CZ200448A3

CZ200448A3 - Název neuveden

Info

Publication number: CZ200448A3
Application number: CZ200448A
Authority: CZ
Inventors: Montserrat Camps; Christian Chabert; Dominique Perrin; Thierry Martin; Matthias Paul Wymann; Christian Rommel
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Priority date: 2001-06-11
Filing date: 2002-06-06
Publication date: 2004-06-16
Also published as: CA2448000A1; BG108513A; EA200400024A1; KR20040004704A; MXPA03011376A; JP2004533832A; CN1539021A; WO2002101084A3; DE60210318T2; DE60210318D1; EP1395677B1; WO2002101084A2; ATE321878T1; CA2448000C; SK142004A3; IL159227A0; EE200400002A; JP4381801B2; EA005092B1; EP1395677A2

Description

Způsob identifikace a/nebo kvantifikace radioaktivně značených molekul, schopných vázat aminoglykosidy

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových metod, stanovení a sad (kitú) k identifikaci a/nebo kvantifikaci molekul navazujících aminoglykosidy (ABM, aminoglycoside binding molecules), enzymů modifikujících takové molekuly, nebo sloučenin modulujících interakci mezi ABM a buď enzymy, nebo aminoglykosidy.

Dosavadní stav techniky

Nedávný vývoj v oblasti vysoce výkonných technik plošného testování (screeningu) rozšířil rozsah aplikací a nyní je jak pro stanovení v roztoku, tak i pro stanovení založených na buňkách dostupný větší výběr materiálů, sestav, způsobů imobilizace (znehybnění) a detekčních systémů (S.A. Sundberg, Curr. Opin. Biotechnol. 11, 47-53, 2000).

Nové analytické techniky a techniky plošného testování (screeningu) často využívají pevného nosiče čí podložky (ve formě desek, zkumavek nebo perliček), na který se znehybní, imobilizuje reakční činidlo a to je poté vystaveno účinku jednoho nebo více z reakčních činidel, vytvářejících měřitelný signál na samotném nosiči, nebo v reakčním roztoku. Krok imobilizace, znehybnění, poskytuje možnost zjednodušit rozdělení mezi různé reakce a/nebo reakční činidla a dovoluje také zesílení signálu. Takového účinku může být dosaženo například impregnováním, napuštěním pevného nosiče molekulami scintilační látky tak, že při excitaci zářením emitovaným (vyzařovaným) z imobilizovaných molekul násobí nebo jinak spojitě mění signál,

- 2 vytvářený samotnou označenou skupinou (Μ. B. Meza, Drug Discovery Toady: HTS suppl. 1, 38-41, 2000).

V součastnosti množství různých směsí s anorganickým nebo organickým polymerním jádrem umožňuje imobilizaci mnoha ligandů, stejně jako impregnaci scintilační látkou, usnadňující oddělení a/nebo citlivou detekci, jako je scintilační a vlnově specifická fluorescence nebo absorbance.

Ze stanovení v pevné fázi, založených na těchto vlastnostech, je stanovení blízké scintilace (Scintillation Proximity Assay, SPA), široce používáno u mnoha biologických testů, zahrnujících použití radioaktivně značených molekul jako jsou enzymové substráty, protilátky, proteiny nebo DNA. Tato technika se opírá o pozorování, že paprsky beta, emitované (vyzařované) z molekul značených slabými radioisotopy (jako 3|_|, 125^ 33p, 35θχ _{se νθ VO}dném prostředí pohybují pouze do omezené vzdálenosti a poté se jejich energie vytratí (rozptýlí). Tyto emise mohou být s velkou citlivostí detegovány, pokud jsou radioaktivně značené molekuly uvedeny do těsné blízkosti pevného nosiče (podložky), obsahující scintilační sloučeninu (jako 2,5-difenyloxazol), čímž vyvolají specifickou emisi. Radioaktivně značené molekuly, které zbývají v roztoku volné, jsou nedetegovatelné, neboť jsou příliš vzdálené od scintilační pevné fáze. Takovým nosičem, na nějž se ligand znehybní, je obvykle polymer (polystyren, polyvinyltoluen, nebo polymery odvozené od yttria) a může být ve formě mikrokuliček (EP 154 734, US 4 271 139) nebo mikrodestiček (mikrotitračních destiček) o 96/384 jamkách (EP 576 090).

Obchodně dostupné jsou SPA-perličky, povlečené mnoha biologicky odpovídajícími ligandy (Amersham). SPA-perličky umožňují například citlivou detekci radioaktivně značených protilátek za použití imobilizovaného proteinu A nebo radioaktivně značených fúzních • · • · · ·

- 3 proteinů s glutathion-S-transferázou (GST) za použití imobilizovaného glutathionu, nebo biotinylovaných radiofosforylovaných kináz za použití imobilizovaného streptavidinu.Jiné obchodně dostupné techniky na bázi SPA (FlashPlate®, NEN Life Science Products) využívají polystyrénové mikrodestičky, jejichž jamky jsou povlečeny vrstvou scintilační látky na bázi polysyrenu. Z dosavadního stavu techniky ovšem není známo, že k vytvoření stanovení na bázi SPA může sloužit imobilizace aminoglykosidů.

Aminoglykosidy jsou hydrofilní, vícenásobně nabité sloučeniny, blízce příbuzné s cukry, jejichž kostra sestává z aminocyklitolového kruhu, nasyceného aminovými a hydroxylovými substitucemi ve specifických polohách. Aminoglykosidy vykazují vysokou ohebnost, velkou rozpustnost ve vodě a vzhledem k zásaditým, silně polárním skupinám které obsahují, jsou poměrně nerozpustné v tucích (T. R. Zembower, G. A. Noskin, M. J. Postelnick, C. Nguyen a L. R. Peterson, Int. J. Antimicr. Agents 10, 95-105, 1998).

Aminoglykosidy mohou být rozděleny do strukturních typů podle polohy svých glykosidických vazeb, stejně jako podle přítomnosti 2-deoxystreptaminové skupiny a jejích substitucí. Určité sloučeniny, často považované za aminoglykosidy, ve skutečnosti aminocukry neobsahují a proto byl k popsání celé této skupiny molekul zaveden výraz aminocyklitol namísto méně přesného názvu aminoglykosid, který je ale běžně přijímán a nadále používán pro svou jednoduchost.

Aminoglykosidy jako neomycin, dibekacin, gentamycin, tobramycin, kanamycin, amikacin a streptomycin jsou dobře známé pro své antibiotické vlastnosti. Tyto molekuly jsou schopné vázat v podmínkách in vivo, stejně jako v podmínkách in vitro, množství biologických ligandu.

- 4 ···· 9 9

Na úrovni buněčné membrány aminoglykosidy navazují polyfosfoinositidy, záporně nabité fosfolipidy, které vytvářejí menší složku membránových dvojvrstev, narušující propustnost a jiné biochemické vlastnosti buněčné stěny (Μ. P. Mingeot-Leclerq, P. M. Tulkens, R. Brasseur, Bioch. Pharmacol. 44, 1967-1975, 1992).

Na nitrobuněčné úrovni bylo prokázáno, že rostoucí počet struktur nukleových kyselin, zejména RNA, je, pokud se týká jejich akce, vázán a modulován působením aminoglykosidů. Příklady RNA jako cílů rozpoznávaných a pozměňovaných aminoglykosidy, jsou ribosomální RNA, aptamery RNA, ribozymy a jiné negativní (antikódující) sekvence RNA (F. Walter, Q. Vicens a E. Westhof, Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 694-704, 1999; R. Schroeder, C. Waldsich a H. Wank, EMBO J. 19, 1-9, 2000). Amidoglykosidy mohou být modifikovány bakteriálními enzymy, poskytujícími znaky odolnosti organismům, které tyto enzymy v sobě přijímají, což je způsobeno snížením protibakteriální schopnosti pozměněných molekul (B. Llano-Sotelo, E. F. Azucena, L. P. Kotra, S. Mobashery a C. S. Chow, Chem. Biol. 9, 455-463, 2002).

Specifičnost fosfonositid-aminoglykosidové interakce byla studována na strukturní úrovni a prokázala účast jak hydrofobních, tak i hydrofilních interakcí, což také určuje toxický účinek pro střední ucho a ledviny pacientů (J. Schacht, Hear. Res. 22, 297-304, 1986).

