CZ20021313A3 - Sekvence RNA se samoątěpící schopností a způsob řízení produkce proteinu pomocí takové RNA - Google Patents
Sekvence RNA se samoątěpící schopností a způsob řízení produkce proteinu pomocí takové RNA Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20021313A3 CZ20021313A3 CZ20021313A CZ20021313A CZ20021313A3 CZ 20021313 A3 CZ20021313 A3 CZ 20021313A3 CZ 20021313 A CZ20021313 A CZ 20021313A CZ 20021313 A CZ20021313 A CZ 20021313A CZ 20021313 A3 CZ20021313 A3 CZ 20021313A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ligand
- gene
- rna
- self
- molecules
- Prior art date
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 50
- 230000014616 translation Effects 0.000 title abstract description 29
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 title abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 157
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 78
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 140
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 103
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 69
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 62
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 60
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 31
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 26
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 26
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 12
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 claims description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 claims description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 2
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 claims description 2
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 claims description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 3
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 claims 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 claims 1
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 claims 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 22
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 9
- FHFYDNQZQSQIAI-UHFFFAOYSA-N pefloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCN(C)CC1 FHFYDNQZQSQIAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960004236 pefloxacin Drugs 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 6
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003687 estradiol congener Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIDGPCDGNMIUNX-UUOKFMHZSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-5-(dihydroxyphosphinothioyloxymethyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O DIDGPCDGNMIUNX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- DNXDWMHPTVQBIP-ZQIUZPCESA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-[6-[(2-iodoacetyl)amino]hexyl]pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCCNC(=O)CI)SC[C@@H]21 DNXDWMHPTVQBIP-ZQIUZPCESA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000003718 Dual-Luciferase Reporter Assay System Methods 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091027874 Group I catalytic intron Proteins 0.000 description 1
- 108091029499 Group II intron Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 108090000883 varkud satellite ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1048—SELEX
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká řízení syntézy proteinu (aktivací či represí) z určité sekvence mRNA, a to vložením sekvence, udělující transkribované RNA podmínečnou samoštěpící schopnost, do netranslatované oblasti (UTR) genu.
Dosavadní stav techniky
Proteosyntéza in vivo je řízena na několika úrovních. První úrovní je transkripce genu poskytující nesestřiženou pre-messengerRNA (pre-mRNA). Rychlost iniciace transkripce jakož i elongace transkriptu je přísně fyziologicky kontrolována základním transkripčním aparátem. Další úrovní je sestřih pre-mRNA na zralou mRNA. Kroky alternativního sestřihu mohou probíhat tkáňově specificky či pod hormonální kontrolou, takže aktivní protein je syntetizován v omezených typech tkání či v jistém fyziologickém prostředí. Dalšími úrovněmi řízení jsou obrat mRNA a schopnost mRNA být translatována na protein. Řízení proteosyntézy léčivy může tedy být teoreticky ovlivněno na každé z vyjmenovaných úrovní.
Léčivo může řídit expresi cílového genu v rámci genomu pozměněním rozsahu syntézy RNA. Toho může být dosaženo látkami, které se váží na DNA s vysokou afinitou a sekvenční specifitou, a tak kompetují s transkripčními faktory nezbytnými pro transkripci cílového genu. Takovými látkami mohou být oligonukleotidy tvořící trojitou šroubovici • · et al., Ciba Found Symp. nukleové kyseliny (Pooga, (1998) 16(9):857-61) či (1997) 209:94-106),
M. et al. ; Nat. pyrolimidazolpolyamidy (C. Helene peptidové Biotechnol (Dickinson, L.A 95(22) :12890-5) . transkripčních et al.; Proč Nati Acad Sci U S A. (1998); Lze toho též dosáhnout pomocí xenogenních faktorů, které se specificky vážou na promotorovou oblast genu a které jsou aktivovány po navázání molekuly induktoru (Allgood, V.E. et al.; Annual Reports in Medicinal Chemistry (1997) 32: 231-239). Léčivy schopnými aktivovat xenogenní transkripční faktory jsou antibiotika, analoga estrogenu a imunosupresory.
Snížené produkce proteinu lze dosáhnout zvýšením obratu mRNA (tj. snížením poločasu rozpadu). „Antisense (antiparalelní, tj . proti smyslu transkripce) oligonukleotidy nasedají na cílovou RNA, což může vyvolat její štěpení RNázou H; může to také zabránit její translaci či vyvolat její rychlejší degradaci narušením její sekundární struktury (Kumar, M. et al.; Microbiol Mol Biol Rev. (1998) 62(4):141534) . Naproti tomu ribozymy nasedají na cílovou RNA a štěpí ji (Foster, A.C. & Altman, S.; Science (1990) 249:783-6). Ribozymy představují typické molekuly RNA vykazující katalytickou aktivitu podobnou enzymům a spojovanou obvykle se štěpením, sestřihem či ligací sekvencí nukleových kyselin. Typickými substráty pro katalyticky aktivní ribozymy jsou molekuly RNA, i když ribozymy mohou katalyzovat i reakce, v nichž jako substráty slouží molekuly DNA. Přirozeně se vyskytující ribozymy, které jsou aktivní uvnitř buněk, působí intramolekulárně (cis), katalýzují pouze jedinou obratovou reakci a obvykle jsou během této reakce samy pozměněny (Cech, T.R.; Biosci Rep. 1990; 10(3):239-61). Ribozymy vsak také mohou být připraveny tak, aby mohly působit intermolekulárně [trans), tj . skutečně katalytickým způsobem, s obratem vyšším ·· ·· • · · · · • · · · · · · • · · · · · · • ·· ······· · než jedna a aniž by byly samy modifikovány. V ribozymu lze rozlišit dvě oddělené oblasti: vazebnou oblast, která uděluje ribozymu jeho specificitu danou hybridizaci se specifickou sekvenci nukleové kyseliny, a katalytickou ribozym vybavuje jeho štěpící, ligační aktivitou.
Řízení produkce proteinu ze specifického cílového genu uvnitř genomu léčivem lze dosáhnout kontrolou translace mRNA na protein. Řízení genové exprese využívající interakce specifické RNA vázající ligand (aptameru) s jí rozpoznávajícím ligandem publikovali Werstuck, G. & Green, M.R.; Science (1998) 282, 296-298. Translace mRNA je v tomto případě inhibována léčivem, které se váže v blízkosti čepičkové (cap) struktury na 5-''konci dané mRNA. Přítomnost léčiva uvnitř buňky zabraňuje v tomto provedení produkci proteinu.
Řízení genové exprese a produkce proteinů je výhodné pro oblast genové terapie a DNA vakcín. Je určeno k předcházení nepříznivým vedlejším účinkům a k vyladění hladiny exprese na účinné léčebné rozmezí. Využití výše zmíněných systémů k řízení genové exprese v genové terapii však naráží na základní překážky. Léčiva vázající DNA, stejně jako „antisense a ribozymové oligonukleotidy jsou těžko biologicky dostupné a ve tkáních i tělesných tekutinách jsou snadno degradovány nukleázami či proteázami. Xenogenní transkripční faktory mohou vyvolat cytotoxickou imunitní odpověď, která zničí buňky exprimující transgen, a tím je léčba či vakcinace oslabena (S. K. Tripathy et al., Nátuře Medicine (1996) 2, 545-550). Navíc léčivy aktivujícími xenogenní transkripční faktory jsou antibiotika, analoga estrogenů či imunosupresory. Nejsou to sama o sobě terapeutika pro genovou léčbu a mohou mít nežádoucí vedlejší účinky. Pro danou terapii by proto bylo výhodné vybrat indukující léčivo, jež by bylo přinejmenším oblast, která a sestřihovou • · · · · · · · ·· • · · · · 4 · ···· • · · · · · ·· · • « ·· ······« · · • · ··· · · « ··· ···· ·· · ·· ···· neškodné. Dalším nedostatkem je požadavek na velký klonovací prostor ve vektorech potřebný k umístění kontrolních sekvencí a genů kódujících transkripční faktory. Je tedy vysoce výhodné
i) nevyužívat pro řízení genové exprese xenogenní proteiny a ii) vybrat indukující léčivo odpovídající danému terapeutickému záměru.
Řízení genové exprese a produkce proteinů je výhodné i pro oblast funční genomiky, transgenních rostlin a transgenních zvířat. Podmíněná exprese genu v tkáňové kultuře nebo v celé rostlině či zvířeti a srovnání fenotypu s expresí genu či bez ní umožňuje určit funkci daného genu. Nevýhody přepínání genové exprese založeného na využití xenogenních transkripčních faktorů jsou dvojí: i) exprese cílového genu a translace mRNA přestávají být pod kontrolou endogenních fyziologických stimulů a ii) indukující léčivo ovlivňuje fyziologii buněk. Je proto vysoce výhodné i) udržovat transgen pod kontrolou jeho endogenního transkripčního promotoru, jakož i zachovat tytéž translační kontrolní sekvence v dané mRNA a ii) vybrat takové indukující léčivo, které nezasahuje do buněčné fyziologie.
Předkládaný vynález představuje výhodné využití výše popsaných jevů.
Podstata vynálezu
Definice
Gen:
Jakákoli molekula nukleové kyseliny kódující biologický produkt, tj. RNA, protein, polypeptid či peptid. V kontextu předkládaného vynálezu pojem gen tedy zahrnuje genomovou DNA
či polosyntetické DNA. Podle geny konkrétné představovat kódující biologický produkt, (gDNA), cDNA nebo syntetické předkládaného vynálezu mohou jakoukoli nukleovou kyselinu která obsahuje jednu či více přirozeně se vyskytujících nebo uměle vložených netranslatovaných oblastí.
Netranslatovaná oblast (UTR) genu:
Sekvence DNA genu, která je transkribována na RNA, ale která není translatována na protein. Oblast UTR se může nacházet před 5-koncem kódující oblasti (5-UTR), za 3'-koncem kódující oblasti (3'-UTR), nebo to může být intron vložený do kódující oblasti.
Netranslatovaná oblast pre-mRNA:
Sekvence pre-mRNA, která není translatována na protein.
UTR se může nacházet před 5-koncem (5Z-UTR), za 3-koncem kódující oblasti (3'-UTR), nebo to může být intron vložený do kódující oblasti.
