CZ20031326A3

CZ20031326A3 - Dekontaminace živočišného krmiva obsahujícího prion (t.j. nositele BSE), způsob jeho výroby a použití

Info

Publication number: CZ20031326A3
Application number: CZ20031326A
Authority: CZ
Inventors: Phillip William Kemp
Original assignee: Austech Sterile Resource Recovery Pty
Priority date: 2000-11-15
Filing date: 2001-11-14
Publication date: 2003-09-17
Also published as: RU2290828C2; NZ526502A; MXPA03004144A; NO20032159L; ATE308894T1; EP1343387A4; HUP0302644A3; NO20032159D0; CZ303982B6; CY1105296T1; CA2427895C; SI1343387T1; WO2002039826A1; NO335436B1; PL362176A1; CA2427895A1; DE60114876T2; AU1481902A; AU2002214819B2; DK1343387T3

Description

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje ke způsobu výroby živočišného krmivá. Přesněji se tento vynález vztahuje ke způsobu výroby živočišného krmivá z živočišných vedlejších produktů, při němž zpracování zásadami a teplem eliminuje nebo omezuje přenosná degenerativní mozková onemocnění, například bovinní spongiformní encefalopatii, Creutzfeldt-Jakobovu chorobu a sctapii (svrbivku).

Dosavadní stav techniky

Přenosná degenerativní mozková onemocnění (TDE), zahrnují bovinní spongiformní encefalopatii (BSE nebo „nemoc Šílených krav“), svrbivku u ovcí, Creutzfeldt-Jakobovu chorobu (CJD), Gerstman-Straussler Schemkerovu chorobu (GSS) a infekci GNS u lidí. Tyto choroby se staly značně známými v posledních letech alespoň částečně díky tomu, že úřady selhaly při kontrole začlenění hovězího masa kontaminovaného BSE do lidských i živočišných dodávek potravin, což vedio k vypuknutí CDJ, zvláště ve Velké Británii (viz Editoriai in Nátuře, 1997, 389 423).

Je již dobře známo, že činitel zodpovědný za přenos TDE je bílkovina obecně uvedená jako bílkovina „prion“, která tvoří základ jak BSE, tak CJD (Hill et al,, Nátuře 1997, 389448).

Obecně se usuzuje, že zničení TDE v mase vyžaduje zpracování při 132 ^ĎC po dobu 20 minut při tlaku 3 bary. Jinak mohou být v přítomnosti zásady teplota a tlak sníženy na 121 °C a, respektive, 2 bary.

Zásady jsou známé pro svůj hydrolytický účinek na biomolekuly, například bílkoviny, a pří snaze o sterilizaci živočišné tkáně kontaminované TDE se jako prostředků na zničení patogenity prionů využívá zpracování zásadami, teplem a tlakem.

Například, Taguchi et al., 1991, Arch. Virol. 119 297 využil hodinové zpracování 1 N NaOH následované zpracováním v autoklávu při 121 °C po 30 minut, aby inaktivovai CDJ-infikované mozkové homogenáty. Ernst & Race., 1993. J. Virol. Meíhods 41 193 použili zpracování v autoklávu společně s NaOH a zpracováním LpH, aby inaktivovali svrbivkou infikované mozkové homogenáty.

• · ·· ··· ·

Rozsáhlejší řadu zkoušek provedl Tayior et al., 1994, Arch. Virol. 139131, aby dekontaminoval BSE-infikované vzorky bovinního mozku nebo vzorky svrbivkou infikovaného mozku krysy. Zpracování zahrnovalo působení 1 M nebo 2 M NaOH po dobu až jedné hodiny, zpracování v autokiávu za teplot mezi 134 °C a 138 °C po dobu až jedné hodiny nebo zpracování chlornanem sodným nebo dichloroisokyanuřáíem sodným po dobu až dvou hodin. Tyto autoři usoudili, že žádný ze zkoušených postupů neposkytl úplnou TDE inaktivaci.

Problém výroby živočišného krmivá z potenciálně TDE-infikované živočišné tkáně je, že není snadné dosáhnout podmínek vysoké teploty a tlaku pomocí tavícího nebo zařízení pro recyklaci živočišného odpadu. Vysokoteplotní výrobní zpracování živočišného krmivá také vede k výrobě nekvalitního krmivá, protože poskytuje nežádoucí vedlejší produkty, například karqinogeny, diaminq kyseliny a prchavé pachy.

Předmětem vynálezu je tedy poskytnutí způsobu výroby živočišného krmivá, v němž je možnost TDE kontaminace alespoň omezena, když ne eliminována.

Podstata vynálezu

Jedno hledisko tohoto vynálezu spočívá ve způsobu výroby živočišného krmivá včetně kroků;

(i) přidáni zásady k živočišnému materiálu, aby pH bylo udrženo na alespoň 6,5;

(ii) zahřátí materiálu kroku (i) na teplotu v rozsahu 55 °C až 99 °C; a dehydratování materiálu vyrobeného v kroku (ii).

Jiné hledisko tohoto vynálezu spočívá ve způsobu výroby TDEdekontaminovaného živočišného krmivá včetně kroků:

(i) přidání zásady k TDE- kontaminovanému živočišného materiálu, aby pH bylo udrženo na alespoň 8,5;

t (ii) zahřátí materiálu kroku (i) na teplotu v rozsahu 55 °C až 99 °C; a (íii) dehydratování materiálu vyrobeného v kroku (ii).

Je vhodné, když je způsob tohoto vynálezu prováděn za přibližně atmosférického tlaku.

Je vhodné, když je přidán dostatek zásady, aby pH bylo udrženo na alespoň 9,5.

Je výhodnější, když je přidán dostatek zásady, aby pH bylo udrženo v rozsahu od 10,5 do 13,0.

·· ··

Ješiě výhodnější je, když je přidán dostatek zásady, aby při byio udrženo v rozsahu 11,0 až 11,5.

Je výhodné, když je zásadou hydroxid vápenatý, například ve formě hydratovaného vápence.

Je výhodné, když je materiál v kroku (ii) zahřátý na teplotu v rozsahu 60 ^ŮC až 90 o z**

La.

V jednom určitém včlenění je teplota asi 60 °C.

V dalším určitém včlenění je teplota 8Q °C až 85 °C.

Kroky (i) a (ii), které se nazývají „hydroiytická táze“, trvají vhodné jednu až čtyři hodiny nebo nejlépe jednu až dvě hodiny.

Po této hydrolytické fázi může být zpracovaný živočišný materiál před dehydratací uskladněn nebo může být hned dehydratován.

S ohledem na dehydrataci je vhodné, když není obsah vlhkosti v živočišném krmivu větší než 10 až 15 hmotn. %. Typicky může hladina vlhkosti s časem klesnout na asi 7 až 8 hmotn. %, což je pro živočišné krmivo tohoto vynálezu optimální.

V ještě dalším hledisku poskytuje tento vynález živočišné krmivo vyrobené podle postupu prvně zmíněného hlediska,

Avšak v ještě dalším hledisku poskytuje tento vynález TDE-dekoníaminované živočišné krmivo vyrobené podle postupu druhého zmíněného hlediska.

