CZ20021559A3

CZ20021559A3 - Použití oxidu dusnatého pro výrobu léku k léčení konstrikce dýchacích cest

Info

Publication number: CZ20021559A3
Application number: CZ20021559A
Authority: CZ
Inventors: Josephine Hjoberg; Göran Hedenstierna; Marieann Högman
Original assignee: Aga Ab
Priority date: 1999-11-03
Filing date: 2000-11-02
Publication date: 2003-05-14
Also published as: HUP0203065A2; EE200200240A; AR026335A1; HUP0203065A3; DE60022070T2; DE60022070D1; EP1225913B1; NO20022113L; BR0015329A; NO20022113D0; CN1230199C; MXPA02004069A; AU778347B2; JP2003513048A; CN1387441A; EP1225913A1; AU1745601A; ES2248153T3; ZA200203391B; ATE302023T1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká oblasti léků pro léčbu konstrikce dýchacích cest u savce, obzvláště člověka. Konkrétně je vynález výhodný pro zesílení účinku léčby oxidem dusnatým nebo vyvolání účinku oxidi} dusnatého u nereagujících osob.

Dosavadní stav techniky

Oxid dusnatý relaxuje hladké svalstvo dýchacích cest (Belvisi N.G,· Scretfon CD, Barnes PJ. Nitric oxide is the endogeneous neurotransmitter of bronchodilator nerveš ín human airways. Eur. J. Pharmacol. 1992, 210: 221-222) a inhalace exogenního oxidu dusnatého zmírňuje bronchokonstrikci jako reakci na různá činidla u laboratorních zvířat a lidí (Dupuy PM, Shore SA, Dražen JM, Frostell C, Hill WA, Zápol WM. Bronchodilator action of inhaled nitric oxide in guinea pigs. J.Clin.Invest. 1992, 90:421-428, Hogman M, Frostell C, Arnberg H, Hedenstierna G, Inhalation of nitric oxide modulates methacholine-induced bronchoconstriction in the rabbit. Eur.Respir.J. 1993, 6:177-180, Hdgman M, Frostell CG, Hedenstrdm H, Hedenstierna G. Inhalation of nitric oxide modulates aduit human bronchial tone. Am.Rev.Respir.Dis. 1993, 148:1474-1478). Byly činěny pokusy relaxovat zúžené dýchací cesty astmatiků inhalací oxidu dusnatého. EP 560 928, patenty Spojených Států č. 5 485 827 a 5 873 359 popisují použití oxidu dusnatého pro léčení bronchokonstrikce a plicní • · · · • · · · • · · · • · ···· · · ϋ ·

·..··..· ·..··..· ·..··..· vazokonstrikce. Ale bylo zjištěno, že účinek léčby vykazuje velkou inter- a intra-individuální variabilitu a někteří astmatici nereagovali vůbec žádným zlepšením po léčbě oxidem dusnatým (Hógman M, Frostell CG, Hedenstróm H, Hedenstierna G. Am.Rev.Respir.Dis. 1993, 18:1474-1478).

Pacienti s astmatem mají měnící se stupeň edému stěn dýchacích cest (Jeffery. P.K. (1996). Aírway pathology in asthma. In Asthma. Basic mechanisms and clinical management, eds. Barnes, P.J., Rodger, I.W. and Thompson, N.C. pp. 47-64 San Diego, CA, U.S.A.: Academie Press.). Bylo navrženo, že edém by mohl být vysvětlením pro změny účinku oxidu dusnatého pozorované u astmatiků. Ve studii s králíky byl účinek oxidu dusnatého na metacholinem indukovanou bronchokonstrikci zrušen zvýšením osmolarity povrchové tekutiny nebulizací hypertonického fyziologického roztoku (Hógman M, Hjoberg J, Hedenstierna G. Increased airway osmolarity inhibits the action of nitric oxide in the rabbit. Eur.Respir.J, 1998, 12:1313-1317). Také in vitro na tracheách morčat je účinek donoru oxidu dusnatého oslaben přidáním NaCl zvyšujícího osmolaritu pufru perfundujícího lumen trachey (Hjoberg J, Hógman M, Hedenstierna G. Hyperosmolarity reduces the relaxing potency of nitric oxide donors in guinea-pig trachea. Br.J.Pharmacol. 1999, 127:391-396).

Proto hlavním problémem tohoto vynálezu je stanovit, proč je dilatační účinek oxidu dusnatého na dýchací cesty obecně snížen, když je povrch dýchacích cest exponován hyperosmolaritě. Na základě zjištění bylo nyní nalezeno řešení tohoto problému prostřednictvím skupiny sloučenin majících schopnost působit proti snížení účinku oxidu dusnatého.

V souladu s tím jedním předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí sloučenin vhodných pro použití pří relaxaci dýchacích cest.

• · · · · · · · ···· • · · · · ·

	·· 3	·· * · · ·	« · · ·
Konkrétněji je	účelem těchto	sloučenin	dosažení
relaxace dýchacích cest.
Dalším předmětem	vynálezu je	poskytnutí	vhodných

sloučenin pro použití při působení proti snížení relaxačních účinků oxidu dusnatého, jsou-li použity samotné, výhodně pro použití u osob nereagujících na oxid dusnatý samotný.

Dále je předmětem vynálezu získání čistě inhalačního léku.

Další provedení vynálezu by měly být odborníkovi zjevné po přečtení popisu uvedeného níže.

