CZ20011216A3

CZ20011216A3 - Benzamidové deriváty

Info

Publication number: CZ20011216A3
Application number: CZ20011216A
Authority: CZ
Inventors: Henry Anderson Kelly; Martin Pass; David Neil Smith
Original assignee: Glaxo Group Limited
Priority date: 1998-10-03
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2001-09-12
Also published as: AU758007B2; PL347152A1; NZ510839A; IL142301A0; PE20001059A1; US6441008B1; WO2000020394A1; AU6467099A; HUP0103744A2; EP1117644A1; JP2002526531A; US6670381B2; CA2345997A1; HUP0103744A3; CO5140085A1; AR023332A1; NO20011654L; US20020169189A1; NO20011654D0; CN1328548A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových benzamidových derivátů, způsobu jejich výroby, farmaceutických přípravků obsahujících deriváty podle současného vynálezu a jejich použití jako inhibitorů trombinu.

Dosavadní stav techniky

Inhibitory trombinu jsou popsány v mezinárodní patentové přihlášce W097/22589.

Trombin je plazmatická serinová proteáza vytvořená přeměnou protrombinu jako prekurzoru na trombin za přítomnosti koagulačního faktoru Xa. Trombin je klíčový enzym hemokoagulační kaskády, který způsobuje přeměnu rozpustného plazmatického proteinu fibrinogenu na nerozpustný fibrin. Nerozpustná fibrinová matrix je rozhodující pro stabilizaci primární hemostatické zátky. Abnormální homeostáza způsobuje závažná onemocnění.

Tvorba trombu v místech aterosklerotického plaku v koronárních artériích je jednou z nejčastějších příčin infarktu myokardu a nestabilní angíny pectoris. Léčba okluzívního koronárního trombu trombolytickou terapií a perkutánní transluminální koronární angioplastikou (PTCA) je spojena s akutním trombotickým uzávěrem postižených cév, které vyžaduje okamžité řešení.

Vysoké procento pacientů podstupující chirurgický zákrok na dolních končetinách nebo břicha trpí tvorbou trombů ve venózním

řečišti, které způsobuje snížení průtoku krve dolními končetinami a predisponuje ke vzniku plicní embolie.

Ve venózním i arteriálním řečišti se rozvíjí diseminovaná intravaskulární koagulace během septického šoku, určitých virových infekcí a rakovinových onemocnění. Je charakterizována rychlým spotřebováním koagulačních faktorů a rozvojem systémové koagulace, která ústí ke tvorbě život ohrožujících trombů v cévním řečišti, způsobujících selhání životně důležitých orgánů.

Kromě přímého účinku na tvorbu krevní zátky bohaté fibrinem má trombin důležité bioregulační účinky na velké množství vaskulárních a krevních buněk. (M. A. Shuman, Ann. NY Acad. Sci., 405: 349 (1986)).

Inhibice trombinu je možnou terapií velkého množství onemocnění. Inhibitory trombinu lze použít v léčbě akutních vaskulárních onemocnění (koronární trombózy, záchvatu mozkové mrtvice, plicní embolie, trombózy velkých žil, opakované stenózy, fibrilace síní, infarktu myokardu a nestabilní angíny pectoris). Tyto látky byly popsány jako antikoagulační činidla in-vivo a ex-vivo a při. terapii otoků a zánětlivých změn. Nízké dávky inhibitorů trombinu mohou redukovat zánětlivé změny vyvolané trombinem aktivovaným destičkovými faktory nebo faktory endoteliálních buněk bez průvodních antikoagulačních účinků. Trombin je jednou z příčin proliferace plicních fibroblastů, takže lze inhibitory trombinu použít při terapii některých plicních fibróz. Byla popsána terapie metastáz tumorů trombinovými inhibitory, které zabraňovaly ukládání fibrinu a nebo inhibovaly nežádoucí aktivaci koagulačního faktoru X cysteinovou proteázou produkovanou některými tumorovými buňkami. Inhibitory trombinu prokazatelně inhibují retrakci neuritu, takže ovlivňují rozvoj neurovegetativních onemocnění, Parkinsonovy nebo Alzheimerovy choroby. Uvádí se účinek inhibitorů trombinu, který ve spojení s trombolytickými činidly potencuje jejich působení,

takže ie možné podat nižší dávky těchto činidel. Ostatní možné použití inhibitorů trombinu je popsáno v US 5371091 (účinek při terapii syndromu Kasabach-Merrittové a hemolyticko-uremického syndromu), v EP 565897 (prevence fibrinových deposit v oku během oftalmologických chirurgických zákroků) a v DE 4126277 (účinek na osteoporózu).

Λ

Podstata současného vynálezu í

Podstata současného vynálezu se týká benzamidových derivátů, které působí jako inhibitory trombinu, obecného vzorce I:

, kde R¹ je C^alkyl nebo Cj.gcykloalkyl,

R² je C^alkyl nebo C3-4alkenyl,

R³ je atom vodíku, Ci.3alkyl nebo atom halogenu, * R⁴ je Ci.₆alkyl, a jejich farmaceuticky vhodných derivátů nebo solvátů.

Ve zmíněném obecném vzorci I patří mezi alkyly přímé nebo větvené řetězce nasycených uhlovodíkových skupin (metyl, etyl a izopropyl), cykloalkylem je nasycené cyklické uhlovodíkové skupiny

větvené řetězce uhlovodíkových skupin obsahující jednu dvojnou vazbu (propenyl, 2-metylpropenyl a butenyl).

Je vhodné, když derivát obecného vzorce 1 obsahuje chirální centrum v pozici označené *. Derivát tedy existuje ve formě dvou optických izomerů. Podstata současného vynálezu se týká jednotlivých enantiomerů derivátu podle vzorce I a směsí enantiomerů derivátu obecného vzorce I, včetně racemických v směsí. Nejvhodnější je použití derivátu obecného vzorce I ve formě jediného čištěného enantiomerů, především (S) izomeru.

Ve shora uvedeném vzorci I platí, že jako R¹ je vhodný propyl, izopropyl, butyl, cyklopentyl nebo cyklohexyl. Preferujeme, když R¹je izopropyl.

Jako R² je vhodný metyl, etyl, propyl nebo izopropyl. Preferujeme, když R²je etyl.

Jako R³ je vhodný metyl nebo chlór. Preferujeme, když R³ je metyl.

Jako R⁴ je vhodný metyl nebo etyl. Preferujeme, když R⁴ je metyl.

Vhodnými benzamidovými deriváty podle obecného vzorce I podle současného vynálezu deriváty ze skupiny:

N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid,

N,N-diizopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin4-ylamino)-propoxy]-benzamid,

N-izopropy!-3,N-dimetyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid,

S.N-dimetyl-N-propyl-S-^S-Ípyridin^-ylaminoj-propoxy]-benzamid,

3-metyl-N,N-dipropyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid,

N-etyl-3-metyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxyj-benzamid,

N-butyl-3-metyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid,

N-cyklohexyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxyj-benzamid,

N-izopropyl-3-metyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid,

3-chloro-N-izopropyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxyj-benzamid,....... .........

