CZ20022220A3

CZ20022220A3 - Aerosol s kapkami kapaliny gama-IFN a jeho pouľití

Info

Publication number: CZ20022220A3
Application number: CZ20022220A
Authority: CZ
Inventors: Vlasselaer Peter Van; J. Woodruff Emlen
Original assignee: Intermune, Inc.
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2003-01-15
Also published as: WO2001049260A3; CN1230197C; MXPA02006518A; CA2395803A1; WO2001049260A2; AU4525801A; ZA200205167B; NO20023135D0; NZ519773A; HK1052876B; NO20023135L; US20010043906A1; EP1286658A2; EP1286658B1; BR0016884A; DE60026618T2; CN1434701A; HK1052876A1; ATE319424T1; DE60026618D1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití lidského gama interferonu (γ-IFN) při přípravě léčiva pro léčení poruch dýchacího traktu inhalací a kapkového aerosolového prostředku pro léčení těchto poruch, který má zvolenou velikost aerosolové částice a požadovanou, předpověditelnou aktivitu y-IFN.

Dosavadní stav techniky

Ačkoliv je lidský gama interferon (y-IFN) v izolované formě dostupný po téměř dvacet let, jeho potenciál při léčení řady různých stavů plic, jako jsou intersticiální nemoci plic, infekční nemoci plic, konstriktivní onemocnění dýchacích cest a cystická fibróza a systémová onemocnění, jako je rakovina, virová nebo bakteriální infekce, a fibrotícké poruchy, poutá zvýšenou pozornost. Nové klinické pokusy zahrnující y-IFN samotný nebo v kombinaci s jinými terapeutickými sloučeninami pro léčení jsou v současné době na postupu.

Nejsoučasnější terapie pomocí y-IFN zahrnují podávání proteinu injekcí, např. subkutánní nebo intravenózní cestou. Důležitou postřehnutelnou výhodou podávání injekcí je to, že dávka a působení proteinu může být pečlivě kontrolováno.

Protein může být například připraven ve stabilní vodné formě, skladované po prodloužená období bez ztráty aktivity nebo změny v stavu jeho agregace, potom podávané v přesně známém obj emu.

Naproti tomu podávání y-IFN inhalací, které vyžaduje aerosolizaci proteinu z roztoku y-IFN, představuje několik ·· ·· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · · ·· ·· ···· výzev. Zejména nebylo dříve známo, zda-li a jak může být γ-IFN aerosolizován bez ztráty aktivity a/nebo agregace proteinu, zvláště kde je aerosol vytvářen za podmínek namáhání ve smyku potřebného pro výrobu žádoucího rozsahu velikosti aerosolových částic. Tato nejistota je částečně z důvodu skutečnosti, že gama je aktivní v nekovalentní dimerické formě, ale ne v monomerické formě. Navíc je možno očekávat, že agregace proteinu snižuje aktivitu. Také toto nebylo známo nebo nebylo známo, jak může být γ-IFN utvářen tak, že jeho aktivita a charakteristika velikosti jeho molekul jsou zachovány za stavu prodlouženého skladování, což stále ještě umožňuje dosáhnout v aerosolu požadovaných vlastností proteinu a základního rysu velikosti částice.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se obrací na a řeší výše uvedené problémy při výrobě kapkového aerosolu γ-IFN, který (i) může být vyroben z formy proteinu stabilní při skladování, (ii) má při výrobě za výsledek aerosolové částice požadovaného, zvoleného rozsahu velikosti a rozdělení velikostí, (iii) vykazuje malou, pokud vůbec nějakou, změnu v aktivitě γ-IFN, podle měření standardní zkouškou pro aktivitu γ-IFN, a (iv) vykazuje malou, pokud vůbec nějakou, změnu v rozdělení molekul proteinu podle velikosti.

Podstata tohoto vynálezu spočívá v použití lidského gama interferonu (γ-IFN) při přípravě léčiva pro léčení poruch dýchacího traktu inhalací, kde vodný roztok lidského gama interferonu γ-IFN, který má s výhodou viskozitu nižší než 2 mPa.s při teplotě místnosti, a který má známou, zvolenou biologickou aktivitu a rozdělení velikosti molekul, a který • · · · obsahuje stabilizační činidlo a dispergační činidlo, se umístí proti desce s průchozími otvory o definované velikosti a pak se těmito otvory protlačuje za podmínek účinných pro tvorbu vodných kapek, které mají jednak střední průměr ve zvoleném rozmezí velikosti, vybraném ze skupiny, zahrnující částice menší než 1 pm, v rozsahu od 1 do 3 pm, od 3 do 5 pm, od 5 do 10 pm, větší než 10 pm a ve dvou nebo více rozmezích velikosti, jednak mají biologickou aktivitu γ-IFN v podstatě stejnou jako je aktivita v roztoku, a jednak mají rozdělení molekul γ-IFN v podstatě stejné jako v roztoku.

Kapky jsou charakterizovány pomocí biologické aktivity γ-IFN a rozdělením velikosti molekul, které je v podstatě stejné jako ve vodném roztoku. Aerosolové kapky jsou určeny pro aplikaci do pacientova dýchacího traktu.

Biologická aktivita γ-IFN v roztoku a v kapkové formě se stanoví pomocí schopnosti γ-IFN stimulovat v kultivovaných obohacených lidských monocytech expresi antigenu CD64, nebo biologická aktivita γ-IFN v roztoku se stanoví pomocí schopnosti γ-IFN stimulovat v kultivovaných lidských monocytech expresi antigenu HLA-DR.

Roztok obsahuje nejméně 1 milion mezinárodních jednotek γ-IFN na mililitr, s výhodou asi 4 až 50 miliónů jednotek na mililitr.

Stabilizujícím činidlem v roztoku může být mannitol, přítomný v množství mezi 5 a 15 mM. Dispergačním činidlem v roztoku může být polysorbát, přítomný v množství mezi asi 50 a 200 mg/1 hmotnostních procent.

• · · ·

V jednom ztělesnění vynálezu se při tvorbě aerosolu deska, proti které je roztok umístěn, podrobí vibracím o amplitudě a frekvenci, které jsou účinné pro tvoření vodných kapek o definované zvolené velikosti. V jiném obecném ztělesnění vynálezu je deska, proti které je roztok umístěn, stacionární, a na roztok se působí tlakem tak, že se deskou protlačuje v proudech, které jsou proudem plynu procházejícím deskou přerušovány do částic o zvolené velikosti.