Neomycin, stejně jako ostatní antibiotika stejné skupiny, je známý od pozdních sedmdesátých let jako látka, která je účinně vázána fosfoinositidy. Taková interakce byla využita k extrakci a čištění fosfoinositidů ze surových extraktů afinitní chromatografií na nosiči, kde byl imobilizován neomycin (J. Schacht, J. Lipid. Res. 19. 1063 - 1067, 1978). Imobilizace aminoglykosidů bylo dosaženo na pevných fázích jako jsou sepharosa (WO 90/08584, JP 61 976 418), polystyrénové mikrotitrační destičky (S. Sachetelli, C. Beaulac, J. Lagace, Bioch.

·· ·0··

- 5 Biophys. Acta 1379, 35-41, 1998), nebo léčebné aparatury (EP 372 130). Jinými aplikacemi, založenými na stejném principu, jsou selektivní separace a agregace liposomů obsahujících fosfoinositidy (M. Riaz, N. D. Weiner, J. Schacht, J. Pharm. Sci. 78, 172-5, 1989; F. Van Bambeke, P. M. Tulkens, R. Brasseur a Μ. P. Mingeot-Leclercq, Eur. J. Pharmacol. 289, 321-333, 1995), nebo detekce polyfosfoinositidů v buněčné membráně a nitrobuněčných vesikulech (mechýřcích) A. Arbuzova, K. Martushova, G. Hangyas-Mihalyne, A. J. Morris, S. Ozaki, G. D. Prestwich a S. McLaughlin, Biochim. Biophys. Acta 1464, 35-48, 2000).

Kromě toho jsou fluorescenčně značené aminoglykosidy známé tím, že jsou užitečné pro plošné testování (screening) sloučenin navazujících RNA (WO 96/35 811). Sloučeniny usnadňující příjem amidoglykosidových antibiotik a obsahující fosfoinositidpolyfosfát nebo jeho derivát a značený polyamin, jako aminoglykosidy, jsou v dosavadním stavu techniky známé (WO 00/18949). Tyto sloučeniny byly popsány jako napomáhající vizualizaci příjmu a lokalizace aminoglykosidů, plošnému testování sloučenin minimalizujících cytotoxicitu aminoglykosidových antibiotik vůči savčím buňkám, jako sloučeniny pro sledování (monitorování) toku vápníku v buňkách a pro plošné testování agonistů a antagonistů proteinů, zejména pak kináz, interagujících s fosfoinositidy. Buď aminoglykosidy, nebo fosfoinositidy mohou být kovalentně vázány na fluorescennční sloučeninu.

Vazebné vlastnosti aminoglykosidů umožňují odstranění (clearancí) bakterii inhibici proteosyntézy, snížením přesnosti translace m-RNA a rozrušením integrity, soudržnosti bakteriální buněčné membrány. Vzájemná reakce (interakce) mezi aminoglykosidy a biologickými ligandy má tedy závažné biologické účinky a metody identifikace a/nebo kvantifikace molekul navazujících aminoglykosidy (ABM), enzymů pozměňujících takové molekuly a sloučenin, modulujících (upravujících) interakci mezi ABM a buď enzymy nebo ·· φ · • ·

- 6 • φφφ φ · φφφφ aminoglykosidy mají mnoho důležitých použití, zejména pokud jsou kompatibilní, slučitelné s vysoce výkonnými sestavami.

Příkladem fyziologického mechanismu, který lze studovat za využití interakce mezi aminoglykosidy a biologickým ligandem, je fosforylace fosfoinositidů buněčné membrány.

Fosfoinositidy mají základní strukturu, nazývanou fosfatitylinositol, sestávající z diacylglycerolu, vázaného fosfodiesterovou vazbou do polohy 1' inositolové čelní skupiny. Acylové řetězce diacylglycerolu (typicky stearyl-arachidodylové) jsou vloženy do vnitřního listu membránové dvojvrstvy. Inositolová čelní skupina, která je cytosolická, může být dále fosforylována v poloze 3', 4', 5' nebo v jakékoliv kombinaci těchto poloh enzymy, které se nazývají fosfoinositidkinázy (PIK) a jsou specifické pro jednotlivé polohy na inositolovém kruhu. Rozdílné stavy fosforylace charakterizují molekuly, mající vysoce specifické vlastnosti. Konkrétně fosfoinositid-3-kinázy (PI3K) vytvářejí skupinu všudypřítomně exprimovaných enzymů, které prostřednictvím fosforylace membránových inositolových lipidů v poloze 3' inositolového kruhu a následného vytváření fosfolipidových druhých poslů hrají klíčovou roli v regulaci mnoha buněčných procesů (jako je motilita, proliferace, diferenciace, apoptóza, membránový transport a metabolismus cukrů), představujících jednu z hlavních drah nitrobuněčné signální transdukce (US 6 017 763; S. J. Leevers, B. Vanhaesebroeck a M. D. Waterfield, Curr. Opin. Cell Biol. 11, 219-225, 1999; R. C. Stein a M. D. Waterfield, Mol. Med. Today 6, 347-357, 2000; K. A. Hinchliffe Curr. Biol. 11_, R371-373, 2001; F. I. Comer a C. A. Parent, Cell 109, 541-544, 2002; A. Simonsen, A. E. Wurmser, S. D. Emr a H. Stenmark, Curr. Opin. Cell Biol. 13, 485-492, 2001).

Až do současnosti bylo identifikováno osm savčích PI3K, které se dělí do tří hlavních tříd (I, II a III) na základě sekvenční homologie, • · ♦···

- 7 struktury, vazebných partnerů, způsobu aktivace a substrátové preference in vitro. Všechny PI3K sdílejí kinázovou doménu, lokalizovanou poblíž C-konce enzymu, lešení podobnou šroubovicovou (helikální) oblast, a doménu C2, známou tím, že navazuje fosfolipidy. N-konec, na němž pravděpodobně dochází k interakcím s adaptérovými podjednotkami a jinými proteiny, je vysoce variabilní. Identifikováno bylo i mnoho dalších enzymů, jejichž katalytické domény blízce připomínají ty na PI3K, jako fosfoiniositid-4-kinázy (PI4K), DNA-dependentní proteinkinázy a mTOR-kináza.

I když působením PI3K mohou být modifikovány, pozměněny i další fosfatidylionositoly, mající skupinu 3' dostupnou pro fosforylaci, hlavním buněčným substrátem je fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát (označovaný také jako Ptdlns(4,5)P2, PIP2 nebo PI₍₄₅₎P2). Během aktivace PI3K některými agonisty receptorů spojených s G-proteinem (GPCR, G Protein Coupled Receptors), růstovými faktory nebo cytokiny zánětu je PI₍₄₅₎P2 přeměněn na fosfatidyíinositol-3,4,5-trifosfát (označovaný také jako Ptdlns(3,4,5)P3, PIP3 nebo PI_(3i4i5)P3). Tato molekula byla charakterizována in vivo jako druhý posel, zodpovědný za velké množství různých signálních událostí, zahrnujících fosforylaci a aktivaci některých poproudových efektorů PI3K. Kromě toho některé proteiny, obsahující domény Pleckstrinovy homologie (PH) nebo Phoxovy homologie (PX) a vyžadující pro svou funkci membránové spojení, reagují přímo s buněčmou membránou tak, že se vážou na fosfoinositidy s velkou škálou specifičnosti a afinity pro různé fosforylační stavy (Z. Xu, B. Hanson a W. Hong, Biochem. J. 360, 513-530, 2001.

U lidí a jiných savců byly popsány čtyři třídy PI3K (isoformy alfa, beta, gamma a delta) ve spojení s jednoznačnými nebo s překrývajícími se buněčnými funkcemi a jsou PI3K lépe charakterizovanými jak na

0 0 0 • ·· 0 strukturní, tak i na funkční úrovni. ΡΙ3Κα, ΡΙ3Κβ a PI3K5 jsou široce exprimovány a aktivovány interakcí, a to prostřednictvím domény SH2 obsahující adaptérové molekuly, s tyrosinkinázou receptoru růstového faktoru a s dalšími nirtobuněčnými proteiny, obsahujícími fosfotyrosin. Naproti tomu ΡΙ3Κγ je exprimována pouze hematopoietickými buňkami (zvláště v leukocytech) a je jedinou isoformou, u níž bylo prokázáno, že odpovídá, prostřednictvím adaptérové molekuly neobsahující doménu SH2, na receptory vázané s G-proteinem za využití interakce a aktivace βγ-podjednotkami G-proteinu. Je zajímavé, že myši postrádající ΡΙ3Κγ vykazují, mezí jinými fenotypy, zřejmý defekt migrace leukocytů a jsou méně vnímavé k septickému šoku, což nasvědčuje roli ΡΙ3Κγ v buněčné migraci (E. Hirsh se spoluautory, Science 287, 1049-1053, 2000).