Tento vynález také poskytuje TDE-dekontaminovaný živočišný materiál vyrobený podle kroků (i) a (ii) v druhém zmíněném hledisku tohoto vynálezu.

Tento vynález také poskytuje použití živočišného krmivá dříve zmíněných hledisek jako hnojivá.

V této specifikaci, pokud není jinak uvedeno, „obsahují“, „obsahuje“ a „obsahující je použito všeobecně, spíše než výlučně, takže uvedená číslice nebo skupina číslic může zahrnovat jednu nebo více neuvedených číslic nebo skupin číslic.

Tento vynález povstal z neočekávaného odhalení vynálezce, který žádost podává, že v zásadou upravený živočišný materiál, který je podroben za atmosférického tlaku působení mírného tepla, účinně zničí TDE. Minimalizování tepelného zpracování se také týká skutečnosti, že živočišné krmivo musí být lehce stravitelné, zvláště pokud jde o obsažené bílkoviny; stejně jako nesmí obsahovat TDE. Nadměrné teplo by navíc vytvořilo nežádoucí produkty, například zesílené aminokyseliny, raeemízací Laminokyselin na jejich D-izomery a tvorbu muísgenů, například 2-amino-3,8diethy,imidazoi-[4.5fj-chinolinu. Také je důležité, aby během výroby docházelo k minimálnímu vypařování tak, aby tvorba nepříjemného zápachu byía minimalizována. Tento vynález dokonce minimalizuje tepelné zpracování za atmosférického tlaku během výroby, zatímco využívá krok dehydratační a krok zásaditého zpracování, aby, co se týče TDE, bylo živočišné krmivo účinně sterilizováno. Výrobní podmínky, které tento vynález poskytuje, jsou pro kapacity mnoha běžných komerčních výrobních zařízení živočišného krmivá snadné, nebo mohou být použity pouze s menšími úpravami takových zařízení.

Živočišné materiály, které mohou být použity, zahrnují, například, živočišný odpad a vnitřnosti z jatek; domácí zvířata malé komerční hodnoty, například vyřazené pro věk nebo suchem zasažené ovce nebo dobytek, nebo ovce zredukovaného stáda; neužitečná nebo vyřazená poražená divoká zvěř nebo její části; drůbeží vnitřnosti nebo drůbež vyřazená pro věk; rybí nebo račí vnitřnosti nebo nepoužitelné druhy z íovů.

Živočišný materiál je nejlépe smíchán dohromady se suchým dehydratačním materiálem, který je schopný absorbovat vlhkost z živočišného materiálu (buď chemicky, nebo fyzikálně), a redukovat tak procentuelní obsah vody v materiálu na suchý stabilní produkt.

Dehydratační materiály zahrnují alespoň jednu nebo více kombinací z: bentonitů, zeolitů, kaolinů nebo jiných jílů v poměru, který nepřesahuje 35 hmotn, %;

oxidu vápenatého, oxidu horečnatého nebo hlinitého v poměru, který nepřesahuje 35 hmotn. %;

diatomitu nebo jiných diamayneííckých zemin v poměru, který nepřesahuje 35 hmotn. %;

sádry, dotomitu, vápence, uhličitanu sodného nebo soli v poměru, který nepřesahuje 35 hmotn. %;

fosforečnanu vápenatého a/nebo kyseliny fosforečné v poměru, který nepřesahuje 35 hmotn. %;

síranu železnatěho a/nebo síranu železitého v poměru, který nepřesahuje 35 hmotn. %;

zrn, škrobů a želatinových materiálů a vedlejších produktů obilí (napříkiad, šrotu, otrub, siupek a podobně) včetně exíruaovanýeh forem v poměru, který nepřesahuje 80 hmotn. %;

zrn bílkovin a olejnatých zrn a jejich vedlejších produktů obílí včetně zpracovaných a extrudovaných forem bílkovinná stravy v poměru, který nepřesahuje 80 hmotn. %;

rostlinných výrobků a vedlejších produktů, například, kokosové moučky a moučky z palmových jader, bavlněné drti a sekaného sena a slámy v poměru, který nepřesahuje 75 hmotn. %; a vedlejších živočišných produktů, například, masové moučky, kostní moučky a krevní moučky a žeíatinových materiálů v poměru, který nepřesahuje 75 hmotn. %.

Vhodné dehydratační materiály, které mohou být použity jsou různé a budou záviset na několika faktorech včetně:

1. blízkosti a ceně dehydratačního materiálu pro dehydratační zařízení,

2. rychlosti, s níž musí být dehydratace provedena,

3. zamýšleném použití výsledného suchého produktu.

Dehydratace je nejlépe prováděna v rotační sušárně.

Zásada použitá v kroku (i) může zahrnovat oxidy, hydroxidy a soli kovových prvků Příklady zahrnují oxid vápenatý, hydroxid vápenatý, hydroxid sodný, uhličitan sodný, siřičitan sodný, hydroxid draselný, uhličitan draselný, hydroxid horečnatý, uhličitan hořečnatý, síran hořečnatý nebo jakékoliv dva či více z nich v kombinaci

Nejlépe je zásadou hydroxid vápenatý (hydratovaný vápenec).

Koncentrace zásad použitých v kroku (i) bude záviset na požadovaném pH, určité použité zásadě a tlumicí kapacitě živočišných nebo jiných materiálů použitých během výroby.

Například typickým poměrem je 25 kg hydratovaného vápence na 1200 kg vlhkého živočišného materiálu.

V závislosti na materiálu, s nímž má být výrobek smíchán, může být hladina pH upravena přidáním kyseliny.

Během výroby mohou být přidány dle volby různé materiály, které mohou zvýšit nutriční hodnotu nebo ekonomickou hodnotu konečného výrobku. Takové další materiály mohou zahrnovat, například, modifikátory bachoru, například monensen nebo avoparcin, enzymy nebo bakteriální kultury; přídatné vitamíny nebo minerály; nebílkovinné zdroje dusíku, například močovinu; antíoxídanty, stabilizátory, antibiotika, inhibitory plísní, konzervační prostředky (včetně soli) a podobně; bílkovinné a tukové modifikátory, které mění stravitelnost v bachoru; ochueovadla, napřikiad, melasu a vedlejší produkty fermentace melasy.

Výhodné je, když živočišné krmivá po vysušeni, před tím, než je přímo krmeno dobytku (jak přežvýkavcům, tak s jedním žaludkem), je ponecháno 24 hodin odstát v granulované nebo kvádrové formě nebo jako jemně mletý prásek φ φ φφφφ • · · φφφ φ · · • · φ φ φ Φφφφ · φ · ·Φ···Φ φφφφ φ φ φφ φφ · φφφφ φφφφ <· φφ φφφ φφ φφ

Živočišné knmivo může být smícháno s potravinovými doplňky, stopovými prvky, bílkovinnou moučkou, cereáiní bílkovinou a oiejnatými zrny, melasou nebo vedlejšími produkty fermentace melasy, senem nebo podobně v jakékoliv kombinaci pro krmení dobytka (jak přežvýkavců, tak s jedním žaludkem); může být použito jako krmení pro domácí zvířata buď ják je vyrobeno, nebo smíchané s jinými materiály; a/nebo může být přímo použito jako složka stravy pro konzumaci lidmi. Obecně bude suchý materiál přimíchán na maximálně 10 až 15 hmotn. % konečného produktu.

