákrokem je artroskopické nabrání biopsie chrupavky z kolena koz. Kozy se chovají na licencované živočišné farmě vAalborg Sygehus Syd, Dánsko. Po anestezii se pomocí malé incize provede artroskopie buď antero-mediálním nebo antero-laterálním vstupem. Dvě další incize se preparují na mediální a laterální straně kolena. Za použití elevátoru se ostrým elevátorem odejme 50 až 200 mg chrupavky a asepticky přenese do transportní zkumavky obsahující sterilní Dulbeccovo MEM/12 a telecí plodové sérum. Za použití perforovacího nástroje se vytvoří v celé tloušťce chrupavky kruhová léze o průměru 0,6 cm, která se o 3 až 5 týdnů později použije k implantaci buněk. Biopsie se transportuje do laboratoře pro výzkum buněk Interface Biotech A/S a podrobí se kultivaci z explantátů.

Druhý chirurgický artroskopický zákrok

Když se kultura chondrocytů rozroste do rozsahu 4 až 10 milionů buněk, což normálně trvá 3 až 5 týdnů, vrátí se buňky zpět na živočišnou farmu, naplněné v dvojité injekční stříkačce spolu s roztokem lidského rekombinantního kolagenu typu lila látkou, jako je například přídavek krátkých kolagenových vláken do jedné komory dvojité injekční stříkačky (krátká kolagenová vlákna, která nemají zhoubný účinek na proliferaci, a která po smísení s gely kolagenu vykázala permeability, jež byly 100 až 10OOkrát větší v porovnání s tím, když je složkou pouze kolagen typu III (bez krátkých kolagenových vláken) [Gentleman E., Nauman E.A., Dee K. C. a Livesay G. A., Tissue Eng., 10(3-4), 421-427 (2004)], a která tudíž omezují jakoukoliv možnou kontrakci působenou rekombinantním kolagenem (po konečném smíšení s buňkami plus trombinem (a chloridem vápenatým z druhé komory dvojité injekční stříkačky).

Druhá komora dvojité injekční stříkačky obsahuje trombin (a CaCI₂) s koncentrací buněk v rozsahu 1 až 10 milionů buněk. Vedení z konce jedné komory stříkačky se spojuje s dalším vedením z druhé komory stříkačky. Tupá jehla/katétr o velikosti 18 gg je připojena k oběma vedením tak, že směs obsahující kolagenovou směs se mísí strombinem a buňkami, když jehlou/katétrem prochází. Tupý konec jehly/katétru je veden - pomocí artroskopu skrze jednu z incizí vytvořených pro chirurgickou manipulaci - do defektu chrupavky o průměru 0,6 cm, vytvořeného perforací. Perforací předtím vytvořený defekt chrupavky o průměru 0,6 cm je vyplněn směsí kolagenu - směsí trombin/buňky, která koaguluje do 30 až 180 sekund, zcela v závislosti na relativní koncentraci složek zúčastněných na koagulaci.

Za použití jiné dvojité injekční stříkačky se buněk prosté fibrinové lepidlo nebo fibrinový těsnící materiál buď jako Tisseel (Baxter, Rakousko) nebo jako Beriplast buď ve formě Pantaject® nebo ve formě sprejové sady (Berijet®), obojí od Aventis Behring, bezprostředně po aplikaci buněčné směsi aplikuje důkladným pokrytím koagulující směsi buněk v defektu. Těsnící materiál se potom nechá koagulovat a incize uzavřít. Po kompletaci druhého chirurgického zásahu se koza (postoperativně) bandážuje, aby se zabránilo odtržení chrupavkového transplantátu (implantátu) maximálním ohnutím kolenního kloubu.

Koza se potom podrobí artroskopické kontrole reparovaného defektu chrupavky po 1 až 2 měsících po posledním artroskopickém ošetření. Po 6 měsících po artroskopickém ošetření se zvíře anestetizuje a koleno reparuje artroskopickou implantací chondrocytů. Lézi prohlédne ortoped, sejmou se fotografie a videa, provedou se denzitometrická měření a „ošetřená“ oblast se odebere a podrobí histologické, histochemické a imunohistochemické analýze.