Funkční specializace isoforem PI3K naznačuje, že inhibice selektivní vzhledem k isoformě, s přijatelnými vedlejšími účinky, by mohla být při mnohých stavech proveditelná a léčebně vhodná. ΡΙ3Κγ se zdá být přitažlivým kandidátem na cílové léčivo k léčbě zánětlivých procesů, zahrnujících migraci leukocytů, jako jsou zhoubná onemocnění a jiná onemocnění se zánětlivou nebo imunitní složkou.

Jako inhibitory PI3K byly převážně studovány dvě molekuly: Wortmannin, dříve známý jako inhibitor aktivity respíračního vzplanutí (A. Arcaro, Μ. P. Wymann, Biochem. J. 296, 297-301, 1993), a LY294002 (G. Powis se spoluautory, Cancer Res. 54, 2419-2423, 1994). Ačkoliv byly Wortmannin i LY294002 široce využívány k vyjasnění biologických funkcí aktivace PI3K na buněčné úrovni v krátkodobých stanoveních, tyto sloučeniny mají specifické vlastnosti, které omezují jejich farmaceutický potenciál. Jak Wortmannin, tak i LY294002 vykazují chabou selektivnost, neboť různé kinázy třídy I jsou inhibovány ve srovnatelných koncentracích (Stein a Waterfield, 2000). Nadto se Wortmannin váže na ATP-vazebné místo na ΡΙ3Κγ nezvratné v • · 9 ·

9

9999

9

- 9 nanomolárních koncentracích, ale je molekulou značně nestálou, zatímco LY294002 se váže na ATP-vazebné místo na ΡΙ3Κγ kompetitivně v mikromolárních koncentracích, ale je molekulou, mající problémy s rozpustností. Dosud bylo provedeno množství chemických modifikací Wortmanninu i LY294002, ale jen málo z nich poskytlo molekuly význame účinnější než jsou mateřské sloučeniny (L. C. Creemer, H. A. Kirst, C. J. Vlahos a R. M. Schultz, J. Med. Chem. 39, 5021-5024, 1996).

Pro zlepšení výkonnosti plošného testování (screeningu) ΡΙ3Κγ nebo jiných kináz a k nalezení účinnějších a specifičtějších inhibitorů byly testovány různé techniky. Veškeré tyto techniky obecně zahrnovaly inkubaci kinázy se substrátem (obvykle fosfoinositidem), radioaktivně značeným prekursorem [γ-³²Ρ]ΑΤΡ nebo [γ-³³Ρ]ΑΤΡ a s potenciálním inhibitorem, ale způsob, jakým jsou tyto základní složky uspořádány nebo pozměněny k provedení stanovení, může mít hluboký účinek na výkonnost a citlivost stanovení.

Dosavadní stav techniky předkládá různé systémy k identifikaci sloučenin, které interferují s fosforylační aktivitou kináz majících vztah k PI3K, za použití protilátek specifických vůči částici, konjugovaných s potenciálním inhibitorem (WO 99/35 283), za použití extrakce lipidů spojené s chromatografickým rozdělením (S. G. Ward, Methods Mol. Biol. 138, 163-172, 2000), přímo značených aminoglykosidú (WO 00/18 949), nebo chromatografie na tenké vrstvě (T. Frew se spoluautory, Anticancer Res. 14, 2425-2428, 1994). Takové analýzy jsou pracné při provádění, obtížně automatizovatelné a vzhledem k radioaktivnímu odpadu vytvářejí problémy a výdaje.

Některé vysoce výkonné techniky plošného testování (screeningu) byly vyvinuty pro studium enzymově modifikovaných fosfoinositidů.

*· 99 9 9 • 999

FlashPlate® mikrodestičky povlečené [³H] PI₍₄₅₎P2, byly vytvořeny začleněním této molekuly prostřednictvím kovalentní vazby a/nebo hydrofobní interakce a použity k testu fosfolipázy C, enzymu, který katalyzuje hydrolýzu fosfoglyceridů na diacylglyceroly a fosforylované alkoholy. Toto stanovení ovšem měří snížení radioaktivity v mikrodestičce, způsobené tvorbou [³H]-inositoIu (inositu) , který migruje ve vodné fázi a poté je odstraněn (WO 99/32655). Alternativně byl fosfoinositid kovalentně navázán na scintilační substrát za použití spojovací molekuly, jako je polyethylenglykol nebo sukcinimid, což poskytlo prostředek vhodný pro stanovení fosfatidyIinositolkináz a plošné testování (screening) sloučenin, které tyto enzymy inhibují (WO 00/00 584).

Ovšem neexistuje žádná známka toho, že aminoglykosidem povlečené scintilační nosiče mohou být použity jako obecný nástroj k identifikaci a/nebo kvantifikaci molekul navazujících aminoglykosidy (ABM), enzymů modifikujících takové sloučeniny či sloučenin modulujících interakci mezi ABM a buď enzymy, nebo aminoglykosidy.

Podstata vynálezu

Nyní bylo prokázáno, že aminoglykosidy, imobilizované (znehybněné) na scintilačním nosiči, umožňují účinnou imobilizaci a detekci příslušně radioaktivně značených skupin, připojených k molekule navazující aminoglykosidy (ABM), nebo od ní odštěpených, měřením následně vytvořeného signálu blízké scintilace (scintillation proximity signál).

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy způsob identifikace a/nebo kvantifikace radioaktivně značených molekul, schopných vázat aminoglykosidy, ve vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:

4444

4

4 4 4

4 4 •·4 4>4 *· 4444

4444 44

a) připraví se vzorek, obsahující alespoň ABM a enzym;

b) uvednému enzymu se umožní buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k ABM, nebo odštěpit radioaktivně značenou skupinu, která je na ABM již přítomna;

c) vzorek se inkubuje s jedním nebo více z pevných nosičů, impregnovaných (napuštěných) scintilační sloučeninou a povlečených aminoglykosidy; a

d) změří se signál blízké scintilace (scintillation proximity signál), vytvářený uvedeným nosičem či nosiči.

V závislosti na kritériích a/nebo na reakčních činidlech, použitých při přípravě vzorku, může být tato metoda aplikována na různá provedení, při nichž jsou vzorky připravené podle stejného kritéria srovnávány měřením emise, vytvářené každým vzorkem díky těsné blízkosti scintilačního nosiče a radioaktivně značené ABM.

V upřednostňovaném provedení předkládaný vynález poskytuje stanovení pro identifikaci a/nebo kvantifikaci sloučenin, modulujících interakci (vzájemnou reakci) mezi ABM a enzymem, schopným buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k ABM nebo odštěpit radioaktivně značenou skupinu již přítomnou v ABM, porovnáním signálu blízké scintilace, vytvářeného scintilačním nosičem či nosiči s aminoglykosidovým povlakem, inkubovaným(i) s různými vzorky, připravenými podle kroku (a) a obsahujícími stejné množství ABM, stejné množství enzymu, za přítomnosti jedné či více z přídavných sloučenin, nebo bez ní.

V jiném upřednostňovaném provedení předkládaný vynález poskytuje stanovení pro identifikaci a/nebo kvantifikaci sloučenin, modulujících interakci (vzájemnou reakci) mezi ABM a aminoglykosidem, srovnáním signálu blízké scintilace, vytvářeného scintilačním nosičem či nosiči s aminoglykosidovým povlakem, inkubovaným(i) s různými vzorky,

- 12 ·» ··♦· ·♦♦♦ ♦ · · • * ♦ * · • · ♦ · · · • » · · 9 94 4 4 • 44 9 4 9 připravenými podle kroku (a) a obsahujícími stejné množství ABM, stejné množství enzymu, za přítomnosti jedné či více z přídavných sloučenin, přidávaných před krokem (c) nebo během něho, či bez takové sloučeniny.

V ještě více upřednostňovaném ztělesnění předkládaný vynález poskytuje stanovení pro identifikaci a/nebo kvantifikaci enzymu, schopného buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k ABM nebo odštěpit radioaktivně značenou skupinu již přítomnou v ABM, porovnáním signálu blízké scintilace, vytvářeného scintilačním nosičem či nosiči s aminoglykosidovým povlakem, inkubovaným(i) s různými vzorky, připravenými podle kroku (a) a obsahujícími stejné množství téže ABM a odlišnou směs molekul, které takový enzym případně obsahují.