Porucha dýchacího traktu je vybrána ze skupiny obsahující intersticiální onemocnění plic, infekční onemocnění plic, bronchiální konstriktivní onemocnění a cystickou fibrózu, kde tvorba vodných kapek je účinná pro výrobu kapek o velikosti v rozsahu od 1 do 3 pm a může také produkovat kapky v rozmezí velikostí 3 až 5 pm a/nebo v rozmezí velikostí menších než 1 pm.

Předmětem tohoto vynálezu je dále použití lidského gama interferonu (γ-IFN) při přípravě léčiva pro léčení inhalací poruch dýchacího traktu, které reagují na systematicky podávaný γ-IFN, kde tvorba vodných kapek je účinná pro výrobu kapek o velikosti v rozsahu od 1 do 3 pm a může také produkovat kapky v rozmezí velikostí 3 až 5 pm.

Předmětem vynálezu je rovněž kapkový aerosolový prostředek pro léčení poruch dýchacího traktu inhalací, tvořený vodným roztokem γ-IFN o viskozitě nižší než 2 mPa.s při teplotě místnosti, obsahujícím stabilizační činidlo a dispergační činidlo, umístěným proti desce s průchozími otvory o definované velikosti, který je uzpůsoben pro protlačování těmito otvory za podmínek účinných pro tvorbu vodných kapek, majících střední objemový průměr o zvolené velikosti vybrané ze skupiny zahrnující velikost menší než 1 pm, od 1 do 3 pm, od 3 do 5 pm, od 5 do 10 pm, větší než 10 pm a ve dvou nebo více rozmezích velikosti, a kde vodné kapky mají biologickou aktivitu γ-IFN v podstatě stejnou jako roztok, přičemž vodné kapky mají rozdělení velikosti molekul γ-IFN v podstatě stejné jako v roztoku, kde aerosol je vytvořen z vodných kapek majících střední objemový průměr o zvolené velikosti vybrané ze skupiny zahrnující velikost menší než 1 pm, od 1 do 3 pm, od 3 do 5 pm, od 5 do 10 pm, větší než 10 pm a ve dvou nebo více rozmezích velikosti, a kde vodné kapky mají biologickou aktivitu y-IFN v podstatě stejnou jako roztok, přičemž vodné kapky mají rozdělení velikosti molekul γ-IFN v podstatě stejné jako v roztoku.

Vodný roztok s výhodou obsahuje nejméně jeden milión mezinárodních jednotek γ-IFN/ml, jak je měřeno jednak schopností γ-IFN stimulovat v kultivovaných obohacených lidských monocytech expresi antigenu CD64, nebo je biologická aktivita γ-IFN v roztoku stanovena schopností γ-IFN stimulovat v kultivovaných lidských monocytech expresi antigenu HLA-DR.

Tyto a jiné předměty a základní rysy tohoto vynálezu budou dále osvětleny v následujícím podrobném popisu tohoto vynálezu, ve spojení s doprovodnými výkresy.

Stručný popis výkresů

Obr. 1A a 1B jsou pohledy v průřezu, v zjednodušené formě, na zařízení užitečné při provádění způsobu podle tohoto vynálezu, zobrazené v statickém (1A) a operačním (1B) stavu;

Obr. 2A a 2B jsou pohledy v průřezu, v zjednodušené formě, na jiné zařízení užitečné při provádění způsobu podle tohoto vynálezu, zobrazené v statickém (2A) a operačním (2B) stavu; Obr. 3A a 3B jsou diagramy zobrazující vzájemný vztah při tokových rychlostech (3A) roztoku γ-IFN proti fyziologickému zařízení, provozovaném při dvou a středních objemových průměrech (VMD) aerosolových kapek vytvořených aerosolizačním zařízením při dvou různých výkonech (3B);

roztoku v aerosolizačním různých hladinách výkonu

000 00 · · * ·

Obr. 4 je diagram zobrazující vzájemný vztah mezi středními aerodynamickými průměry (VMD) fyziologického a roztoku γ-IFN a procento frakce jemných částic (% FPF), definované jako procento částic v rozmezí velikosti od 0,5 do 6,0 pm, vytvořených výše uvedeným aerosolizačním zařízením při dvou různých hladinách výkonu pro roztok γ-IFN a fyziologický roztok;

Obr. 5A a 5B jsou diagramy tokových rychlostí jako funkce VMD (středních aerodynamických průměrů) (5A) nebo % FPF (% frakce jemných částic) (5B) při vysoké a nízké hladině výkonu aerosolizačního zařízení pro roztok γ-IFN a fyziologický roztok;

Obr. 6 zobrazuje diagramy exprese antigenu CD64 v monocytech stimulovaných (i) zvyšováním zředění s každým ze tří různých roztoků γ-IFN po aerosolizaci (plné kosočtverce, plné čtverce, plné trojúhelníky), (ii) stejný roztok γ-IFN, ale bez aerosolizace (x's) a (iii) samotné prostředí;

Obr. 7A a 7B jsou profily chromatografů v kapalné fázi roztoků γ-IFN, kontrolního (předaerosolizovaného) (8A) a aerosolizovaného (8B); a

Obr. 8A a 8B jsou hmotnostní spektrografy oblasti vrcholu 13,77 v chromatografech obr. 7A a 7B, respektive.

Podrobný popis vynálezu

A. Definice

Pokud není uvedeno jinak, zde použité výrazy mají následující významy:

• ·· „Lidský gama-interferon nebo „γ-IFN se týká polypeptidu, který vykazuje aktivitu lidského γ-IFN, jak je definován a popsán v US patentu č. 5 096 705. Peptid může mít plnou přírodní sekvenci lidského γ-IFN, jak je popsána v US patentu č. 5 096 705 nebo má N-koncová a/nebo C-koncová zkrácení plné délky přírodního peptidu, jak je popsáno, například v US patentech čís. 5 690 925, 5 582 824, 5 574 137, 4 921 698,

832 959 a 4 604 284 nebo obsahuje vnitřní deleční nebo substituční mutace, jak jsou popsány v US patentu č.