Podstata vynálezu

Výše uvedené předměty, a také další předměty vynálezu, které mohou být dedukovány odborníkem po prostudování popisu uvedeného níže, jsou uskutečněny použitím, způsobem a farmaceutickým přípravkem definovaným v průvodních patentových nárocích.

Konkrétně je podle prvního aspektu vynálezu poskytnuto použití inhalačního oxidu dusnatéh.q (NO) ve formě plynného oxidu dusnatého nebo donoru oxidu dusnatého, v kombinací s lapačem („scavenger) aniontu superoxidu pro výrobu léku pro léčení konstrikce dýchacích cest u savce, obzvláště člověka, kombinace jsou použity v terapeuticky účinném množství pro dosažení relaxace konstrikce dýchacích cest.

Podle předkládaného vynálezu bylo tedy překvapivě zjištěno, že redukovaný relaxační účinek exogenního oxidu dusnatého zjištěný v průdušnici podrobené intraluminální hyperosmolaritěje, alespoň částečhě, způsoben anionty superoxidu.

Anionty superoxidu mohou být tvořeny různými buňkami • · • · j j. j · j j. j · · · · v izolované průdušnici morčete (Sadeghi-Hashjin G, Henricks PA, Folkerts G, Muis T, Garssen J, Nijkamp FP. Role of the epithelial layer in the generatíon of superoxide anion by the guinea-pig isolated trachea. Mediators.Inflamm. 1998, 7:35-40) a rychle reagují s oxidem dusnatým za vzniku peroxynitritu (Huie RE, Padmaja S. The reaction of NO with superoxide. Free Radíc.Res.Commun. 1993, 18.:195-199, Saran M, Michel C, Bors W. Reaction of NO with 0₂-. implications for the action of endothelium- derived relaxing factor (ERRF). Free Radíc.Res.Commun. 1990, 10:221-226.). Je známo, že peroxynitrit způsobuje poškození tkání (Kooy NW, Royall JA, Ye YZ, Kelly DR, Beckman JS. Evidence for in vivo peroxynitrite production in human acute lung injury. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 1995, 157,1250-1254, Beckman JS, Beckman TW, Chen J,

Matshall PA, Freeman BA. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite, implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proč.Nati.Acad.Sci.U.S.A. 1990,

87:1620-1624) a indukuje nadměrnou vnímavost dýchacích cest (Sadeghi-Hashjin G, Folkerts G, Henricks PA, Verheyen AK, van der Lindě HJ, van Ark I, Coene A, Nijkamp FP. Peroxynitrite induces airway hyperresponsiveness in guinea pigs in vitro and in vivo. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 1996, 153:1697-1701).

Konkrétně bylo zjištěno, že když byl použít lapač superoxidových aniontů, ve formě lapače aniontu superoxidu, v kombinací s donorem oxidu dusnatého, byl zesílen relaxační účinek oxidu dusnatého nebo byl zrušen samotný redukující účinek oxidu dusnatého. Jinými slovy, zdá se, že problémem při nedostatečné reakci nebo žádné reakci na oxid dusnatý při léčbě konstrikce dýchacích cest je inaktivace molekuly oxidu dusnatého.

Pokud jde o stav techniky v tomto ohledu, lze odkázat například na následující dokumenty.

Dokument WO 96/39409 popisuje sloučeniny, které oxidují • · · · • · · · a/nebo redukují superoxidy. Sloučeniny mohou být podávány s oxidem dusnatým nebo adičními sloučeninami oxidu dusnatého. Sloučeniny jsou použitelné pro léčení zánětlivých chorobných stavů u savců, konkrétně lidí. Astma je zmíněno jako jeden z mnoha zaznamenaných zánětlivých chorobných stavů. Nicméně není zde žádná informace o zlepšeném dilatačním účinku na dýchací cesty, tj. neodkazuje se na asthma bronchiale.

Použití lapače superóxidových iontů pro lékařské účely je také popsán ve WO· 99/37616. Nicméně popsaná léčba se týká stavů spojených s oxidačním stresem nebo dysfunkcí endotelu. Kromě toho odkazovaný účinek je intracelulární. Jinými slovy, existují druhové rozdíly mezi těmito dvěma použitími, v daném pořadí. Odkaz na astma ve výčtu chorobných stavů se tedy ve WO 99/37616 týká stavu spojeného s oxidačním stresem nebo dysfunkcí endotelu, což je případ zánětu dýchacích cest a chorobných stavů vaskulární dysfunkce, v daném pořadí, a ne konstrikce dýchacích cest, jako v předkládaném vynálezu. Předkládaný vynález není zdvislý na žádné ehdotelové dysfunkci. Spíše vypadá, že účinek je epitelový. Kromě toho, obecně je extracelulární.

Endotelově závislá aktivita lapače aniontu superoxidu je také uvedena v dokumenu Medline, přístupové č. 1999104010. Kromě toho, aktivita je popsána pouze v souvislosti s transplantací plic a je omezena na plicní vaskulární účinek.

Patent Spojených Států č. 5 747 026 se týká způsobu doručujícího antioxidanty k buňkám a tkáním. Sloučeniny jsou dopravovány v lipozomech citlivých na pH. Uvádí se, že tento způsob doručování antioxidantů k tkáním zabraňuje, mezi jiným, vazospazmu a plicní toxicitě různorodých oxidantů a ochraňuje působení oxidu dusnatého. Poskytnutá experimentální data pouze ukazují, že antioxidanty per se projevují vaskulární relaxační účinek v určitých pokusech na zvířatech. Nejsou předložena žádná data, že antioxidanty by mohly posílit relaxační účinek • · · · • · · · • · · · * ·· · · ·· · ·* <· ·· ·· «· ·· inhalovaného oxidu dusnatého na dýchací cesty.