V ještě dalším provedení předkládaný vynález poskytuje stanovení pro identifikaci a/nebo kvantifikaci ABM porovnáním signálu blízké scintilace, vytvářeného scintilačním nosičem či nosiči s aminoglykosidovým povlakem, inkubovaným(i) s různými vzorky, připravenými podle kroku (a) a obsahujícími stejné množství téhož enzymu, a odlišnou směs molekul, které případně obsahují ABM.

Výše popsaná stanovení mohou být aplikována přímým způsobem nebo kompetitívné, přidáním sloučenin, které soutěží s jednou ze složek začleněných ve stanovení nebo ji upravují, jako je ABM odlišná od ABM použité v kroku (a) a (b), nebo enzym modifikující aminoglykosid. Kromě toho tyto metody umožňují plošné testování (screening) vzorků ve vysoce výkonné sestavě či formaci pro stanovení. Možné inhibitory fosfoinositid-3-kinázy například využívají scintilačních perliček povlečených neomycinem.

- 13 φφ φφφφ •· ·*»· φφ φ • · · φ φ Φφφφ • · ·· · φφφφ * ···· φφφφ φφφ φφφφ φφ φφ ·· φφ φ

V dalším provedení předkládaný vynález poskytuje scintilační pevné nosiče povlečené aminoglykosidem a jejich použití k identifikaci a/nebo kvantifikaci radioaktivně značených molekul, schopných vázat aminoglykosidy, ve vzorku.

Konečně předkládaný vynález poskytuje sadu pro identifikaci a/nebo kvantifikaci radioaktivně značených molekul schopných vázat aminoglykosidy (ABM), enzymů modifikujících takové molekuly nebo sloučenin modulujících interakci mezi ABM a buď enzymy nebo aminoglykosidy, zahrnující scintilační pevný nosič, povlečený aminoglykosidem.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje reakci řízenou PI3K, uváděnou v Příkladech provedení vynálezu. Tyto enzymy vážou a hydrolyzují substrát ATP za vzniku ADP a volné fosfátové skupiny, která je převedena do polohy 3' inositolového kruhu fosfatidylinositolu (Pl) za vzniku PI₍₃₎P. Pokud je ATP aktuálně poskytnut ve formě [³³Ρ]γ-ΑΤΡ, radioaktivně značená konečná (terminální) fosfátová skupina je převedena na fosfolipid. Reakce probíhá in vivo s PI₍₄₅₎P2 za vzniku signální molekuly PI_(3i4i5)P3.

Obr. 2 znázorňuje interakci mezi SPA perličkami a značenými nebo neznačenými fosfoinositoly.

Obr. 3 znázorňuje interakci mezi SPA perličkami a značenými nebo neznačenými fosfoinositoly, kde pouze neznačené fosfoinositoly vytvářejí detegovatelnou emisi. Dokonce i pokud je přítomna pouze jediná molekula radioaktivně značeného/neznačeného PI₍₃₎P, může být interakce (vzájemná reakce) stanovena také na základě interakce perliček s micelami, jak je znázorněno na Obr. 2.

Μ ···· ·· ·«··

- 14 Obr. 4 ukazuje radioaktivně značený PI₍₃₎P, měřený za použití neomycinu-SPA perliček a získaný při různých koncentracích [³³Ρ]γ-ΑΤΡ a lidského rekombinantního GST-PI3Ky. Konečný objem vzorku byl 100 mikrolitrů. Neomycinem potažené SPA perličky byly inkubovány 60 minut a reakce poté pokračovala 45 minut.

Obr. 5 znázorňuje vliv objemu stanovení na tvorbu PI_<3)P (na poměr pozadí/signál) v přítomnosti či v nepřítomnosti Wortmanninu. Množství rekombinantního GST-PI3Ky bylo 25 nanogramů.

Obr. 6 znázorňuje titraci neomycinem povlečených SPA perliček za použití [³³P]y-ATP a GST-PI3Ky a v přítomnosti či v nepřítomnosti inhibitoru, Wortmanninu. Vzorek obsahoval 25 nanogramů GST-PI3Ky v celkovém objemu 50 mikrolitrů. Po inkubacipři teplotě místnosti v trvání 45 minut byla do každé jamky přidána rostoucí množství neomycinem povlečených SPA perliček.

Obr. 7 znázorňuje, jak termální inaktivace enzymu inhibuje vytváření PI₍₃₎P.V 50 mikrolitrech reakce je obsaženo 12,5 nanogramů rekombinantního GST-PI3Ky, který byl ovlivňován (nebo nebyl ovlivňován) po dobu 5 minut teplotou 95 °C před inkubací s tukovými měchýřky a v přítomnosti nebo v nepřítomnosti 5 mikromolárního Wortmanninu.

Obr. 8 znázorňuje inhibiční křivky PI3Ky, získané za použití neomycinem povlečených SPA-perliček a nespecifických (rapamycin) nebo specifických (Wortmannin, LY2924002) inhibitorů. Rostoucí koncentrace Wortmanninu nebo LY 2924002 byly přidány k 50 mikrolitrům reakční směsí, obsahující 12,5 nanogramů rekombinantního GST-PI3Ky a tukové (lipidové) měchýřky.

«4 4444 • 4

4 4

44*

4444 • 4 4 4 4

4 4 4 4

Λ £- 444444 * J O - 4444 44 44 44

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález kombinuje znalosti, týkající se afinity aminoglykosidů pro specifické třídy molekul s technologiemi, založenými na zesílení signálu díky blízkosti isotopů vyzařujících paprsky beta a scintilačních nosičů. Specifičnost a síla amidoglykosidem zprostředkovaných interakcí umožňuje vysoce spolehlivou identifikaci signálu blízké scintilace, vytvářeného mezi příslušně značeným ABM a nosičem, jakmile se vzorek, jež má být analyzován, dostane do kontaktu se scintilačním pevným nosičem, povlečeným aminoglykosidem. Po pochopení základních principů může být vynález aplikován v různých analytických metodách a použitích, zahrnujících ABM a enzymy, schopné buď radioaktivně značenou skupinu přítomnou ve vzorku připojit k ABM, nebo radioaktivně značenou skupinu, která je již v ABM přítomna odštěpit.

Metody podle předkládaného vynálezu umožňují identifikaci a/nebo kvantifikaci radioaktivně značených molekul schopných vázat aminoglykosidy (ABM) ve vzorku, přičemž tyto metody zahrnují kroky, v nichž se:

a) připraví vzorek obsahující alespoň ABM a enzym;

b) umožní uvedenému enzymu buď radioaktivně značenou skupinu přítomnou ve vzorku připojit k ABM, nebo odštěpit radioaktivně značenou skupinu, která je v ABM již přítomná;

c) vzork inkubuje s jedním nebo více z pevných substrátů, impregnovaných (nasycených) scintilační sloučeninou a povlečených aminoglykosidem;

d) měří emise, vytvářená scintilačním nosičem či nosiči.

Změnou podmínek a/nebo raekčních látek použitých při přípravě vzorku v kroku (a) a srovnáním různých vzorků může být předkládaný •9 9999

9

9 9 • 9999

9

- 16 • « · • 9

9

9 9

9999 99

9999

9 9 9

9 9 9 • 9 9 9 9

9 9 9 9

99 vynález použit ke stanovení přítomnosti a aktivity různých molekul, jak bude zřejmé z popisu vynálezu.

Molekuly schopné vázat aminoglykosidy (ABM) jsou veškeré sloučeniny, které, pokud jsou patřičně radioaktivně značené, interagují s amidoglykosidem povlečeným scintilačním nosičem s afinitou, která dostačuje pro vytvoření specifického signálu blízké scintilace. Specifičnost tohoto signálu může být stanovena srovnáním signálu, získaného za použití scintilačního nosiče, s jinými typy částic, ale existují dvě hlavní třídy biologických sloučenin, které vykazují silnou afinitu k imobilizovaným aminoglykosidům, a tedy mohou být in vivo a in vitro pozměněny radioaktivní skupinou slučitelnou se stanovením blízké scintilace: nukleové kyseliny (zejména RNA) a fosfolipidy.