3-chioro-N,N-diizopropyl-5-[2-(pyridin-4-ylamino)-butoxy]-benzamid a jejich farmaceuticky vhodné deriváty nebo solváty.

Velmi vhodným derivátem obecného vzorce I podle současného vynálezu je N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid a jeho farmaceuticky vhodné deriváty nebo solváty.

Farmaceuticky vhodným derivátem je jakákoli farmaceuticky vhodná sůl nebo metabolicky vhodný derivát, například derivát aminoskupiny derivátu obecného vzorce I nebo jakéhokoli jiného derivátu, která po podání přímo nebo nepřímo poskytne derivát obecného vzorce I nebo jeho účinný métabolit nebo zbytek. Podle v oboru platných pravidel lze připravit farmaceuticky vhodný derivát jakékoli funkční skupiny derivátu obecného vzorce I. Takové ' postupy jsou v oboru známé a uvedené v dostupné literatuře (Burger's Medicinal Chemistry And Drug Discovery, 5^th edition, vol. 1: Principles And Practice).

Farmaceuticky vhodnými deriváty derivátu obecného vzorce I jsou jejich anorganické a organické soli. Vhodnými kyselinami jsou: kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, dusičná, chloristá, fumarová, maleinová, fosforečná, glykolová, mléčná, salicylová, sukcinová, toluen-p-sulfonová, di-p-tolyl-vinná, sulfanilová, vinná, octová, citrónová, metan-sulfonová, mravenčí, benzoová, malonová, naftalen-2-sulfonová a benzen-sulfonová kyselina. Preferované farmaceuticky vhodné soli derivátu obecného vzorce I jsou soli kyseliny toluen-p-sulfonové. Pokud nejsou ostatní kyseliny (štavelová) farmaceuticky vhodné, lze je použít jako meziproduktů v syntéze derivátů obecného vzorce I podle současného vynálezu a jejich farmaceuticky vhodných adičních solí kyselin jako meziproduktů.

Inhibiční vliv na trombin derivátů obecného vzorce I lze doložit chromogenní zkouškou inhibice lidského α-trombinu za t použití N-p-tosyl-gly-pro-lys p-nitroanilidu jako chromogenního substrátu.

Deriváty obecného vzorce I mají podle dále popsaných APTT zkoušek účinek in vitro antikoagulační.

Deriváty mají antitrombotický účinek doložený dále uvedeným modelem arteriovenózního zkratu.

Deriváty obecného vzorce I lze použít u všech stavů, u kterých lze předpokládat, že podání inhibitorů trombinu povede ke zlepšení stavu pacienta. Mezi taková onemocnění patří:

akutní vaskulární onemocnění (koronární trombóza, záchvat mozkové mrtvice, plicní embolie, trombóza hlubokých žil, periferní arteriální okluze, opakované stenózy a fibrilace síní); otoky a zánětlivá onemocnění způsobená PAF (syndrom dechové tísně dospělých, septický šok a reperfusni poškození); plicní fibrózy, nádorové metastázy, neurodegenerativní onemocnění (Parkinsonova a Alzheimerova choroba), virové infekce, syndrom Kasabach-Merrittové, hemolytický uremický syndrom, artritidy, osteoporóza.

Deriváty obecného vzorce I lze použít jako anti-koagulační činidla při podání mimotělní krve (dialýza, filtrace krve, bypass a skladování krevních derivátů) a opatření povlakem invazívních zařízení (protetika, umělé chlopně a katétry) k zabránění nežádoucího vzniku trombu. ............

Vynález se dále týká postupu terapie savců, včetně člověka, trpícího onemocněním, které lze omezit nebo vyléčit podáváním účinného množství derivátu obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky vhodného derivátu.

Terapií deriváty podle současného vynálezu je podávání účinného množství derivátu profylaktické, a nebo vedoucího ke zlepšení stavu pacienta.

Vynález se dále týká použití derivátu obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky vhodného derivátu k výrobě lékového přípravku pro terapii stavů, které lze ovlivnit podáváním inhibitorů trombinu.

Derivát obecného vzorce I podle současného vynálezu lze podat jako surový chemický přípravek. Preferujeme podání účinné látky ve formě farmaceutického přípravku.

Vynález se dále týká farmaceutického přípravku derivátu obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky vhodného derivátu společně s jedním nebo více farmaceuticky vhodným nosičem, a eventuálně jinými terapeutickými a/nebo profylaktickými činidly. Deriváty podle současného vynálezu lze použít v kombinaci s jinými antitrombotickými léčivy: s antagonisty tromboxanových receptorů, prostacyklinomimetiky, inhibitory fosfodiesterázy, antagonisty fibrinogenu, trombolytiky (aktivátorem tkáňového plazminogenu a streptokinázou), nesteroidními protizánětlivými léčivy (aspirinem) a podobně.

Deriváty podle současného vynálezu lze podat ve formě přípravků pro orální, bukáíní, parenterální, místní, rektální, transdermální, inhalační nebo insuflační (nosem nebo ústy) podání.

Přípravky pro perorálni podání ve formě tablet nebo kapslí lze připravit v oboru známým způsobem za použití vhodným pomocných látek, kterými jsou vazná činidla (želatinový kukuřičný škrob, polyvinylpyrolidon nebo hydroxypropyl-metylcelulóza), plnidla (laktóza, mikrokrystalická celulóza nebo hydrogenfosforečnan vápenatý), kluzné látky (stearát horečnatý, talek nebo oxid křemičitý), disintegrační činidla (bramborový škrob nebo sodná sůl glykolátu škrobu) nebo smáčedla (laurylsulfát sodný). Obalení tablet se provede vhodným technologickým postupem.

Kapalné přípravky pro perorálni podání mají formu roztoků, sirupů a suspenzí nebo je lze připravit jako prášky pro uvedení do roztoku ve vodě nebo v jiném nosném prostředí před podáním. Lze je připravit v oboru známým způsobem za použití farmaceuticky vhodných suspenzních činidel (sorbitolový sirup, deriváty celulózy nebo hydrogenované jedné tuky), emulzifikačních činidel (lecitin ·· ·· ·· ♦ · · · · • ··· · · nebo akaciová guma), bezvodého nosného prostředí (mandlový olej nebo propyl-p-hydroxybenzoáty nebo kyselina sorbová).

Přípravky mohou obsahovat pufry, látky na úpravu chuti nebo barvy nebo.sladidla.

Přípravky pro perorální podání lze vhodně připravit tak, aby docházelo ke kontrolovatelnému uvolňování účinné látky.

Přípravky pro bukální podání lze podat ve formě tablet nebo pastilek připravených vhodným technologickým způsobem.