V Pediatr. Res. 1999, 45: 293 A je popsána studie o účinku z rhSOD a inhalovaného plynného NO na plicní hypertenzi v modelu na jehňatech. Nicméně neexistuje žádný náznak jakkoliv se týkající nějakých účinků na dýchací cesty.

Podrobný popis vynálezu

Kombinace oxidu dusnatého a lapače aniontu superoxidu podle předkládaného vynálezu může být použita pro výrobu léku pro léčení všech typů konstrukčních problémů v dýchacích cestách. Tyto konstrikční problémy mohou být výsledkem hyperreaktivity dýchacích cest, astmatu a dalších stavů vyvólávajících konstrikci dýchacích cest.

Výhodné provedení předkládaného vynálezu spočívá ve výrobě léku pro léčení konstrukce dýchacích cest spojepých s asthma bronchiale, obzvláště akutní stav asthma bronchiaíe.

Obzvláště výhodné provedení vynálezu se týká léční savce, u kterého bylo prokázáno, že nereaguje na inhalaci samotného oxidu dusnatého (plynného nebo ve formě donora). Toto prQvedení má významný klinický význam, protože mezi různými skupinami pacientů léčených inhalovaným oxidem dusnatým je obecně velká skupina nereagujících osob.

Podle jednoho provedení vynálezu je oxid dusnatý použit v plynné, inhalační formě. Inhalace plynného oxidu dusnatého může představovat velkou výhodu v terapii, např. ve srovnání s neplynným donorem oxidu dusnatého, protože plyn nemá žádné částice nebo kapíčky, které se mohou rozptýlit a dopravit do respiračního traktu. Plyny mají dlouhou dráhu volné difúze, snadno míjí olpstrukce (jako například zúžené dýchací cesty) a rozpouští se přímo v tkáni bez vyvolání nárazového bfonchospazmu. Prospěšný účinek NO plynu na tonus • ·· · » · • φ • · · «

	7	·· ···· ·( • · · · · • · · · · • · · Φ · · • · * · » · ·» «.♦ · ·	• · · · · * · · ·« « · · · « · · · • · » · · • « » ·« · ·· ♦· · ·
bronchíálního	hladkého	svalstva je	pozorován	okamžitě po
inhalaci, což	činí NO	použitelný	při první	obraně proti
bronchospazmu,	která může být následována, je	-li žádoucí,
inhalácí déle	působícího	činidla.

Podle dalšího provedení vynálezu, jak bylo definováno výše, je nicméně oxid dusnatý podáván ve formě donoru oxidu dusnatého, tj. sloučeniny, která působí uvolňováním oxidu dusnatého. Známé sloučeniny uvolňující oxid dusnatý použitelné v praxi vynálezu jsou nitpososloučeniny nebo nitrosylové sloučeniny, jako je například S-nitroso-N-acetylpenicilamin, S-nitroso-L-cystein a nitrosoguanidin, charakterizované -NO skupinou, která je spontánně uvolňována nebo jinak přenesena ze sloučeniny za fyziologických podrhínek, jako jsou například dosaženy v plíci. Další sloučeniny jsou sloučeniny, ve kterých je NO ligand na komplexu přechodového kovu, a jako takový je snadno uvolňován nebo přenesen ze sloučeniny za fyziologických podmínek, např. nitroprusid, komplex NO-feredoxin nebo komplex NO-hem. Další vhodné sloučeniny obsahující dusík jsou Sloučeniny, které jsou metaboližovány enzymy endogenními pro reópírační a/nebo vaskulární systém za vzniku NO skupiny, např. arginin, glyceroltrinitrát, isoamylnitrit, anorganický nitrit, azid a hydroxylamin. Tyto typy sloučenin uvolňující oxid dusnatý a způsob jejich syntézy jsou v oboru dobře známy. Výhodně je donor oxidu dusnatého sloučenina, která uvolní oxid dusnatý takovým způsobem, že jsou ovlivněny pouze dýchací cesty a plícní cévy.

Donor oxidu dusnatého použitý ve vynálezu může být podáván jako prášek (tj. jemně mletá pevná látka, buď poskytnutá čistá nebo jak směs s práškem biologicky kompatibilního nosiče nebo s jednou nebo více dalšími terapeutickými sloučeninami) nebo jako kapalina (tj. rozpuštěný nebo suspendovaný v biologicky kompatibilním tekutém nosiči, volitelně smíchaný s jednou nebo více dalšími ·· ··· ·

B« • · · ·

BBBB terapeutickými sloučeninami) a může být příhodně inhalovaný v nebulizované formě (výhodně zahrnující částice nebo kapičky mající průměr menší než 10 pm). Tekuté a práškové nosiče, které jsou vhodné k inhalaci, jsou obecně používány v tradičním inhalačních astmatických léčivech, a tak v oboru známy. Optimální rozsah dávek může být určen rutinními postupy odborníkovi známými.