Molekuly RNA mající různý původ a strukturu (včetně ribozomů, ribosomálních RNA, aptamerů RNA a jiných negativních, nekódujících RNA) vykázaly silnou afinitu pro jeden či více aminoglykosidú (Walter se spoluautory, 1999; Schroeder se spoluautory, 2000). Všechny druhy RNA nejsou navazovány všemi aminoglykosidy se stejnou afinitou a stejným způsobem. V závislosti na RNA a/nebo enzymu modifikujícím RNA (jímž je protein či jiná RNA), které mají být studovány, je tedy vhodná RNA zahrnuta do vzorku a příslušný aminoglykosid je imobilizován, znehybněn na scintilačním nosiči. Dosavadní stav techniky udává různé příklady specifických RNA-aminoglykosidových komplexů (Y. Wang, J. Kilián, K. Hamasaki a R. R. Rando, Biochemistry 35, 12338 - 12346, 1996; K. Hamasaki, J. Kilián, J. Cho a R. R. Rando, Biochemistry 37, 656 - 663, 1998; J. Cho a R. R. Rando; Biochemistry 38, 8548-8554, 1999).)

Interakce mezi fosfolipidy a aminoglykosidem a účinek aminoglykosidú na enzymy modifikující fosfolipid byly studovány a využívány již mnoho let (Schacht, 1986; Mingeot-Leclerq se spoluautory, ·· 4494

- 17 • · · · 4 4

4 9 9 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

44 4 9 94 94

4 4 4 4 ··· 4 4

1992). Některé enzymy, schopné modifikovat fosfolipidy přidáním nebo odštěpením chemické skupiny (jako fosfolipidkinázy, fosfatázy a lipázy) byly identifikovány a spojeny s důležitými biologickými funkcemi (Leevers se spoluautory, 1999; Stein a Waterfield, 2000). Jak bylo řečeno u RNA, složení vzorku a imobilizovaný aminoglykosid se mohou příslušně měnit v závislosti na fosfolipidu a/nebo enzymu modifikujícím fosfolipid, které jsou zamýšleny studovat.

Radioaktivně značená skupina může být k ABM přidána buď za použití chemické syntézy nebo enzymu, který ji může přenést z vhodného prekursoru. Chemická adice (připojení) radioaktivně značené skupiny může předcházet přípravě vzorku, obsahujícího enzym štěpící ABM, takovým způsobem, že účinek blízké scintilace je vyrušen. Enzymově provedené přidání radioaktivně značené sloučeniny může buď předcházet reakci popsanou pro chemickou adici, nebo se může provádět okamžitě před vystavení vzorku vlivu aminogiykosidem povlečeného scintilačního substrátu.

Pro zde předkládaný vynález je vhodný jakýkoliv isotop, který může být začleněn do chemické skupiny k vytvoření radioaktivně značené skupiny, přičemž tato skupina bude slučitelná a ABM, enzymem a s interakcí mezi ABM a glykosidem. Jakmile bude radioaktivně značená skupina začleněna do ABM, měla by emitovat, vyzařovat radiační energii, aktivující scintilační nosič, přičemž ABM je vázána na imobilizovaný aminoglykosid. Pokud radioaktivně značená skupina není začleněna do ABM, bude obecně ze scintilačního nosiče odstraněna příliš daleko pro umožnění radioaktivní energii aktivovat scintilační nosič. Proto může být měření specifického signálu blízké scintilace prováděno dokonce i bez oddělení nosiče od vzorku. Nosič je ovšem možné od vzorku oddělit za použití jakýchkoliv vhodných prostředků před měřením signálu blízké scintilace, například odstředěním nosiče a odstraněním kapalné fáze.

4444

4· 4

- 18 ·· 44» · • · · · · 4 4 4 4 ·· 44 4 4444 • 44·· 4444 ···

44 4444 44 4

444444 44 44 44 4

Pokud jsou jako příklady ABM brány RNA a fosfolipidy, je vhodným isotopem ³³P, který je možné snadno začlenit jako radioaktivně značenou fosfátovou skupinu, přičemž se vychází z [γ-³³Ρ]ΑΤΡ, a to ať už do kostry nukleové kyseliny, nebo do inositolového kruhu. Pro vytvoření radioaktivně značené skupiny však mohou být využity i další isotopy, o nichž je známo, že poskytují účinek blízké scintilace (jako ³H, ¹²⁵l nebo ³⁵S).

Předkládaný vynález může být aplikován za použití různých typů scintilačního pevného nosiče, umožňujících účinnou imobilizaci aminoglykosidů. Dosavadní stav techniky (EP 154 734, EP 576 090, US 4 271 139, US 3 018 178, EP 556 005) i výrobci (Amersham, NEN) nabízejí mnoho příkladů pevných fází, impregnovaných různými scintilačnímí sloučeninami, obvykle pak polymerní sloučeniny (polyvinyltoluen, polystyren), tvarované ve formě perliček nebo mikrodestiček, ale použita může být jakákoliv vhodná forma. Jak bylo uvedeno dříve, použití perliček nebo mikrodestiček značně zlepšuje výkonnost způsobů podle tohoto vynálezu, které jsou zvláště vhodné k provádění souběžných analýz mnoha vzorků (až do několika tisíc), což je přístup, který není proveditelný pro mnoho ABM, zahrnujících enzymy.

Způsoby a reakční činidla (reagencie), umožňující účinnou a stálou imobilizaci aminoglykosidů (a obecně biologických ligandů) na pevné fázi, byly v dosavadním stavu techniky uvedeny pro mnoho nosičů a polymerů (Sachetelli se spoluautory, 1998; WO 90/08585; EP 372 130, EP 350 407). Obecně tyto způsoby zahrnují inkubaci aminovaného ligandů s pevnými fázemi souběžně nebo následně po aktivaci pevných fází nebo aminovaného ligandů sloučeninou nebo pufrem. Tato vazebná reakce pak může být následována jinou reakcí, v níž jsou nezreagované slupiny blokovány a/nebo dojde ke stabilizaci fixace (zachycení) ligandů.

·* ftftft· ftft ·♦·· • · · · · · · · • · ··· · « e · • ···· ···· ···· • ·· ···· ·· ·

Jak je vysvětleno v dosavadním stavu techniky (WO99/33499), pokud aldehydová částice (RCHO, nacházející se na nosiči) reaguje s primární aminovou částicí (R'NH₂, nacházející se na aminoglykosidů), rovnováhy je dosaženo s reakčním produktem, kterým je poměrně nestálá iminová částice (R'NCHR). Tato vazba může být stabilizována redukční alkylací iminové částice za použití redukčních činidel (tj. stabilizačních činidel), jako jsou borohydrid sodný nebo kyanoborohydrid sodný, čímž je vytvořena forma sekundárního aminu (R'NH-CH₂R). Vazebné a stabilizační reakce se obvykle provádějí při pH v hodnotách od 6 do 10 a při teplotě od 4 do 37 °C a jsou skončeny v průběhu 24 hodin. Pro způsoby a použití podle předkládaného vynálezu je vhodná i jakákoliv jiná vhodná reakce a postup, umožňující účinnou kovalentní (či nekovalentní) imobilizaci aminoglykosidů na scintilačním nosiči v průběhu všech uvedených manipulací nebo reakcí.

Jakmile byly vzorky obsahující radioaktivně značené ABM připraveny, ať už byla použita jakákoliv metoda, mohou být vystaveny účinku amidoglykosidem povlečených nosičů po dobu, dostačující k dosažení vazby na tento nosič a pak je měřen signál blízké scintilace pro každý vzorek metodami, uvedenými v dosavadním stavu techniky a za použití obchodně dostupných počítačů (Wallac). Volitelně mohou být do vzorků před jejich inkubací se scintilačním nosičem přidány sloučeniny blokující enzymatickou reakci, ale přítomnost aminoglykosidů už mnoho takových reakcí inhibuje.

Za využití způsobů a znalostí podle tohoto vynálezu však mohou být vypracována různá pokusná uspořádání k charakterizaci různých druhů molekul.

Způsoby podle tohoto vynálezu mohou být použity u stanovení sloužících k identifikaci a/nebo kvantifikaci sloučenin, modulujících (upravujících) interakci mezi v podstatě čistou ABM a buď v podstatě •Φ φφφ» φφ φ φ φφφ φ φφφ φφφ φ φφφφ • φφφ ·« φ φφφ φφφ •Φ φφφφ φ φ φφφφ φφ • φ φ φ φ φφφ čistým enzymem, nebo aminoglykosidem. Srovnáním signálu blízké scintilace, sdruženého se scintilačními nosiči povlečenými aminoglykosidem, mohou být charakterizovány a/nebo čištěny různé sloučeniny nebo jejich směsi (jako sériové nebo chromatografické frakce, podíly), mající například specifickou inhibiční aktivitu.