··· ···· *e ··· ·· ··

Příklad 4

Artroskopická implantace autologních chondrocytů, preklinická, bez druhého utěsnění fibrinem

První chirurgický artroskopický zákrok

K preklinickému pokusu se použije pěti koz. Kozy se podrobí dvěma (2) chirurgickým zákrokům. Prvním chirurgickým zákrokem je artroskopické nabrání biopsie chrupavky z kolena koz. Kozy se chovají na licencované živočišné farmě vAalborg Sygehus Syd, Dánsko. Po anestezii se pomocí malé incize provede artroskopie buď antero-mediálním nebo antero-laterálním vstupem. Dvě další incize se preparují na mediální a laterální straně kolena. Za použití elevátoru se ostrým elevátorem odejme 50 až 200 mg chrupavky a asepticky přenese do transportní zkumavky obsahující sterilní Dulbeccovo MEM/12 a telecí plodové sérum. Za použití perforovacího nástroje se vytvoří v celé tloušťce chrupavky okrouhlá léze o průměru 0,6 cm, která se o 3 až 5 týdnů později použije k implantaci buněk. Biopsie se transportuje do laboratoře pro výzkum buněk Interface Biotech A/S a podrobí se kultivaci z explantátů.

Druhý chirurgický artroskopický zákrok

Když se kultura chondrocytů rozroste do rozsahu 4 až 10 milionů buněk, což normálně trvá 3 až 5 týdnů, vrátí se buňky zpět na živočišnou farmu naplněné v dvojité injekční stříkačce spolu s roztokem lidského rekombinantního kolagenu typu III plus látkou, jako je například přídavek krátkých kolagenových vláken do jedné komory dvojité injekční stříkačky (krátká kolagenová vlákna, která nemají zhoubný účinek na proliferaci buněk, a která, když jsou smíchána s gely kolagenu, prokázala permeability 100 až 1000krát větší ve srovnání s tím, když je složkou pouze kolagen typu III (bez krátkých kolagenových vláken) [Gentleman E., Nauman E.A., Dee K. C. a Livesay G. A., Tissue Eng., 10(3-4), 421-427 (2004)], a která tudíž omezují jakoukoliv možnou kontrakci působenou rekombinantním kolagenem (při konečném smísení s buňkami plus trombinem (a chloridem vápenatým z druhé komory dvojité injekční stříkačky). Druhá komora dvojité injekční stříkačky obsahuje trombin (a CaCE) s koncentrací buněk v rozsahu 1 až 10 milionů buněk. Vedení z konce jedné komory stříkačky se spojuje s dalším vedením z druhé komory stříkačky. Tupá jehla/katétr o velikosti 18 gg je připojena k oběma vedením tak, že směs obsahující kolagenovou směs se mísí strombinem a buňkami, když jehlou/katétrem prochází. Tupý konec jehly/katétru je veden - pomocí artroskopu skrze jednu z incizí vytvořených pro chirurgickou manipulaci - do defektu chrupavky o průměru 0,6 cm, vytvořeného perforací.

Perforací předtím vytvořený defekt chrupavky o průměru 0,6 cm je vyplněn směsí kolagenu - směsí trombin/buňky, která koaguluje za 30 až 180 sekund, zcela v závislosti na relativní koncentraci komponent zúčastněných na koagulaci. Nepoužije se žádný druhý těsnící materiál.

Po dokončení druhého chirurgického zásahu se koza (postoperativně) bandážuje, aby se zabránilo odtržení chrupavkového transplantátu (implantátu) maximálním ohnutím kolenního kloubu.

Příklad 5

Artroskopická implantace autologních chondrocytů, při použití přístupu fibrinogen-trombin, preklinický pokus, kombinovaná s druhým fibrinovým utěsněním

První chirurgický artroskopický zákrok

K preklinickému pokusu se použije pěti koz. Kozy se podrobí dvěma (2) chirurgickým zákrokům. Prvním chirurgickým zákrokem je artroskopické nabrání biopsie chrupavky z kolena koz. Kozy se chovají na licencované živočišné farmě vAalborg Sygehus Syd, Dánsko. Po anestezii se pomocí malé incize provede artroskopie buď antero-mediálním nebo antero-laterálním vstupem. Dvě další incize

se preparují na mediální a laterální straně kolena. Za použití elevátoru se ostrým elevátorem odejme 50 až 200 mg chrupavky a asepticky přenese do transportní zkumavky obsahující sterilní Dulbeccovo MEM/12 a telecí plodové sérum. Za použití perforovacího nástroje se vytvoří v celé tloušťce chrupavky okrouhlá léze o průměru 0,6 cm, která se o 3 až 5 týdnů později použije k transplantaci buněk (implantaci buněk). Biopsie se transportuje do laboratoře pro výzkum buněk Interface Biotech A/S a podrobí se kultivaci z explantátů.