Ligand:
Ligandem může být molekula nukleové kyseliny, protein, polysacharid či cukr, nebo organická či anorganická molekula, která interaguje se sekvencí samoštěpící RNA a buď inhibuje nebo stimuluje samoštěpení.
Předkládaný vynález poskytuje způsoby a kompozice určené k řízení produkce proteinů v buňce. Tento vynález poskytuje zejména způsoby a kompozice k řízení produkce proteinů pomocí určitých sekvencí nukleových kyselin vložených nejméně do jedné oblasti UTR genu, které molekulám RNA transkribovaným z daného genu udělují samoštěpící schopnost závislou na • Φ φ ·· ·· ·· · · φφφ φ « « · φ φ ΦΦΦΦ φ φ φ • · φφ φφφφφφφ φ φ • φ φφφ φφφ φφφ ΦΦΦΦ φφ φ φφ ΦΦΦΦ ligandu (ligand-dependentní). Dané pre-mRNA či mRNA tedy mohou podléhat samoštěpení, které lze regulovat prostřednictvím přítomnosti či nepřítomnosti ligandu. Štěpení řízené ligandem umožňuje řídit produkci proteinu tímto ligandem (obr. 1).
Tento způsob je výhodný tehdy, kdy je gen transfekován do kultivovaných buněk nebo vpraven do živých zvířat a je třeba řídit jeho expresi. Množství proteinu syntetizovaného v buňce je úměrné množství jeho mRNA a závisí na účinnosti translace této mRNA na protein. Dvě struktury mRNA jsou rozhodující pro její účinnou translaci na proteiny (Gallie, R.; Genes & Dev. (1991) 5: 2108-2116) a pro její stabilitu (Beelman, C.A. &
Parker, R. ; Cell (1995) 81: 179-183): struktura čepičky na
5'-konci a sekvence póly(A) na 3'-konci. Z obr. 2A je patrno, že exprese genu pro luciferázu může být řízena odstraněním buď póly(A) z 3'-konce nebo čepičky z 5'-konce mRNA. Vložení aktivní sekvence nukleové kyseliny popsané v tomto vynálezu do oblasti 5'- či 3'-UTR reportérového genu způsobuje štěpení transkribované RNA a tím postupné odstranění čepičky z 5'-konce a póly(A) z 3'-konce. Aktivní sekvence nukleové kyseliny v obou z těchto oblastí snižuje produkci luciferázového proteinu, zatímco přítomnost neaktivní sekvence nukleové kyseliny v těchto oblastech genovou expresi neovlivňuj e.
Tento vynález může být využit k řízení produkce v podstatě všech typů proteinů, v podstatě ve všech typech buněk, in vitro, ex vivo i in vivo.
Prvním konkrétním předmětem předkládaného vynálezu je modifikovaný gen kódující protein, polypeptid či peptid, přičemž tento modifikovaný gen obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, vloženou do netranslatované oblasti (UTR) tohoto ·» genu a udělující molekule RNA transkribované z daného genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost.
Jak bylo řečeno výše, modifikovaným genem může být DNA, cDNA či syntetická DNA. Modifikovaný gen genomova obsahuje alespoň jednu oblast UTR, která se v něm buď přirozeně vyskytuje, nebo do něj byla uměle vložena. Tak např. pokud jde o molekulu gDNA, gen obsahuje přirozeně se vyskytující oblasti UTR jako 5'-UTR, introny či 3'-UTR. Pokud se genem míní cDNA nebo molekula, oblasti UTR, jako syntetická (či polosyntetická) např. introny, do ní mohou být vloženy. Navíc, i když gen obsahuje přirozené oblasti UTR, lze do něj vložit další oblasti UTR, a to buď nově přidat nebo nahradit ty, které již obsahuje. Modifikovaný gen může dále obsahovat transkripční promotor k řízení transkripce kódující oblasti na pre-mRNA. Gen může navíc být součástí vektoru, a to ve formě plasmidu, viru, kosmidu, fága, umělého chromozomu apod. Modifikovaný gen může kódovat jakýkoli typ proteinu, polypeptidu či peptidů, včetně lidských proteinů, polypeptidů či peptidů lidského, jiného savčího, virového či bakteriálního původu, nebo případně jejich derivátů. Kódovaný biologický produkt může vykazovat terapeutickou či profylaktickou aktivitu a může také představovat např. markerovou molekulu.
Jak bylo řečeno výše, modifikovaný gen v předkládaném vynálezu obsahuje nejméně jednu určitou sekvenci nukleové kyseliny vloženou do oblasti UTR daného genu. Touto oblastí UTR může být 5'-UTR, 3'-UTR nebo intron. Ačkoli vložení jediné kopie sekvence nukleové kyseliny do vynálezu stačí zajistit řízení v konkrétních provedeních může modifikovaný gen obsahovat několik kopií takové sekvence nukleové kyseliny vložených do různých UTR nebo do různých míst UTR, nebo různé sekvence genu v předkládaném produkce proteinu, ·· φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φφφφ nukleové kyseliny vložené do různých UTR či do různých míst UTR.
V jednom provedení vynálezu je samoštěpení sekvence RNA vložené do oblasti UTR v pre-mRNA inhibováno ligandem. To znamená, že v nepřítomnosti ligandu se pre-mRNA či mRNA štěpí a produkce proteinu je snížena; daná pre-mRNA či mRNA není za přítomnosti ligandu štěpena a produkce proteinu je obnovena.
Určitý modifikovaný gen v tomto vynálezu tedy obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která uděluje RNA transkribované z daného genu ligandem-inhibovnaou samoštěpící schopnost.
V dalším provedení je samoštěpení sekvence RNA vložené do oblasti UTR na pre-mRNA aktivováno ligandem. To znamená, že pre-mRNA nebo mRNA se v přítomnosti ligandu štěpí a produkce proteinu je potlačena; v nepřítomnosti ligandu se pre-mRNA či mRNA neštěpí a produkce proteinu je obnovena.
Další určitý modifikovaný gen v předkládaném vynálezu obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která uděluje RNA transkribované z daného genu ligandem-aktivovanou samoštěpící schopnost.
Předkládaný vynález se také týká způsobu modifikace genu, zahrnující vložení sekvence nukleové kyseliny, která uděluje RNA transkribované z daného genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost, oblasti zmíněného genu. Nukleová kyselina do alespoň jedné netranslatované muže být vložena do různých míst sekvence UTR. Pokud jde o 5'-UTR či 3'-UTR, vložení lze provést v různých místech, která v zásadě neovlivní transkripci DNA na pre-mRNA. Taková místa lze určit analýzou sekvence UTR a využitím restrikčních míst, která jsou zde přítomna nebo vytvořena uměle. Vložení lze také provést rekombinací, mutagenezí apod. Pokud jde o introny, pro jejich vložení lze použít jakékoli místo, které neovlivní • * « · transkripci . kyseliny v sekvencích,
Jelikož účinnost samoštěpení sekvence nukleové UTR může záviset na okolních nukleotidových je výhodnější využít počítačové programy jako
RNAfold (Zuker, M.; Methods Mol Biol (1994) 25:267-94), které předpovídají nejstabilnější konformace, a odhadnout, zda se sekvence nukleové kyseliny po vložení do konkrétního místa UTR poskládá do produktivní konformace. Vlivem okolních sekvencí se daná sekvence nukleové kyseliny skutečně může poskládat odlišným způsobem, čímž získá neaktivní či ligandindependentní konformaci (Stage-Zimmermann, T.K. RNA (1998) 4:875-889). V závislosti na výše popsaných metodologiích lze pro vložení sekvence nukleové kyseliny do oblasti UTR vybrat různá místa.
Konkrétní sekvencí nukleové kyseliny použitou v předkládaném vynálezu k řízení produkce může být jakákoli sekvence nukleové kyseliny kódující RNA s ligand-dependentní samoštěpící schopností. Délka této sekvence nukleové kyseliny může být různá v závislosti na její povaze a původu. Obvykle tato sekvence nukleové kyseliny přestavuje 10 až 500 párů baží, optimální je méně než 300 párů baží. Typickým příkladem takové nukleové kyseliny je sekvence o 20 až 200 párech baží.
Nukleová kyselina může být různého původu. Zejména může být odvozena od přirozeně se vyskytujících samoštěpících sekvencí RNA. Z tohoto hlediska je možno najít sekvence DNA, jejichž transkripty RNA vykazují samoštěpící aktivitu, o které je známo, že ji ovlivňují různé ligandy jako např. tzv. „hammerhead ribozymy, ribozymy viru hepatitidy delta, ribozym Neurospora VS, vlásenkové ribozymy, intron skupiny I, intron skupiny II a RNáza P (Clouet-ďOrval, B. et al.; Biochemistry (1995) 34: 11186-90; Olivě, J.E. et al., EMBO J. (1995) 14: 3247-51; Rogers, J. et al.; J.Mol.Biol. (1996) 259: 916-25).
9« 99 «9 9
Λ »
9 9 •»999 9 9
9
Tyto sekvence mohou být připraveny uměle a využity podle předkládaného vynálezu. Zejména DNA kódující RNA tohoto typu (nebo jejich funkční deriváty) mohou být připraveny konvenčními technikami a využity pro modifikaci genu podle předkládaného vynálezu.
Lze také vybrat jakékoli sekvence DNA, jejichž transkripty RNA vykazují samoštěpící aktivitu, a inhibitory samoštěpení mohou být identifikovány v knihovnách sloučenin.
Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je však nejprve vybrán vhodný ligand a poté jsou in vitro připraveny sekvence DNA, jejichž transkripty RNA mají ligand-dependentní samoštěpící schopnost. Z tohoto hlediska podávaný vynález popisuje konkrétní způsob, kterého lze využít k přípravě umělých, přirozeně se nevyskytujících ligand-dependentních samoštěpících RNA a jejich kódujících DNA. Tyto umělé, přirozeně se nevyskytující ligand-dependentní RNA se nazývají aptazymy a jsou dalším předmětem předkládaného vynálezu.
V určitém provedení tohoto vynálezu tedy představuje sekvenci nukleové kyseliny uměle syntetizovaná DNA kódující aptazym. Tento aptazym lze získat evolucí a selekcí in vitro popsanými níže.
Příprava aptazymu
Způsobem popsaným v předkládaném vynálezu lze nejprve vybrat ligand a poté připravit odpovídající aktivovaný nebo inhibovaný aptazym.