V první skupině pokusných uspořádání může každý vzorek obsahovat stejné množství ABM, enzymu schopného převádět radioaktivně značenou skupinu na ABM, prekursoru obsahujícího tuto radioaktivně značenou skupinu a jedné nebo více z přídavných sloučenin, například možných inhibitorů takového enzymu. Alternativně se stejná množství ABM, již chemicky nebo enzymaticky radioaktivně značených, smísí v každém vzorku se stejnými množstvími enzymu, schopného odštěpit radioaktivně značenou ABM takovýn způsobem, že radioaktivně značená skupina bude oddělena od částice, zodpovědné za interakci s aminoglykosidy, a s jednou nebo více z přídavných sloučenin, které jsou případnými inhibitory zmíněného enzymu. Také v tomto případě srovnání s kontrolním vzorkem umožní identifikaci a/nebo kvantifikaci inhibice enzymu, způsobenou těmito přídavnými sloučeninami, přičemž je použito způsobů podle předkládaného vynálezu.

Srovnáním kontrolního vzorku s ostatními vzorky může být inhibice enzymu, vyvolaná takovými přídavnými sloučeninami, identifikována a/nebo kvantifikována za použití způsobů podle tohoto vynálezu, jako snížení signálu blízké scintilace, neboť příklady vykazují v případě inhibování fosforylace vlivem kinázy specifickou polohu na fosfolipidu. Alternativně mohou být takovými sloučeninami proteiny navazující fosfoinositidy (Xu se spoluautory, 2001).

V druhé skupině pokusných uspořádání se předpokládá, že přídavné sloučeniny inhibují interakci mezi ABM a aminoglykosidem. Při

4 4444

4

- 21 44444 44 40 44 4 srovnání kontrolního vzorku se vzorky, do nichž byly přídavné sloučeniny přidány hned po skončení reakce radioaktivního označování (před krokem (c) nebo během něho, ukazuje snížení měřeného signálu blízkého scintilaci, že sloučeniny narušují interakci mezi ABM a aminoglykosidem, imobilizovaným na scintilačním nosiči. Jedná se o ten případ, v němž je přidána ABM odlišující se od ABM použité v krocích (a) a (b), nebo enzym modifikující aminoglykosid, nebo bakteriální enzym modifikující aminoglykosid (Llano-Sotelo se spoluautory, 2002).

V jiné situaci může být buď ABM, nebo enzym aktuálně v nedostatečně vyčištěné formě, neboť je získán ze sériových nebo chromatografických frakcí. V takovém případě zvýšení nebo snížení měřeného signálu blízké scintilace naznačuje, že určitá frakce může být obohacena specifickým enzymem (za použití standardizované radioaktivně značené ABM ve všech vzorcích), nebo specifickou ABM (v případě použití standardizovaného enzymu a reakce radioaktivního značení).

Všechny dříve popsané způsoby mohpu být použity přímo nebo kompetitivně, přidáním sloučenin které kompetují, soutěží, s jednou ze sloučenin přítomných ve vzorku, nebo ji pozměňují. Takové molekuly mohou být zahrnuty do stanovení k ověření jejich účinku na kinázovou aktivitu a/nebo interakci s aminoglykosidy, nebo s možností charakterizovat a/nebo kvantifikovat tyto molekuly a jejich vlastnosti.

Dříve uvedené způsoby mohou být obsaženy ve stanoveních k plošnému testování (screeningu) a v sadách pro analyzování vzorků ve vysoce výkonné sestavě. Scintilační pevné nosiče povlečené aminoglykosidem, předložené v tomto vynálezu, mohou být použity k identifikaci a/nebo kvantifikaci molekuly schopné vázat ve vzorku radioaktivně značený aminoglykosid a v sadách pro identifikaci a/nebo kvantifikaci molekul schopných vázat amidoglykosidy, enzymů • · · · · · • · · · • · ·

- 22 • · ··· ···· • ··· · · · · · · · · modifikujících takové molekuly, nebo sloučenin, modulujících (pozměňujících) interakci mezi ABM a buď enzymy nebo aminoglykosidy molekuly schopné vázat radioaktivně vázaný aminoglykosid ve vzorku.

Následující Příklady provedení vynálezu jsou určeny k dokreslení tohoto vynálezu při použití neomycinem povlečených SPA perliček (jako scintilačních nosičů), lidské rekombinantní ΡΙ3Κγ spojené s glutation-S-transferázou (jako enzymu), fosfoinosidu (jako molekuly schopné vázat aminoglykosid) a [³³Ρ]γΑΤΡ (jako prekursoru poskytujícího radioaktivně značenou skupinu), v přítomnosti nebo v nepřítomnosti sloučenin inhibujících enzym. Tento vynález ukazuje jak zajistit prostředky k provedení in vitro stanovení inhibitorů PI3K, založeného na SPA perličkách a které je zvláště odolné a opakovatelné (reprodukovatelné) v typické sestavě pro vysoce výkonná stanovení (mikrotitrační destičky o 96 nebo 384 jamkách).

Předkládaný vynález byl popsán s ohledem na specifická provedení, avšak objem popisu zahrnuje veškeré modifikace a substituce, které mohou být provedeny odborníkem v oboru, aniž by došlo k překročení smyslu a účelu patentových nároků. Příklady provedení vynálezu by neměly být brány jako jakýmkoliv způsobem omezující použitelnost a vhodnost vynálezu, jak byl předložen.

Příklady provedení vynálezu

1. Materiály a metody

Příprava neomycinem povlečených SPA perliček

Polyvinyltoluenové, neomycinem povlečené SPA perličky (100 ml suspenze o hustotě 100 mg/ml; Amersham) se odstřeďují 10 minut při 4400 g. Supernatant se odstraní a perličky peletu se resuspendují v 100 • · · · • · • · · · • · ·

- 23 ······ * · · · ·· · ml borátového pufru (pH 8,5). Po 15 minutách míchání válcovým mixerem se suspenze odstřeďuje 10 minut při 4 400 g a dvakrát se resuspenduje ve 100 ml borátového pufru, který má stejnou hodnotu pH. Poté se perličky resuspendují ve 100 ml 50 mmol.l'¹ neomycinsulfátu (pH 8,5). Nádoba obsahující suspenzi se překryje fólií a inkubuje se přes noc ve válcovém mixeru při teplotě místnosti. Pak se suspenze převede do skleněných kádinek, přidá se 150 mg borohydrátu sodného, míchá se dalších 180 minut při teplotě místnosti a nakonec ze odstřeďuje 15 minut při 17 600 g. Po resuspendování za použití 100 ml dvojnásobně destilované vody a trojnásobném odstředění (17 600g, 15 minut) a po dalším trojnásobném odstředění se 100 ml 1% sacharózy se perličky nakonec resuspendují v 50 ml 1% sacharózy. Koncentrace perliček v suspenzi je určena za použití gravimetrického stanovení a je následně upravena na 100 mg/ml. Pak je rozdělena na alikvotní části po 500 mg a lyofilizována.

Vzorky supernatantu jsou odebrány v průběhu výrobních kroků po celonoční inkubaci se sulfátem neomycinu, zfiltrovány a množství přítomného neomycinu je stanoveno fluorometricky za použití fluorescaminového stanovení (A. Lorenzen a S. W. Kennedy, Anal. Biochem. 214, 346-348, 1993). Fluorescamin je molekula, která v přítomnosti aminových skupin rychle reaguje a vytváří fluorescenční skupiny. Standardní křivka je získána z reakce známého množství neomycinu (do 1,5 mg/ml) s fluorescaminem a za použití této křivky je množství neomycinu, právě imobilizovaného na perličkách, odhadnuto na 36 pg na mg perliček.

Imobilizační postupy využívající vyšší množství sulfátu neomycinu (150 mmol) a/nebo borátový pufr o vyšší hodnotě pH (pH 10,0) vedou k imobilizaci neomycinu ve srovnatelném množství (19 až 127 pg/mg perliček).