Deriváty podle současného vynálezu lze podat parenterálně jednorázově injekcí nebo kontinuálně infuzí. Přípravky pro injekční podání v jednotlivých dávkách se vyrobí ve formě ampulí nebo nádobách obsahujících několik jednotlivých dávek s přísadou konzervačního činidla. Přípravky pro parenterálie jsou suspenze, roztoky nebo emulze v olejovém nebo vodném nosném prostředí a mohou obsahovat další pomocné látky - suspenze, stabilizační a/nebo disperzní činidla. Derivát podle současného vynálezu pro parenterální podání lze připravit jako prášek, který se před použitím smíchá s vhodnou pomocnou látkou (sterilní apyrogenní vodou).

Deriváty podle současného vynálezu lze vyrobit v lékové formě pro místní podání insuflací nebo inhalací. Jde především o aerodisperze a aerosoly aplikované inhalátorem nebo insuflátorem nebo o inhalační prášky.

Prášky k zevnímu použití lze připravit za použití práškových základů (laktózy, talku nebo škrobu). Aerodisperzní přípravky lze vyrobit ve formě tlakového balení obsahujícího vhodný hnací plyn a vodných nebo suspenzních aerodisperzí nebo léčivých aerosolů lze aplikovat jednotlivé odměřené dávky léčiva.

·♦ ·· • · · · · • ·

rektálních přípravků, resp. čípků nebo klyzmat obsahujících odpovídající čípkové základy (kakaové máslo nebo glyceridy).

Deriváty podle současného vynálezu lze upravit na depotní lékovou formu. Tyto přípravky lze podat implantací (podkožně, transdermálně nebo intramuskulárně) nebo intramuskulární injekcí. K přípravě těchto lékových forem lze použít vhodné polymerní nebo hydrofobní materiály (emulze ve vhodném oleji) nebo iontoměničové pryskyřice nebo jako těžko rozpustné deriváty (těžko rozpustné soli).

Navrženou dávkou derivátů podle současného vynálezu pro podání lidem je 0,1 mg až 1 g (na přibližně 70 kg tělesné hmotnosti), především od 1 mg do 500 mg účinné látky v jednotlivé dávce (hmotnost volné báze). Jednotlivou dávku lze podat jedenkrát až čtyřikrát denně. Velikost dávky závisí na cestě podání. Velikost jednotlivé dávky závisí na obecně známých faktorech jako je věk a hmotnost pacienta, závažnost onemocnění apod. Dávkování a cestu podání určí u jednotlivých pacientů lékař nebo veterinář podle vlastních zkušeností a stavu pacienta.— ---------------- ----------Deriváty podle současného vynálezu lze připravit podle obecně známých způsobů výroby. Například v první způsobu výroby (A) se deriváty obecného vzorce J, kde zbytky R¹, R², R³, a R⁴ jsou shora definovány, připraví odštěpením ochranných skupin derivátu obecného vzorce II:

N i' (II) • ·

, καβ P¹ je vhodná ochranná skupina

LJ (terc.butoxy-karbonyl) za vhodných podmínek (kyselé pH k odstranění terc.-butoxykarbonylo vé skupiny).

Druhým způsobem výroby je reakce derivátu obecného vzorce III s derivátem obecného vzorce IV:

,kde R⁷ je atom vodíku a L je hydroxylová skupina. Vazebná reakce se provede za použití standardních činidel (dietylazodikarboxylátu a trifenylfosfinu) ve vhodném rozpouštědle (toluenu).

Třetím způsobem syntézy (C) derivátu obecného vzorce I je reakce derivátu obecného vzorce III s derivátem obecného vzorce IV, kde R⁷ je atom vodíku a L je vhodná odštěpitelná skupina (chlorid) za přítomnosti vhodné báze (uhličitanu draselného). Vazebná reakce se provede za přítomnosti vhodného rozpouštědla (Ν,Ν-dimetylformamidu) při teplotě zvýšené teplotě.

Čtvrtým způsobem (D) je výroba derivátu obecného vzorce I reakcí derivátu obecného vzorce (V) a derivátu obecného vzorce (VI):

R² _t „NH R (VI) , kde R⁷ je atom vodíku. Reakce se provede za přítomnosti aktivačního činidla nebo jiných činidel (1-hydroxybenzotriazol, 2-(1 H-benztriazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetrametyluronium-tetrafluorborát (TBTU)) a-zásady (etyl-diizopropylamin) ve vhodném rozpouštědle (N,N-dimetylformamid).

Deriváty obecného vzorce II. lze připravit reakcí derivátů obecného vzorce (III) s derivátem obecného vzorce (IV), kde R⁷ je P¹ (shora uvedený) a L je hydroxylové nebo vhodná odštěpitelná skupina (4-toluensulfonát (tosylát)). Pokud L je. hydroxylové — —skupi na, pak se vazebné reakce proved e podIe postupu (Β). Pokud------------------je L tosylát, pak se vazebná reakce provede ve vhodném rozpouštědle (Ν,Ν-dimetylformamid) za přítomnosti vhodné zásady (hydridu sodného).

Sloučeninu obecného vzorce (II) lze připravit reakcí derivátu obecného vzorce (V) a derivátu obecného vzorce (VI), kde R⁷ je P¹shora popsaný, za podmínek reakce uvedeného u způsobu syntézy (D).

Deriváty obecného vzorce (III) lze připravit z derivátu obecného vzorce (VII):

obvykle za použití bromidu boritého ve vhodném rozpouštědle (dichlormetan).

Deriváty obecného vzorce (lil) lze také připravit z derivátu obecného vzorce (IX):

(IX) ₀^_Vy!_<l_{e rea}|<;_Cí _sp- kyselým chloridem (pivaloylchlorid) za přítomnosti zásady (trietylamin) ve vhodném rozpouštědle (toluen), a následně reakcí se deriváty obecného vzorce (VI).

Deriváty obecného vzorce (VII) lze připravit reakcí derivátů obecného vzorce (Vlil) a obecného vzorce (VI):

A • · · • Λ 9

9

obvykle podle způsobu (D) syntézy. Reakci derivátů obecného vzorce (Vlil) a obecného vzorce (VI) lze provést za použití oxalylchloridu a za přítomnosti Ν,Ν-dimetylformamidu ve vhodném rozpouštědle (tetrahydrofuran).

Deriváty obecného vzorce (V) lze připravit oxidací odpovídajícího aldehydu obecného vzorce (X):

(X) , kde R⁷ je atom vodíku nebo P¹. Přeměna aldehydu se · provede působením vhodným oxidačním činidlem (chlorit sodný) za--------přítomnosti sulfamové kyseliny ve směsi vody a 1,4-dioxanu.