Lapač aniontu superoxidu pro použití podle vynálezu může být kterákoliv sloučenina, o které se připouští, že je vhodná pro použití u savců, obzvláště lidí, která může být pohódlně podávána. Lapač aniontu superoxidu může být enzym anionty superoxidu.

mající schopnost odstranit

Superoxiddismutáza je dobře známý, obecně rozšířený enzym, který je výhodnou sloučeninou pro použití podle vynálezu. Nicméně lapač aniontu superoxidu může také být jiná sloučenina mající schopnost lapat anionty superoxidu. Příklady těchto sloučenin jsou antioxidanty, např. vitamín E, vitamín C, bilirubin, urát, butylovaný hydroxytoluen, butylovaný hydroxyanisol, propylgallát, ethoxychin a stopový prvek selen.

Složky použité pddle vynálezu mohou být podávány komerčně dostupnými inhalačními přístroji. Stlačený plyn NO může být získán od komerčního dodavatele, typicky jako směs 200 až 2000 ppm NO v čistém plynu N₂. Směs plynů NO-N2 může být dopravena do inhalačního plynu v množství 1 až 100000 nmol/mínut nebo může být smíchána se vzduchem, kyslíkem nebo dalším vhodným plynným nosičem nebo směsí plynů, obecně na koncentraci 1 ppm až 180 ppm dané směsi. Pro inhalaci během delších časových období je obecně použit rozsah 1 až 40 ρρηι, zatímco 1 až 80 ppm nebo 1 až 180 ppm může být použito pro kratší časová období, když je žádoucí okamžitý silný účinek. Obzvláště výhodné rozsahy v posledně uvedených případech jsou 40 až 80 ppm nebo 40 až 180 ppm, v daném pořadí. Pokud jde o další detaily ohledně inhalace NO, odkazuje se na stav • ♦♦ · • · · · • · · » techniky, např. EP 560 928 Bl, formou odkazu.

Oxid dusnatý a lapač podávány postupně v kterémkoliv současně, v druhém uvedeném složkami z nezávislých zdrojů formě přípravku obsahujícího aniontu superoxidu.

jehož popis je tímto zahrnut aniontu superoxidú mohou být pořadí nebo mohou být podávány případu buď s těmito dvěma současně nebo spolu, nebo ve jak oxid dusnatý tak lapač

Lapač aniontu superoxidu může být podáván stejným způsobem jako NO, tj. inhalací, ale také jinými běžnými způsoby podávání pro léčiva, Z těchto způsobů se odkazuje na sublingvální, perorální a rektální podávání, aplikaci na epitelové povrchy a injekce, které mohou být subkutánní, intramuskulární, intravenózní nebo intraperitoneální. Nicméně výhodně je lapač ahiontu superoxidu podáván inhalací. Tak může být podáván jako prášek (tj. jemně mletá pevná látka, buď poskytnutá čistá nebo jak směs s práškem biologicky kompatibilního nosiče nebo s jednou nebo více dalšími terapeutickými sloučehinami) nebo jako kapalina (tj. rozpuštěný nebo suspendovaný v biologicky kompatibilním tekutém nosiči, volitelně srftíchaný s jednou nebo více dalšími terapeutickými sloučeninami), ale může být příhodně inhalovaný v nebulizované formě (výhodně zahrnující částice nebo kapičky mající průměr menší než 10 pm). Tekuté a práškové nosiče, které jsou vhodné k inhalaci, jsou obecně používány v tradičním inhalačních astmatických léčivech, a ták v oboru známy.

Lapač aniontu superoxidu je použit v terapeuticky účinném množství, takové množství je snadno stanoveno odborníkem, závisí inter alia na typu použité sloučeniny a způsobu podávání. Jak je odborníkovi zjevné, termín terapeutickým v tomto ohledu, a také obécně v popisu a patentových nárocích zahrnuje přofylaktřekou léčbu, a také ···· ·» • · 9 · • 999 ·»* » · * ♦ · ♦ • · ♦♦·· · · · · « *··« * · ♦ · ···· léčbu stanoveného chorobného stavu. Kromě toho termín terapeuticky účinný je použit ve smyslu, který je v tomto oboru techniky běžný, jak je např. definováno v patentu EP 560 928 Bl, ačkoli obecně v tomto specifickém případu je lapač aniontu superoxidu terapeuticky účinný, jakmile zruší negativní účinek dosažený při použití oxidu dusnatého samotného nebo zesílí účinek oxidu dusnatého samotného. Nicméně jako vodítko může být dodáno, že rozsah účinných dávek pro superoxiddismutáza může například být 1 000-50 000 jednotek na kg tělesné hmotnosti (U/kg), 5 000-15 000 U/kg je výhodný rozsah a 8 00Q-12 000 U/kg je obzvláště výhodné. Podobné lapací účinky pro další lapače aniontu superoxidu mohou snadno být experimentálně stanoveny odborníkem.

Podle druhého aspektu vynálezu je poskytnut způsob léčby konstrikce dýchacích cest u savce, obzvláště člověka. Způsob obsahuje podávání savci, který potřebuje tuto léčbu, oxidu dusnatého (NO) inhalací, v kombinaci s lapačem aniontu superoxidu, kombinace je použita v terapeuticky účinném množství pro dosažení relaxace konstrikce dýchacích cest.

Pokud jde o specifická a výhodná provedení způsobu odkazuje se na ta specifická a výhodná provedení, která byla popisována v souvislosti s použitím podle vynálezu.