Některými příklady vyrobeného živočišného krmivá jsou:

1. Tuku zbavené jateční pevné frakce (typicky < 10 % tuku na bázi suché hmoty) plus „lepkavá voda“ jsou smíchány s hydroxidem vápenatým, aby bylo dáno požadované pH 11 (přibližně 1 : 30 hmotn. % na bázi suché hmoty), a jsou ponechány odstát 1 hodinu ve vyrovnávací nádobě. Výrobek je pak přes hodinu sušen při 80 °C v rotační sušičce, aby byl poskytnut výsledný výrobek < 10 % volné vlhkosti, který je pak umlet na jemnou moučku.

2. Tuku zbavené jateční pevné frakce (typicky < 10 % tuku na bázi suché hmoty) jsou smíchány s hydroxidem vápenatým, aby bylo dáno požadované pH 10 (přibližně 1 : 50 na bázi suché hmoty), a jsou ponechány odstát 30 minut ve vyrovnávací nádobě a pak jsou sušeny v rotační sušičce s určitým přístupem solárního tepla přes tři hodiny při 60 °C, aby byl poskytnut výsledný výrobek < 10 % vlhkosti. Tento výrobek je pak umlet na jemnou moučku.

3. Syrový odpadní rybí materiál je smíchán se zásadou skládající se z 80 % z hydroxidu vápenatého a z 20 % z hydroxidu sodného na pH 10,5 (přibližně 1 : 40 na bázi suché hmoty), a přes čtyři hodiny sušen při 70 °C v rotační sušičce, aby byl poskytnut výsledný výrobek < 11 % vlhkosti, který je pak umlet na jemnou moučku.

Ačkoliv ještě žádné infekční TDE u jiných domácích zvířat než u přežvýkavců (například ryb a drůbeže) nebylo detekováno, v některých zemích existují zákazy krmení bílkovinných mouček zahraničního živočišného původu. Například v Austrálii a ve Spojených státech existuje zákaz krmení jakékoliv bílkovinné moučky živočišného původu přežvýkavcům. V mnoha evropských zemích existuje úplný zákaz krmení jakékoliv bílkovinné moučky živočišného původu všem živočišným druhům. Tyto zákazy existují ·♦ 0000

0« 000« • 0 0 0 0 0 kvůli obavám, že infekční TDE by eventuelně mohía být detekována u jiných živočichů, než přežvýkavců.

Také bude oceněno, že živočišné krmivo tohoto vynálezu může být použito jako TDE-dekontaminované hnojivo.

Aby bylo možné vynálezu plně porozumět, budou nyní popsána vhodná včlenění s odkazy na doprovodný obrázek (obr. 1), který je schematickým diagramem zařízení použitého ve způsobu tohoto vynálezu.

S ohledem na způsob tohoto vynálezu je dehydratační materiál smíchán se syrovým živočišným materiálem a pak zahrát a sušen. Je běžné smíchat veškeré materiály na počátku, ale není to podstatné, protože jakékoliv přísady mohou být přidány v jakoukoliv dobu postupu. Když je smíchán, je materiál vysušen. Může být použit jakýkoliv tepelný sušící systém, ale obvykle je nejvíce praktický normální průtokový systém s ohřátým vzduchem.

S odkazem na obr. 1 jsou živočišné odpady 10 (např. z poraženého dobytka) umlety nebo nasekány v části 11 před tím, než je přidána zásada 12 (nejlépe hydroxid vápenatý) a míchány v míchačce 13.

Po mletí a před přidáním zásady 12, může být živočišný odpad 10 zahrát, aby zkapalněla lojová složka. Zahřátý živočišný odpad je pak scezen nebo slisován, aby vznikla kapalná a pevná frakce. Kapalná frakce je okyselena a oddělena do lojové frakce, dalších kapalín (většinou vody) a zbylých pevných látek (nazývaných „lepkavá voda“). Tato lepkavá voda může být zpracovávána samostatně nebo smíchána s pevnou frakcí ke zpracování zásadami a teplem.

V tomto příkladu zvedne přídavek zásady 12 (nejlépe hydroxidu vápenatého) pH směsi na asi 11,0 až 11,5. Během této „hydrolytické táze by mělo být pH udržováno na alespoň 8,5 nebo nejlépe na pH 9,5 po dobu 1 až 4 hodiny. Toto pH může klesnout, když dojde k hydrolýze, proto je vhodnější začít při pH alespoň 11,0, takže pH nikdy neklesne pod 8,5 nebo nejlépe pod 9,5.

Během této hydrolytické feze může být teplota udržována na 60 °C po delší dobu (řekněme tří hodiny), aby byla snížena spotřeba energie, nebo může být udržována na 80 až 85 °C po kratší dobu (řekněme jednu hodinu).

Směs je pak transportována (např. šnekem) do bubnové sušárny, která je vybavena dmychadlem nebo ventilátorem pro protiproudý tok vzduchu 16, vytápěná topným článkem 15. Nejlépe právě v tomto místě jsou přidány do sušárny možné ·· ·· 9· 4444 ·· ««·· • · · · · « · · · • · ·· · · «»· · · · dehydratační materiály (např. bentonit, zeoiit, vápenec, mleté obilné klíčky), aby usnadnily dehydratační proces.

Živočišné krmivo normálně opustí sušárnu 14 s obsahem vlhkosti asi 10 až 11 hmotn. %. Bylo zjištěno, že tento obsah vlhkosti klesne na asi 7 až 8 hmotn. % během dvaceti čtyř až čtyřiceti osmi hodin po sušení díky pokračující hyuiolýze bílkovin.

Suché živočišné krmivo je dopraveno do kladívkového mlýna 17, aby bylo rozemleto na požadovanou velikost granulí/prášku a granuiovaný/práškový materiál krmivá je dopraven do balícího/transportního prostoru 18.

Má-li být krmivo použito k přímému krmení, např. ryb, může být přidána do míchačky 13 (po počátečním smíchání) nebo do kladívkového mlýna 17 kyselina 19, aby snížila pH konečného výrobku, např. na pH 6,5 až 7,5.

Tam, kde má být výrobek smíchán s kyselými materiály, například obilím, nemusí být zapotřebí přidávat kyselinu, protože zásaditý výrobek může být vyvážen kyselosti obilí.

Odborníkům bude hned zřejmé, že hodnotné krmivo, nejlépe pro živočichy, ale také vhodné ke konzumaci lidmi, může být vyrobeno z živočišné tkáně, v podstatě bez TDE kontaminace nebo mající nejmenší možnou TDE kontaminaci, a že výsledné krmivo je vhodné pro široké použití, včetně použití jako hnojivá.