845 196.

obsahuj ícího vykazuj ícího ,Roztok γ-IFN' se týká roztoku γ-IFN stabilizační a dispergační činidla, výhodně biologickou aktivitu γ-IFN nejméně 1 miliónu mezinárodních jednotek (IU nebo jednotek) gama-IFN na mililitr, výhodněji mezi 4 a 50 milióny jednotek/ml, odpovídajících od 0,05 do 2,5 mg.s/ml γ-IFN. Jeden výhodný prostředek obsahující γ-IFN označovaný jako roztok 1 γ-IFN, má složení uvedené v tabulce 1 dále. Tento prostředek je prodáván pod obchodní značkou ACTIMMUNE a obsahuje rekombinantní lidský interferon γ-ΐΒ, rhlGB, jak je popsán a patentově chráněn v US patentu č. 5 582 824 .

„Aerosol nebo „kapkový aerosol je suspenzí kapkových částic v plynném prostředí, např. vzduchu. „Vodný aerosol je aerosol vytvořený z vodného roztoku, což znamená, že obsahuje nejméně asi 90 % vody, výhodně 5 % nebo více vody jako rozpouštědla roztoku.

„Střední velikost částice nebo „objemový střední aerodynamický průměr (VMD) se týká aritmetického průměru velikosti částic v částicemi tvořeném aerosolu, jak je stanoven pomocí standardních způsobů třídění částic podle

0 0 9 4 9 · ··· 4 : j**· · : z ·**· ♦ ί ί .*

0·· 00 ·· 00 00 0000 velikostí. Částice vytvářející aerosolový prostředek mají výhodně úzké rozdělení velikosti částic, např. menší než 1 až 2 standardní odchylky od průměru. Alternativně 80 % a výhodně 95 % částic má velikost ve zvoleném rozmezí velikosti, např. 1 až 3 pm.

„% FPF (% frakce jemných částic) (0,5 až 6,0 pm) je procento frakce jemných částic s objemovými průměry mezi 0,5 a 6,0 pm. Toto rozmezí velikosti, jak je měřeno pomocí laserového souboru rozptylu světla je frakcí vhodnou pro ukládání v plicích.

„Rychlost toku je rychlost výroby aerosolu měřená v mikrolitrech aerosolizace za sekundu (pl/s).

„Stav plicního onemocnění je stav plic charakterizovaný přebytkem fibrózy nebo tvorby kolagenu, nebo neodpovídající infiltrací makrofágu ve vstupním místě plic, zvláště při infekci. Výraz zahrnuje bez omezení intersticiální plicní fibrózu, tuberkulózu, virový nebo bakteriální zápal plic a chronické granulomatózní onemocnění.

„Množství aerosolu účinné pro dodání nejméně X pg lidského γ-IFN do pacientových plic je množství lidského γ-IFN v aerosolovém prostředku potřebné pro dodání požadovaného množství lidského γ-IFN do pacientových plic, a vztahuje se k účinnosti dodání aerosolem, které je procentem lidského γ-IFN, které dosáhne plic/celkovým množstvím lidského γ-IFN v aerosolu. Například k podání 50 pg lidského γ-IFN do pacientových plic, kde účinnost dodání je 50 %, je v aerosolu podáno celkové množství 100 pg lidského γ-IFN.

II. Způsob aerosolizace • 4 44

I 4 4 4 » 4 <

Tento vynález zahrnuje, v jednom aspektu, způsob tvorby vodného aerosolu γ-IFN, pro použití při podávání zvolené dávky γ-IFN pacientovi, např. lidskému pacientovi. Jak je uvedeno dříve, způsob bude schopen realizovat svůj potenciál proti jiným formám dodávání γ-IFN pouze, jestliže může být spolehlivě dosaženo následujících cílů (i) dlouhého času skladování s malým nebo žádným úbytkem biologické aktivity γ-IFN (ii) reprodukovatelné výroby aerosolových kapek v rámci dobře definovaného rozsahu nebo rozsahů velikosti, (iii) množství γ-IFN v aerosolu dostatečného pro terapeutickou účinnost, a (iv) malého nebo žádného úbytku biologické aktivity nebo změny v stavu molekul γ-IFN. Tento oddíl pojednává o novém prostředku a podmínkách aerosolizace, které byly nalezeny, podle tohoto vynálezu, pro dosažení těchto cílů.

A. Roztok γ-IFN

Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu, bylo nalezeno, že stabilní roztok γ-IFN, obsahující γ-IFN v koncentraci nejméně 1 milión mezinárodních jednotek (IU nebo jednotek) gama-IFN na mililitr, výhodněji mezi 4 a 50 milióny jednotek/ml, může být aerosolizován do kapek s dobře definovanou velikostí a s malou nebo žádnou ztrátou biologické aktivity nebo změnou v rozdělení velikosti molekul γ-IFN, který je dimerní ve svém přírodním, aktivním stavu. To znamená, že molekula není ani monomerizována ani agregována při kroku aerosolizace. Uvedené koncentrace umožňují, například dávku tak velkou jako 1 milión jednotek v objemu aerosolu tak malém jako je 25 mikrolitrů.

Navíc k nízkým koncentracím pufrujících komponent, které udržují roztok na pH výhodně kolem asi 5,5±0,5, roztok • φφ φφ ♦* «φ φφ φφφ φφφφ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φ φφ φφφ ·· φφφ φ · «*· · · . * *11 iii 11 II II II ιιιι obsahuje stabilizační činidlo, které pomáhá stabilizovat protein obsažený v roztoku a dispergační činidlo, které pomáhá udržovat protein v roztoku v monodisperzní formě a/nebo pomáhá při solubílizování komponent roztoku při rehydrataci ze suchého stavu, např. lyofilizovaného stavu.

Stabilizačním činidlem je výhodně cukr, jako je mannitol, laktóza, maltóza, sorbitol, glukóza nebo dextróza, alkohol, jako je glycerol, ethylenglykol v monomerní nebo polymerní formě nebo aminokyselina. Stabilizační činidlo je výhodně přítomno v množství kolem asi 1 až 10 g/1, nebo alternativně v molárním množství mezi 2 a 25 mM. Jedním výhodným stabilizačním činidlem je mannitol, přítomný v množství mezi 5 a 15 mM.

Dispergačním činidlem je výhodně neiontové povrchově aktivní činidlo, jako je polysorbát, výhodně Polysorbate 20 nebo Polysorbate 80 nebo polysacharid, jako je karboxymethylcelulóza, nebo alginát. Dispergační činidlo je výhodně přítomno v množství mezi 20 a 500 mg/1. Jedním výhodným dispergačním činidlem je Polysorbate 80, přítomný v množství mezi asi 50 a 200 mg/1. Podrobně by mělo být dispergační činidlo přítomno v množství, které zvyšuje viskozitu na ne více než asi 10, výhodně ne více než asi 6 mPa.s při 25 °C.