Konečně podle třetího aspektu vynálezu je poskytnut farmaceutický přípravek pro léčbu brOnchokonstrikce u Savce, obzvláště čloÝěka, který obsahuje oxid dusnatý (NO) v kombinaci s lapačem aniontu superoxidu, oxid dusnatý a lapač aniontu superoxidu jsou přítomny v terapeuticky účinném množství pro dosažení relaxace konstrikce dýchacích cest.

S odkazem na specifická a výhodná provedení přípravku Se Odkazuje na specifická a výhodná provedení použití podle vynálezu.

»· ··*· • * · · « ·

Popis obrázků

Obr. 1: Relaxace průdušnice kontrahované po karbacholu (CCh) prostřednictvím donoru oxidu dusnatého nitroprusídu sodného (SNP) po zvýšení intraluminální osmolaríty na 950 mOsm. Kontrolní skupina ošetřena hyperosmolaritou před experimentem a během experimentu a skupina předem ošetřena 100 u/ml superoxiddismutázy (SOD) na extraluminální straně. Hodnoty jsou procenta relaxace průdušnice kontrahované po CCh v průměru ± s.e.průměru. *významně odlišný od CCh.

Vynález bude nyní podrobněji vysvětlen následujícími neomezujícími příklady:

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Byla použita ín vitro metoda perfúze trachey morčete pro zkoumání účinku superoxiddismutázy (SOD), lapače aniontů superoxidu, na relaxaci dýchacích cest prostřednictvím donoru oxidu dusnatého nitroprusídu sodného (SNP) po zvýšení osmolaríty chloridem sodným na epiteliální straně.

Materiál a metody

Perfundovaný preparát průdušnice

Experimentální protokol byl· schválen oblastním výborem

pro etiku pokusů na zvířatech. Samcům morčat kmene Dunkin Hartley o hmotnosti 500 až 60Q g byla podána nadměrná dávka pentobarbitalu 0,1 mg ' kg^-1 tělesné hmotnosti intraperltoneálně. Průdušnice byly rychle vyříznuty bez pojivové tkáně, tuk a krevní cévy byly odstraněny a trachey byly připevněny do perfúzního držáku z nerezové oceli. Použitý perfúzní systém byl vylepšenou verzí systému autorů Fedan & Frazer (Fedan JS, Frazer DG. Influence of epithelium on the reactivity of guinea pig isolated, perfused trachea to bronchoactive drugs. J. Pharxnacol.Exp.Ther. 1992, 262:741-750), popisovaného dříve autorem Munakata (Munakata M, Mitzner W, Menkes HA. Osmotic stimuli induce epithelial-dependent relaxation in the guinea pig trachea. J.Appl.Physiol. 1988, 64:466-471). Poté, co byly do lumen průdušnice od každého konce vloženy centrálně fixované katétry s postranními otvory, průdušnice byla natažena do své délky in šitu a umístěna svisle do 25 ml extraluminální orgánové lázně obsahující Krebs-Henseleitův pufr. Katétr ve vstupním otvoru průdušnice, na proximálním konci, byl připojen k jedné strané diferenčního tlakového čidla (P300D, Validyne Engineering Cooperation, CA., USA) a výstupní katétr na distálním konci průdušhice byl spojen s druhou stranou snímače. Vnitřek průdušnice byl perfundován Krebs-Henseleitovým pufrem z 25 ml intraluminální lázně o průtoku 26 ml min^-1 v recirkulující kličce. Krebs-Henseleitův pufr v obpu lázních, extraluminální a intraluminální, byl udržován na 37 °C a probubláván směsí plynů 95% O₂ a 5% CO₂. Transmurální tlak byl upraven tak, aby bazální hodnota odpovídala nule. Reakce průdušnice byly zaznamenávány počítačem (LabView 3.0 software, National Instruments Austin, TX, USA) s použitím specificky navrženého programu (laskavě poskytnutý firmou Astra Draco, Lund, Švédsko) přizpůsobeného systému.

Reakce jsou vyjádřeny jako rozdíl v tlaku mezi ·· ··*· ·*♦· ♦ · * ♦ * • · · · · · • · ♦ · * · • ♦ · · * * · ·· «* ·· ·» ♦ ·« * proximálním a distálním místem, záznamu (ΔΡ, cmH₂O) .

Roztoky a reagencie

Modifikovaný izotonický Krebs-Henseleitův pufr měl osmolaritu 290 mOsm a byl složen z (v iriM):

NaCl, 117, NaHCO₃, 25, KH₂PQ₄., 1,2, MgSO₄, 1,2, KC1, 4,7, CaCl₂, 2,5 a glukóza, 1,03 (pH 7,4, 37°C). Hyperosmolární pufr byl tvořen zvýšením koncentrace NaCl na 203 mM, což zvýšilo osmolaritu na 450 mOsm. Karbachol (Sigma Chemical Co, MO, USA) byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku. Donor oxidu dusnatého nitroprusid sodný (SNP, Sigma) a superoxiddismutáza (SOD, z bovinních jater, Sigma) byla rozpuštěna v KrebsHenseleitově pufru. SNP byl až do použití chráněn před světlem.