Přehled obrázků na výkresech

Tabulka 1: Konečné pH různě zpracovaných vzorků masa.

Tabulka 2; Přehled stupňů clearance bílkoviny prionu ve vzorcích masa obohacených TDE po zpracování zásadou a teplem.

Obr. 1; příklad zařízení pro výrobu živočišného krmivá.

Obr. 2: titrace 263K masového výtažku SPO17220Q. Pás 1; proteázou K strávený 263K Hs masový výtažek, 10~^2,1. Pás 2: nestrávený 263K Hs masový výtažek. 10'²¹. Pás 3: duhové markéry s nízkou molekulovou hmotností. Pásy 4 až 10: řada pětinásobných zředění proteázou K stráveného 263K masového výtažku od 10^1,4 do, eventuelně, 10'^5,6zředění.

Obr. 3: analýza vzorků postupu následující trávení proíeázy K. Pás 1: proteázou

K strávený 263K Hs masový výtažek, 10'^2,1. Pás 2: duhové markéry s nízkým molekulárním poměrem . Pás 3: proteázou K strávený 287.1A. Pás 4: proteázou

K strávený 287.1-1. Pás 5: vaření směsi 1x. Pás 6: vaření směsi 1x. Pás 7: proteázou ► 99 • ·

9 9 9 ·♦«· ► 9 9

I 9 999

9999

9999 99

K strávený 287.1-2. Pás 8: proteázou K strávený 287.1-3. Pás 9: proteázou K strávený

287.1- 4. Pás 10: vaření směsi 1x.

Obr. 4: analýza nestrávených vzorků postupu. Pás 1: nestrávený 263K Hs masový výtažek, 10 ^2,1. Pás 2: proteázou K strávený 263K Hs masový výtažek, IQ²·¹. Pás 3: nestrávený 287.1A. Pás 4: nestrávený 287.1-1. Pás 5: duhové markéry s nízkým molekulárním poměrem, Pás 6: vaření směsi 1x. Pás 7: nestrávený 287.1-2. Pás 8: nestrávený 287.1-3. Pás 9: nestrávený 287.1-4. Pás 10: vaření směsi 1x.

Obr. 5: titrace 263K masového výtažku SPO172200. Pás 1: proteázou K strávený 263K Hs masový výtažek, 10^2J. Pás 2: nestrávený 263K Hs masový výtažek, 10^2,1. Pás 3: duhové markéry s nízkou molekulovou hmotností. Pásy 4 až 10: řada pětinásobných zředění proteázou K stráveného 263K masového výtažku od 10^1,4do, eventuelně, 10^{5 6}zředění.

Obr. 6: Western blot analýza proteázou K strávených vzorků. Pás 1: pozitivní srovnávací pokus při zředění 10^2,8. Pás 2: markéry molekulové hmotnosti. Pás 3: vzorek 309.1A. Pás 4: slepý pokus. Pásy 5 až 10: vzorky 309.1-1,3, 309.1-1,6, 309.1-2,3, 309.1-3,3,

309.1- 4,3 a eventuelně, 309.1-4,3.

Obr. 7; Western blot analýza proteázou K nestrávených vzorků. Pás 1: pozitivní srovnávací pokus při zředění 10 ²’⁸. Pás 2: markéry molekulové hmotnosti. Pás 3: vzorek 309.1A. Pás 4: slepý pokus. Pásy 5 až 10: vzorky 309.1-1,3, 309.1-1,6, 309.1-2,3,

309.1- 3,3, 309.1-4,3 a eventuelně, 309.1-4,3.

Příklady provedení vynálezu

Aby bylo možné tomuto vynálezu snadněji porozumět a aby byl vysvětlen v praktickém provedení, odkazujeme odborníky na následující příkiady.

Příklad 1

Od místního řezníka byla zakoupena mieíá hovězí kýta a byiy odváženy 4 alikvotní části o váze 10 g. Dvě alikvotní části byly umístěny do kovových kádinek, byi přidán 1mL 263K surového mozkového homogenótu křečci svrbivky (cHs) a důkladně promíchán. Do obou kádinek bylo přidáno 20 mL. 5% roztoku hydroxidu vápenatého, obsah byl zamíchán, přikryt folií a umístěn na 12 hodin do 60 °C teplé vodní lázně. Roztok byl během dvanácti hodinové inkubace míchán přibližně každých 30 minut Ke • 99

9

ÍO

99

9 9 · • 999 9

9 9 9 9

9 9 9 • 999 9 · 99

9999 třetí 10g alikvotní části masa byí přidán 1mL cHs, důkladně promíchán a pak bylo přidáno 20 mL 1% roztoku SDS. Tato směs byla dána na 10 minut do míchačky „end over end“. Tato směs pak byla 5 minut vařena, vyčeřena, rozdělena a zmražena při -80 °C. Toto tvoří vzorek 287.1A cHs.

Poslední 10g alikvotní část byla umístěna do kovové kádinky, byla obohacena 1mL cHs, důkladně promíchána a pak umístěna do sušárny s 60 °C k sušení vzduchem. Opět byl vzorek míchán každých přibližně 30 minut. Když byio suché, byio dehydratované maso ze sušárny vyjmuto a rozdrceno pomocí třecí misky a tloučku. Toto rozdrcené maso bylo smícháno s20 ml 1x vařené směsi, umístěno do míchačky „end over end“, mícháno 12 hodin při pokojové teplotě, pak vyčeřeno a rozděleno. Toto tvoří vzorek

287.1-1 cHs.

Po dvanácti hodinách v 60°C vodní lázni byly dvě kovové kádinky vyjmuty. Jedna kádinka byla umístěna do 60°C sušárny a za občasného míchání sušena vzduchem, jak bylo popsáno dříve. Materiál z druhé kádinky byl dán do odstředivkové zkumavky a pH bylo upraveno na 7,5. Bylo přidáno 22 mL 1x vařené směsi, umístěno do míchačky „end over end“ a mícháno 12 hodin pří pokojové teplotě. Toto pak bylo vyčeřeno, rozděleno a zmraženo při -80 °C, Toto tvoří vzorek 287.1-2 cHs.

Po dehydrataci při 60 °C bylo hydrolyzované maso vyjmuto ze sušárny a rozdrceno pomocí třecí misky a tloučku. K rozdrcenému masu bylo přidáno 20 mL 50 mM acetátu sodného a pH bylo upraveno na 7,5. Bylo přidáno 23 mL 2x vařené směsi a zkumavka byla umístěna na míchačku „end over end“, kde byla při pokojové teplotě směs míchána 12 hodin. Toto bylo pak vyčeřeno, rozděleno a zmraženo při -80 *C Toto tvoří vzorek 287.1-3 cHs.