Rozpouštědlem roztoku je voda nebo voda s relativně malými množstvími, např. menšími než 5 až 10 objemových %, s vodou mísitelného rozpouštědla, jako je ethanol. Jednou nevýhodou těkavějších rozpouštědel v roztoku je to, že rychlé odpařování během a po aerosolizaci může způsobit značné snížení velikosti kapek.

♦ «4 44 *4 »4 ·4 • 4 4 4444 «444 « 4*4 4 « 44 44 4

444 44 4 4 4 4 4 • 44 «444 444

444 44 ·· 44 «4 4444

Tabulka 1, uvedená níže udává složení jednoho výhodného roztoku γ-IFN, označovaného zde jako roztok 1 γ-IFN, a obsahujícího 4 milióny jednotek γ-IFN/ml. Roztok zajišťuje skladování při 4 °C až do několika měsíců bez patrné ztráty aktivity γ-IFN nebo změny v stavu agregace molekul proteinu.

Tabulka 1

Dodaná voda	Bezbarvý čirý roztok 0,86 ml naplněný do borosilikátové, zátkou z butylového kaučuku uzavřené lékovky
Rekombinantní lidský interferon γ-1Β	0,20 ± 0,02 mg/ml
Mannitol	40,0 ± 4,0 mg/ml
Sodík	0,13 ± 0,01 mg/ml
Kyselina jantarová	0,59 ± 0,03 mg/ml
Polysorbate 20	0,10 ± 0,03 mg/ml
Rozpouštědlo	voda pro injekci, USP dostatečné množství
Osmolalita	nestanoveno
PH	5,5 ± 0,5
Viskozita	0,6 mPa.s při 25 θΰ¹

B. Výroba aerosolu

Podle důležitého rysu tohoto vynálezu bylo nalezeno, že roztok γ-IFN vytvořený podle výše uvedeného, může být aerosolizovaný za podmínek, které vytvářejí kapkové částice definované velikosti ve zvoleném rozmezí velikosti, jako je (i) menší než 1 pm, (ii) 1 až 3 pm, (iii) 3 až 5 pm, (iv) 5 až 10 pm, (v) větší než 10 pm, nebo (vi) dvě nebo více z těchto

-» 4W	19			19	99
19 1	•	•	• ·	1 9	1 «
1 111	*	•	11	i i	1
• « i	*	•	• 1	1 i	•
··· 99	99		• *	11	1191

rozmezí velikosti, přičemž produkuje malý nebo žádný úbytek biologické aktivity a malou nebo žádnou změnu v stavu rozdělení velikosti molekul.

Způsob výhodně zahrnuje, za prvé umístění roztoku γ-IFN proti desce, která má otvory nebo póry o definované velikosti. Póry jsou rozměrově výhodně přímé, procházející skrz, póry (konstantního průměru) mají velikosti vybrané v rozsahu velikostí od 0,5 do 10 pm. Obecně rozměry vyráběných aerosolových částic jsou přímo závislé (ačkoliv nikoliv nezbytně identické) na velikosti pórů desky. Jinou důležitou proměnnou je rychlost toku roztoku skrz desku, která závisí jak na viskozitě roztoku tak „tlaku použitém na roztok. Jak bude ukázáno dále, tento tlak může být bud’ skutečný hydrostatický tlak nebo, kde kapky jsou vytvářeny pohybem skrz vibrující desku, jak je uváděno dále, frekvence a řízená amplituda desky.

Roztok je protlačován skrz otvory za podmínek účinných pro tvorbu vodných kapek, které mají střední objemový průměr v jednom nebo více z výše uvedených rozmezí velikosti. Kapky jsou charakterizovány pomocí biologické aktivity γ-IFN rozdělení velikosti molekul, které jsou v podstatě stejné jako ve vodném roztoku γ-IFN. Aerosolové kapky jsou potom doručeny do pacientova dýchacího traktu.

Jedno výhodné zařízení pro provádění tohoto způsobu je vysvětleno na obr. IA a 1B, a je podrobně vysvětleno v US patentu č. 5 971 951, zahrnutém zde ve formě odkazu. S odkazem na tyto obrazy, toto zařízení, uvedené pod číslem 10, zahrnuje aerosolovou komoru 12, která končí na svém levém konci na obraze hubicí 14. Zásobník 16 pro dodávku účinné látky je podle tohoto vynálezu částečně naplněn roztokem 19 γ-IFN.

ΦΦ ΦΦ «· « • ··· •Φ ·* * · · ·Φ· ·· • · · · ΐ'> ·Φ

Φ · ♦

ΦΦ ····

Zásobník má stlačitelné nebo rozpínatelné stěny 18 a stěnu 21 dna, proti kterým je při procesu aerosolizace vyvinuta síla.

Zásobník je opatřen porézním, nízkoodporovým filtrem 20, který dovoluje roztoku téct volně skrz něj, ale slouží pro zamezení průchodu jakékoliv prachové látky obsažené v roztoku. Mezi zásobníkem a komorou 12 je porézní membránová deska 22, která je zde tvořena množinou pórů, jako jsou póry 24, skrz které je roztok během aerosolizace protlačován. Filtrační deska je výhodně tvořena materiálem, jako je polykarbonát nebo polyester, který má hustotu asi 1,7 mg/cm³, a tloušťku mezi asi 8 až 12 pm.

Velikosti pórů (průměry) v desce 22 jsou zhruba požadovaných průměrů aerosolové částice. Tudíž, například, pro vytvoření aerosolu s částicemi v rozmezí 1 až 3 pm, by měla být vybrána membránová deska s průměrem pórů mezi asi 0,5 a 1,5. Avšak velikost částice je také citlivá na rychlost toku skrz desku, která je zase určována jak viskozitou roztoku tak silou aplikovanou na zásobník.

Síla, která je aplikována na zásobník, aby tlačila roztok 19 přes filtr a potom vytlačovala roztok skrz póry v desce 22, je výhodně silou, která vytváří hydrostatický tlak asi 5 MPa nebo méně, výhodněji 3,5 MPa nebo méně. Jak ukazuje obr. IB toto působení tlaku na zásobník vytlačuje roztok skrz membránovou desku, ve skutečnosti vytváří proudy vytlačované kapaliny, jak jsou naznačeny pod označením 26, které jsou přerušovány na kapky 30, zčásti pohybem toku vzduchu 28 komorou ve směru šipky.