Druhý chirurgický artroskopický zákrok

Když se kultura chondrocytů rozroste do rozsahu 1 až 10 milionů buněk, což normálně trvá 3 až 5 týdnů, vrátí se buňky zpět na živočišnou farmu naplněné v dvojité injekční stříkačce, spolu s roztokem fibrinogenu v jedné komoře s koncentrací buněk 1 až 10 milionů buněk v 0,5 ml v roztoku fibrinogenu. Druhá komora dvojité injekční stříkačky obsahuje trombin (a CaCb). Alternativně je roztok fibrinogenu v první komoře a buňky mohou být kombinovány s trombinem a chloridem vápenatým v druhé komoře. Vedení z konce jedné komory stříkačky se spojuje s dalším vedením z druhé komory stříkačky. Jehla/katétr o velikosti 18 gg je připojena k oběma vedením tak, že směs obsahující buňky a fibrinogen se mísí s trombinem, když jehlou/katétrem prochází. Tupý konec jehly/katétru je veden - pomocí artroskopu skrze jednu z incizí vytvořených pro chirurgickou manipulaci - do defektu chrupavky o průměru 0,6 cm, vytvořeného perforací.

Perforací předtím vytvořený defekt chrupavky o průměru 0,6 cm je vyplněn směsí buňky-fibrinogen - trombin, nebo alternativně směsí fibrinogen trombin/buňky, která koaguluje během 30 až 180 sekund.

Za použití jiné dvojité injekční stříkačky se bezprostředně po aplikaci směsi buněk aplikuje fibrinové lepidlo neobsahující buňky nebo fibrinový těsnící materiál buď jako Tisseel (Baxter, Rakousko) nebo jako Beriplast buď ve formě Pantaject® nebo ve formě sprejové sady (Berijet®) obojí od Aventis Behring, důkladným pokrytím koagulující směsi buněk v defektu. Těsnící materiál se potom nechá koagulovat a incize uzavřít. Po kompletaci druhého chirurgického zásahu se koza (postoperativně) • 99 • a • « • 9 bandážuje, aby se zabránilo odtržení chrupavkového transplantátu (implantátu) maximálním ohnutím kolenního kloubu.

Příklad 6

Artroskopické implantace autologních chondrocytů, při použití přístupu fibrinogen-trombin, prekiinický pokus, bez druhého fibrinového utěsnění

První chirurgický artroskopický zákrok

K preklinickému pokusu se použije pěti koz. Kozy se podrobí dvěma (2) chirurgickým zákrokům. Prvním chirurgickým zákrokem je artroskopické nabrání biopsie chrupavky z kolena koz. Kozy se chovají na licencované živočišné farmě vAalborg Sygehus Syd, Dánsko. Po anestezii se pomocí malé incize provede artroskopie buď antero-mediálním nebo antero-laterálním vstupem. Dvě další incize se preparují na mediální a laterální straně kolena. Za použití elevátoru se ostrým elevátorem odejme 50 až 200 mg chrupavky a asepticky přenese do transportní zkumavky obsahující sterilní Dulbeccovo MEM/12 a telecí plodové sérum. Za použití perforovacího nástroje se vytvoří v celé tloušťce chrupavky okrouhlá léze o průměru 0,6 cm, která se o 3 až 5 týdnů později použije k transplantaci buněk (implantaci buněk). Biopsie se transportuje do laboratoře pro výzkum buněk Interface Biotech A/S a podrobí se kultivaci z explantátů.

Druhý chirurgický artroskopický zákrok

Když se kultura chondrocytů rozroste do rozsahu 1 až 10 milionů buněk, což normálně trvá 3 až 5 týdnů, vrátí se buňky zpět na živočišnou farmu naplněné v dvojité injekční stříkačce, spolu s roztokem fibrinogenu v jedné komoře s koncentrací buněk 1 až 10 milionů buněk v 0,5 ml v roztoku fibrinogenu. Druhá

komora dvojité injekční stříkačky obsahuje trombin (a CaCb). Alternativně je roztok fibrinogenu v první komoře a buňky mohou být kombinovány s trombinem a chloridem vápenatým v druhé komoře. Vedení z konce jedné komory stříkačky se spojuje s dalším vedením z druhé komory stříkačky. Jehla/katétr o velikosti 18 gg je připojena k oběma vedením tak, že směs obsahující buňky a fibrinogen se mísí s trombinem, když jehlou/katétrem prochází. Tupý konec jehly/katétru je veden - pomocí artroskopu skrze jednu z incizí vytvořených pro chirurgickou manipulaci - do defektu chrupavky o průměru 0,6 cm, vytvořeného perforací.