Zbytek drtě ze vzorku 287.1-3 cHs byí znovu suspendován a inkubován s 10 mL 50mM pufru acetátu sodného (pH 6,0), a na 60 minut při pokojové teplotě umístěn na míchačku „end over end“. Toto bylo pak vyčeřeno, rozděleno a zmraženo pří -80 ^eC. Toto tvoří vzorek 287.1 -4 cHs.

Pak byly vzorky analyzovány pomocí Western bloíů. Western Bíot analýza 263K křečci svrbivky zahrnuje použití specifické monoklonálni protilátky, 3F4. 3F4 rozpozná jak normální buněčnou formu bílkoviny prionu PrP^c, tak formu spojenou s nemocí PrP^Sc. Na rozdíl od normální buněčné formy je PrP^Sc relativně rezistentní vůči proteázs, a jako trávení proteázy K vzorků může být použito k rozlišení PrP^Sc od PrP^c. Trávení proteázy K zpracovaných vzorků je také vhodné k odstranění bílkovin přítomných ve ·· ··· · zpracovaných vzorcích, které by mohiy způsobit ve stanovení metodou Western blot nespecifické zabarvení nebo zabarvení pozadí křížovou reakcí.

Obr. 2 ukazuje íítraci 263K křeččího upraveného masového výtažku svrbivky použitého v těchto zkouškách (SP0172200). Ukazuje typický vzor skvrn pozorovaný u 263K, při použití 3F4. Domníváme šě, žě dospěte bílkovina PrP upíné délky má patrný molekulární poměr (M_r) -33 000 daltonů (33K, horní pruh pásu 2). Po trávení proteázy K je obvykle pozorován {viz pás 1) převažující Široký pruh v oblasti 28K, méně zřetelný širší pruh ~23K, a ostrý, ale šerý pruh ~19K. Všimněte si, že v masových výtažcích 263K Hs mohou být také detekovány (pás 2) tyto nižší Mr druhy, patrně díky endogenním proteázám přítomným v, nebo během přípravy masového výtažku.

Pásy 4 až 10 ukazují řadu pětinásobných zředění masového výtažku 263K, od zředění 1 : 25 (10¹·⁴) do, eventuelně, zředění 1 : 390 625 (10 ^{5 6}) Druh 28K PrP^Sc může být detekován v pásech 4 až 7, t. j. od zředění 10'³·⁵. Při delších expozicích tohoto blotu (není na obrázku), je také při zředěních 10^Λ2 detekován druh 28K. Konečný bod, nebo titr, masového výtažku je definován jako první zředění, při kterém již není druh 28K PrP detekován. Títr tohoto výchozího materiálu je proto 10^-4,8, nebo 7,8 x i O² libovolných jednotek/ml.

Western blot analýza zpracovaných vzorků strávených proteázou Kje ukázána na obr. 3. Proteázou K strávený 263K Hs masový výtažek SP0172200 slouží jako vnitřní pozitivní srovnávací pokus (pás 1, 10'²¹ zředění). Druh 28K PrP může být jasně viděn ve vzorcích 287.1A a 287.1-1 (pásy 3 a, eventuelně, 4). Druh bílkoviny ~33K je také pozorován, což nasvědčuje, že strávení těchto vzorků proteázou Kje neúplné. Žádné pruhy bílkovin nejsou pozorovány ve vzorcích 287.1-2, 287.1-3 nebo 287.1-4 (pásy 7 až, eventuelně, 9), což nasvědčuje, že proces alkalické hydrolýzy odstranil bílkoviny PrP^ScProtože Žádné druhy PrP^Sc nejsou u těchto vzorků pozorovány, můžeme se domnívat, že mají konečný bod, nebo titr 10°, nebo 1 x 10° libovolných jednotek/ml. Všimněte si, že nelze učinit odhad litru pro vzorky 287.1A nebo 287.1-1.

Abychom potvrdili, že nebyly bílkoviny PrP^Sc odbourány krokem trávení proteázou K, byly metodou Western biotting analyzovány nestrávené zpracované vzorky (obr. 4). Jak netrávený, tak proteázou K strávený 263K Hs masový výtažek SP0172200 sloužily jako vnitřní pozitivní srovnávací pokusy (pásy 1 a, eventuelně, 2). Opět může být druh bílkoviny PrP pozorován ve vzorcích 287.1A a 287.1-1 (pásy 3 a, eventuelně, 4). Žádné pruhy bílkovin nejsou viditelné ve vzorcích 287.1-2, 287.1-3 nebo 287.1-4, (pásy 7 až, eventuelně, 9), což potvrzuje výsledky obr, 3.

·· ···· • · · · · ····· ···· ♦ · ·· ··· ·· ··

Příklad 2

Byly provedeny předběžné zkoušky ke zjištění stability pH následující zpracování masového materiálu.

5% roztok hydroxidu vápenatého bví upraven ná pH 12 pomocí kyseliny chlorovodíkové. Pak bylo přidáno 20 mL tohoto roztoku k10 g mletého libového hovězího masa a vzorek pečlivě promíchán. Bylo změřeno pH a pak bylo monitorováno asi 85 minut, přičemž během této doby zůstalo nezměněno na hodnotě pH 12.

Podobně byl 5% roztok hydroxidu vápenatého upraven na pH 10,5 a 20 mL bylo pečlivě promícháno s 10 g mletého libového hovězího masa. Počáteční pH bylo 5,4 a tó bylo upraveno na pH 10,5 dalším přídavkem hydroxidu vápenatého. Toto pH pak spadlo během 25 minut na 10,3.

Příklad 3

Dvě 10g alikvotní části mleté hovězí kýty byly umístěny do jednotlivých kovových kádinek, a každá alikvotní Část byla obohacena ImL 263K surového mozkového homogenátu křeččí svrbivky (cHs). Do každé kádinky pak bylo přidáno 20 mL hydroxidu vápenatého pH 12, vzorky byly pečlivě zamíchány a bylo změřeno pH, které byio 12 pro oba vzorky. Kádinky pak byly přikryty fólií a inkubovány při 75 °C celkem 3 nebo 6 hodin (2 nebo, eventuelně, 5 hodin ve vodní lázni a konečně 1 hodinu v sušárně).

Čtyři 10g alikvotní části mleté hovězí kýty byly umístěny do jednotlivých kovových kádinek, a každá alikvotní část byla obohacena 1mL 263K surového mozkového homogenátu křeččí svrbivky (cHs). Do každé kádinky pak bylo přidáno 18 mL hydroxidu vápenatého pH 10,5, vzorky byly pečlivě zamíchány a bylo upraveno pH na 10,5 (hydroxidem vápenatým) pro všechny vzorky. Kádinky pak byly přikryty folií a inkubovány při 60 °C celkem 3 hodiny, při 75 °C celkem 3 nebo 6 hodin nebo při 90 °C tři hodiny (nakonec ve vodní lázni s konečnou 1 hodinou v sušárně).

Všechny vzorky byly neutralizovány na pH 6,5 až 7,5 a pak upraveny na konečnou koncentraci 1 % SDS. Vzorky byly míchány na míchačce „end over end“ přibližně 10 minut při pokojové teplotě, vařeny 5 minut a vyčeřeny nízkorychlostní centrifugou. Kalová frakce pak byla sebrána, rozdělena a zmražena při -70 °C.