• · φ φ · · · · · φ φ φφφ φφφφ φ φφφ φ φφφ φφφφφ φφφφφφ φφ φφ φφ φ

- 24 φφ φ

Příprava lidské rekombinantní ΡΙ3Κγ

Enzym, používaný v Příkladech provedení vynálezu, je exprimován jako rekombinantní fúzní protein s glutathion-S-transferázou (GST; částice, která umožňuje rychlé a účinné vyčištění afinitní chromatografií) za použití systému Baculovirus/Sf9 hmyzí buňky, jak byl dříve popsán (WO 96/12024), pouze s tím rozdílem, že fragment cDNA, klonovaný na vektor pAcG2T, postrádá segment kódující prvních 36 aminokyselin lidské ΡΙ3Κγ (SWISSPROT Acc. No. P48736), který byl exprimován počínaje isoleucinem v poloze 37. Exprese a vyčištění rekombinantního proteinu se provádějí za použití standardních protokolů pro GST fúzní proteiny. Alternativní formy tohoto enzymu jsou známé a mohou být rovněž použity (WO 97/40173, WO 96/25488).

Příprava fosfolipidů

Dokonce i pokud Pl není Pl_(4>5)P, molekulou převáděnou in vivo prostřednictvím ΡΙ3Κγ na signální molekulu ΡΙ_(3Λ5)Ρ, rychlost konverze (přeměny) Pl na PI₍₃₎P je obecně považována za velmi dobře odrážející aktivitu enzymu in vitro (Obr. 1).

Fosfolipidový substrát je připraven ve formě micel, obsahujících směs 100 pmol.l'¹ fosfatidylinositolu (Pl, Fluka) a 250 μιτιοΙ.Ι'¹fosfatidylserinu (PS, Fluka). Fosfolipidy jsou odpařeny do sucha pod proudem dusíku ve zkumavce z borosilikátového skla. Lipidy jsou pak resuspendovány v Hepes (40 mmol.l'¹, pH 7,4; N-[2-hydroxyethyljpiperazin-N'-[2-ethansulfonová kyselina]) mícháním mechanickým míchadlem 20 minut a dezintegrací ultrazvukem (sonikací) ve vodní lázni (Branson 2500) po dobu 15 minut.

Inhibitory kinázy • 9

9 9 9

9

9 9 9

9 9

- 25 Nespecifické a specifické kinázové inhibitory, testované k ověření spolehlivosti metod založených na SPA a povlečené neomycinem (Wortmannín, LY2924002, Rapamycin), jsou obchodně dostupné (Upstate Biotechnology).

2. Stanovení ΡΙ3Κγ za použití neomycinem povlečených SPA perliček

I když tento typ stanovení je široce využíván u vysoce výkonných plošných testování, protoklol byl vypracován tak, aby umožňoval provádění stanovení ve standardních mikrotitračních destičkách o 384/96 jamkách. Ve specifickém případu vysoce výkonného plošného testování sloučenin inhibujících ΡΙ3Κγ se vzorky obsahující lidskou rekombinantní GST-PI3y, fosfolipidové micely, radioaktivně značený ATP a volitelně i sloučeniny jež mají být testovány jako inhibitory tohoto enzymu, smísí ve vhodném pufru. Reakce vede k agregování, srážení více či méně důležité radioaktivní frakce fosfolipidú do formy micel (Obr. 2. Poté jsou přidány neomycinem povlečené SPA-perličky, blokující reakci a interakci (vzájemnou reakci) mezi fosfolipidy dostatečně silně k jejich imobilizaci, znehybnění na povrchu perliček (Obr. 3). Kvantifikace signálu blízké scintilace, získaného ze značeného PI₍₃₎P znehybněného na perličkách, umožňuje vyhodnocení kinázové aktivity v různých vzorcích.

V závislosti na rozměrech mikrotitrační jamky může být upraven objem reakce. Zatímco mikrotitrační destička o 96 jamkách umožňuje použití objemů do 50 mikrolitrů, mikrotitrační destička o 384 jamkách vyžaduje snížení objemů vzorků na 30 mikrolitrů. Tabulka I ukazuje objem každé reakční složky, která má být smísena pro získání tří různých konečných objemů (všechny objemy jsou uvedeny v mikrolitrech).

• · · · ·· · · • · ·

- 26 • · · · · · · · · • · · · · · · · · · · · · ······ · · ·· ·· ·

Tabulka I

lidská rekombinantní GST-PI3Ky	5	10	10
fosfolipidové micely	10	10	50
kinázový pufr	10	20	30
inhibující sloučenina (či voda u kontrolních reakcí)	5	10	10
konečný objem	30	50	100

Enzym se rozpustí ve 40 mmol.I¹ Hepes (pH 7,4), 1 mmol.l'¹ DTT (dithiothreitolu) a 5% ethylenglykolu. Množství přidaného enzymu v každém vzorku samozřejmě odráží množství radioaktivně značeného substrátu, ale obvykle činí 7,5 až 100 nanogramů na vzorek.

Konečná koncentrace složek kinázového pufru je od 10 do 40 μιηοΙ.Ι'¹/200 nCi [³³Ρ]γ-ΑΤΡ, 10 mmol.l·¹ MgCI2, 1 mmol.l·¹ DTT, 1 mmol.l·¹β-glycerolfosfát, 100 μηηοΙ.Ι'¹ NaVO4, 0,1 % cholát sodný a 40 mmol.l'¹Hepes (pH 7,4). Přítomen může být také DMSO (dimethylsulfoxid) pro zlepšení rozpustnosti inhibující sloučeniny, ale k vyloučení nepravého, rušivého inhibičního účinku na kinázu by jeho množství nemělo překročit 1% konečnou koncentraci.

Po inkubaci při teplotě místnosti v rozmezí od 45 do 180 minut, za mírného míchání, se reakce zastaví přídavkem 60 mikrolitrů (při objemu vzorku 30 mikrolitrů) nebo 180 mikrolitrů (při objemu vzorlu 50 či 100 mikrolitrů) fosfátem pufrovaného fysiologického roztoku (PBS, phosphate buffered šalině), obsahujícího 10 mmol.l'¹ neznačeného ATP (kompetujícího, soutěžícího o nespecifickou vazbu s již přítomným radioaktivně značeným ATP), 5 mmol.l'¹ ethylendiamintetraacetátu (EDTA, sloučeniny inhibující kinázu) a 100 μg (250 pg pro reakční • · · · • * · · * · • · ·

- 27 « · * · · ···« • · · · · · · · ···· • · · » · · · · · · «····· · · ·· ·· φ objemy 50 či 100 μΙ) neomycinem povlečených polyvinyltoluenových SPA-perliček.

Po inkubaci v trvání 60 minut při teplotě místnosti a za mírného míchání jsou pak neomycinem povlečené SPA-perličky zpětně získány odstředěním destiček při 1 500 g v trvání 5 minut a odstraněním supernatantu. Množství radioaktivního PI₍₃₎P, vytvořeného v každé jamce, je kvantifikováno scintilačním měřením za použití MicroBeta™ odečítače destiček (Wallac). Kvantifikace je místo cpm, počtem radioaktivních impulsů za minutu, udána dpm, počtem rozpadů za minutu proto, aby byla zohledněna skutečnost, že cmp přesně odpovídají dpm pouze tehdy, pokud má beta-odečítač 100% účinnost při měření dezintegračních dějů. Pokud to nelze zaručit, je do výpočtů zaveden korekční faktor, kde 1 Ci odpovídá 2,22 x 10¹² dpm.

K prokázání účinnosti detekční metody, zlepšení výkonnosti stanovení a zvýšení poměru signál/pozadí ve formátu mikrotitračních destiček byly proměnlivé podmínky testovány titrací různých složek stanovení.

Bylo zjištěno, že snížení koncentrace [³³Ρ]γ-ΑΤΡ ze 40 na 10 μηηοΙ.Ι'¹/200 nCi poskytuje dvojnásobné zvýšení poměru signál/pozadí, zvláště pak v přítomnosti menšího množství kinázy (Obr. 4). Jak je prokázáno srovnáním impulzů, získaných za použití dvou různých množství kinázy, specifický signál je úměrný koncentraci enzymu. Zmenšení objemů ze 100 μΙ na 50 μΙ potom takový poměr dále zlepšuje (Obr. 5).