Výběr ligandu
Ligandem může být molekula nukleové kyseliny, protein, polysacharid či cukr, nebo organická či anorganická molekula. Povaha ligandu může být vybrána tak, aby byl dodáván exogenně,
4» « «4 44 » 4» 4¼ • · 4 * 4 4 4 · • · · · · 4 φ · «
44·· 44·· 4 4 4 4 •4 444 444
4 4 4 4 4 4 »4 A f * 4 Γ 4 4 takže to může být nějaká netoxická molekula nebo léčivo, které snadno vstupuje alespoň do buněk transfekovaných transgenem. Může být též navržen zcela endogenní systém, v němž řídícím ligandem bude molekula (např. nějaký malý metabolit či makromolekula) přítomná uvnitř cílové buňky. V tomto případě může být ligandem molekula přítomná uvnitř populace cílových buněk a v zásadě chybějící (či přítomná v nízké koncentraci) v jiných buněčných populacích, čímž je zajištěna tkáňová selektivita jeho exprese. Ligandem může být zejména molekula přítomná v cílové buněčné populaci, která je v přímém či nepřímém vztahu k patologickému jevu nebo stavu, jenž má být korigován, a v zásadě nepřítomná v buňkách či tkáních, jež tímto patologickým stavem nejsou postiženy. Aktivita liganddependentní samoštěpící nukleové kyseliny je pak závislá na její vazbě k danému metabolitu či makromolekule. Je-li liganddependentní samoštěpící nukleová kyselina inaktivována daným metabolitem či makromolekulou (např. patogenním proteinem), tj. neštěpí-li se v jeho přítomnosti, exprese genu je pak omezena na buňky, které exprimují metabolitu či makromolekuly, tj . na populaci (mezi příklady takových molekuly p53, aktivované onkogeny apod.). Dalšími příklady potenciálních ligandů jsou antibiotika (např. doxycyklin, pefloxacin aj.), molekuly aplikované lidským jedincům (jako léčiva, adjuvans, substituenty apod.) nebo např. jakékoli molekuly, jejichž užití by nebylo pro lidské jedince škodlivé. Daný proces vyžaduje vysokou specificitu molekulového rozpoznávání mezi aptazymem a ligandem. Takové specificity může být v zásadě dosaženo užitím aptamerů nukleových kyselin (Famulok, M.; Curr. Opin. Struct. Biol. (1999); 9: 324-329).
dostatečné postiženou ligandů patří množství buněčnou mutované • · » · · ·· ···· současné knihoven
Výběr aptazymu
Aptazymy schopné ligand-dependentního samoštěpení lze připravit a izolovat in vitro evolucí a selekcí. Tento způsob je příbuzný technologii SELEX (patent USA 5270163, zahrnut formou odkazu), což je technika umožňující prohledávání vysoce variabilních kombinatorních různých molekul RNA či DNA (jednovláknových či dvouvláknových DNA) . Těmito charakteristikami mohou být i) katalytická aktivita nukleové kyseliny, ii) schopnost nukleové kyseliny tvořit s požadovanou cílovou molekulou specifický komplex s vysokou afinitou a selektivitou.
Uvedený způsob se liší od dříve popsaných metod pro selekci alosterických ribozymů (WO94/13791; WO98/08974).
Konkrétněji, způsob přípravy popsaný v tomto vynálezu (viz obr. 3A a 3B) zahrnuje:
1. Přípravu množiny molekul různých dvouvláknových deoxyribonukleových kyselin (DNA), kde nejméně část sekvence v molekule je náhodnou či částečně náhodnou sekvencí, takže v dané množině molekul je tato sekvence pro různé molekuly odlišná. Obvykle lze připravit náhodnou sekvenci např. pomocí syntetizátoru nukleových kyselin,
2. přepis této množiny molekul DNA na množinu molekul ribonukleové kyseliny (RNA) za podmínek, v nichž by nemělo dojít k samoštěpení: v přítomnosti ligandu pro selekci samoštěpících sekvencí nukleových ligandem, nebo v nepřítomnosti samoštěpících sekvencí nukleových ligandem,
3. zakotvení všech molekul RNA dané množiny na pevný nosič za podmínek, kdy by nemělo dojít k samoštěpení (v přítomnosti či nepřítomnosti ligandu) kyselin ligandu kyselin inhibovaných pro selekci aktivovaných
4. inkubaci dané množiny molekul RNA v přítomnosti či nepřítomnosti ligandu za podmínek, kdy by nemělo dojít k samoštěpení (v přítomnosti či nepřítomnosti ligandu),
5. separaci molekul RNA zakotvených na pevném nosiči od molekul RNA, které vznikly samoštěpením a jsou přítomny v kapalné fázi. Denaturaci a promytí molekul RNA zakotvených na pevném nosiči,
6. opakování kroků 3 až 5 v několika cyklech, tj. cca 1 až 50 cyklech, aby byly odstraněny sekvence RNA schopné samoštěpení v nepermisivních podmínkách, byť s nízkou účinností danou zaujímáním řady neproduktivních konformací,
7. přidání či odstranění daného ligandu k danému souboru molekul a inkubace za podmínek umožňujících samoštěpení, a
8. separaci dané množiny molekul RNA na ty, které vykazují samoštěpící schopnost (přítomných v kapalné fázi) a na ty, jež ji nevykazují (zakotvených na pevném nosiči), k získání první selektované množiny molekul RNA s ligand-dependentní samoštěpící schopností.
Ve výhodném uspořádání tohoto vynálezu tento způsob dále zahrnuje:
9. Reverzní transkripci první selektované množiny molekul RNA na množinu jednovláknových komplementárních molekul DNA (cDNA) a amplifikaci (např. pomocí PCR) této množiny jednovláknových molekul DNA na množinu dvouvláknových molekul DNA, a
10. opakování kroků 2 až 9 v několika cyklech, např. v 10 až 100 cyklech, k získání daných aptazymů.
Tento způsob může být též využit k přípravě aptamerů, tj. sekvencí RNA vázajících ligand.
V jednom provedení tohoto vynálezu mají molekuly daného souboru zcela náhodnou sekvenci s výjimkou dvou krátkých • ·
přilehlých úseků, které obklopují promotor pro RNA polymerázu a místa nasednutí amplifikačních primerů.
V dalším provedení tohoto vynálezu je množina molekul připravena podle známé ribozymové sekvence. Takové molekuly se mohou skládat např. z konstantní sekvence odvozené od ribozymu spojené s náhodnou či částečně náhodnou sekvencí.
Počet náhodných nukleotidů není přesně určen. Obecně však náhodná sekvence obsahuje 10 až 300 nukleotidů, výhodné je 20 až 200, nej výhodnější je však 20 až 180 nukleotidů. Ačkoli je zde tato sekvence nazývána „náhodnou, rozumí se tím, že sekvence je náhodná pouze v původním výběru, avšak výsledek selekčního procesu není náhodný a zahrnuje specifické sekvence vykazující ligand-dependentní samoštěpící aktivitu.
Výchozí množina může obsahovat různý počet molekul DNA. V konkrétním případě může výchozí množina obsahovat až 102° molekul či více. Typická množina obsahuje 104 až 1016 molekul.
Je třeba upřesnit, že výše popsaný způsob může být využit k přípravě množin různých typů molekul DNA, včetně např. knihoven genomové DNA, cDNA či RNA.
Během jednotlivých selekčních kroků je žádoucí pracovat v podmínkách napodobujících buněčné prostředí, ve kterém bude aptazym nakonec použit. Např. pokud má být aptazym využit pro produkci proteinů v savčích buňkách, má tomu odpovídat iontové složení selekčního média a teplota má být nastavena na 37°C.
V každém selekčním a amplifikačním kroku je výhodné postupně zvyšovat selekční prahové hodnoty. Např. v každém postupném evolučním kroku in vitro lze užít nižší a nižší koncentrace ligandu, takže výsledkem je výběr typu molekul se zvyšující se afinitou k požadovanému ligandu. Frekvence a doba inkubací v krocích 3 až 5 (nepermisivní podmínky) může být postupně zvyšována, čímž lze zvyšovat kontrolu ligandu nad
.... .... · · · ·
Λ · · · · * ·
.............
samoštěpícími sekvencemi nukleové kyseliny. Doba trvání inkubace v kroku 7, za podmínek umožňujících samoštěpení, může být postupně zkracována, čímž se selektují molekuly s vyšší štěpnou rychlostí.
Navíc lze do množiny molekul DNA selektované během kroku 9 vnášet mutace amplifikaci (např. pomocí PCR) v mutagenních podmínkách. Tento mutagenní krok rozšiřuje sekvenční různorodost v selektované množině molekul.
Výběr kazety pro genovou expresi řízenou ligandem
Selekce aptazymu in vitro obvykle poskytne soubor řady sekvencí, které vykazují požadovanou schopnost liganddependentního samoštěpení. Vyselektované aptazymy je pak možno klonovat a určit jejich přesnou sekvenci. Toho může být dosaženo ligací molekul souboru dvouvláknových DNA kódujících aptazymy s odpovídajícím linearizovaným plasmidovým vektorem a transformací bakterií výslednými cirkularizovanými plasmidovými vektory (Sambrook et al (1989) . Molecular cloning, a laboratory manual, Second Edition, N. Ford, ed., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Klonované plasmidy obsahující aptazymy mohou být sekvenovány metodou popsanou Sangerem et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) s využitím soupravy Applied Biosystems podle návodu výrobce. Obvykle je sekvenováno 10 až 1000 klonů, mezi nimiž je možno nalézt řadu různých skupin molekul vykazujících požadovanou vlastnost.
Poté je třeba vyselektovat takové aptazymy, které umožňují ligand-dependentní expresi reportérového genu v cílových buňkách. Kazety pro expresi reportérových genů které je nesou, lze připravit standardními biologie (Sambrook et al. (1989) a vektory, technikami
Molecular molekulární cloning, a laboratory manual, Second Edition, N. Ford, ed., • ·
Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Cílové buňky jsou transfekovány dvěma reportérovými geny; reportérový gen (1) obsahuje sekvenci in vitro vyselektovaného aptazymu uvnitř alespoň jedné oblasti UTR, a reportérový gen (2) aptazym neobsahuje. Obě kultury buněk jsou kultivovány jednak v přítomnosti a jednak v nepřítomnosti ligandu. Hodnotí se poměr exprese reportérového genu (1) a reportérového genu (2) v přítomnosti a nepřítomnosti ligandu. Pokud má být produkce proteinu potlačena, je vybrán klon aptazymu s nej nižší hodnotou tohoto poměru a pokud má být produkce proteinu vyvolána, je vybrán klon s nejvyšším tímto poměrem.