Podrobnosti týkající se těchto vzorků jsou shrnuty v tabulce 1.

• · · · · · • · * ··· ·· ···· • · · · ♦ ···· ·· ·· ··· • · ♦ · ·· ··

Vzorky byly analyzovány metodou Western bíot.

Jako srovnávací byla jedna lOg aiikvotní část mleté hovězí kýty obohacena 1mL 263K cHs, pečlivě zamíchána a bylo přidáno 20 ml 1 % SDS. Tento vzorek byl míchán na míchačce „end over end“ přibližně 10 minut při pokojové teplotě, vařen 5 minut a vyčeřen nízkóřychlóštní centrifugou. Kalová frakce pak byla sebrána, rozdělena a zmražena při -70 ⁰C.

Obr. 5 ukazuje titraci 263K křeččího upraveného masového výtažku svrbivky použitého v těchto zkouškách (SP0172200). Ukazuje typický vzor vybarvování pozorovaný u 263K, při použití mÁb 3F4. Domníváme se, že dospělá bílkovina PrP úplné délky má patrný molekulární poměr (M_r) ~33 000 dáltónů (33K, horní pruh pásu 2). Pb trávení proteázou Kje obvykle pozorován (viz pás 1) převažující široký pruh v oblasti 28K, méně zřetelný širší pruh ~23K, a ostrý, ale šerý pruh ~19K. Všimněte si, že v masových výtažcích 263K Hs mohou být také detekovány (pás 2) tyto druhy s nižší molekulovou hmotností, patrně díky endogenním proteázám přítomným v , nebo během přípravy masového výtažku.

Zpracované vzorky byly testovány pouze v nezředěném roztoku, buď bez tráveni nebo po trávení proteázou K při konečné koncentraci 10 pg/mL (založené na předchozích výsledcích). Tyto výsledky ukazují obr. 6 a 7.

Proteázou K strávený 263K cHs masový výtažek SP0172200 sloužil jako vnitřní pozitivní srovnávací pokus (pás 1 obrázku 6). Druh 2SK PrP může být jasně viděn ve vzorku 309.1A (jak s, tak bez trávení proteázou K; viz pás 3 obr. 6 a 7). Několik dalších druhů bílkovin je pozorováno v netráveném vzorku. Druhy 33K PrP jsou ještě viditelné po trávení proteázou (pás 3 obr. 6), což nasvědčuje, že trávení proteázou K bylo neúplné.

Žádné pruhy bílkovin nebyly pozorovány v žádném ze vzorků upravených teplem nebo hydroxidem vápenatým (pásy 5 až 10), ať s, nebo bez trávení proteázou K, dokonce při delších expozicích western blotů (do 30 minut). Všechny reakce, kdy došlo ke zpracování hydroxidem vápenatým nebo teplem testované v této práci, tedy odstranily prpse bjjkovjny protože žádné druhy PrP^Sc nejsou u těchto vzorků pozorovány, můžeme se domnívat, že mají konečný bod tiíru 10^z nebo 1 x 10° libovolných jednotek na ml. Všimněte si, že nelze učinit odhad titru pro vzorek309.1A.

Množství PrP bílkovin přítomných ve zpracovávaných vzorcích nebylo kvantifikováno titraci v analýze Western bíot. Ačkoliv, ovšem, nemohly být žádné PrP

99

9 9

999

9

9999 99 ·· 9999

9 9 999

9999 • 9 9

999

9 9 9

99 detekovány v žádném ze vzorků zpracovaných hydroxidem vápenatým nebo tepiem, lze učinit odhad clearance ve srovnání s odhadnutým 263K obohacením.

Log_w faktoru clearance je poměr celkového množství 263K, které obohatilo počáteční masný materiál, k celkovému množství 263K znovu nalezeném v konečném zpracovaném vzorku vyjádřený jako hodnota íog₁₀:

clearance - ^titf esového výtažku x objem obohacení titr vzorku x objem vzorku

U všech ošetřených vzorků bylo dosaženo faktoru clearance > 3,4 logaritmu. Tyto výpočty jsou shrnuty v tabulce 2.

V závěru byl přidán do vzorků mletého hovězího masa 263K Hs a byl změřen účinek zpracováni hydroxidem vápenatým a teplem podle tohoto vynálezu na základě eliminace bílkovin PrP^Sc. Kladné výsledky, o nichž zde referujeme, naznačují, že způsob tohoto vynálezu je důkladným postupem k odstraněni nebo ínakíivaci TDE ze vzorků masa používaný při výrobě živočišných krmiv.

Odborníci ocení, že tento vynález není omezen zde podrobně popisovanými včleněními, a že lze uvažovat o množství dalších včlenění, která jsou, nicméně, v souladu s širším smyslem a rozsahem tohoto vynálezu.

Veškerá vědecká a patentová literatura, o níž bylo pojednáno v této specifikaci, je zde začleněna odkazem.

TABULKA 1

Vzorek	Popis	pH
309.1A	libové mleté hovězí maso obohacené 263K cHs (srovnávací)	6,5
309.1-1.3	vzorek zpracovaný při pH 10,5, 75 °C, 3 hodiny	8,8
309.1-1.6	vzorek zpracovaný při pH 10,5, 75 °C, 6 hodin	8,8
309.1-2.3	vzorek zpracovaný pří pH 10,5,60 °C, 3 hodiny	n.d
309.1-3.3	vzorek zpracovaný při pH 10,5, 90 °C, 3 hodiny	8,2
309.1-4.3	vzorek zpracovaný pří pH 12,0, 75 °C, 3 hodiny	11,6
309.1-4.6	vzorek zpracovaný při pH 12,0, 75 °C, 6 hodin	11,5

·· ·* ·♦ ··<· ·· ···· • · · ··· « · · • · ·· · · 999 9 9 9 • · · · · · · 9 · · · • · · · ♦ 9 9 9 9 9

9999 19 99 999 99 99

TABULKA 2

Vzorek	Titr (a. j. na m!)	Objem (ml)	Celek (a. j. na ml)	Clearance ílogwj
obohacení	7,8x10⁴	1	7,8x10⁴	-
309.1-1.3 cHs	_1χ10ϋ	30	3,0x10’	£3,41
309.1-1.6 cHs	ΐχ10°	25	2,5x10’	>3,49
309.1-2.3 cHs	1x10°	30	3,0x10’	£3,41
309.1-3.3 cHs	1x10°	26	2,6x10’	>3,48
309.1-4.3 cHs	-_x1oo	20	2,0x10’	£3,59
309.1-4.6 cHs		15	1,5x10’	>3,72

t* ·· 99 99*9 90 0999

999 099 99 9

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby živočišného krmivá, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(i) přidání zásady k živočišnému materiálu, aby pH bylo udrženo na alespoň 8,5;

(ii) zahřátí materiálu kroku (i) na teplotu v rozsahu 55 °C až 99 °C; a (iii) dehydratování materiálu vyrobeného v kroku (ii).
2. Způsob výroby TDE-dekontaminovaného živočišného krmivá, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(i) přidání zásady k TDE-kontaminovanému živočišnému materiálu, aby pH bylo udrženo na alespoň 8,5;

(ii) zahřátí materiálu kroku (i) na teplotu v rozsahu 55 °C až 99 °C; a (iii) dehydratování materiálu vyrobeného v kroku (ii).
3. Způsob podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že pH je alespoň 9,5.
4. Způsob podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že pH je v rozmezí 10,5 až 13.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že pH je v rozmezí 11,0 až 11,5.
6. Způsob podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že teplota je v rozmezí 60 °C až 90 °C.