Deriváty obecného vzorce (X) lze připravit z derivátu obecného vzorce (XI) a (IV):

O

OH

R' (XI) (IV)

	·· • * • ·	·· ♦· • · · • ····	·· · • · · · • · ·
• ·	··	·· ··	·· ··

, kde R⁷ je atom vodíku nebo P¹ a

L je hydroxyíová skupina nebo vhodná odštěpitelná skupina (4-toluensulfonát (tosylát)). Pokud je L vhodná odštěpitelná skupina, pak R⁷ je především P¹. Pokud L je hydroxyl, pak se vazebná reakce provede za použití reakčních činidel použitých ve způsobu B syntézy. Pokud L je tosylát, pak se vazebná reakce provede ve vhodném rozpouštědle (N,N-dimetylformamid) za přítomnosti vhodné zásady (hydridu sodného).

Deriváty obecného vzorce (V) lze také připravit z derivátu obecného vzorce (XII):

, kde R⁷ je atom vodíku nebo P¹ a R⁸ jsou vhodné ochranné skupiny (alkyl - metyl). Reakce se provede za použití hydroxidu lithného v 1,4-dioxanu nebo vodného roztoku hydroxidu sodného v etanolu.

Deriváty obecného vzorce (XII) lze připravit reakcí derivátů obecného vzorce (XIII) a (IV) :

	16	• ·· rr ·<· ·· · · · · * · · • ·· · · ··« · « • · ·’· ·· · · · * • « * ♦ · · · ·· ··· ·· ·· ·· ««
	R³ Λ	R⁷ R⁴
	R^B-O^AJ\_OH
	0 (XIII)	(IV)
kde R⁷ je atom vodíku nebo P¹,
R⁸	je vhodná ochranná skupina (alkyl - metyl) a
L	je hydroxylová skupina	nebo vhodná odštěpitelná

skupina (4-toluensulfonát (tosylát). Pokud je L vhodná odštěpitelná skupina, pak R⁷ je především P¹, a k syntéze se použijí reakční činidla uvedená ve způsobu syntézy derivátu obecného vzorce (X).

Deriváty obecného vzorce (IV), (VI), (Vlil), (IX), (XI) a (XIII) jsou v oboru známé nebo je lze připravit obecně známými postupy.

Biologické zkoušky:

1. Inhibice trombinu

Deriváty podle současného vynálezu mají inhibiční účinek na trombin, který lze prokázat in vitro schopností inhibice lidského atrombinu prokazatelné chromogenní zkouškou za použití N-p-tosylgly-pro-lys p-nitroanilidu jako chromogenního substrátu. Všechna ředění se provádějí v pufru následujícího složení: 50 mM roztoku HEPES, 150 mM roztoku chloridu sodného, 5 mM roztoku chloridu vápenatého, 0,1% PEG a při pH 7,4.

Substrát (konečná koncentrace 100 μΜ) se přidá do trombinu (konečná koncentrace 1 nM) a reakce se sleduje 10 minut při 405nm čtečkou Biotek EL340. Zkouška se provede při teplotě místnosti. Hodnoty IC₅₀ se určí pomocí Kineticalc™ a a _ At. x.-Γ·»___TM

Ke stanovení hodnot

•	·· ··	·«	99	φ.
·· ·		•	9 9	··
•	·· « ·	··♦	9 . 9	• ;
.· ·»	• · · ·	• ·	9 9 9	•
• ·	• · ·	♦ 9	9 9	•
• · ·	·· ··	99	9 9	···

o

Ί co

I w ww deriváty předem inkubují s trombinem po stanovenou dobu, a následně se přidá chromogenní substrát.

2. Postup stanovení hodnot APTT

Deriváty podle současného vynálezu mají in vitro schopnost prodloužit dobu srážení lidské plasmy, respektive prodloužit , aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT). Plasma s obsahem 0,38%hmotnostně/objemových citrátu sodného získaná z krve zdravých dobrovolníků, se uskladní při teplotě -70°C. Stanovení hodnot APTT se provede za použití Thrombtrack 4 (Nycomed). Aktinové činidlo (zředěný extrakt dehydratovaného králičího mozku obsahujícího i kyselinu elagovou) se získá od Baxter Healthcare Corporation USA. Citrátovaná plazma se přidá buď do derivátu nebo do destilované vody, a následně se přidá aktinové činidlo. Směs se 2 minuty míchá při teplotě 37°C, a následně se srážení aktivuje přidáním chloridu vápenatého, Deriváty podle současného vynálezu prodlouží normální hodnotu APTT (30-35 sekund) na hodnoty, které závisí na výši jejich

--------koncentrace. Stupeň prodloužení APTT se vypočítá z poměru doby_________ srážení v přítomnosti derivátu podle současného vynálezu a bez jeho přítomnosti. Podle koncentrace derivátů, která prodlouží „normální“ APTT 1,5krát, se porovnávají antikoagulační účinky jednotlivých derivátů.

Výsledky:

Tabulka uvádí výsledné hodnoty IC50 - inhibice trombinu a APTT - antikoagulačního účinku derivátů obecného vzorce I podle současného vynálezu stanovené popsanými biologickými zkouškami:

	IC₅₀ (nM)	APTT (nM)
1	< 1	40 (1,5x)
2	< 1	80 (1,5x)
3	3	90 (1,5x)
4	5	97 (1,5x)
5	< 1	110 (1,5x)
6	1,5	120 (1,5x)
7	< 1	100 (1,31 x)
8	< 1	100 (1,32)
9	< 1	60 (1,5x)
10	3,4	100 (1,28x)
11	26	65 (1,5x)

3. Popis modelového arterio-venózního zkratu

Deriváty podle současného vynálezu mají antitrombotický účinek, který lze doložit in vivo schopností omezit tvorbu trombu v arterio-venózním zkratu provedeného na krysím modelu. V anestézii (Inactin 120 mg/kg i.p.) se krysám provede inzerce extrakorporálního zkratu mezi a. carotis sin. a v.jugularis dx.. Zkrat představují dvě 12 cm polyetylénové kanyly (Portex, vnitřní průměr 0,58 a 0,86 mm) spojené přes centrální otvory v zátce ze silikonové pryže o průměru základny 3 mm (Jencons Scientific Ltd) polyetylenovou kanylou o délce 6 cm (Portex, vnitřní průměr 3 mm). Touto spojovací kanylou se pevně napne 8 cm hedvábná nit, která je vedena přes centrální otvor zátky a podélně středem zkratu. Před kanylací se zkrat naplní 154 mM roztokem chloridu sodného (fyziologický roztok). Po kanylaci se zamezí průtoku krve zkratem ponecháním hemostatické svorky na karotické artérii. Do levé i

karotické artérie se umístí sonda pro měření průtoku ultrazvukem (Transonic Systems lne., 0,5 mm), která se spojí s měřící zařízením průtoku Transonic (model T206), které kontinuálně sleduje fázový průtok karotické artérie. Kontinuální hodnoty arteriální průtoku jsou zaznamenávány systémem Ml² (Modular Instruments lne.).