Experimentální protokol

Všechny protokoly začínaly ekvilibračním obdobím 60 až 75 minut s promytím každých 15 minut, kdy oba intraluminální a extraluminální roztoky byly nahrazeny čerstvým pufrem. Potom byly průdušnice podrobeny jednomu z následujících protokolů:

1) Kontroly (n=6). Intraluminální a extraluminální pufry byly izoosmolární a průdušnice byla kontrahována ΙμΜ karbacholem (CCh) aplikovaným extraluminálně, odpovídající 50% maximální kontrakci (jak určeno v časnějších experimentech, data nejsou ukázána). CCh kontrahovaná průdušnice byla relaxována donorem oxidu dusnatého 3mM SNP přidaným k intraluminální lázni. Po 60 minutách promývání, kdy oba intraluminální a extraluminální pufry byly nahrazovány čerstvým pufrem každých 15 minut, byl postup opakován.

2) Hyperosmolární pufr (n=6). Průdušnice byly »· ··*· • ·· · kontrahovány na 50% maximální kontrakci aplikací ΙμΜ karbacholu extraluminálně. Průdušnice byla relaxována donorem oxidu dusnatého 3mM SNP přidaným k intraluminální lázni. Po 60 minutách promývání byl intraluminální pufr nahrazen hyperosmolárním pufrem 10 minut před druhou karbacholovou kontrakcí, pak byl do průdušnice podán SNP za hyperosmolárních podmínek.

3) Superoxiddismutáza SOD (n=5). Průdušnice byly ošetřeny jako kontrolní skupina, s jedným dodatkem k protokolu, SOD v koncentraci 10 jednotek/ml byl aplikován na extraluminální stranu průdušnice 10 minut před druhým podnětem s CCh a SNP.

4) Hyperosmolární pufr a SOD. Enzym superoxiddismutáza (SOD) byl použit pro zkoumání účinku superoxidových aniontů na relaxační účinek SNP, Po prvním kontrolním podnětu, kdy k relaxaci CCh kontrahované průdušnice byl použit 3mM SNP, následovalo 60 minut promývání, pak bylo aplikováno 100 u/ml SOD na extraluminální stranu průdušnice (n=8) 10 minut před výměnou intraluminálního pufru za hyperosmolární pufr. Průdušnice byla potom kontrahována s ΙμΜ CCh a byl studován účinek 3mM SNP.

Statistika

Statistická analýza byla prováděna s použitím software Statistica (verze 5.0, StatSoft. Inc, Tulsa, OK, USA). Výsledky byly analyzovány Wilcoxonovým neparametríckým párovým testem a Mannovým-Whitneyovým U-testem, kde bylo vhodné. Pro analýzu mezi skupinami byl použit Kruskalův-Wallisův test (analýza rozptylu). Výsledky jsou předloženy jako průměrné hodnoty ± s.ě, průměru. Statistický výsledek s P<0,05 byl považován za významný.

: i ·• ·· ·

Výsledky

Počáteční CCh indukovaná kontrakce průdušnice mela stejnou velikost v různých studovaných skupinách (ns) a všechny skupiny relaxovaly po následném SNP (p<0,45) do stejného stupně (ns) . To byla kontrola, aby bylo zřejmé, že všechny průdušnice byly životaschopné a měly stejné počáteční předpoklady.

1) Kontrola. CCh vyvolal kontrakci průdušnice o 1,49 ± 0,30 cmH₂0, následná expozice SNP relaxovala dýchací cesty o 53,1 ± 6%, tj. o 0,68 ±0,11 cmH₂0 (viz obrázek 1).

2) Hyperosmolární pufr. Po zvýšení osmolarity intraluminálního pufru na 450 mOSM, byla CCh kontrakce menší (0,83 ± 0,17 cmH₂0, p<0,05) než v normálních podmínkách. Když byly průdušnice podrobeny intraluminální hyperosmolaritě, SNP relaxoval CCh kontrahovanou průdušnici o 31 ± 7 % (viz obrázek 1). To bylo významně menší procentní snížehí než v izoosmolárních kontrolních podmínkách (viz kontrolní skupina, p<0,45) (víz obrázek 1).

3) SOD. SOD neměla žádný účinek na bázální tonus a nebyl žádný rozdíl mezi průdušnicemi ošetřenými a neošetřenými SOD, co se týče CCh kontrakce (ošetřené SOD: 1,36 ± 0,15 cmH₂o, neošetřené viz výše: 1) kontrola) nebo SNP relaxace (ošetřené SOD: 57 ±12%, neošetřené viz výše: 1) kontrola) (viz obrázek 1).

4) Hyperosmolární pufr a SOD. V průdušnicích ošetřených SOD před vystavením intraluminální strany hyperosmolaritě, SNP relaxoval průdušnici o 46 ± 5 %, od 1,67 ± 0,29 do 0,92 ± 0,19 cmH₂0. Tato relaxace se nelišila od relaxace průdušnic předem ošetřených SOD v izoosmolárních podmínkách a byla to významně větší relaxace než v průdušnicích podrobených působení hyperosmolárního pufru, které nebyly předem ošetřeny SOD • •44

4 »·*· ·· 4 • 4 4 4 4 4 · 4 «

4 4 444 444

4 4 4 4 · · 4 4 4 • · · 4 44·· · · · · (p<0,05) (viz obrázek 1).