Perforací předtím vytvořený defekt chrupavky o průměru 0,6 cm je vyplněn směsí buňky-fibrinogen - trombin, nebo alternativně směsí fibrinogen trombin/buňky, která koaguluje během 30 až 180 sekund, v závislosti na koncentraci jednotlivých složek.

Po kompletaci druhého chirurgického zásahu se koza (postoperativně) bandážuje, aby se zabránilo odtržení chrupavkového transplantátu (implantátu) maximálním ohnutím kolenního kloubu

• ·· ·· · ·· ·9 • · · · · · · Φ · · · • Φ · · · ····«

Φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦΦΦ

Φ * · · · · · · ·

ΦΦΦ ΦΦ·® «Φ ··· ·· ··

AÍ-/ý

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Endoskopický způsob ošetřování defektů chrupavky nebo kosti u živočichů, vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje kroky:

(i) identifikace polohy defektu, (íi) aplikace buněk vybraných ze skupiny sestávající z chondrocytů, chondroblastů, osteocytů a osteoblastů a jejich kombinací do defektu chrupavky nebo kosti.

2. Způsob podle nároku 1 pro artroskopickou nebo endoskopickou implantaci homologních nebo autologních buněk do defektu živočišného těla, vyznačující se tím, že zahrnuje krok (i) artroskopické nebo endoskopické aplikace tekutiny do dutiny nebo na povrch obsahující defekt a kroky (ii) aplikace buněk na defekt v podstatě současně s nosným materiálem, přičemž aplikace je prováděna na defektu pokrytém tekutinou, (iii) smísení buněk a nosného materiálu, (iv) ztuhnutí nosného materiálu tak, že defekt je pokryt směsí buněk a nosného materiálu bez významného množství tekutiny, a (v) popřípadě odstranění tekutiny z dutiny nebo povrchu drenáží nebo odsáváním.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že krok (i) předchází krokům (ii) až (v).

4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že aplikace tekutiny v kroku (i) je v podstatě současná s aplikací buněk v kroku (ii) a nosného media v kroku (iii).

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že tekutinou je plyn.

6. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že je živočichem savec, jako je člověk.

7. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že defektem je defekt kloubu nebo kosti.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že defektem je defekt chrupavky.

9. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že buňky jsou původu vhodného pro zacílení na vhodnou tkáň, kde se vizualizace provádí endoskopem.

10. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že buňkami jsou chondrocyty, osteocyty nebo osteoblasty.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že buňkami jsou chondrocyty.

12. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že buňkami jsou homologní a/nebo autologní chondrocyty.

13. Způsob podle kteréhokoli z nároků 2, 3 a 5 až 12, vyznačující se tím, že tekutinou v kroku (i) je tekutinou kapalina.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že kapalinou je fysiologicky přijatelné vodné medium vybrané ze skupiny, kterou tvoří roztok chloridu sodného, Ringerova soluce, medium pro kultivaci buněk, pro buňky příznivá kapalná látka a podobně.

9 9

9 9 9 9 • 9 «

9 9 «

15. Způsob podle kteréhokoli z nároků 2 až 14, vyznačující se tím, že nosný materiál v kroku (ii) je volen ze skupiny, kterou tvoří rozpustné kolageny, fibrinogeny a aprotininy.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že nosný materiál se aplikuje ve formě vodné směsi.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že vodná směs dále zahrnuje jedno nebo více adhezi podporujících činidel a/nebo jeden nebo více fysiologicky přijatelných iontů, jako jsou ionty vápníku nebo hořčíku.

18. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že buňky v kroku (ii) se aplikují ve formě buněčné suspenze.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že buňky jsou suspendovány ve vhodném mediu, jako je například vhodné medium pro růst, popřípadě obsahující jeden nebo více růstových faktorů.