Po zavedení kanyl a připojení zkratu, a po následné ekvilibraci se přistoupí k podání vehikula nebo derivátu. Po 30 minutách po podání se uvolní hemostatická svorka z karotidy a krev se nechá proudit zavedeným zkratem. Po 15 minutách se průtok uzavře arteriální svorkou, zkrat se odstraní a do centrální části zkratu se pomalu vstříkne 0,5 ml fyziologického roztoku, aby se odstranila volná krev. Bavlněná nit spolu s trombem se opatrně oddělí a trombus se zváží. Stanoví se koagulační hodnoty včetně aktivovaného parciálního tromboplastinového času (APTT).

Přímou kardiální punkcí se odeberou 2 ml vzorku krve, který se přenese do zkumavky obsahující citrát sodný (poměr 9:1, výsledná koncentrace citrátu 12,9 mM). Vzorek krve se jemně zamíchá, a následně se centrifuguje 2 minuty při 10000g. Plazma se deka n tu je. - M ate riá I u rč e nýkanalýze se us kl ad η í p ři te p I o tě 4°C----------------------Všechna měření se provedou na · automatickém analyzačním zařízení Sysmex CA5000 podle přiloženého návodu.

Antitrombinová aktivita se projevila snížením hmotnosti trombu, prodloužením doby rozvoje okluze a zvýšením krevního průtoku a souvisela se změnou měřených koagulačních parametrů.

Použité zkratky:

HPLC chromatografie s vysokou rozlišovací schopností

Rt doba retence

DIPEA N-etyl-diizopropylamin

DMF N,N-dimetylformamid

TBTU 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1 ,3.3-tetrametyluroniunn-tetrafluorborát

DMAP 4-dimetylaminopyridin br široký s singlet d dvojice, dublet t triplet m multiplet

TLC chromatografíe na tenké vrstvě

Příklady provedení vynálezu

Metody:

Analytická HPLC se provede na chromatografu Hewlett Packard Series II 1090 pro kapalinovou chromatografii za použití kolony Rainin Microsorb C18 (velikost: 4,6 x 150 mm, katalogové číslo: 80-215-C5), při rychlosti průtoku 1,5 ml/min. Elučními roztoky jsou systémy:

A: 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové ve vodě,

g. q Q5o^ kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu.

Gradientní eluce: systém 1: 15-95% B v A během 15 minut.

Doba retence se vztahuje k vlnové délce (λ) 254nm, pokud není uvedeno jinak.

Preparativní HPLC:

Systém A: kolona Supelcosil LC-ABZ (velikost 21,2 mm x 25 cm nebo

21,2 mm x 10cm) , rychlost průtoku 15 ml/min, eluční systémy:

A: 0,1% kyseliny trifluoroctové ve vodě,

B: 0,01% kyseliny trifluoroctové ve směsi acetnitrilu a vody v poměru 95:5.

Systém B: kolona Prochrom 50 mm s 200 g silikagelu Sorbsil 060. rychlost průtoku 80 ml/min, eluční činidlo: dichlormetan (80), metanol (20), octová kyselina (0<5) & amoniak (0,5)].

TLC se provede za použití oxidu křemičitého Camlab (Polygram® SILG/UV254) při eluci směsí dichlormetanu, etanolu, vodného roztoku amoniaku ve stanoveném poměru.

Rychlá chromatografie se provede na koloně silikagelu Měrek (Měrek 9385) nebo za použití předem vyrobené kolony Sl Megabond Elut® (chemicky vázaná normální fáze, velikost 60 cm³ / 10 g).

Meziprodukt 1 (S)-2-(2,3,5,6-tetrachlor-pyridin-4-ylamino)-propan-1-ol

Do roztoku 30 g pentachlorpyridinu ve 300 ml 2-propanolu se přidá 18 ml DIPEA, 0,8 g DMAP a 18 g (S)-(+)-2-amino-1-propanolu a reakční směs se 18 hodin zahřívá pod refluxem. Po zchlazení se reakční směs zahustí za sníženého tlaku. Vytvořený zbytek se rozetře s metanolem a f i I tr uj e s e za. vzn i ku .18 g výši ed n é s I o u če n i ny j ako bil é p e vn é I á tky. Hmotové spektrum: MH+279.

Meziprodukt 2 (S)-2-(pyridin-4-ylamino)-propan-1-ol

V atmosféře vodíku se 24 hodiny míchá směs 6 g (S)-2-(2,3,5,6-tetrachlor-pyridin-4-ylamino)-propan-1-olu, 10% roztoku paladia na aktivním uhlí, 14,3 g uhličitanu draselného a 110 ml etanolu. Reakční směs se filtruje přes Harbolite™ a filtrát se zahustí za sníženého tlaku za vzniku 3,2 g bílé pevné látky výsledné sloučeniny.

Hmotové spektrum: MH+ 153.

Meziprodukt 3

3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)propoxy]benzoová kyselina

Na teplotu 60°C se 1 hodinu zahřívá směs 9,5 g metylesteru kyseliny 3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)propoxy]benzoové a 31,5 ml 2M roztoku hydroxidu sodného ve 100 ml etanolu. Po zchlazení se reakční směs neutralizuje přidáním kyseliny chlorovodíkové k pH 7 a směs se zahustí za sníženého tlaku. Vytvořený zbytek se čistí rychlou chromatografií na koloně při eluci směsí dichlormetanu a etanolu v poměru 4:1, etanolem a směsí metanolu a kyseliny mravenčí v poměru 10:1 za vzniku surového výsledného produktu. Následnou rychlou chromatografií na koloně Megabond při eluci směsí dichlormetanu a etanolu v poměru 4:1 a metanolem. Vznikne 6,8 g výsledné světle žluté pevné látky jako výsledné sloučeniny.

Hmotové spektrum: MH+ 287.

Meziprodukt 4 metylester kyseliny 3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-yl-amino)-propoxyjbenzoové

A) : Na směs 11,2 g metyl-3-hydroxy-5-metylbenzoátu¹, 17,7 g trifenylfosfinu, 10,3 g (S)-2-(pyridin-4-ylamino)-propan-1-olu a 300 ml tetrahydrofuranu se 10 minut působí 10,6 ml dietyl-azodikarboxylátem a vytvořený roztok se v atmosféře dusíku 72 hodin míchá při teplotě místnosti. Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku a surový produkt se čistí rychlou chromatografií na koloně při eluci směsí dichlormetanu, etanolu a vodného roztoku amoniaku v poměru 95 : 5 : 0,5 za vzniku 9,5 g výsledné sloučeniny jako bezbarvého oleje. Hmotové spektrum: MH+ 301.