Příklad 2

Výsledky z lázně s orgánovou perfúzí byly také reprodukovány v in vivo experimentech. Králíkům byla podána anestézie intramuskulární injekcí fluanisonu a fentanylcitrátu a intravenózní injekcí diazepamu a byli paralyzováni pankuroniumbromídem. Králíci byli intubováni a ventilováni servo ventilátorem (Siemens 900). Vdechová kyslíková frakce byla 0,5. Zvířata byla rozdělena do čtyř různých skupin: 1/ Metacholiňová (MCh) skupina, dýchací cesty byly vystaveny podnětu 1 mg MCh/ml, 2/ NO-MCh skupina, kde inhalace 80 ppm NO byla zahájena před MCh podnětem a udržována po zbylou dobu experimentu, 3/ hypertonický fyziologický roztok (HS)-NO-MCh skupina, kde hypertonický 3,6% fyziologický roztok byl nebulizován do dýchacích cest, pak následovala NO inhalace a MCh podnět a 4/ SOD-HS-NO-MCh skupina, kde 8 000 U/kg SOD bylo nebulizováno před nebulizací HS a inhalací NOO, pak následoval MCh podnět.

Hodnoty respirační rezistence, vypočtené z tlaku v dýchacích cestách a záznamu průtoku plynu, byla vypočtena pro výchozí stav a po MCh podnětu v každé skupině.

*· ♦»»· ·· »·«· ·· *·· · * · · · · «·· 4 » · * · · · « » « • · ♦ ♦ « « · · · · « • *· · * ·♦ » » ♦· ·

Výsledky:

Rezistence (cmfoO/l/s) „£L__ .. MCh

1. 54 ±4 161 ±18 ** _JBU, , ua+MCh

2. 50±2 66=tl2

-JBL- HS+NQ + MCh

3. 4S±2 190 + 22 **

Efc, SQD + HS+NO+MCh

4. 47±4 103 ±15 **

T

BL: Bazální hodnota^: ** = významný rozdíl mezi BL a podnětem (p<0,01)

T = významný rozdíl mezi skupinami, 3 a 4 po podnětu <0,05

Diskuse

Lze tedy pozorovat, že králíci reagovali silnou konstrikcí dýchacích cest na MCh podnět s trojnásobným zvýšením rezistence (skupina 1) . NO inhalace takovému zvýšení zabránila (skupina 2) (bylo pozorováno nepatrné, nevýznamné zvýšení). Nebulízace HS do dýchacích cest také kompletně zrušila účinek NO inhalace (skupina 3) . Zvýšení rezistence bylo tedy stejně veliké jako v první skupině, exponované pouze MCh. Konečně ve skupině přijímající SOD prostřednictvím nebulizace bylo oslabeno zvýšení rezistence, přestože byl podán NO po podávání hypertonického fyziologického roztoku (skupina 4). Zvýšení rezistence bylo tedy pouze poloviční oproti zvýšení pozorovanému u skupiny exponované hypertonickému fyziologickému roztoku, ale ne SOD.

Problém jevu osob nereagujících na inhalovaný oxid ··*· • · ··· · > » · ·· ·· ·· • « · * · · * ♦ · · * · · ·· <

» · · « * · · · · • · · · · • »· ·· dusnatý byl zkoumán dříve. Bylo ukázáno, že hyperosmolarita na epitelóvé straně dýchacích cest oslabí účinek inhalovaného oxidu dusnatého (Hógman M, Hjoberg J, Hedenstierna G. Increased aírway osmolarity inhibits the action of nitrid oxide in the rabbít. Eur.Respir.J. 1998, 12:1313-1317) a že je to pravděpodobně způsobeno inaktivací molekuly oxidu dusnatého (Hjoberg J, Hógman M, Hedenstierna G. Hyperosmolarity reduces the relaxing potency of nitric oxide donors in guineá-pig trachea. Br.J.Pharmacol. 1999, 127:391-396). Podle předloženého přikladu bylo Zjištěno, že zabránění tvorby superoxidu v průdušnici morčat podrobené zvýšené osmolaritě na epitelóvé straně zvýší relaxaci předem kontrahované průdušnice prostřednictvím donoru oxidu dusnatého nitroprusidu sodného.

Claims

NÁROKY ·* ··· · ♦ · Φ

Φ Φ * • · · ·

1. Použití inhalovatelného oxidu dusnatého (N0)_z ve formě plynného oxidu dusnatého nebo donoru oxidu dusnatého, v kombinaci s lapačem aniontu superoxidu pro výrobu léku pro léčení konstrikce dýchacích cest u savce, obzvláště člověka, přičemž kombinace je použita v terapeuticky účinném množství pro dosažení relaxace konstrikce dýchacích cest.
2. Použití podle nároku 1, přičemž lék je inhalační lék.
3. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2, přičemž konstrikce dýchacích cest je výsledkem hyperreaktivity dýchacích cest nebo astmatu.
4. Použití podle nároku 3, přičemž konstrikce dýchacích cest je spojena s asthma bronchiale.
5. Použiti podle nároku 4, přičemž konstrikce dýchacích cest je spojena s akutním stavem asthma bronchiale.
6. Použití podle nároku 4, přičemž konstrikce dýchacích cest je spojena se status asthmaticus.
7. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, přičemž savec je osoba nereagující na samotnou inhalaci oxidu dusnatého nebo donoru oxidu dusnatého.