X
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že tepíoía je 60 ^eC.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že teplota je v rozmezí 80 °C až 85 °C.
9. Způsob podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že doba trvání kroků (i) a (ii) je 1 až 4 hodiny.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že doba je 1 až 2 hodiny.

0· 00 ·· 0000 00 0000 • · · 0 0« 0 0 0 • 000 0 0000 0 0 0 •0 000 0 000 0 0 • ·· 0« 0 0000 0000 0« 00 000 00 «0
11. Způsob podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že je prováděn za atmosférického tlaku.
12. Živočišné krmivo, vyznačující se tím, že je vyrobeno podle způsobu nároku 1.
13. TDE-dekontaminované živočišné krmivo, vyznačující se tím, že je vyrobeno podle způsobu nároku 2.
14. TDE-dekontaminovaný živočišný materiál, vyznačující se tím, ie je vyroben podle kroků (i) a (ii) nároku 2.
15. Použití živočišného krmivá nároku 12 nebo nároku 13 jako hnojivá.

Í8

99 99 ·9 ©·©'· ·· ····

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 999 9 9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9999 99

99 99 9 >'W

W ,·

J·

7/ l/.-í ! ’ , i^ři ;«'·«· ί'?>.;κ/ί'™,ť, '“i ' y 13 tawy^yh“'¹:!¹’,’ ·· ¹ a«W.'SS^4 W’ '' aewa»«>r' ®ÍW4Í 'ři !ιί .

«mm®;» sesmwiw.s·-» ‘τ WWWW“* *; í · ne»s»i«8«i u W««MÍ'MWW’' ?

5H8ÍM ««W»,,“ ,1 μμμημημημη (“sVιΚβΛΜηΛ í? i

1 .J’*“ /—,.. 'S;SS:S T - >*Μ.»,ι,,^^Βϋ ,·. . —..,--/:.: - ^::É; > -_:Λ ύ/ζίνφΛίΤ / < ‘ .Uí

itt;

OBR.1

99 99 • · 9 • t·* • 9 « • 9 4 ···· »9 ·· 9999

9 9 9 999

99 999

9999 » · <

I · · I • 9 99

8í»iB ; '„.„.X :.2.. 3 4 .J S__7 .s s w__

JÍ^ÍÍÍWh*^ /_ν«ζ”-ί X, , z» . V *.~’\*ΧΧ'.ί ZZ *‘ ** >ΐ '^l ' ’-‘2t·' ’» «η ;.·'^ίν>:·Χ?Ώ2Χ')· <£':X“i’>; - ,-«” K?J: 7 ',' , </ . . ‘ ,--X..X·,-·'- .'.'i” '‘^-Χξϊττ.................“ fa*''¹ jSí“ ίΧ'ΧίΧΐΜί^’ΧΧ-.Λ’¹*:*:.^,' * «.’*,' ~ ' » ’3, _t‘f** jiM ^x >

?A 4'C '- .y W; X ·> τ *. 4 -. f, - 4^*4 ,t'yi . . < „ _ f ‘Χυ 4-^-⁴) „2Λ1 <*' ,Χ» *-V*,· » ,Χ «,. 4*lftefe«H&ú ‘ΑΧ A3«W /^^/0^1^^.^1^^440^0311^^32511^^^25/^1^ ί... %. -Λ-ί · ·α'· . ', < *.,’-XS3--*·*».-:. «7 , ·.,«.-*.exwo.

&Λ 'A^fee.'; <;’.' .íifeři · 'úX · .»-\Ý*2íŠ.'?ř>

OBR.2

4.^4

4.. •S'-*.'-'Ά6χ-6 ,7, Ί®«'“_uvw'«:,'«i·;: >” · 1 ΰ:«, --; ”t:í^1,X i,’* , Viji>',^lí ’ ί'ΉΙ,’,ϊ, < r L^XH!· ’

«.1«^»»ίΐίΐ;.·;«·'ί-ΐ_Λΐ« , ,·»,S “,¹ i >. ·' 83β!ββΕβββ«Βΐί&

awťwm/V* ř»« ms ?««wsw* w,’ i, wW'Sr^r'.s^r*'A.'hw“<> ' i.·* ’.

-J51'^ * ·«»' «··/* !'·: v!··»- , ‘^-,Λ-ϊΐι ' -*<&« i·.»· v>z .,ΛΧχ’Αί·.

‘ ‘Λ^ύχ.· >'

X \ ·*>*' ” >

·'!., 'í&P.-s· . -‘ ,'^'SSsW^as ¹ ' -*' '<* asfsBSfflee^eš ' -Λ ’-X. ΧτΚ'ΤΚΚ',·’

Biahms^^e^e»

4., >^4 _{Λ f iiri<PM} '-’ ·.' «-- ''< · v ·, ’ _ -X^MKrWBi.

' ' ‘X ‘ ^^wiww-whřís

Λ .' “ ·'ν:>4Λ««Λ ’ ·,'. 4 -^s- .·⁴ \ > 'ffxSfrA^eiW?!

s:Ba»siBašriBssea^^^ sHBShBĚSšyÍšgšiSM^^^^a »íS^S8Baffli«iBs::ssgssasg«ssaeísi^egg aKyBíSaBasšBfaíBsysissBSsB^íiHigís^^^^ms SShSsaseSaHSSBi^SfšSsišes^iŠsií^Meeee syOigaasEaBSssgEMhBSSEgisSSsiíWBSSisWSgSSÍ^eSSSSih ysh®!EÍyBMp«BgaBiBíe^ffaÉía^SB1^8^^e»íi® * !> >

,,'Λ.Λ- ÍH «- X» ' “· >- ('’Ό· v v< y vy .« λ -'· <? > v. ά -' -, ¹ -. y ^m>ň·'· ^,is % ·- · -.4Í :-· i Ssíwsj· skbsh

4i.. ..

OBR. 3 φφ «φ >·» I·®» • φ φφφφ ** φφφφ φφφφ φ φ φφ φφφ

OBR. 4

\.,ΐί’· · '',Αψ,.ζ ^6- ><,· V' ^J“s « ^ι ; '> »<Ί' . > -w- - ^ι>, ί :

«.'W ''5¹

ί.,Ήΐί,'ί,'ΐί-^,&'ϊ^'ίίιί,-'.'ίΚ.