B) : Na směs 8 g metyl-3-hydroxy-5-metylbenzoátu¹, 11,9 ml tributylfosfinu, 4,9 g (S)-2-(pyridin-4-ylamino)-propan-1-olu a 300 ml toluenu se působí 12,1g 1 .ť-fazodikarbonylj-dipiperidinu a vytvořený

tonlntě mí<;tnn<;ti roztok se 18 hodin v atmosféře dusíku míchá nři ·-·— r··

Reakčni směs se filtruje a filtrát zahustí za sníženého tlaku. Vytvořený zbytek se čistí rychlou chromatografií na koloně při eluci směsí chloroformu, metanolu a vodného roztoku amoniaku v poměru 95:5:1 za vzniku 13,3 g výsledné sloučeniny jako oleje.

Hmotové spektrum: MH+ 301.

Meziprodukt 5 etylester kyseliny 2-(terc.butoxykarbonyl-pyridin-4-yl-amino)-máselné

Do roztoku 2 g terc.butyl-esteru pyridin-4-yl-karbamové kyseliny² v 25 ml bezvodého dimetylformamidu se přidá 0,54 g 60% disperze hydridu sodného v minerálním oleji a 1,7 ml etyl-2-brombutyrátu. Směs se míchá 18 hodin při teplotě místnosti. Přidá se 25 ml vody a směs se extrahuje dietyléterem. Sloučené organické extrakty se promyjí nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem hořečnatým a zahustí se za sníženého tlaku. Surový produkt se čistí rychlou chromatografií na koloně při eluci směsí cyklohexanu a etylacetátu v poměru 4:1 za vzniku 0,332 g výsledné sloučeniny jako - bezbarvého oleje.----------------------——^j------------- ---------------------------------—-------Hmotové spektrum: MH+ 295.

Meziprodukt 6

2-(pyridin-4-yl-amino)-butan-1-ol

Za stálého míchání se na roztok 0,33 g etylesteru kyseliny 2(terc.butoxykarbonyl-pyridin4-yl-amino)-máselné v 5 ml etanolu se působí 0,12 g hydroborátu sodného a směs se míchá dalších 18 hodin. Přidá se 1 ml vody a směs se zahustí za sníženého tlaku. Vytvořený zbytek se nechá absorbovat na oxid křemičitý a vytvořený prášek se čistí rychlou chromatografií na koloně, která se eluuje směsí metanolu, chloroformu a vodného roztoku amoniaku v poměru •i'’'.'”'

.. - » . VÍ'

10:89:1. Po odpařování se získá 0,168 g výsledné sloučeniny jako oleje.

Hmotové spektrum: MH+ 167.

Meziprodukt 7

3-chlor-N,N-diizopropyl-5-metoxy-benzamid

Do roztoku 0,1 ml dimetylformamidu a 4,67 g 3-chlor-5-metoxybenzoové kyseliny³ ve 100 ml bezvodého tetrahydrofuranu se po kapkách přidá 2,36 ml oxalyl-chloridu: Po 1 hodině se do reakční směsi přidá 3,75 ml diizopropylaminu a 9,51 ml DIPEA a směs se dalších 18 hodin míchá. Reakční směs se rozdělí mezi etylacetát a vodu a organický podíl se extrahuje 1M roztokem kyseliny chlorovodíkové, nasyceným vodným roztokem bikarbonátu sodného a vodou. Po sušení organického podílu s nasyceným roztokem chloridu sodného a nad síranem sodným se rozpouštědlo odstraní za sníženého tlaku za vzniku 4,6 g výsledné sloučeniny jako hnědé pevné látky.

Hmotové spektrum: MH+ 270.

Meziprodukt 8

3-chloro-5-hydroxy-N,N-diizopropyl-benzamid

Do míchaného roztoku 2,96 g 3-chlor-N,N-diizopropyl-5-metoxybenzamidu v 30 . ml bezvodého dichlormetanu se při teplotě -78°C přidá 40 ml roztoku bromidu boritého v dichlormetanu. Reakční směs se nechá zahřát na teplotu místnosti a 19 hodin se míchá. Následně se zchladí na teplotu -78°C a přidá se 20 ml metanolu. Reakční směs se nechá opět zahřát na teplotu místnosti, 24 hodin se míchá, a pak se zahustí za sníženého tlaku. Vytvořený zbytek se rozdělí mezi etylacetát a nasycený vodný roztok bikarbonátu sodného. Organický podíl se promyje vodou a suší se nad nasyceným roztokem chloridu • · ·· ♦ · « · • ♦·· sodného a nad síranem sodným. Surový produkt se čistí rychlou chromatografii na koloně při eluci směsí cyklohexanu a etyl acetát v poměru 1:1 za vzniku 2,24 g výsledné sloučeniny jako bílé pevné látky.

HPLC systém 1: Rt =11,1 minut.

Meziprodukt 9 metylester kyseliny 3-chloro-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]benzoové

Na směs 4,5 g metylesteru 3-chlor-5-hydroxy-benzoové kyseliny⁴, 6,3 g trifenylfosfinu, 3,65 g (S)-2-(pyridin-4-ylamino)-propan-1 -olu a 100 ml tetrahydrofuranu se působí 10 minut s 5,7 ml dietylazodikarboxylátu. Vytvořený reakční roztok se 96 hodin míchá při tepíotě místnosti v atmosféře dusíku. Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku a surový produkt se čistí rychlou chromatografii na koloně při eluci dichlormetanu, metanolu a vodného roztoku amoniaku v poměru 97:3:0,3 za vzniku 1,5 g výsledné sloučeniny jako bezbarvého oleje.

H m otové spe ktrum: ΜH + 321._______________

Meziprodukt 10

3-chloro-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzoová kyselina

Směs 1,47 g metylesteru 3-chloro-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxybenzoové kyseliny v 15 ml etanolu a 4,6 ml 2M roztoku hydroxidu sodného se 3 hodiny zahřívá na teplotu 60°C. Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku a okyselí k pH 4 přidáním kyseliny octové. Na vytvořený roztok se působí dietyléterem a pevná látka jako sraženina se oddělí filtrací. Pevný produkt se smíchá s vodou, a pak se filtruje za vzniku 1,1 g výsledné sloučeniny jako béžové pevné látky Hmotové spektrum: MH+307.

Meziproduktu

N-[(1 S)-2-chlor-1 -metyletyl]pyridin-4-amin-hydrochlorid

Na roztok 15 g (S)-2-(pyridin-4-ylamino)-propan-1-olu ve 150 ml dichlormetanu se působí 59 g thionyl-chloridu, přičemž se teplota směsi udržuje nižší než 10°C. Vytvořená směs se 18 hodin míchá při teplotě místnosti. Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku za vzniku 20,1 g výsledné sloučeniny jako bílé pevné látky. Hmotové spektrum: MH+171.