Jak ukazuje obr. IB, zařízení 10 je uspořádáno tak, že síla aplikovaná na zásobník působí vnitřní deformaci desky,

A A A A · A A · · · ·

AA·· A··· A· · přemísťuje plášť desky více k střední oblasti komory 12, tak aby umístila plášť desky ve středu komory 12, takže vytlačovaný roztok je unášen rychleji se pohybujícím vzduchem blízko samého středu komory.

Obr. 2B je průřezovým pohledem na kritické aerosol vytvářející komponenty jiného typu aerosolizačního zařízení 34 užitečného při tvorbě aerosolu γ-IFN, který má požadovanou velikost kapek a malou nebo žádnou ztrátu aktivity γ-IFN nebo změnu v rozdělení velikosti molekul proteinu. Zařízení 34 je detailně popsáno, například v US patentu č. 5 938 117, který je zde zahrnut ve formě odkazu. Toto zařízení zahrnuje zásobník (neznázorněno), který zadržuje roztok γ-IFN a který dodává roztok vytvořený v nádrži 36 na vnitřní povrch 38 vibrující membrány 40.

Jak ukazuje obr. 2B, membrána 40 obsahuje množinu konických otvorů nebo pórů, jako je pór 42, které jsou tvarovány a dimenzovány pro výrobu požadovaných kapek, jako je 44, když deska vibruje v jisté amplitudě a frekvenci. Vibrace desky je vytvářena oscilátorem (naznačeným pomocí vlny 46), jako je piezoelektrický oscilátor, který osciluje frekvencí obvykle v rozsahu 50 až 80 kHz. Vibrující deska vytváří, ve skutečnosti, povrchový tlak, který způsobuje, že roztok rozteklý po desce se pohybuje skrz póry a přerušuje se do částic požadovaných velikostí. Velikost kapek vytvořených pomocí zařízení, stejně jako rychlost vytlačování kapek závisí na velikosti pórů desky, amplitudě a frekvenci vibrace a viskozitě roztoku, který má být aerosolizován. Obecně a jak je naznačeno na obr. 2B, velikost kapek je mezi menšími a většími otvory pórů. Například pro výrobu kapkových částic v rozmezí velikosti 1 až 2 pm, větší otvor póru 42A je asi 1,5 pm a menší otvor 42B asi 0,6 až 0,7 pm.

C. Proměnné výroby aerosolu

Homogennost, předvídatelnost a rozdělení velikosti kapkových částic je v souladu s tímto vynálezem citlivé na viskozitu roztoku, která ovlivňuje rychlost toku roztoku v aerosolizačním systému a přítomnost jistých složek, jako jsou povrchově aktivní činidla a proteiny, které mohou ovlivnit vlastnosti spojené s povrchovým napětím roztoku.

Aerosolizační systémy, jako jsou systémy popsané dříve, jsou obvykle cejchované standardním zředěním, např. lOmM fyziologickým roztokem, který má viskozitu a vlastnosti spojené s povrchovým napětím blízké vodě. Při použití standardního fyziologického roztoku mohou být měřeny velikosti kapek a rozdělení velikosti pro specifické výrobní parametry, zvláště rychlost toku a velikost póru desky. Pro zajištění, že daný roztok poskytne předpovídatelnou charakteristiku velikosti kapek a rozdělení velikostí, při známých výrobních parametrech (rychlost toku a velikost póru), je proto potřeba zajistit, že se roztok v aerosolizačním systému chová v podstatě jako zředěný fyziologický roztok.

V předkládaném případě, roztok γ-IFN označený jako roztok 1, který má složky uvedené v tabulce 1, byl srovnáván s lOmM fyziologickým roztokem v aerosolizačním zařízení Aerogen aerosolizer (AG), jak je podrobně popsáno v příkladu 1. Stručně, rychlosti toků, VMDs (objemové střední aerodynamické průměry) a % FPF (% frakce jemných částic) jsou měřeny pro dva roztoky v každém ze šesti různých zařízení a při každém ze dvou různých výkonových nastaveních.

Rychlosti toků jsou stanoveny pro oba zkušební roztoky při nízkém (520 mV) a vysokém (750 mV) výkonu s výsledky uvedenými na obr. 3A. Každý bod představuje AG při nižším nebo vysokém výkonu. Byly zaznamenávány rychlosti toků v rozmezí od 9 μΐ/s do 18 μΐ/s. Roztok 1 má ve srovnání s fyziologickým roztokem střední odchylku 0,4 pl/s, ale snížení je, jak funkčně zanedbatelné, tak nikoliv statisticky významné. Prozkoumání údajů ukazuje, že se rychlosti toků při vysokém výkonu zvýší.

VMDs (objemové střední aerodynamické průměry) fyziologického roztoku a roztoku 1 byly porovnány za použití stejných šestí zařízení AG, které jsou navrženy pro výrobu VMDs v rozsazích velikosti částic mezi asi 3,5 a 5,5 pm. Obr. 3B ukazuje, že VMDs roztoku 1 jsou mírně pod přímkou shodnosti a jsou proto mírně menší než odpovídající hodnoty fyziologického roztoku. Při nastavení na nízký výkon, střední odchylka ve VMD mezi kapkami roztoku 1 a kapkami fyziologického roztoku je asi 0,2 pm a při nastavení na vysoký výkon asi 0,3 pm. Mírné snížení VMD mírně zvyšuje % FPF.

Jako fyziologický roztok, nevykazuje roztok 1 žádný významný rozdíl ve VMD při nastavení na nízký a vysoký výkon, což ukazuje, že výkon může být pro zvýšení rychlosti aerosolizace měněn bez významného ovlivnění střední velikosti kapky.

VMD a % FPF (% částic v rozmezí velikosti od 0,5 do 6,0 pm) jsou pro oba roztoky v silném vzájemném vztahu, jak ukazuje obr. 4. Údaje naznačují, že téměř stejného chování v oblasti velikosti částic a rozdělení jejich velikostí je dosaženo pro každý z těchto dvou roztoků.