V- ίΆ‘7 , % \· v/wú,’ ^ιΆ;', -:Ά- ΐ!>·;

,*'!, '.^'χ', j,¹1’',ψύ/ί//!¹; , νΆ jJť,¹ - ;ϊ* iV , ζ.>

?’,,' '«L 1^!'/ « ' ί, ι' ^/.''N^iÍVÍm'’ ν’ ίιΆ’ ' /’4'' *·_χ ,,’’

Άϋ· ·' ? ‘ϊ,υ ΑΧ <’»*'’ ' χ , -/ 'Χ

Ν,'ΨΑΧΖΧ'-ι’Α '!Η, .MAA' ’ ^1,1 * “'ίίΐνΐ'ί ^i-xf

W>! ΑΜ>ψ /Λ¹ 'KU ,!ΆΧ\ askb*’/:;:

,,, ,, ,',,ΐ _Ýlí,» -<:' „ ,,- f -, ,.^,^ '7íf „;·Κ,··^Ι .,'„····,‘,· '-,„ ,,¾.^ '' ’4 ^r/ r : li. S ¹ t ' í > ¹ -hF' r 'Ϊ™ r^l?<,,,¹''Íi-ri?;'r '’“'-/-W ',1¹ ' ''(‘'^'..'^'^'-S.-lií Ké : rii‘ -ίΦί- Λή-L¹ ň-; ®f(f 'i? S,’-';

_r1,( ,,,,’, ,,, -,,4,:, ,ΐ',χ,ΐ,, ,'t-:·, ¹„ ,1;.·;'. ' »;ζ ¢, - f, Ví ’ <.·’» >í...i,.,“T'.^ ...............................................................................................................

*, *“* ,'/’

ŮW:

OBR. 5 • · ·· 4« • · • ··» ·· fcfcfcfc • * • ··· • fc ···· • 9 9 • · fc · » ·

999 9

99 999

9 4 • fc 4 • fc 9 fc

B^SSSSSřBEsSSe sSWíííWO^SSSeSBTfii ^BsBHíišgBífflíSšíSeSSBSS ssii^ases^^B leaigsseBasi· tges^s^SSgSW^SSese asaga^miSiisi^gmssB^s ' » ' i ’ \ ‘ f s í A 3 i 4 ,V („<♦ Ari f ‘ i > ·& </ k* «”· •'rT“ <_f < ,^XC? - ' ·&· a· <

αα^αγα‘7^, //* A>-_s /'.> - v

- í '>' < i ' A/U > <

’ ^lfV W-’>-? A Α“Α· /;<-',V? ? /λ^Λ^ ‘ ^,f;ó'^^k' Ά ’' ’S > *< ’Λ· ’ ,Α'·“*’ L ίί^Κ^ί-ίί^^ίΙίίίβΕί^ϊίΙίιίΙ^ΐ^βίίί^ί&ίίΡ^ί^'π^^^ΑΕίΜΠί^&ίΜ^Η^ίίΚΜίΚ;^^

5 .1 ”í ,‘ΐ·. ,''/s‘^r,,'-^,'^!A(^,\^ft'--’v./-,y w......s.«/“'.‘,w'. -^««.'íí'-·.-..--í >·ν ·. -'-„^sv '.-'-·’ΐ -sír,-·,-·,

-^J -í.

íiSSi ‘ ',,.<S ‘ , ' .*', i <γ, <Ί y*¹ ·! , ‘i * < „' >,«.', ϋře,'.«Λ<'í· i'’;;’ ·, ;,-λ^

-íWr''^¹ a·;· .'ίΆί'-ν ,»f‘/u.^,,',^,'^,,r',,; 'taSARV^t' ’>'>. '«.ΛΝ s,ž!R i « • 'í·,,, \ ťs ,’<*;{* « «,:,, ,;/.'i .uffitóůA,'. ií.&sw,'A.eíí''::.- ?

“,'írt a w«? «ní κ ,w

Ssíí' 13W<S3Í íffii&WK n <V; „ M<>'. ,,'«...

»w s<«»^ < /ntóí ϊ / /^! ,?<'»> -Λ 4 —*‘^'> »< *,v r ^,f

I „M,* ), Vl «« « ϋ. í-r ™V-> i- «'“', >K ' >· :

ÍWNW;í'<eS' -!·í«'lB’,^!l \:·;; >t‘i j'' ; ·;· .¾Eisp/fc^“· .' ·'E< ..·γ· ;· i v» t a ¹ t Π -λ v> < - ’ . » x '^-. ' ’-'Λ «C < ·* i, »

OBR. 6 ' ft· ,ηΑ * X <Λ£ΗΤ Ϊ* „>«·&>><*“YJ*-<r >·< * * „i * x - , - < - , i x > :

ϊ- **^ίχ v,· Α^'ν ’ í! , <ý^W#řA«*/ifc«W»»xiřVAířsM^ *Φ^ΒΛ« -^-. (φ S ^(«,','ΐίϊ¹ síí^íftV-.-.e „‘ ^,· - .·, .- ·;--/ • IV! 'X'-' .-'Z >* ^,;%ý .. : ’ ? ;wr «..i »--' ?ΐ * >' _s'

WV i «1,8 ^«/^'zWRíř^íííříA·· ^r,, ?,·' i,·:,iiM':i|i',ii'.!,^«>·ί%«ί««»»?«ί»Γ^^,'.^ΛΑ'3ϊ ti'V f.·-í- ' -i:

«-, «« ’·νΒ’<Λ(^«Α*Λ«ϊ»ΐ(*Μ4ζί«·'η·««ϊ Λ '-w. ' .’,, !;»Βπ'ΐ,Ή · _w i*'/' V > “x „ Ί '/z;,' ííe.....'. /; «·.->«.·« «I ,! ^r f? ;

ΐ · - >¹ ·; tsc .-.sť^T^cř^msMsetó»^^ BS r; “‘rv SsňBiíY ; ,,,,.,„ >,, _WbSSíEíě.S® sbskbs’ , . ' μ US--.Í vs^-^Wí. ΐ,^ > .“ > -a·.

šSSiSBišhšgSS^SiSh^SWgešSaeeffiěS^SsSwsffigSB?

j:

»< ·\Μ,

- -X,-.8,5, SsBBESBBSBS ηιη········ «W^ešSšieeSSěěSSigiiS 8,; »í “ ’S li, 5‘.S“'« ,3Β»ϊ'.'Κ wsw.mw &.> fí.S ·ιΠ:.^,!ίΊ;!ί^,:·:Λ;ΐ!κ?1:Ιίί!^!ί^!ί:!υι!ίΙΚ!;ί!!ί!::1!ίίΐΜ»?ίί:>ί«>!Ηί!«Γα!ί;^ϊ*Ηί®»ϊ>.11»^.ν>“Κ1·>ϋίίϋί!!Π!Ώ:ίΗ'ί:’.·:····ίί^: i^zibHeeisi

SbOLÍSíSBÍ!

OBR. 7