Předkládaný vynález lze použít k řízení produkce proteinů in vitro, in vivo či ex vivo v různých typech buněk.
Z tohoto hlediska tento vynález spočívá ve způsobu řízení produkce proteinu, polypeptidu či peptidů kódovaného genem, kterýžto způsob zahrnuje vložení sekvence nukleové kyseliny, udělující RNA transkribované z daného genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost, do nejméně jedné z netranslatovaných oblastí daného genu.
V určitém provedení poskytuje tento vynález způsob odstranění čepičkové struktury z 5-konce a/nebo póly(A) z 3-konce pre-mRNA či mRNA genu, jehož exprese má být řízena, v závislosti na ligandu. Toho lze dosáhnout vložením sekvence poskytující schopnost ligand-dependentního samoštěpení transkribované RNA do alespoň jedné z oblastí UTR daného genu.
Tento vynález tedy také spočívá ve způsobu odstranění čepičkové struktury z 5-konce a/nebo póly(A) z 3-konce pre-mRNA či mRNA transkribované z genu, kterýžto způsob zahrnuje vložení sekvence nukleové kyseliny poskytující RNA transkribované z daného genu schopnost liganddependentního samoštěpení.
• ·
V určitém provedení je uvedeným způsobem odstraněna čepičková struktura z 5'-konce pre-mRNA či mRNA transkribované z daného genu a sekvence nukleové kyseliny je vložena alespoň do jednoho místa v 5'-netranslatované oblasti genu.
V jiném určitém provedení je uvedeným způsobem odstraněna struktura póly(A) z 3'-konce pre-mRNA či mRNA transkribované z daného genu a sekvence nukleové kyseliny je vložena alespoň do jednoho místa v 3'-netranslatované oblasti genu.
Předkládaný vynález se také týká způsobu řízené produkce proteinu, polypeptidu či peptidu v buňce, který zahrnuje kroky (i) vnesení modifikovaného genu kódujícího protein, polypeptid či peptid do buňky, přičemž daný modifikovaný gen obsahuje, vloženou do své netranslatované oblasti (UTR), sekvenci nukleové kyseliny poskytující molekule RNA transkribované z daného genu schopnost ligand-dependentního samoštěpení a (ii) působení na buňku prostřednictvím přítomnosti či nepřítomnosti ligandu.
V dalším určitém provedení modifikovaný gen obsahuje, vloženou do své netranslatované oblasti (UTR), sekvenci nukleové kyseliny poskytující molekule RNA transkribované z daného genu schopnost ligandem-aktivovaného samoštěpení, a produkce je potlačena působením ligandu na buňku, zatímco produkce je obnovena (či zvýšena) odstraněním ligandu (nebo omezením kontaktu s ním či jeho nepřítomností).
V jiném určitém provedení modifikovaný gen obsahuje, vloženou do své netranslatované oblasti (UTR), sekvenci nukleové kyseliny poskytující RNA molekule transkribované z daného genu schopnost ligandem-inhibovaného samoštěpení, a produkce je zvýšena působením ligandu na buňku, zatímco produkce je snížena (či potlačena) odstraněním ligandu (nebo omezením kontaktu s ním či jeho nepřítomností).
·· ·· • · 9 · • · · ·
9999
U výše popsaného způsobu provedení může být ligand buď dodán exogenně do buňky nebo může být endogenní složkou buňky, jak bylo popsáno výše. Ligandem tedy může být molekula, která se preferenčně vyskytuje v buňkách, v nichž je produkce proteinu, polypeptidu či peptidu zamýšlena (a která se v zásadě nevyskytuje, nebo je exprimována v nižších koncentracích v jiných buňkách či tkáních).
Výše popsaný způsob provedení může být využit k produkci proteinu, polypeptidu či peptidu v buňce (nebo buněčné populaci či kultuře) in vitro či ex vivo.
Tento způsob provedení lze také využít k produkci proteinu, polypeptidu či peptidu v buňce, tkáni či orgánu in vivo.
Výše zmíněnou buňkou může být např. prokaryotická buňka, eukaryotická buňka, savčí buňka či rostlinná buňka. Může být také použita tkáň, orgán, izolovaná buněčná kultura, stabilizovaná buněčná linie či primární kultura. Výhodné je využít savčí buňky, zejména myší či lidské, nejlépe ex vivo či in vivo. Pro účely in vivo může být gen vnesen do buněk zavedením do organismu a ligand může být dodán exogenní cestou nebo přímo obsažen v buňce. Gen může být také vnesen do vektoru typu plasmidu, viru, kosmidu, umělého chromozomu či jejich kombinace. Výhodnými vektory jsou plasmidy a viry, jako např. adenoviry, retroviry, AAV, HSV, HIV apod.
Předkládaný vynález také vymezuje a nárokuje kombinace ligandu a modifikovaného genu (nebo vektoru tyto obsahující), jak bylo popsáno výše, a to k současnému, samostatnému či postupnému užití.
Výhodné využití zahrnuje:
ligand a modifikovaný gen, kde samoštěpení RNA transkribované z dané sekvence je daným ligandem inhibováno;
• « 444· • «···
44
4 4 4
4 ♦
4 4 4
4 4
4444 ligand a modifikovaný gen, kde samoštěpení RNA transkribované z dané sekvence je daným ligandem aktivováno.
Ve výhodném provedení je ligand vybrán ze skupiny molekul nukleových kyselin, proteinů, polysacharidů, cukrů a organických či anorganických molekul.
Další aspekty a výhody předkládaného vynálezu budou popsány v následujících příkladech, které je třeba považovat pouze za ilustrativní a které neomezují rozsah tohoto vynálezu.
Popis obrázků
Obr. 1:
Popis ligand-dependentního řízení produkce proteinu podle předkládaného vynálezu
Obr. 2A, 2B a 2C:
Ukázka, že samoštěpící sekvence RNA (např. „hammerhead sekvence ribozymu) vložená do oblasti UTR na pre-mRNA může řídit genovou expresi. Obr. 2A: produkce reportérového proteinu bez ribozymové sekvence, s inaktivní ribozymovou sekvencí či s aktivní ribozymovou sekvencí v jedné z oblastí UTR daného genu. Obr. 2B: místo vložení ribozymových sekvencí (štěpná místa pro restrikční enzymy) uvnitř pre-mRNA reportérového genu. Obr. 2C: sekvence aktivního a neaktivního ribozymu.
Obr. 3A a 3B:
Obr. 3A: schéma selekčního postupu pro samoštěpící sekvence RNA inhibované ligandem.
• «
Obr. 3B: schéma selekčního postupu pro samoštěpící sekvence RNA aktivované ligandem.
Obr. 4:
Schéma plasmidu využitých ke klonování souboru aptazymů.
Obr. 5:
Návrh výchozí množiny molekul. Je ukázána úplná sekvence dvouvláknových molekul DNA využitých v prvním selekčním cyklu, jakož i vzájemné polohy a sekvence různých syntetických primerů.
Obr. 6:
Časový průběh dvou selekcí. U obou selekcí je ukázán procentuální podíl RNA vymytých v každém selekčním cyklu pomocí doxycyklinu nebo pefloxacinu jako ligandu. Prázdný prostor mezi oběma cykly naznačuje zvýšení selekčního tlaku (buď změnou inkubačních dob a/nebo snížením koncentrace ligandu (viz Tab. 1)).
Obr. 7:
Kinetika samoštěpení selektovaného souboru molekul RNA za přítomnosti zvyšujícího se množství doxycyklinu. Levý graf: soubor po 10. selekčním cyklu; pravý graf: po 13. selekčním cyklu.
Obr. 8:
Samoštěpící aktivita aptazymů citlivého na doxycyklin a převedení aptazymů na aptamer. Aptazymová RNA byla inkubována s 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, při 37°C, samoštěpení bylo zahájeno přidáním 10 mM MgCl2 a reakce byla sledována po dobu 3 minut. Ve vyznačenou dobu byl do štěpné reakce přidán 200 nM • · • to to • ···· • to ·· toto • · · • · • * ··· ···· doxycyklin (Dox) či tetracyklin (Tet) . Samoštěpící reakce byla provedena bez přidáni RNA (levý graf: kontrola), s přidáním 1 μΜ a 2 μΜ aptameru odvozeného od aptazymu (2. a 3. graf zleva: 1 μΜ aptamer, 2 μΜ aptamer) a s přidáním 1 μΜ a 2 μΜ nepříbuzné RNA (4. a 5. graf zleva: 1 μΜ nepříbuzné RNA, 2 μΜ nepříbuzné RNA) .
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Selekce aptazymu inhibovaných doxycyklinem a pefloxacinem
Byla provedena selekce in vitro za účelem vybrání aptazymu inhibovaných (tj . neštšpených v jejich přítomnosti) doxycyklinem nebo pefloxacinem (označovaným v částech i) až iv) jako ligand) . Podmínky pro obě selekce byly kromě použitého ligandu totožné.
i. Příprava výchozí degenerované množiny molekul
Výchozí degenerovaná množina molekul byla připravena standardní chemickou syntézou DNA pomocí systému pro syntézu nukleových kyselin Expedite (Millipore). Oligonukleotidy byly purifikovány na denaturačních polyakrylamidových gelech. Byly syntetizovány tyto primery:
Výchozí (variabilní) primer:
5'-CGCGTTGTGTTTACGCGTCTGATGAGT-N(40)-ACGAAACTACCTCGAGACGT (SEK. ID. Č. 1)
Primer 1:
5'-CGCGTTGTGTTTACGCGTCTGATG (SEK. ID. Č. 2) * φ φ
• ΦΦΦΦ ·<
φ φ
φφ φ φ « φ φφ ΦΦΦ·
Primer 2:
5'-AGCTGGTACCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCGGTAGTCACGCGTTGTGTTTA CGCGTCTGATG (SEK. ID. Č. 3)
Primer 3:
5'-ACGTCTCGAGGTAGTTTCGT (SEK. ID. Č. 4)
Po přečištění bylo získáno 6 nmol výchozího primeru (4.1015 molekul). Celková DNA byla amplifikována pomocí PCR s užitím primerů 1 a 3 jak bylo popsáno (Bartel D.P. & Szostak J.W.; Science (1993) 261: 1411-1418). Další amplifikační krok byl proveden za stejných podmínek s užitím 6 nmol preamplifikovaného dvouvláknového produktu jako templátu a primerů 2 a 3. Konečné molekuly DNA měly tyto charakteristiky (od 5' do 3'): restrikční místo pro KpnI, promotor RNA polymerázy T7, restrikční místo pro Sací, „hammerhead ribozymovou sekvenci obsahující 40 náhodných nukleotidů obsažených v doméně šroubovice II, restrikční místo pro Xhol (viz obr. 5).