Meziprodukt 12

N-etyl-3-hydroxy-N-izopropyl-5-metylbenzamid

Do zchlazené suspenze o teplotě nižší než 5°C 50 g 3-hydroxy-5-metylbenzoové kyseliny¹ ve 100 g trietylaminu a 500 ml toluenu se v atmosféře dusíku přidá 97,2 ml pivaloyl chloridu, a vytvořená směs se 2 hodiny míchá při teplotě 0-5°C. Přidá se 55,7 ml etyl-izopropylaminu, reakční směs se 2 hodiny míchá při teplotě 0-5°C, a pak se nechá ________zahřát na teplotu místnosti. Směs se dvakrát promyje vodou a zahustí za sníženého tlaku za vzniku tmavého olej. Tento olej se rozpustí v 500 ml etanolu a na roztok se 3 hodiny působí 5M roztoku 100 g hydroxidu sodného v 500 ml vody při teplotě místnosti. Po odstranění etanolu za sníženého tlaku se vytvořený zásaditý roztok zředí vodou a extrahuje toluenem. Zásaditý podíl se okyselí kpH 5 přidáním kyselin octové a vytvořená vodná směs se extrahuje dichlormetanem. Sloučené organické extrakty se promyjí nasyceným roztokem chloridu sodného a zahustí za sníženého tlaku za vzniku 41 g výsledné sloučeniny jako oranžovo-hnědé pevné látky.

Hmotové spektrum: MH+ 222.

Příklad 1

N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]benzamid

Do roztoku 5 g N-etyl-3-hydroxy-N-izopropyl-5-metyl-benzamidu v 50 ml dimetylformamidu se přidá 14,1 g uhličitanu draselného. Směs se zahřívá na teplotu 45°C a po částech se během 5 minut přidá 9,4 g N[(1S)-2-chlor-1-metyletyl]pyridin-4-amin-hydrochloridu. Směs se zahřívá na teplotu 115-120°C a 100 hodin se míchá při této teplotě. Po zchlazení na teplotu místnosti, se přidá -100 ml vody a vytvořená suspenze se extrahuje dichlormetanem. Sloučené organické podíly se promyjí 10% roztokem hydroxidu sodného (10 g hydroxidu sodného v 100 ml vody), suší se nad síranem horečnatým, filtrují se a zahustí za sníženého tlaku za vzniku hnědého oleje. Tento olej se čistí rychlou chromatografií na koloně při eluci gradientem poměrů směsi dichlormetanu, metanolu a vodného roztoku amoniaku od 98:1:1 do 94:5:1 za vzniku 4,4 g výsledné sloučeniny jako žlutého oleje. Hmotové spektrum: MH+ 356.

1H-NMR δ ppm (DMSO-d₆): 8,04 (1/2ΑΑΈΒ', 2H), 6,90 (brs, 1H), 6,72 (brs, 1H), 6,67 (brs, 1H), 6,58 (1/2ΑΑΈΒ', 2H), 4,45,3,83 (dvakrát brs, 1H), 4,05-3,90 (m, 3H), 3,33 (m, 2H), 2,32 (s, 3H), 1,28 (d, 3H), 1,301,05 (m,9H).

Výslednou sloučeninu příkladu 1 lze také připravit podle následujícího postupu:

N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]benzamid

Směs 0,1 g kyseliny 3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxybenzoové, 0,225 g TBTU, 0,5 ml DIPEA a 0,09 ml N-etylizopropylaminu ve 2 ml bezvodého dimetylformamidu se 60 hodin míchá při teplotě místnosti. Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku a zbytek se rozdělí mezi etylacetát a nasycený vodný roztok bikarbonátu sodného. Sloučené organické podíly se suší nad nasyceným roztokem chloridu sodného a nad síranem hořečnatým a zahustí se za sníženého tlaku. Surový produkt se čistí rychlou chromatografií na koloně Megabond při eluci směsí dichlormetanu, etanolu a vodného roztoku amoniaku v poměru 95: 5: 0,5 za vzniku 0,097 g výsledné sloučeniny jako žlutého oleje.

TLC (95:5:0,5): Rf0,3.

Hmotové spektrum: MH+ 356.

Obdobným způsobem se za použití komerčně dostupných aminu připraví:

Příklad 2

N,N-diizopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid TLC (95: 5: 0,5): Rf 0,1.

Hmotové spektrum: MH+ 370.

Příklad 3

N-izopropyl-3,N-dimetyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid TLC (95: 5: 0,5): Rf 0,3.

Hmotové spektrum: MH+ 342.

Příklad 4

3,N-dimetyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid TLC (95: 5; 0,5): Rf 0,3.

Hmotové spektrum :MH+ 342.

·· ·· ·· ·· • · · · · · ·· · · ··· · ·

Příklad 5

3-metyl-N,N-dipropyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid

TLC (95: 5: 0,5): Rf 0,3.

Hmotové spektrum: MH+ 370.

Příklad 6

N-etyl-3-metyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid

TLC (95: 5: 0,5): Rf 0,3.

Hmotové spektrum: MH+356.

Příklad 7

N-butyl-3-metyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid

TLC (95: 5: 0,5): Rf 0,3.

Hmotové spektrum: MH+ 384.

Příklad 8

N-cyklohexyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxybenzamiď

TLC (95: 5: 0,5): Rf 0,3.

Hmotové spektrum: MH+ 410.

Příklad 9

N-izopropyl-3-metyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]benzamid

TLC (100:8:1): Rf 0,3.

Hmotové spektrum: MH+ 370.

• Φ· ·» ·· ·· · · « · · » · · • ·· « ♦ ··« · ·

Příklad 10

3-chlor-N-izopropyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]benzamid

Směs O,1g 3-chlor-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy-benzoové kyseliny, 0,225 g TBTU, 0,5 ml DIPEA a 0,067 g N-propylizopropylaminu ve 2 ml bezvodého dimetylformamidu se 24 hodin míchá při teplotě místnosti. Směs se vlije do nasyceného vodného roztoku bikarbonátu sodného a extrahuje se etylacetátem. Sloučené organické extrakty se zahustí za sníženého tlaku a zbytek se čistí rychlou chromatografií na koloně Megabond při eluci směsí dichlormetanu, metanolu a vodného roztoku amoniaku v poměru 95:5:0,5 za vzniku 0,08 g výsledné sloučeniny jako žlutého oleje. TLC (97: 3: 0,3): Rf 0,2. .

Hmotové spektrum: MH+ 390.

Příklad 11

3-chloro-N,N-diizopropyl-5-[2-(pyridin-4-ylamino)-butoxy]-benzamid-hydrochlorid

Ňa směs 0,05 gi 3-chlor-5-hýdróxy-N,N-diizopropyl-benzamidu, 0,023 g 2-(pyridin-4-yl-amino)-butan-1-olu, 0,04 g trifenylfosfinu a 1 ml toluenu se působí 0,03 ml diizopropyl-azodikarboxylátu a vytvořený roztok se 8 dní míchá v atmosféře dusíku. Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku a zbytek se čistí rychlou chromatografií na koloně při eluci směsí chloroformu, metanolu a vodného roztoku amoniaku v poměru 90:10:1 za vzniku surového vzorku výsledné sloučeniny, který se čistí preparativní HPLC (systém A) a na čištěný produkt se působí 1M roztokem chlorovodíku v dietyléteru za vzniku 0,002 g výsledné sloučeniny jako pryže.