Jelikož žádné významné rozdíly mezi formulacemi při dané hladině výkonu nebyly pozorovány, byly údaje sdruženy a byly vypočítány lineární regrese. Bylo zjištěno, že koeficienty • ···· ···· ··· · · ·· · · · • · · · ·· ·· ···· jsou statisticky významné při P^0,05. Rychlosti toku byly úměrné k VMD (obr. 5A) . Nebyly zjištěny statistické rozdíly mezi úhly sklonu při vysokém/nízkém výkonu. V rozmezí VMD, které je předmětem zájmu, se rychlosti toku zvýšily přibližně

1,5 μΐ/s	pro každé	u<zvýšení VMD. Jak	je	možno očekávat
z inverzního vztahu	mezi VMD a % FPF	(obr.	4), % FPF se
zvyšují se	snižováním	rychlosti toku (obr.	5B) .
Výše	uvedené	studie demonstrují,	že	roztok γ-IFN

připravený v souladu s tímto vynálezem má v podstatě stejnou rychlost toku, velikost kapek a charakteristiku rozdělení velikosti kapek jako standardní zředěný fyziologický roztok, když je aerosolizován podle tohoto vynálezu.

D. Charakteristika aerosolu

Navíc k předvídatelnosti a jednotnosti velikosti kapek, je důležité, že proces aerosolizace, který je spojený s působením vysokých lokálních smykových sil, nemění významně biologickou aktivitu nebo rozdělení velikosti molekul γ-IFN v aerosolu. Tyto dvě základní vlastnosti mohou být spojené natolik, jak je γ-IFN aktivní v dimerizovaném stavu a může se očekávat, že ztrácí aktivitu, buď monomerizací agregace, když je předmětem působení vysokých smykových sil spojených s aerosolizací, a/nebo denaturací proteinu ve fázových rozhraních kapalina/vzduch v malých kapkách aerosolu.

Biologická aktivita roztoku γ-IFN, před a po aerosolizací, může být vyhodnocena standardními in vitro způsoby pro zkoušení aktivity γ-IFN. Například biologická aktivita γ-IFN v roztoku a kapkové formě může být stanovena buď (i) schopností γ-IFN stimulovat expresi antigenu CĎ64 v kultivovaných obohacených lidských monocytech, nebo (ii) schopností γ-IFN stimulovat expresi antigenu HLA-DR v kultivovaných lidských monocytech.

Dříve uvedený způsob je používán pro demonstraci, že aerosolizace ve shodě s tímto vynálezem má malý nebo žádný účinek na biologickou aktivitu IFN. Stručně, lidské monocyty jsou při kultivaci stimulovány pomocí snižujících se koncentrací roztoku γ-IFN, buď v neaerosolizované formě nebo po aerosolizaci. Buňky jsou kultivovány v standardním mediu přes noc při 37 °C. FITC-značkovaná protilátkaCD64 se potom přidá do buněk a po promytí buněk pro odstranění protilátky, je stanovena fluorescence spojená s buňkami.

Výsledky jsou zobrazeny na obr. 6 pro tři představitele aerosolizovaných formulací (plné kosočtverce, plné čtverce a plné trojúhelníky), roztok 1 γ-IFN před aerosolizaci (znaky v podobě hvězdy) a samotné prostředí (plné kruhy). Jak je vidět, tyto tři aerosolizované formulace vykazují v podstatě stejnou biologickou aktivitu jako neaerosolizovaný roztok. Prostředí samotné dává očekávanou nízkou indukci povrchového antigenu CD64.

Výsledky demonstrují, že roztok γ-IFN připravený v souladu s tímto vynálezem, když je aerosolizován v souladu s tímto vynálezem, vykazuje malou nebo žádnou ztrátu biologické aktivity γ-IFN.

Pro stanovení účinku aerosolizace na rozdělení velikosti molekul γ-IFN, byl analyzován roztok γ-IFN před a po aerosolizaci pomocí chromatografie v kapalné fázi, na identifikaci a izolaci základního vrcholu γ-IFN, po kterém následovala hmotnostní spektroskopie pro identifikaci různé velikosti/druhů částic ve vrcholu γ-IFN.

0 0 0 0 0 · 0 0 0 0 ♦ · 0 0 · · · · 0 0 0 • · 0 · · 00 000 0 0

000 0000 000

000 00 00 ·0 00 0000

Obr. 7Α a 7B jsou chromatogramy roztoku 1 γ-IFN frakcionovaného chromatografií v kapalné fázi, před a po aerosolizaci v souladu s tímto vynálezem. Tyto dva chromatogramy jsou v základě identické a mají jednoduchý vrchol γ-IFN při asi 13,80, odpovídající dimerizovanému γ-IFN a dva nosné vrcholy při asi 9,52 a 22,32 odpovídající vrcholům polysorbátu.

Tyto vrcholy γ-IFN z každého vzorku byly izolovány a dále analyzovány pomocí hmotnostní spektroskopie, s výsledky zobrazenými na obr. 8A a 8B. Několik dominantních vrcholů mezi 1177 a 1830 odpovídá různým protonizovaným formám samostatných dimerických částic.

Celkem molekulární analýza vzorků ukazuje, že aerosolizace roztoku γ-IFN nemá žádný měřitelný účinek na rozdělení velikosti molekul, tj . stav dimerizace nebo agregace γ-IFN.

Bylo také potvrzeno, že vystavení roztoku γ-IFN působení aerosolové kovové desky přes noc nemá žádný účinek na rozdělení molekul sloučeniny.

III. Použití aerosolu při léčení

Podle tohoto vynálezu, kapkové aerosoly lidského γ-IFN, vyrobené, jak je uvedeno výše, jsou používány při ošetřování řady pulmonálních stavů, přímým dodáním γ-IFN do postižené oblasti dýchacího traktu nebo dodáním γ-IFN do proudu krve, pro léčení systemických stavů, jako je virová infekce, rakovina nebo fibrotické stavy, reagující na systematicky podávaný γ-IFN.

Ve většině případů, bude pro dodání do bronchiálních míst, žádoucí velikost kapkové částice aerosolu 1 až 3 pm, . Při

4 4 4 4 4 4 4*44 • 4 ·· · 4 · · · 4 · • · · · · ·· · · · 4 4 4 4* · 4 4 4 *44

444 44 44 44 44 4444 stavech nemoci, jako je cystická fibróza, kde může docházet k malému pohybu vzduchu v dolním dýchacím traktu, mohou být požadovány dokonce malé velikosti např. menší než 1 pm. Kde jsou postiženy jiné oblasti dýchacího traktu nebo kde je žádoucí podávat γ-IFN systematicky, mohou být nej účinnější větší velikosti částic, obvykle 3 až 5 pm nebo kombinace malých a větších částic např. 1 až 3 pm a 3 až 5 pm.