·· »»«· Μ «««· « + ···· * · ··» · ♦ · « • · · « · · 9 · Λ • · · ♦ · · ···· * • · · · · · * · · ·· · »· ·· · · ·« « · »·
8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, přičemž výroba se týká léku pro postupné podávání oxidu dusnatého a lapače aniontu superoxidu v kterémkoliv pořadí.
9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, přičemž lék je ve formě přípravku obsahujícího oxid dusnatý a lapač aniontu superoxidu pro jejich současné podávání.
10. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků, přičemž superoxidový lapač je vybraný ze skupiny, kterou tvoří enzymy a antioxidanty mající schopnost odstranit anionty superoxidu.
11. Použití podle nároku 10, přičemž lapač aniontu superoxidu je superoxiddismutáza.
12. Použití podle nároku 11, přičemž dávka superoxiddismutázy je v rozsahu 1 000 až 50 000 V/kg, výhodně 5 000 až 15 000 U/kg a nejvýhodněji 6 000 až 12 000 U/kg.
13. Použití podle nároku 10, přičemž superoxidový lapač je vybrán ze skupiny, kterou tvoří vitamín E, vitamín C, bilirubin, urát, butylovaný hydroxytoluen, butylovaný anisol, propylgallát, ethoxychín a selen.
14. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků, přičemž NO je přítomný v léku v množství 1 až 100 000 nmol/minutu.
15. Použiti podle kteréhokoliv z předchozích nároků, přičemž koncentrace NO pro inhalaci je v rozsahu 1 až 180 ppm, výhodně • · » · · » · · · · * ···· ♦··· · · _a ·

1 až 80 ppm, obzvláště 1 až 40 ppm, NO je přítomný v nosičovém plynu nebo směsi plynů.
16. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků, přičemž donor oxidu dusnatého je vybrán ze skupiny, kterou tvoří S-nitroso-N-acetylpeňicilamin, S-nitrosocystein, nitroprusid, nitrosoguanidin, glyceroltrinitrát, isoamylnitrit, anorganický nitrit, azid a hydroxylamin.
17. Způsob léčení konstrikce dýchacích cest u savce, obzvláště člověka vyznačuj ícísetím, že obsahuje podávání savci, který potřebuje tuto léčbu, oxidu dusnatého (NO) ve formě plynného oxidu dusnatého nebo donoru oxidu dusnatého inhalací, v kombinaci s lapačem aniontu superoxidu, přičemž kombinace je použita v terapeuticky účinném množství pro dosažení relaxace konstrikce dýchacích cest.
18. Způsob podle nároku 17 vyznačuj ícísetím, že lapač aniontu superoxidu je také podáván inhalací,
19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 a 18 vyznačuj ícísetím, že konstrikce dýchacích cest je výsledkem hyperreaktivity dýchacích cest nebo astmatu.
20. Způsob podle nároku 19 vyznačuj ícísetím, že konstrikce dýchacích cest je spojena s asthma bronchiale, obzvláště status asthmaticus nebo akutní Stav asthma bronchiale.

·· «·«· φφ ♦· ·»·Φ • · ♦ · · » φ · » * · · · v · Φ·« • · <·«· φ · · · · * · · · ♦ ·· · · · · » ·· ♦♦ ·· «Γ« ·« ··
21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 20 vyznačuj ícísetím., že savec je osoba nereagující na inhalaci samotného oxidu dusnatého nebo donoru oxidu dusnatého.

22. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 21 v y z n a č u jící se tím, že oxid dusnatý a lapač aniontu superoxidu jsou podávány postupně v kterémkoliv pořadí. 23. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 21 v y z n a č u jící se tím, že oxid dusnatý a lapač aniontu superoxidu jsou podávány současně.
24. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 23 vyznačující se tím, že lapač aniontu superoxidu je vybrán Ze skupiny, kterou tvoří enzymy a antioxidanty mající schopnost odstranit anionty superoxidu, obzvláště vitamín E, vitamín C, bilirubin, urát, butylováný hydroxytoluen, butylováný anisol, propylgallát, ethoxychin a selen.
25. Způsob podle nároku 23 vyznačuj ícísetím, že lapač aniontu superoxidu jě superoxiddismutáza.
26. Způsob podle nároku 25 vyznačuj ícísetím, že dávka superoxiddismutázy je v rozsahu 1 000 až 50 000 U/kg, výhodně 5 000 až 15 000 U/kg a nej výhodněji 8 000 až 12 000 U/kg.

·· *·«· 44 ««*>

• * · · · · 4 · « • · 4 4 « 4 4 4« ·· · « · · · · 4 4 » kteréhokoliv z nároků setím, že inhalované 100 000 nmol/minutu nebo 1 obzvláště 1 až 40 ppm, NO směsi plynů.
27. Způsob podle vyznačuj íeí množství NO je 1 až výhodně 1 až 80 ppm, v nosičověm plynu nebo

17 až 26 terapeutické až 180 ppm, je přítomný
28. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 27 vyznačující se tím, že donor oxidu dusnatého je vybrán ze skupiny, kterou tvoří S-nitroso-N-acetylpenicilamin, S-nitrosocystein, nitroprusid, nitrosoguanidin, glyceroltrinitrát, isoamylnitrit, anorganický nitrit, azid a hydroxylamin.
29. Farmaceutický přípravek pro léčbu konstrikce dýchacích cest u savce, obzvláště člověka, vyznačující se t í m, že obsahuje oxid dusnatý (NO) ve formě plynného oxidu dusnatého nebo donoru oxidu dusnatého, v kombinaci s lapačem aniontu superoxidu, oxid dusnatý a lapač aniontu superoxidu jsou přítomny v terapeuticky účinném množství pro dosažení relaxace konstrikce dýchacích cest.
30. Farmaceutický přípravek podle nároku 29 vyznačující se tím, že je pro použití, jak bylo definováno v kterémkoliv z nároků 2 až 16.