Tato knihovna DNA byla použita při výchozím selekčním cyklu in vitro jako templát pro RNA polymerázu T7.
ii. Obecné schéma selekce
Schéma použité selekce je znázorněno na obr. 3A a 3B. Během selekce bylo provedeno několik modifikací daného selekčního schématu, které jsou detailně popsány níže (oddíl iii) .
a) Transkripce a imobilizace na koloně
Standardní transkripční reakční směsi obsahovaly: 250 jednotek RNA polymerázy T7 (Stratagene), pufr T7 (Stratagene), 2,5 mM dNTP všech typů, 20 mM GMPS, 20 μθί α32Ρ GTP, RNasin (50 jednotek), ligand (1 mM). Transkripční reakční směs byla inkubována přes noc při 37°C. Neštěpené transkripty RNA byly
·· ··
•9 ··«· poté vyčištěny na 8% polyakrylamidovém gelu. Po purifikaci byl k RNA přidán Iodo-Acetyl-LC-Biotin (Pierce - 200násobný nadbytek) na 90 min při laboratorní teplotě. RNA konjugovaná s biotinovou kotvou pak byla vyčištěna na gelu za stejných podmínek jak bylo popsáno výše a inkubována 30 min při laboratorní teplotě se streptavidin-agarózou (Pierce). Materiál na koloně byl pak 6x promyt střídavě těmito roztoky: 1 ml promývací pufr A (WA; 25 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 5 mM EDTA), promývací pufr B (WB; 3 M močovina, 5 mM EDTA) a voda. Nakonec byl pětkrát promyt vodou.
b) Negativní selekce
Imobilizovaná RNA byla inkubována při 37°C po dobu 2 až 4 hod se selekčním pufrem (SB; 40 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl, 10 mM sperdimin, 8 mM MgCl2) za přítomnosti ligandu (1 mM - 1 μΜ). Inkubace byla zahájena přidáním hořčíku. Po 5. cyklu byla inkubace v průběhu prvních 2 h 30 min lOkrát přerušena a kolona byla dvakrát promyta 1 ml WB (denaturující podmínky) a třikrát promyta vodou. Materiál na koloně byl pak důkladně promyt (6x 1 ml WA - WB - H2O; 5x 1 ml H2O) .
c) Pozitivní selekce
Pozitivní selekce byla provedena za podobných podmínek jako negativní selekce, ale bez ligandu. Doba inkubace byla výrazně kratší (10 až 1 min). Štěpené sekvence nukleových kyselin byly vymyty 1 ml WB. Vymytá RNA byla vyčištěna dvěma extrakcemi směsí fenolu a chloroformu a etanolovým srážením.
d) Reverzní transkripce a amplifikace
RNA byla nakonec reverzně transkribována DNA polymerázou Tth (Boehringer) a amplifikována reakcí PCR s užitím primerů 3 ·► *· « « · • * a 4 za standardních podmínek. Této templátová DNA bylo využito jako templátu pro RNA polymerázu T7 v dalším selekčním cyklu.
iii. Modifikace selekčního schématu v průběhu selekce
V průběhu selekce bylo provedeno v selekčním schématu několik modifikací (viz Tab. 1) . V prvním cyklu bylo užito 16 nmol RNA, aby byla zachována různorodost molekul daného souboru. Materiál kolony a promývací objemy byly upraveny tak, aby odpovídaly tomuto množství RNA. V pozdějších cyklech bylo množství RNA sníženo. Koncentrace ligandu a použité inkubační doby byly také upraveny, aby byla zvýšena stringence reakce. Po 10. a 13. selekčním cyklu byla provedena mutagenní reakce PCR za popsaných podmínek (Caldwell R.C. & Joyce G.F.; in: PCR Methods and Applications (1992) : 28-33) . Mutagenní PCR umožňuje získat více různorodých molekul RNA příbuzných selektovaným sekvencím.
iv. Obohacení selektovaného souboru molekul (obr. 6)
Eluční profily získané během selekce aptazymů inhibovaných doxycyklinem a aptazymů inhibovaných pefloxacinem byly velmi podobné, což naznačuje, že tento typ selekčního schématu je mimořádně robustní. První náznaky obohacení selektovaného souboru molekul byly pozorovatelné během 4. cyklu a byly potvrzeny během 5. cyklu. Kinetický experiment provedený se selektovaným souborem molekul však neukázal významný rozdíl mezi štěpením v přítomnosti a v nepřítomnosti ligandu. Navíc byla účinnost štěpení v tomto souboru molekul výrazně snížena ve srovnání s neselektovaným souborem (nepublikováno). Lze předpokládat, že tento výsledek je způsoben současným vyselektováním skupin molekul RNA vykazujících samoštěpící schopnost v nepermisivních podmínkách, byť s nízkou účinností danou zaujímáním řady neproduktivních konformací.
• »· »· w * • · » φ φ • φ «φφ ΦΦΦΦ φ* • t φφφ φ φφφ « φ · φφ φ «φ φφ • · · ί φ φ · φφφ * φφφ
Φφ ΦΦΦΦ
Aby byly odstraněny tyto nežádoucí molekuly, selekční schéma bylo modifikováno zařazením několika denaturačních kroků do negativní selekce (viz ii-b).
Během 7. cyklu bylo možno pozorovat další obohacení. Stringence selekce byla tedy zvýšena snížením koncentrace ligandu na 100 μΜ a eluční doby na 1 min. Po 3 cyklech bylo možno pozorovat další obohacení. V této fázi byla se selektovaným souborem molekul provedena mutagenní reakce PCR a selekční stringence se zvýšila desetinásobným snížením koncentrace ligandu. Po 3 cyklech bylo opět možno pozorovat obohacení souboru. Tento postup (mutagenní PCR - zvýšení selekční stringence - 3 selekční cykly) byl se selektovaným souborem molekul opakován a poskytl další obohacení souboru. Po této fázi byl proveden poslední cyklus s vysoce sníženou dobou vymytí (10 s), aby byly vybrány nej rychleji se štěpící sekvence nukleové kyseliny.
v. Kinetika souboru molekul (obr. 7)
Během selekce a po ní byly vybrané soubory molekul transkribovány za standardních podmínek (250 jednotek RNA polymerázy T7 (Stratagene), pufr T7 (Stratagene), 2,5 mM dNTP všech typů, 20 gCi a32P GTP, 50 jednotek RNasin, 1 mM ligand) . Neštěpené transkripty byly vyčištěny na gelu, defosforylovány telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Stratagene) a jejich 5'-konce radioaktivně značeny pomocí polynukleotidkinázy T4 (Stratagene) a γ32Ρ-ΑΤΡ. Radioaktivně značené molekuly RNA pak byly vyčištěny na gelu a inkubovány v koncentraci 10 nM v SB s různým množstvím ligandu při 37°C. Reakce byla zahájena přidáním hořčíku. V různých časových bodech byly odebrány alikvoty a smíchány s týmž objemem nanášecího pufru (9 M močovina, 5 mM EDTA) na ledu, aby byla reakce zastavena. Vzorky byly poté naneseny na 12% sekvenační gel a proužky toto·· • ·· ·· · ·· to to · to · · · · · • · to to to to · · • · ·· ······· · • ' · · · Λ · · ••••••to ·· · ·· odpovídající neporušeným (103 nt) či štěpeným (13 nt) sekvencím nukleové kyseliny byly kvantifikovány pomocí radiometru typu „phosphor imager (Molecular Dynamics).
Příklad 2
Selekce expresních kazet indukovaných v savčích buňkách doxycyklinem či pefloxacinem
Soubory molekul DNA získaných po 10., 13. a 16. selekčním cyklu jsou štěpeny restrikčními enzymy Xhol a KpnI. Plasmidy pNPGl a pNPG2 (obr. 4) jsou štěpeny týmiž enzymy a dané tři soubory DNA jsou ligovány s každým z obou plasmidů. Kmen E. coli DH5a je transfekován s každou ze šesti ligačních směsí standardním postupem (Sambrook et al. (1989). Molecular cloning, a laboratory manual, Second Edition, N. Ford, ed. , Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Pro každou transfekci je izolována stovka kolonií. Z každé z těchto kolonií je extrahována a purifikována plasmidová DNA. Aptazymy klonované v plasmidech jsou sekvenovány metodou podle Sangera et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74 (1977) 54635467) s využitím soupravy Applied Biosystems podle návodu výrobce.
Kultury lidských buněčných linií HeLa a HEK293 jsou transfekovány plasmidovou DNA spojenou do komplexů s lipofektaminem (Gibco-Life Sciences, Bethesda, MD USA) podle návodu výrobce (6 μΐ lipofektaminu na 1 μg DNA). V jedné sérii pokusů jsou buňky inkubovány s 10 μΜ doxycyklinem a 10 μΜ pefloxacinem a v další sérii pokusů jsou buňky inkubovány bez ligandu. 48 hod po transfekci jsou buňky lyžovány a je zaznamenána aktivita luciferázy Renilla a luciferázy světlušky
• · podle návodu výrobce (Promega, Madison, WI USA) . Je vypočítán poměr luciferázové aktivity světlušky (kontrolované aptazymem) a luciferázové aktivity Renilla (poměr R) pro oboje reakční podmínky (tj . v závislosti na plasmidu a ligandu) . Plasmidy poskytující nejvyšší produkci luciferázy světlušky za přítomnosti ligandu (doxycyklinu či pefloxacinu) a nejnižší produkci luciferázy světlušky v nepřítomnosti ligandu vykazují nejvyšší hodnotu poměru R. Tyto plasmidy jsou vybrány pro další využití v experimentech s přenosem genů, ve kterých má být produkce proteinu řízena doxycyklinem či pefloxacinem.