Rovněž bylo prokázáno, že neomycinem povlečené SPA-perličky umožňují lineární zvýšení znovu získaného radioaktivně značeného substrátu až do hodnoty 750 μg perliček/jamku (Obr. 6). Poslední dva

4 ·· · 4 4 4 4 4 4 · 44 4 4444

4444 4444 444

- 28 44 4·4 ·

444444 44 44 44 4 pokusy zahrnovaly také vzorky, do nichž byl přidán známý inhibitor ΡΙ3Κγ, nazývaný Wortmannin (Upstate Biotechnology), které tak potvrzovaly specifičnost kinázové aktivity, detegované prostřednictvím těchto SPA-perliček. Vyloučena byla také možnost, že by samotné perličky mohly nespecificky navazovat značený substrát, neboť teplotní ovlivnění při 95 °C, inaktivující ΡΙ3Κγ, signál zcela vrátilo na hodnoty pozadí (Obr. 7).

Spolehlivost způsobů stanovení podle tohoto vynálezu byla testována srovnáním křivek pro IC₅₀, získaných za použití dvou známých inhibitorů PI3K (Wortmanninu a LY2924002) a jako kontroly rapamycinu, který inhibuje mTOR, odlišný kinázový proud v dráze, regulované ΡΙ3Κγ. Rostoucí koncentrace Wortmanninu nebo LY2924002 byly přidány k lidské rekombinantní GST-PI3Ky a tukovým měchýřkům. Hodnoty IC₅₀pro Wortmannin a LY2924002 (2,6 nmol.l'¹, respektive 2 μηιοΙ.Ι'¹) souhlasí s jejich zveřejněnými hodnotami (Stein a Waterfield, 2000), zatímco rapamycin nemá žádný pozoruhodný účinek (Obr. 8). Tyto hodnoty IC₅₀ nejsou ovlivněny pořadím, v jakém jsou přidány inhibitor a tukové měchýřky.

Hodnoty Km daného enzymu pro ATP a Pl byly rovněž vypočítány, ovšem ty nejsou významně odlišné od hodnot, naměřených za použití běžných postupů. Poměry signál/pozadí, hodnoty Km a IC₅₀ pro Wortmannin a LY2924002, vypočítané za použití buď mikrotitrační destičky o 96 jamkách/50 mikrolitrů, nebo mikrotitrační destičky o 384 jamkách/30 mikrolitrů, rovněž nevykazovaly závažný rozdíl.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob identifikace a/nebo kvantifikace radioaktivně značených molekul, schopných vázat aminoglykosidy, ve vzorku, vyznačující se t í m, že zahrnuje následující kroky, v nichž:

a) se připraví vzorek, obsahující alespoň nějakou molekulu schopnou vázat aminoglykosidy a nějaký enzym;

b) se umožní uvednému enzymu buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k molekule schopné vázat aminoglykosidy, nebo odštěpit radioaktivně značenou skupinu, která je na molekule schopné vázat aminoglykosidy již přítomna;

c) se vzorek inkubuje s jedním nebo více z pevných nosičů, impregnovaných scintilační sloučeninou a povlečených aminoglykosidem; a

d) změří se vyzařování vytvářené scintilačním nosičem či nosiči.
2. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že vzorek a nosič či nosiče se oddělí mezi kroky (c) a (d).
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že různé vzorky, připravené podle kroku (a), obsahují stejné množství molekuly schopné vázat aminoglykosidy, stejné množství enzymu, schopného buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k molekule schopné vázat aminoglykosidy, nebo radioaktivně značenou skupinu, která je na molekule schopné vázat aminoglykosidy již přítomna, odštěpit a jednu či více z přídavných sloučenin.
4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že různé vzorky, připravené podle kroku (a), obsahují stejné množství molekuly schopné vázat aminoglykosidy, stejné množství enzymu, schopného buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k molekule schopné vázat aminoglykosidy, nebo radioaktivně • · · « · ·

- 30 φφ ···· • ΦΦΦ • · φ φφφ φ φ φ «φφφ φ φ φφφ φφφφφ φφφφ φ φ φ φ φ «φ φ φ φ značenou skupinu, která je na molekule schopné vázat aminoglykosid již přítomna, odštěpit, za přítomnosti či v nepřítomnosti jedné či více z přídavných sloučenin, přidávaných před krokem (c) nebo během něho.
5. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že různé vzorky, připravené podle kroku (a), obsahují stejné množství molekuly schopné vázat aminoglykosidy, a různé směsi molekul případně obsahujících enzym, schopný buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k molekule schopné vázat aminoglykosidy, nebo radioaktivně značenou skupinu, která je na molekule schopné vázat aminoglykosid již přítomna, odštěpit.
6. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že různé vzorky, připravené podle kroku (a), obsahují stejné množství enzymu, schopného buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k molekule schopné vázat aminoglykosidy, nebo radioaktivně značenou skupinu, která je již přítomna na molekule schopné vázat aminoglykosid, odštěpit a různé směsi molekul, případně obsahujících molekulu schopnou vázat aminoglykosidy.
7. Stanovení k identifikaci a/nebo kvantifikaci sloučenin modulujících vzájemné reakce mezí molekulou schopnou vázat aminoglykosidy a enzymem, schopným buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k molekule schopné vázat aminoglykosidy, nebo radioaktivně značenou skupinu, která je již přítomna na molekule schopné vázat aminoglykosidy, odštěpit, vyznačující se t í m, že se srovnává signál blízké scintilace, vytvářený nosiči, získaný podle způsobu, popsaného v nároku 3.
8. Stanovení podle nároku 7, vyznačující se tím, že sloučeniny jsou případnými inhibitory enzymu.

• ft ft • · · · · · · · · • ft · · · · · · · • ftftft ft ftftft ftft ftft ft • · · ftft·· ftft · ······ ftft ftft ftft ft

- 31 • · ft · « · •· ··♦·
9. Stanovení k identifikaci a/nebo kvantifikaci sloučenin modulujících vzájemnou reakci mezi molekulou schopnou vázat aminoglykosidy a aminoglykosidem, vyznačující se tím, že je srovnáván signál blízké scintilace, vytvářený nosiči, získaný podle způsobu, popsaného v nároku 4.
10. Stanovení podle nároku 9, vyznačující se tím, že sloučeninami je míněn bakteriální enzym, modulující aminoglykosid.
11. Stanovení k identifikaci a/nebo kvantifikaci enzymu, schopného buď připojit radioaktivně značenou skupinu, přítomnou ve vzorku, k molekule schopné vázat aminoglykosidy, nebo radioaktivně značenou skupinu, která je již přítomna na molekule schopné vázat aminoglykosidy, odštěpit, vyznačující se t í m, že je srovnáván signál blízké scintilace, vytvářený nosiči, získaný podle způsobu, popsaného v nároku 5.
12. Stanovení k identifikaci a/nebo kvantifikaci molekuly schopné vázat aminoglykosidy, vyznačující se tím, že je srovnáván signál blízké scintilace, vytvářený nosiči, získaný podle způsobu, popsaného v nároku 6.
13. Stanovení podle nároků 7 až 12, vyznačující se tím, že je přidána sloučenina, kompetující s jednou ze složek zahrnutých ve stanovení nebo takovou složku pozměňující.
14. Stanovení podle nároků 7 až 13, vyznačující se tím, že scintilačními nosiči jsou perličky.
15. Stanovení podle nároků 7 až 14, vyznačující se tím, že aminoglykosidem je neomycin.

·· ··· · ·· ··*·

- 32 • · · · • · · · · • · · · · · · · • ·· *
16. Stanovení podle nároků 7 až 15, vyznačující se tím, že molekulou schopnou vázat aminoglykosidy je monofosforylovaný nebo polyfosforylovaný fosfoinositid.
17. Stanovení podle nároků 7 až 15, vyznačující se tím, že molekulou schopnou vázat aminoglykosidy je molekula RNA.
18. Stanovení podle nároku 16, vyznačující se t í m, že enzymem je fosfoinositidkináza.
19. Použití scintilačního pevného nosiče, povlečeného aminogiykosidem, k identifikaci a/nebo kvantifikaci radioaktivně značené molekuly schopné vázat aminoglykosidy, ve vzorku.
20. Sada pro k identifikaci a/nebo kvantifikaci molekul schopých vázat aminoglykosidy, enzymů upravujících takové molekuly nebo sloučenin modulujících vzájemnou reakci mezi molekulami schopnými vázet aminoglykosidy a buď enzymy, nebo aminoglykosidy molekuly schopné vázat radioaktivně značené aminoglykosidy, vyznačující se t í m, že zahrnuje scintilační pevný nosič, povlečený aminogiykosidem.