20. Způsob podle nároku 18 nebo 19, vyznačující se tím, že buněčná suspenze dále zahrnuje jednu nebo více koagulujících složek, které iniciují tuhnutí nosného materiálu po kontaktu mezi nosným materiálem a koagulující složkou.

21. Způsob podle kteréhokoli z nároků 18 až 20, vyznačující se tím, že buněčná suspenze dále zahrnuje jedno nebo více adhezi podporujících činidel a/nebo jeden nebo více fysiologicky přijatelných iontů, jako jsou ionty vápníku nebo hořčíku.

22. Způsob podle nároku 20 nebo 21, vyznačující se tím, že koagulující složkou je trombin nebo složka podobná trombinu.

23. Způsob podle kteréhokoli z nároků 2 až 22, vyznačující se tím, že tuhnutí nosného materiálu je výsledkem interakce mezi nosným materiálem a trombinem nebo složkou podobnou trombinu a tuhnutí obaluje buňky ve ztuhlém materiálu.

24. Způsob podle nároku 18 nebo 19, vyznačující se tím, že buněčná suspenze zahrnuje nosný materiál, přičemž způsob dále zahrnuje krok aplikace roztoku obsahujícího koagulující činidlo.

25. Způsob podle kteréhokoli z nároků 2 až 23, vyznačující se tím, že míšení buněk s nosným materiálem v kroku (iii) se provádí aplikováním nosného materiálu a/nebo buněk pod přetlakem.

26. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že suspenze zahrnující buňky a nosný materiál se mísí s koagulujícím činidlem aplikováním roztoku obsahujícího koagulující činidlo pod přetlakem.

27. Souprava pro použití při způsobu podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že souprava zahrnuje dvě oddělené nádoby, přičemž první nádoba zahrnuje buňky a druhá nádoba zahrnuje nosný materiál.

28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že buňky v první nádobě jsou ve formě buněčné suspenze.

29. Souprava podle nároku 28, vyznačující se tím, že buňky jsou suspendovány ve vhodném mediu, jako je například vhodné růstové medium, popřípadě zahrnující jeden nebo více růstových faktorů.

30. Souprava podle nároku 28 nebo 29, vyznačující se tím, že buněčná suspenze dále zahrnuje jednu nebo více koagulujících složek, které iniciují tuhnutí nosného materiálu po kontaktu mezi nosným materiálem a koagulující složkou.

31. Souprava podle kteréhokoli z nároků 28 až 30, vyznačující se tím, že buněčná suspenze dále zahrnuje jedno nebo více adhezi podporujících činidel

4« • 4 • 444 •·· 4 4 4« a/nebo jeden nebo více fysiologicky přijatelných iontů, jako jsou ionty vápníku nebo hořčíku.

32. Souprava podle nároku 30 nebo 31, vyznačující se tím, že koagulující složkou je trombin nebo složka podobná trombinu.

33. Souprava podle kteréhokoli z nároků 27 až 32, vyznačující se tím, že dále zahrnuje třetí nádobu, zahrnující koagulující složku.

34. Souprava pro použití při způsobu podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zahrnuje dvě oddělené nádoby, přičemž první nádoba zahrnuje buňky a druhá nádoba zahrnuje koagulující činidlo.

35. Souprava podle nároku 34, vyznačující se tím, že první nádoba zahrnuje nosný materiál.

36. Souprava podle nároku 34 nebo 35, vyznačující se tím, že dále zahrnuje třetí nádobu, zahrnující nosný materiál.

37. Souprava podle kteréhokoli z nároků 27 až 36, vyznačující se tím, že souprava je ve formě injekční stříkačky obsahující dvě oddělené komory, přičemž první komora obsahuje buňky a druhá komora obsahuje nosný materiál nebo koagulující činidlo.

38. Souprava podle nároku 37, vyznačující se tím, že injekční stříkačkou je dvojitá injekční stříkačka nebo podobně.

39. Souprava podle kteréhokoli z nároků 27 až 38, vyznačující se tím, že dále zahrnuje návod k použití soupravy.

40. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 26, vyznačující se tím, že dále zahrnuje aplikaci hydroxyapatitu, například ve formě granulátu hydroxyapatitu.

• · ·· ·· · • · · · · · • · · · • · · · · • · · · ·· ·· ·· ···

42. Použití roztoků kolagenu jako kultivačního media pro buňky, které mají