Příklad 3
Produkce proteinů vyvolaná doxycyklinem u myší pg plasmidové DNA plasmidů pNPGl či pNPG2 obsahujících aptazym (selektovaných dle příkladu 2) je injikováno do musculus tibialis cranialis (zadní končetiny) osmiměsíčních Balb/C myší a zadní končetiny jsou následně vystaveny elektroporaci k zesílení genového přenosu (Mír, L.M. et al.: P.N.A.S. USA (1999); 96(8):4262-7). Jedné skupině myší je v pitné vodě podáván doxycyklin (0.2 mg/ml), druhé skupině ne. Sedm dní po genovém přenosu jsou zvířata utracena a svaly musculus tibialis cranialis jsou odebrány. Svalová tkáň je suspendována v 1 ml lytického pufru (Dual-Luciferase reportér Assay System, Promega, Madison, WI USA) a homogenizována pomocí skleněných a keramických kuliček v homogenizátoru typu Fast-Prep (Bio 101, Vista, CA USA) . Aktivita luciferázy světlušky a Renilla je kvantifikována podle návodu výrobce Promega. Je srovnána produkce luciferázy světlušky syntetizované myšími buňkami (s působením doxycyklinu a bez • · · ··· ·ο ·· φφφφ · · φ ···« • · φ φ · · ·· · • φ φφ ······· · · • φ · · · · · ·
Φ Φ φ Φ Φ Φ Φ ·· Φ 9 · ΦΦΦΦ něj). Nerovnoměrnosti v účinnosti transfekce u jednotlivých zvířat mohou být kompenzovány srovnáním poměru produkce luciferázy světlušky a luciferázy Renilla u obou skupin. Tak lze ověřit, že produkce luciferázy v myších buňkách byla vyvolána doxycyklinem.
Příklad 4
Selekce aptamerů RNA vázajících doxycyklin (obr. 8)
Aptamery byly vybrány postupem popsaným v příkladu 1. Soubor molekul DNA byl vložen do plasmidu pNPG2 jako v příkladu 2. Některé klony byly sekvenovány metodou dle Sangera et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 54635467) pomocí soupravy Applied Biosystems podle návodu výrobce.
Klon 6 byl podroben další analýze. Sekvence DNA klonu 6 byla amplifikována pomocí PCR s užitím primerů 2 a 3 (příklad 1). Amplifikovaná sekvence (horní vlákno) je popsána níže:
AGCTGGTACCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCGGTAGTCACGCGTTGTGTTTACG
CGTCTGATGAGTGGTACAGTCCAGGGTGAAGTTCCAATTTTGAACACCTCCACGAAACTACC TCGAGACGT (SEK. ID. Č.5)
Dvakrát podtrženo: promotor RNA polymerázy T7
Podtrženo: náhodná sekvence výchozí množiny DNA (příklad
1)
Tučně: štěpné místo
Amplif i kovaná sekvence DNA (SEK. ID. Č. 5) byla transkribována RNA polymerázou T7 a výsledná RNA pak byla vyčištěna jako v příkladu 1. Sekvence RNA je následující (dále je označována jako aptazym):
GGAGCUCGGUAGUCACGCGUUGUGUUUACGCGUCUGAUGAGUGGUACAGUCCAGGGU
GAAGUUCCAAUUUUGAACACCUCCACGAAACUACCUCGAGACGU (SEK. ID. Č. 6) • »· 4 4 4 4 · • 4 « · · ♦ · · ♦ • · · · · · ·· • · ·· 4444444 «
4 4 4 4 4 4 44 4 44
Sekvence klonu 6 byla také amplifikována pomocí PCR s užitím primerů 3 a 4. Primer 4 a amplifikovaná sekvence jsou uvedeny níže:
Primer 4:
5'-AGCTGGTACCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCGGTAGTCACGCGTTGTGTTTA CGCGTCTGATG (SEK. ID. Č. 8)
Amplifikovaná sekvence:
agctggtacctaatacgactcactataggagctcggtagtGacgcgttgtgtttacg
CGTCTGATGAGTGGTACAGTCCAGGGTGAAGTTCCAATTTTGAACACCTCCACGAAACTACC TCGAGACGT (SEK. ID. Č.7)
Dvakrát podtrženo: promotor RNA polymerázy T7
Podtrženo: náhodná sekvence výchozí množiny DNA (příklad
1)
Tučně: mutovaná báze
Primerem 4 je do sekvence vnesena mutace z C na G, která inaktivuje samoštěpící schopnost „hammerhead ribozymů, ale minimálně přitom zasahuje do jejich terciární struktury (Baidya, N. and Uhlenbeck, O.C.; Biochemistry (1997) 36: 11081114) .
Amplif ikovaná sekvence DNA (SEK. ID. Č. 7) byla transkribována RNA polymerázou T7 a výsledná RNA pak byla vyčištěna jako v příkladu 1. Sekvence RNA je následující (dále je označována jako aptazym):
GGAGCUCGGUAGUGACGCGUUGUGUUUACGCGUCUGAUGAGUGGUACAGUCCAGGGU
GAAGUUCCAAUUUUGAACACCUCCACGAAACUACCUCGAGACGU
Pokus popsaný na obr.
ukazuje, že 1) daný aptazym má specificky inhibována doxycyklinu, inhibuje samoštěpící aktivitu, která je doxycyklinem (tetracyklin, izomer štěpení mnohem slaběji) a 2) daný aptamer je schopen zrušit inhibici samoštěpení doxycyklinem, ale ne inhibici samoštěpení tetracyklinem. Vysvětluje se to tím, že aptamer vytěsňuje daný aptazym z vazby s doxycyklinem. Je to důkaz, že mutací nukleotidu C na G ve směru 5 od štěpného místa se aptazym mění v ligand RNA, který se specificky váže na doxycyklin.
« · · · · · · · · • · · · · ······· · · ·
Tabulka
| 17 | |||||||
| kD | 1-1 | ||||||
| o | |||||||
| g | 2 | ||||||
| LT) | Ch | i | |||||
| 1—1 | O | rN | |||||
| o | |||||||
| i—1 | |||||||
| i—1 | G | ||||||
| co | mi | * | |||||
| G | |||||||
| 2 | O | •H | |||||
| CN | o | zt | e | ||||
| ,—| | £ Ch | 10 | + | i—I | |||
| 11 | o o | G H g | |||||
| LT) | X | ||||||
| 10 | 15 | ||||||
| σι | o | X | |||||
| O | |||||||
| o | |||||||
| 00 | 1—f | ||||||
| Γ'-' | |||||||
| co | i—1 | ||||||
| o | |||||||
| fci | |||||||
| LQ | g | G | |||||
| •H | |||||||
| 1-1 | e | ||||||
| LT) | |||||||
| χ; | |||||||
| co | 1 | ||||||
| CN | 1—í | ||||||
| 1—1 | G | ||||||
| 0 | x | •H | |||||
| i—1 | g | £ | |||||
| G | C\J | ||||||
| o | |||||||
| co | tH | ||||||
| 1—1 | |||||||
| Ή | Ή | ||||||
| G | G | ||||||
| > | > | ||||||
| •H | Ή | ||||||
| P | P | ||||||
| fÚ | •H | ||||||
| Cn | N | ||||||
| Φ | O | ||||||
| Ό a | G | Ch | |||||
| <ΰ | |||||||
| Cn | (0 | al | |||||
| •H | X | X | |||||
| r—j | o | o | ctí | ||||
| < | Ό | X | u | ||||
| s | Φ | Ch | |||||
| íh | υ | ||||||
| ω | (0 | Ή | Ή | Ή | |||
| o | Ή | 0 | G | G | G | ||
| r—1 | í> | P | >U | Φ | X | Φ | G |
| X | p | G | rt) | O | Φ | υ | Φ |
| >1 | ω | a? | X | X | X | X | Cn |
| O | >N | υ | G | Φ | G | φ | Φ |
| o | G | X | 1—1 | X | l—l | P | |
| £ | 0 | G | Φ | G | Φ | G | |
| 2 | μ; | H | « | HJ | tn | 2 |
ί » »« ·· · «· ·* «··· ··· · ♦ · * • « «··· · · · φ 9 99 9999999 9 ·
9 9 9 9 9 9 9
999 9999 99 * ·♦ ····
SEZNAM SEKVENCÍ <160> 9 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 87 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 1 cgcgttgtgt ttacgcgtct gatgagtnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnacg aaactacctc gagacgt 87 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 2 cgcgttgtgt ttacgcgtct gatg 24 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 3 agctggtacc taatacgact cactatagga gctcggtagt cacgcgttgt gtttacgcgt 60 ctgatg 6 6 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 4 acgtctcgag gtagtttcgt 20 <210> 5 <211> 128 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 5 agctggtacc taatacgact cactatagga gctcggtagt cacgcgttgt gtttacgcgt 60 ctgatgagtg gtacagtcca gggtgaagtt ccaattttga acacctccac gaaactacct 120 cgagacgt 128 <210> 6 <211> 101 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 6 ggagcucggu agucacgcgu uguguuuacg cgucugauga gugguacagu ccagggugaa 60 guuccaauuu ugaacaccuc cacgaaacua ccucgagacg u 101 <210> 7 <211> 128 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 7 agctggtacc taatacgact cactatagga gctcggtagt cacgcgttgt gtttacgcgt 60 ctgatgagtg gtacagtcca gggtgaagtt ccaattttga acacctccac gaaactacct 120 cgagacgt 128 <210> 8 <211> 66 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 8 • · ♦·♦· 4 · * • 4 4 · ·····»« · ·
4 4 4 4 4 · ·
444 ««·· *· · ·♦ 4444 agctggtacc taatacgact cactatagga gctcggtagt cacgcgttgt gtttacgcgt 60 ctgatg 66 <210> 9 <211> 101 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 9 ggagcucggu agugacgcgu uguguuuacg cgucugauga gugguacagu ccagggugaa 60 guuccaauuu ugaacaccuc cacgaaacua ccucgagacg u 101
Claims (4)
1. Modifikovaný gen kódující RNA, protein, polypeptid či peptid, přičemž modifikovaný gen obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, vloženou do netranslatované oblasti genu (UTR), kterážto sekvence uděluje molekule RNA transkribované z genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost.
2. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž genem je genomová DNA.
3. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž genem je cDNA.
4. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž genem je syntetická DNA obsahující alespoň jednu netranslatovanou oblast.
5. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž netranslatované oblast je vybrána z oblastí 5-UTR, 3'-UTR a intronů.
6. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž netranslatované oblast je přirozeně obsažená v genu nebo byla do genu vložena.
7. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž sekvence nukleové kyseliny uděluje RNA transkribované z genu ligandemaktivovanou samoštěpící schopnost.
8. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž sekvence nukleové kyseliny uděluje RNA transkribované z genu ligandeminhibovanou samoštěpící schopnost.
9. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž sekvence nukleové kyseliny je odvozena od „hammerhead ribozymů, ribozymů viru • ·« ·< · ·* ·· ·« * · t ♦ « · φ * * • · · · · · * · · • ♦·····♦··»· · • · «·· · · · ··· «··· ·· · ·· ···* hepatitidy delta, RNA Neurospora VS, vlásenkových ribozymů, intronů skupiny I, intronů skupiny II a RNázy P.
10. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž sekvence nukleové kyseliny je umělá DNA kódující aptazym, který je možno získat in vitro evolucí a selekcí.
11. Modifikovaný gen podle nároku 1, přičemž ligand je vybrán z nukleových kyselin, proteinů, polysacharidů, cukrů, organických a anorganických molekul.
12. Modifikovaný gen podle nároku 1, obsahující navíc transkripční promotor.
13. Vektor obsahující modifikovaný gen podle nároku 1 nebo 12.
14. Způsob řízení produkce proteinu, polypeptidu či peptidu z genu, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se do alespoň jedné netranslatované oblasti genu vloží sekvence nukleové kyseliny udělující RNA transkribované z genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost.
15. Způsob modifikace genu, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se do alespoň jedné netranslatované oblasti genu vloží sekvence nukleové kyseliny udělující RNA transkribované z genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost.
16. Způsob odstranění čepičkové struktury z 5'-konce a/nebo úseku póly(A) z 3'-konce pre-mRNA nebo mRNA transkribované z genu, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se do alespoň jedné netranslatované oblasti genu vloží • a • * 4 · 4 · · ♦ *
4 · · · 4 4··* * · · ·
4 · · 4 · · · · ··· »·♦· ·· 4 ·· ···* sekvence nukleové kyseliny udělující RNA transkribované z genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost.
17. Způsob podle nároku 16, sloužící k odstranění čepičkové struktury z 5'-konce pre-mRNA nebo mRNA transkribované z genu, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se do alespoň 5'-netranslatované oblasti genu vloží sekvence nukleové kyseliny udělující RNA transkribované z genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost.
18. Způsob podle nároku 16, sloužící k odstranění úseku póly(A) oblasti z 3'-konce pre-mRNA nebo mRNA transkribované z genu, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se do alespoň 3'-netranslatované oblasti genu vloží sekvence nukleové kyseliny udělující RNA transkribované z genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost.
19. Způsob řízené produkce proteinu, polypeptidu či peptidu v buňce, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy: (i) do buňky se vnese modifikovaný gen kódujícího protein, polypeptid či peptid, přičemž modifikovaný gen obsahuje, vloženou do netranslatované oblasti (UTR) genu, sekvenci nukleové kyseliny udělující RNA transkribované z genu ligand-dependentní samoštěpící schopnost, a (ii) na buňku se působení prostřednictvím přítomnosti či nepřítomnosti ligandu.
20. Způsob řízené produkce proteinu, polypeptidu či peptidu v buňce, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy: (i) do buňky se vnese modifikovaný gen kódujícího protein, polypeptid či peptid, přičemž modifikovaný gen obsahuje, vloženou do netranslatované oblasti (UTR) genu, sekvenci nukleové kyseliny udělující RNA transkribované • · 9 •··· · · z genu ligandem-aktivovanou samoštěpící schopnost, a (ii) na buňku se působí přítomností ligandu, což vede k potlačení produkce, nebo nepřítomností ligandu, což vede ke zvýšení produkce.
21. Způsob řízené produkce proteinu, polypeptidu či peptidu v buňce, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy: (i) do buňky se vnese modifikovaný gen kódujícího protein, polypeptid či peptid, přičemž modifikovaný gen obsahuje, vloženou do netranslatované oblasti (UTR) genu, sekvenci nukleové kyseliny udělující RNA transkribované z genu ligandem-inhibovanou samoštěpící schopnost, a (ii) na buňku se působí přítomností ligandu, což vede ke zvýšení produkce, nebo nepřítomností ligandu, což vede ke snížení produkce.
22. Způsob podle nároků 19, 20 nebo 21, vyznačující se tím, že ligand se exogenně dodává do buňky.
23. Způsob podle nároků 19, 20 nebo 21, vyznačující se tím, že ligandem je patogenní či nepatogenní endogenní složka buňky.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že ligandem je molekula obsažená výhodně v buňkách, v nichž se produkce proteinu, polypeptidu či peptidu provádí.
25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že ligandem je molekula obsažená v cílových buňkách, v nichž se produkce proteinu, polypeptidu či peptidu provádí, zatímco v jiných buňkách tato molekula chybí nebo je obsažena v malém množství.
» · • · ···· »· « · · · · · ··· ···· 99 ♦ »* ·»··
26. Způsob podle nároků 19, 20 nebo 21, vyznačující se tím, že se produkuje protein, polypeptid či peptid v buňce in vitro nebo ex vivo.
27. Způsob podle nároků 19, 20 nebo 21, vyznačující se tím, že se produkuje protein, polypeptid či peptid v buňce, tkáni nebo orgánu in vivo.
28. Způsob podle nároků 19, 20 nebo 21, vyznačující se tím, že buňka se vybere z buněk prokaryotických, eukaryotických, savčích či rostlinných.
29. Způsob podle nároků 19, 20 nebo 21, vyznačující se tím, že gen je součástí vektoru, který se vybere z vektoru typu plasmidu, viru či jejich kombinace.
30. Kombinace ligandu a modifikovaného genu podle nároku 1, a to pro současné, oddělené či postupné použití.
31. Kombinace ligandu a modifikovaného genu podle nároku 30, kde samoštěpení RNA transkribované ze sekvence je ligandem inhibováno.
32. Kombinace ligandu a modifikovaného genu podle nároku 30, kde samoštěpení RNA transkribované z genu je ligandem aktivováno.
33. Kombinace podle nároků 30, 31 nebo 32, kde ligand je vybrán ze skupiny obsahující molekuly nukleové kyseliny, proteiny, polysacharidy, cukry a organické nebo anorganické molekuly.
• 9 ·«
9 9 9
99 9 9 9 9 9 9
9 9 9999 99 ·
9 9999 9999 999 9
99 999 99«
999 -9999 99 9 ·· 9999
34. Způsob in vitro evoluce a selekce pro přípravu liganddependentní samoštěpící sekvence RNA, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:
a) Připraví se množina různých molekul dvouvláknové deoxyribonukleové kyseliny (DNA), přičemž alespoň část sekvence molekul této množiny je náhodnou nebo částečně náhodnou sekvencí, takže tato část sekvence se v různých molekulách množiny liší,
b) provede se transkripce množiny molekul DNA na množinu molekul ribonukleové kyseliny (RNA) za podmínek, kdy nedochází k samoštěpení: za přítomnosti ligandu pro selekci samoštěpící sekvence nukleové kyseliny, která je ligandem-inhibovaná, nebo v nepřítomnosti ligandu pro selekci samoštěpící sekvence nukleové kyseliny, která je ligandem-aktivovaná,
c) zakotví se (imobilizují) všechny molekuly množiny RNA na pevném nosiči za podmínek, kdy nedochází k samoštěpení (v přítomnosti či nepřítomnosti ligandu),
d) množina molekul RNA se inkubuje v přítomnosti či nepřítomnosti ligandu za podmínek, kdy nedochází k samoštěpení,
e) separují se molekuly RNA zakotvené na pevném nosiči od molekul RNA přítomných v kapalné fázi vzniklých samoštěpením, a molekuly RNA zakotvené na pevném nosiči se denaturují a promyjí,
f) opakují se kroky d) až e) v několika cyklech, např. 1 až 50krát, aby se odstranily sekvence RNA schopné samoštěpení v nepermisivních podmínkách, byť s nízkou účinností danou zaujímáním řady neproduktivních konformací, ♦ 4· 44
44 « 4 «4 • · · ·
4 4 4 4 4 • 4 4 4 4
4444444 44 4
4 4 4· ·
g) k množině molekul se přidá ligand nebo se odstraní a množina se inkubuje za podmínek umožňujících samoštěpení a
h) separují se molekuly RNA z množiny na takové, které vykazují samoštěpící schopnost (přítomné v kapalné fázi) a na ty, které ji nevykazují (zakotvené na pevném nosiči), čímž se získá první vyselektovaná množina molekul se samoštěpící schopností.
35. Způsob podle nároku 34 vyznačující se tím, že dále obsahuje kroky, kdy:
i) provede se reverzní transkripce první selektované množiny molekul RNA z kroku h) na množinu jednovláknových molekul komplementární DNA (cDNA), a množina jednovláknových molekul cDNA se amplifikuje na množinu dvouvláknových molekul DNA,
j) opakováním kroků b) až i) v několika cyklech, např. 10 až lOOkrát, se získají dvouvláknové molekuly DNA kódujících ligand-dependentní samoštěpící molekuly RNA.
36. Způsob podle nároku 34 nebo 35, vyznačující se tím, že molekuly DNA z množiny molekul DNA z kroku a) mají sekvenci odvozenou ze známé sekvence RNA vykazující samoštěpící schopnost, ve které určitý podíl nukleotidů byl nahrazen 10 až 100 náhodnými nukleotidy.
37. Způsob podle nároku 34 nebo 35, vyznačující se tím, že molekuly DNA z množiny molekul DNA z kroku a) mají sekvenci odvozenou ze známé sekvence RNA vykazující samoštěpící schopnost, ve které určitý podíl nukleotidů byl nahrazen sekvencí známého ligandů RNA (aptamer).