Dodaná dávka γ-IFN je výhodně nejméně 10 pg (200 000 jednotek) a může být až tak vysoká jako 200 pg (4 milióny jednotek) nebo více. Obvyklé objemy aerosolu jsou 50 až 200 pl, s asi 50 až 80 % celkového objemu aerosolu, které dosáhnou cílové oblasti. Program dávek je obvykle 2- až 3-krát týdně po dobu potřebnou pro dosažení terapeutických cílů.

Jako příklady stavů, které mohou být léčeny, řada různých stavů plicních nemocí je charakterizována nadměrnou fibrózou nebo tvorbou kolagenu nebo nedostatečnou makrofágovou infiltrací v plicích, zvláště při infekci. Pro některé stavy nemocí, např. intersticiální pulmonální fibróza (IPF), dosažení konce léčby může vyžadovat dávkování po 6 až 12 měsíců nebo déle, nebo po prodlouženou dobu tak dlouho, pokud stav nemoci vyžaduje dohled. Pro jiné stavy, např. bakteriální nebo virovou infekci, je dávkování opakováno, dokud infekce nebo příznaky infekce nejsou překonány.

Jednou výhodou předkládaného způsobu proti léčení injekční formou lidského γ-IFN je, že relativně vysoké dávky, např. v rozmezí 200 až 500pg dávek, mohou být podávány bez závažných vedlejších účinků pozorovaných při horních limitech snášenlivosti injektovaného γ-IFN, který je asi 250 pg. Toto léčení, např. léčení IPF, může být prováděno v kombinaci s jinými léčebnými způsoby, např. kortikosteroidy

nebo méně), nesteroidními analgetiky. Jednou výhodnou je lidský γ-IFN v kombinaci mg/týden nebo méně.

·· ·♦ • » · * • · 9 ·· ··

9999 (prednisolone 10 mg/den protizánětlivými léčivy a kombinační léčbou pro IPF s prednisolone, podávaný orálně

Pro léčení tuberkulózy resistentní vůči lékům, může být léčení prováděno v kombinaci s léčivy v současné době používanými při léčení tuberkulózy, jako jsou clofazimine, ofloxacin nebo rifabutin, kde toto posledně uvedené léčivo je podáváno v normálních nebo snížených dávkách. V tomto léčení je pokračováno dokud není infekce potlačena, např. do žádných dalších příznaků aktivní infekce.

Pro léčení virové nebo bakteriální pneumonie, může být množství lidského γ-IFN podávaného v dávce tak malé jako 10 pg nebo tak vysoké jako 200 až 300 pg, podávaných nejméně dvakrát, ale obvykle ne vícekrát než za týden. Léčba může být prováděna v kombinaci s léčivy v současné době používanými při léčení virových nebo bakteriálních infekcí.

Pro léčení chronické granulomatózní nemoci je aerosolizovaná sloučenina podávána nejméně 2- až 3-krát týdně, po dobu nejméně 6 měsíců a obvykle tak dlouho pokud tento stav existuje a vyžaduje léčení. Podobné režimy jsou vhodné pro léčení cystické fibrózy (CF) a astma, ačkoliv v posledně jmenovaném stavu, kombinace malých a větších velikostí kapek může být výhodná.

Z předchozího, může být oceněno jak jsou různé předměty a základní rysy tohoto vynálezu naplněny. Aerosolizační způsob je účinný pro výrobu aerosolu γ-IFN, který má předpovídatelné velikosti kapek a rozdělení jejich velikostí, v žádoucích rozsazích velikosti, které jsou účinně směrovány do vybraných

00 »0 00 00 00

0 0 0 0 0 0 · 0 t «0·· 0 · ·· 0 0 0

000 0000 000 000 ·· 00 00 00 »000 oblastí dýchacího traktu. Podle toho může být dosažena vysoká účinnost dávky léčiva, mezi 50 až 80 %, což umožňuje účinné dávkování s relativně malou ztrátou proteinového materiálu a v předem stanovitelných dávkách.

Dávka γ-IFN může být skladována, např. v kapalné formě, po prodlouženou dobu, s malou ztrátou aktivity po dobu několika měsíců nebo více, a tento roztok může být aerosolizován podle tohoto vynálezu s malým nebo žádným úbytkem biologické aktivity nebo rozdělení velikosti proteinu.

Jako výsledek, výhody inhalační terapie proti jiným formám parenterálního podávání, obvykle zahrnujících injekci jehlou, jsou dosaženy při relativně přesných dávkách léčiva a účinnosti dodání léčiva.

Následující příklady ilustrují způsoby měření specifikací provozních cílů podle tohoto vynálezu. Příklady jsou zaměřeny tak, že ilustrují, ale v žádném případě nelimitují rozsah tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Způsoby aerodynamických studií

Aerosolové generátory (AG) lze získat od společnosti Aerogen, lne. (Sunnyvale, Kalifornie). Specificky se vybírá šest generátorů AGs konstruovaných tak, že produkují různé velikosti kapek v rozmezí přibližně 3,5 až 5,0 pm a měří se VMDs (střední aerodynamické objemové průměry), % FPF (% frakce jemných částic) a rychlosti toku v lOmM fyziologickém roztoku a roztoku 1 γ-IFN a při nastaveních výkonu na dolní úvrati (520 mV) a horní úvrati (750 mV) . Do tabulky se zaznamenávají ·· ·« 0* 00 »0

0 0 »· * 0 0 0 0

000 0 « 00 0 0 0

000 0# 0 «» 0· 0 0 0 0 0 0 střední a standardní odchylky vzorků z opakovaného stanovení. Tabulka 2 ukazuje cílové specifikace ze všech provedení.

Tabulka 2

Kritérium	Způsob zkoušky nebo princip	Nižší cílový limit	Vyšší cílový limit
VMD (pm)	laserová difrakce	3,0	5,0
% FPF (0,5 až 6,0 pm)	laserová difrakce	13,2	67,1
Rychlost toku formulace (pl/s)	stanovený objem	6,7 pl/s	19,3 pl/s
Vyluhovátelné UV/VIS	neaplikovátelné
Kovy vyluhované z AG	AA		způsob LOQ

Tabulka 3 uvedená níže zobrazuje analytické způsoby použité pro měření různých základních veličin objemové fáze a kapky.