• Φφ ·· · φ • · • φ φ φ φφφ »··· • φ • ΦΦΦ • Φ Φ· φ » φ · • · · φφφ • φ φ φ« ΦΦΦΦ
38. Způsob podle nároku 34 nebo 35, vyznačující se tím, že molekuly DNA z množiny molekul DNA z kroku a) mají sekvenci, tvořenou úplně náhodnou sekvencí, s výjimkou dvou krátkých přilehlých úseků, které obklopují promotor pro RNA polymerázu a místa pro nasednutí amplifikačních primerů.
39. Syntetická, přirozeně se nevyskytující molekula DNA, která kóduje ligand-dependentní samoštěpící sekvenci RNA.
40. DNA podle nároku 39, kde ligandem je molekula nukleové kyseliny, protein, polysacharid nebo cukr, nebo organická či anorganická molekula.
41. DNA podle nároku 39, kde ligandem je endogenní složka buňky.
42. Syntetická, přirozeně se nevyskytující ligand-dependentní samoštěpící molekula RNA.
43. Způsob in vitro evoluce a selekce pro přípravu ligandvázající sekvence RNA, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:
a) Připraví se množina různých molekul dvouvláknové deoxyribonukleové kyseliny (DNA), přičemž alespoň část sekvence molekul této množiny je náhodnou nebo částečně náhodnou sekvencí, takže tato část sekvence se v různých molekulách množiny liší,
b) provede se transkripce množiny molekul DNA na množinu molekul ribonukleové kyseliny (RNA) za podmínek, kdy nedochází k samoštěpení: za přítomnosti ligandu pro selekci samoštěpící sekvence nukleové kyseliny, která je ligandem-inhibovaná, nebo v nepřítomnosti ligandu « * ···· »» »· » 4 * 4 • · «
4 4 4 · • 4 · 4 · 4 • 4 9 ·♦ ··*♦ pro selekci samoštěpící sekvence nukleové kyseliny, která je ligandem-aktivovaná,
c) zakotví se (imobilizují) všechny molekuly množiny RNA na pevném nosiči za podmínek, kdy nedochází k samoštěpení (v přítomnosti či nepřítomnosti ligandu),
d) množina molekul RNA se inkubuje v přítomnosti či nepřítomnosti ligandu za podmínek, kdy nedochází k samoštěpení,
e) separují se molekuly RNA zakotvené na pevném nosiči od molekul RNA přítomných v kapalné fázi vzniklých samoštěpením, a molekuly RNA zakotvené na pevném nosiči se denaturují a promyjí,
f) opakují se kroky d) až e) v několika cyklech, např. 1 až 50krát, aby se odstranily sekvence RNA schopné samoštěpení v nepermisivních podmínkách, byť s nízkou účinností danou zaujímáním řady neproduktivních konformaci,
g) k množině molekul se přidá ligand nebo se odstraní a množina se inkubuje za podmínek umožňujících samoštěpení,
h) separují se molekuly RNA z množiny na takové, které vykazují samoštěpící schopnost (přítomné v kapalné fázi) a na ty, které ji nevykazují (zakotvené na pevném nosiči), čímž se získá první vyselektovaná množina molekul se samoštěpící schopností,a
i) mutuje se nukleotid C ve směru 5' od štěpného místa aptazymu na G, aby se samoštěpící aktivita zrušila.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99402552A EP1092777A1 (en) | 1999-10-15 | 1999-10-15 | Self-cleaving RNA sequences and their use for the control of protein synthesis. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021313A3 true CZ20021313A3 (cs) | 2002-07-17 |
Family
ID=8242144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021313A CZ20021313A3 (cs) | 1999-10-15 | 2000-10-13 | Sekvence RNA se samoątěpící schopností a způsob řízení produkce proteinu pomocí takové RNA |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1092777A1 (cs) |
| JP (1) | JP2003512059A (cs) |
| KR (1) | KR20020037384A (cs) |
| CN (1) | CN1377414A (cs) |
| AU (1) | AU784832B2 (cs) |
| BR (1) | BR0014632A (cs) |
| CA (1) | CA2387185A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20021313A3 (cs) |
| HU (1) | HUP0203268A3 (cs) |
| IL (1) | IL148572A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02002864A (cs) |
| NO (1) | NO20021713L (cs) |
| NZ (1) | NZ518396A (cs) |
| PL (1) | PL355165A1 (cs) |
| WO (1) | WO2001029234A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200202823B (cs) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6858390B2 (en) | 1998-12-31 | 2005-02-22 | Ingeneus Corporation | Aptamers containing sequences of nucleic acid or nucleic acid analogues bound homologously, or in novel complexes |
| US20180327747A1 (en) * | 2015-11-12 | 2018-11-15 | Baylor College Of Medicine | Exogenous control of mammalian gene expression through aptamer-mediated modulation of polyadenylation |
| KR20210093285A (ko) * | 2018-11-13 | 2021-07-27 | 온코루스, 인크. | 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 및 사용 방법 |
| CN116555253A (zh) * | 2022-01-30 | 2023-08-08 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08507203A (ja) * | 1992-12-04 | 1996-08-06 | イノーバー ラボラトリーズ，インコーポレイテッド | 調節可能な核酸治療およびそれらの使用方法 |
| US5663064A (en) * | 1995-01-13 | 1997-09-02 | University Of Vermont | Ribozymes with RNA protein binding site |
| AU6591798A (en) * | 1997-03-31 | 1998-10-22 | Yale University | Nucleic acid catalysts |
| EP1023312A4 (en) * | 1997-10-07 | 2005-04-13 | Smithkline Beecham Corp | PROCESS RELATING TO THE MODULATION OF GENE EXPRESSION |
| AU6522599A (en) * | 1998-10-23 | 2000-05-15 | Children's Medical Center Corporation | Use of a self-cleaving rna motif to modulate gene expression |
-
1999
- 1999-10-15 EP EP99402552A patent/EP1092777A1/en not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-10-13 HU HU0203268A patent/HUP0203268A3/hu unknown
- 2000-10-13 BR BR0014632-3A patent/BR0014632A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-10-13 KR KR1020027004832A patent/KR20020037384A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-10-13 IL IL14857200A patent/IL148572A0/xx unknown
- 2000-10-13 PL PL00355165A patent/PL355165A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-10-13 EP EP00977426A patent/EP1224305A2/en not_active Withdrawn
- 2000-10-13 CA CA002387185A patent/CA2387185A1/en not_active Abandoned
- 2000-10-13 NZ NZ518396A patent/NZ518396A/en unknown
- 2000-10-13 AU AU15149/01A patent/AU784832B2/en not_active Ceased
- 2000-10-13 JP JP2001532217A patent/JP2003512059A/ja not_active Withdrawn
- 2000-10-13 CZ CZ20021313A patent/CZ20021313A3/cs unknown
- 2000-10-13 WO PCT/EP2000/010423 patent/WO2001029234A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-10-13 CN CN00813861A patent/CN1377414A/zh active Pending
- 2000-10-13 MX MXPA02002864A patent/MXPA02002864A/es not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-04-10 ZA ZA200202823A patent/ZA200202823B/xx unknown
- 2002-04-11 NO NO20021713A patent/NO20021713L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1377414A (zh) | 2002-10-30 |
| PL355165A1 (en) | 2004-04-05 |
| NZ518396A (en) | 2004-01-30 |
| EP1092777A1 (en) | 2001-04-18 |
| CA2387185A1 (en) | 2001-04-26 |
| HUP0203268A3 (en) | 2005-08-29 |
| JP2003512059A (ja) | 2003-04-02 |
| WO2001029234A2 (en) | 2001-04-26 |
| IL148572A0 (en) | 2002-09-12 |
| AU784832B2 (en) | 2006-07-06 |
| AU1514901A (en) | 2001-04-30 |
| BR0014632A (pt) | 2002-06-18 |
| WO2001029234A3 (en) | 2001-11-29 |
| EP1224305A2 (en) | 2002-07-24 |
| HUP0203268A2 (hu) | 2003-01-28 |
| MXPA02002864A (es) | 2003-07-21 |
| NO20021713L (no) | 2002-06-12 |
| ZA200202823B (en) | 2003-09-23 |
| KR20020037384A (ko) | 2002-05-18 |
| NO20021713D0 (no) | 2002-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5834186A (en) | Regulatable RNA molecule | |
| RU2523596C2 (ru) | Одноцепочечная кольцевая рнк и способ ее получения | |
| KR100386337B1 (ko) | 진핵세포에서부위-특이적돌연변이를위한화합물과그방법 | |
| PT1527176E (pt) | Novas formas de muléculas de arn de interferência | |
| ES2616561T3 (es) | Molécula para tratar un trastorno inflamatorio | |
| CN107208096A (zh) | 基于crispr的组合物和使用方法 | |
| AU2006317222B2 (en) | DNA constructs for specific inhibition of gene expression by RNA interference | |
| JP2008526213A (ja) | 自己保護オリゴヌクレオチドを使用する、遺伝子発現を調節するための組成物および方法 | |
| WO2001049844A1 (en) | Compositions and methods for gene silencing | |
| WO2010084371A1 (en) | Novel circular interfering rna molecules | |
| JP2005517450A (ja) | 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いるＲＮＡ干渉媒介性標的発見および標的評価 | |
| WO2005056750A2 (en) | Inversion-duplication of nucleic acids and libraries prepared thereby | |
| JPH11507818A (ja) | 脊椎動物テロメラーゼの必須オリゴヌクレオチド | |
| CZ20021313A3 (cs) | Sekvence RNA se samoątěpící schopností a způsob řízení produkce proteinu pomocí takové RNA | |
| JP2706568B2 (ja) | 新規な薬物および試薬の同定 | |
| EP1668144A2 (en) | Nucleotide sequences promoting the trans-membrane transport of nucleic acids | |
| WO2024005186A1 (ja) | ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法 | |
| JP7437020B2 (ja) | Ｄｎａ酵素及びｒｎａ切断方法 | |
| CN100494380C (zh) | 一组抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的核苷酸序列、其片段及其应用 | |
| Platz et al. | Effects of various promoter derived sequences on the cleavage kinetic of an hammerhead ribozyme directed against cyclin E1 mRNA | |
| Logashenko et al. | Short double-stranded RNA suppresses multiple drug resistance gene expression in tumor cells. | |
| Carranza | Synthetic coenzymes for in vitro selection of DNA enzymes | |
| MX2008006657A (en) | Dna constructs for specific inhibition of gene expression by rna interference | |
| WO2006006514A1 (ja) | siRNA発現ベクターライブラリー作製方法 |