• · ·

Tabulka 3

Zkouška	Dostupnost (typové č., stručný popis, zákaznicky nebo k vyvinutí)
Vymezení nároků	UV spektrofotometrie při 280 nm
Označení stability API	neaplikováno; provede 3. strana
Viskozita	Viskozimetr a konickou deskou zn. Brookfield
PH	skleněná elektroda
Osmolalita	osmometr využívající tlak par zn. Wescor
Rychlost toku	TP 1051
VMD (laser)	TP 1502
GSD (laser)	TP 1502
% FPF (0,5 až 6,0) (laser)	TP 1502

Zatímco tento vynález je popisován s ohledem na specifická ztělesnění, bude oceněno, že různé změny se mohou provést bez odchylky od nárokovaných patentových nároků.

1°0Α.~Μϋ ____ * «ί ·· *·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití lidského gama - interferonu (γ-IFN) při přípravě léčiva pro léčení poruch dýchacího traktu inhalací, kde vodný roztok lidského gama - interferonu γ-IFN, který má známou, zvolenou biologickou aktivitu a rozdělení velikosti molekul a který obsahuje stabilizační činidlo a dispergační činidlo, se umístí proti desce s průchozími otvory o definované velikosti a pak se těmito otvory protlačuje za podmínek účinných pro tvorbu vodných kapek, které mají jednak střední průměr ve zvoleném rozmezí velikosti, vybraném ze skupiny, zahrnující částice menší než 1 pm, v rozsahu od 1 do 3 pm, od 3 do 5 pm, od 5 do 10 pm, větší než 10 pm a ve dvou nebo více rozmezích velikosti, jednak mají biologickou aktivitu γ-IFN v podstatě stejnou jako je aktivita v roztoku, a jednak mají rozdělení molekul γ-IFN v podstatě stejné jako v roztoku.
2. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že biologická aktivita γ-IFN v roztoku a v kapkové formě se stanoví pomocí schopnosti γ-IFN stimulovat v kultivovaných obohacených lidských monocytech expresi antigenu CD64, nebo biologická aktivita γ-IFN v roztoku se stanoví pomocí schopnosti γ-IFN stimulovat v kultivovaných lidských monocytech expresi antigenu HLA-DR.
3. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok obsahuje nejméně 1 milion mezinárodních jednotek γ-IFN na mililitr.
4. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok obsahuje jako stabilizační činidlo mannitol.

• · · · ·· ·· * ·

9 * * ♦ • · · · · · « · · · · · ♦ · · · ·
5. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, že roztok obsahuje 5 až 15 mM mannitolu.
6. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok obsahuje jako dispergační činidlo polysorbát.
7. Použití podle nároku 6, vyznačující se tím, že roztok obsahuje 50 až 200 mg/1 polysorbátu.
8. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že deska se podrobí vibracím o amplitudě a frekvenci, které jsou účinné pro tvoření vodných kapek o definované zvolené velikosti.
9. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že na roztok, který je umístěn proti stacionární desce, se působí tlakem tak, že se deskou protlačuje v proudech, které jsou proudem plynu procházejícím deskou přerušovány do částic o zvolené velikosti.
10. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že porucha dýchacího traktu je vybrána ze skupiny obsahující intersticiální onemocnění plic, infekční onemocnění plic, bronchiální konstriktivní onemocnění a cystickou fibrózu, kde tvorba vodných kapek je účinná pro výrobu kapek o velikosti v rozsahu od 1 do 3 pm.
11. Použití podle nároku 10, vyznačující se tím, že tvorba vodných kapek je účinná rovněž pro výrobu kapek o velikosti v rozsahu od 3 do 5 pm.
12. Použití podle nároku 10 pro přípravu léčiva pro léčení cystické fibrózy, vyznačující se tím, že tvorba vodných kapek je účinná rovněž pro výrobu kapek o velikosti menší než 1 pm.
13. Použití podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčení inhalací poruch dýchacího traktu, které reagují na systematicky podávaný γ-IFN, vyznačující se tím, že tvorba vodných kapek je účinná pro výrobu kapek o

4 4 4« velikosti v rozsahu od 1 do 3 pm.
14. Použití podle nároku 13, vyznačující se tím, že tvorba vodných kapek je účinná rovněž pro výrobu kapek o velikosti v rozsahu od 3 do 5 pm.
15. Kapkový aerosolový prostředek pro léčení poruch dýchacího traktu inhalací, vyznačující se tím, že je tvořen vodným roztokem γ-IFN, obsahujícím stabilizační činidlo a dispergační činidlo, umístěným proti desce s průchozími otvory o definované velikosti, který je uzpůsoben pro protlačování těmito otvory za podmínek účinných pro tvorbu vodných kapek, majících střední objemový průměr o zvolené velikosti vybrané ze skupiny zahrnující velikost menší než 1 pm, od 1 do 3 pm, od 3 do 5 pm, od 5 do 10 pm, větší než 10 pm a ve dvou nebo více rozmezích velikosti, a kde vodné kapky mají biologickou aktivitu γ-IFN v podstatě stejnou jako roztok, přičemž vodné kapky mají rozdělení velikosti molekul γ-IFN v podstatě stejné jako v roztoku, kde aerosol je vytvořen z vodných kapek majících střední objemový průměr o zvolené velikosti vybrané ze skupiny zahrnující velikost menší než 1 pm, od 1 do 3 pm, od 3 do

5 pm, od 5 do 10 pm, větší než 10 pm a ve dvou nebo více rozmezích velikosti, a kde vodné kapky mají biologickou aktivitu γ-IFN v podstatě stejnou jako roztok, přičemž vodné kapky mají rozdělení velikosti molekul γ-IFN v podstatě stejné jako v roztoku.
16. Kapkový aerosolový prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že vodný roztok obsahuje nejméně jeden milión mezinárodních jednotek γ-IFN/ml jak je měřeno jednak schopností γ-IFN stimulovat v kultivovaných obohacených lidských monocytech expresi antigenu CD64, nebo je biologická aktivita γ-IFN v roztoku stanovena schopností γ-IFN stimulovat v kultivovaných lidských monocytech expresi antigenu HLA-DR.

ϊ *
17. Kapkový aerosolový prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že roztok obsahuje jako stabilizační činidlo mannitol.
18. Kapkový aerosolový prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že roztok obsahuje 5 až 15 mM mannitolu.
19. Kapkový aerosolový prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že roztok obsahuje jako dispergační činidlo polysorbát.
20. Kapkový aerosolový prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že roztok obsahuje 50 až 200 mg/1 polysorbátu.
21. Kapkový aerosolový prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že roztok má při pokojové teplotě viskozitu menší než 2 mPas.