Hmotové spektrum: MH+ 404,

HPLC systém 1: Rt 11,1 minut.

• *·	··	• «	·· ·
• * ·	• «	•	• · ··
• ♦·	• ·	···	• · ·
·· ··	··	··	·· ··

Příklad 12

N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid-hydrochlorid

Ve 35 ml 2M roztoku kyseliny chlorovodíkové se rozpustí 6,21 g Netyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamidu a reakční směs se míchá 10 minut, a pak se směs zahustí za sníženého tlaku. Vytvořený zbytek se dvakrát azeotropicky destiluje acetnitrilem. Celý postup se opakuje za vzniku 6,19 g výsledné sloučeniny jako amorfního prášku.

Hmotové spektrum: MH+ 356.

HPLC systém 1: Rt 7,0 minut.

Výslednou sloučeninu příkladu 12 lze také připravit podle následujícího postupu:

N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]benzamid-hydrochlorid

Na směs 10,3 g—1 ,T-(azodikarbonyl)-dipiperidinu a 10,3 g tributylfosfinu v 350 ml toluenu se působí 4,1 g (S)-2-(pyridin-4ylamino)-propan-1-olu a 12 g N-etyl-3-hydroxy-N-izopropyl-5-metylbenzamidu a vytvořený roztok se 24 hodin míchá při teplotě 40°C v atmosféře dusíku. Reakční směs se filtruje a filtrát se zahustí za sníženého tlaku za vzniku světle hnědého oleje, který se částečně čistí preparativní HPLC (systém B). V dichlormetanu se rozpustí 21,17 g vytvořeného oleje v dichlormetanu a promyje vodným roztokem amoniaku, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, a pak se zahustí za sníženého tlaku za vzniku 5,74 g oleje. Olej se rozpustí v 50 ml tetrahydrofuranu, do směsi se přidá 0,52 ml metanolu a 1,2 ml acetyl chloridu a 30 minut míchá při teplotě místnosti. Roztok se zahustí za sníženého tlaku, a pak se vytvořený zbytek azeotropicky destiluje

sloučeniny jako 3,7 g bílé pěny.

Hmotové spektrum: MH+ 356.

1H-NMR δ ppm (DMSO-d₆): 13,62 (brs, 1H), 8,84 (brd, 1H), 8,22, 8,07 (brd, 2H), 7,02, 6,93 (dvakrát brd, 2H), 6,78 (brs, 1H), 6,68 (brs, 1H), 6,60 (brs, 1H), 4,40, 3,76 (brs, 1H), 4,22 (m, 1H), 4,06, 3,98 (ABX, 2H), 3,29, 3,12 (dvakrát brs, 2H), 2,27 (s, 3H), 1,28 (d, 3H), 1,25-1,00 (brm, 9H).

Příklad 13

4-metyl-benzensulfonát N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4ylamino)-propoxy]-benzamidu

Do roztoku 3 g N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxybenzamidu v 30 ml izopropylalkoholu se přidá 1,62 g ptoluen-sulfonové kyseliny a vytvořený roztok se 30 minut míchá při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku za vzniku světle žlutého oleje, který se znovu rozpustí v 10 ml izopropylalkoholu. Vytvořený roztok se pak přidá do 50 ml diizopropyléteru. Vznikne 3,22 g výsledné sloučeniny jako bílé krystalické pevné-látky.-------Hmotové spektrum: MH+ 356.

¹H-NMR δ ppm (DMSO-d₆): 13,09 (brs, 1H), 8,61 (brd, 1H), 8,23, 8,08 (dvakrát t/2AA'BB’, 2H), 7,48 (1/2AA'BB’, 2H), 7,11 (1/2AA’BB', 2H), 7,03, 6,88 (dvakrát Y2AA'BB', 2H), 6,78 (brs, 1H), 6,68 (brs, 1H), 6,60 (brs, 1H), 4,40, 3,76 (dvakrát brs, 1H), 4,22 (m, 1H), 4,09, 3,97 (ABX, ^j2H), 3,29, 3,12 (dvakrát brs, 2H), 2,28 (s, 6 hodin), 1,27 (d, 3H), 1,24

1,02 (m,9H).

Příklad 14

2-hydroxybenzoát N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamidu

ylamino)-propoxy]benzamidu v 3,2 ml toluenu se přidá roztok 0,25 g salicylové kyseliny v 1,2 ml tetrahydrofuranu a vytvořený roztok se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti. Roztok se zchladí na teplotu 0°C a zředí 5 ml diizopropyléteru, přičemž nedojde ke krystalizaci. Roztok se pak zahustí za sníženého tlaku za vzniku 1,0 g výsledné sloučeniny jako pěny.

Hmotové spektrum: MH+ 356.

¹H-NMR δ ppm (CDCl₃): 8,02 (brd, 2H), 7,95 (dd, 1H), 7,61 (brd, 1H), 7,31 (dt, 1H), 6,91 (brd, 1H), 6,80 (dt, 1H), 6,70 (brs, 1H), 6,66 (brd, 2H), 6,56 (brs, 1H), 4,59, 3,92 (dvakrát brs, 1H), 4,07-3,82 (třikrát m, 3H), 3,38,3,20 (dvakrát brs, 2H), 2,30 (s, 3H), 1,35 (d, 3H), 1,26 (brt, 3H), 1,13 (brd, 6H).

Příklad 15 (2R,3R)-2,3-dihydroxybutandiolát N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S(pyridin-4-ylamino)propoxy]-benzamidu

Do roztoku 0,65 g N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4ylamino)-propoxybenzamidu v 3,2 ml tetrahydrofuranu se přidá roztok 0,28 g L-tartarové kyseliny v 5 ml metanolu. Při teplotě místnosti nejde ke krystalizaci. Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku za vzniku bezbarvé pryže, která se rozpustí v minimálním množství izopropylalkoholu a následně se přidá do přebytku 250 ml diizopropyléteru. Vytvořený roztok se 2 dny míchá při teplotě místnosti a filtruje se za vzniku výsledné sloučeniny jako 0,82 g bílé pevné látky. Hmotové spektrum: MH+ 356.

¹H-NMR δ ppm (DMSO-d₆): 8,12 (1/2AA'BB’, 2H), 7,97 (d, 1H), 6,83 (1/2ΑΑΈΒ·, 2H), 6,79 (brs, 1H), 6,68 (brs, 1H), 6,61 (brs, 1H), 4,40, 3,76 (dvakrát brs, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,04 (s + ABX, 3H), 3,98 (ABX, 1H), 3,28, 3,13 (dvakrát brs, 2H), 2,28 (s, 3H), 1,27 (d, 3H), 1,241,00 (m,9H).

Příklad 16

4-aminobenzensulfonát N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamidu

Do roztoku 0,65 g N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4ylamino)-propoxy]benzamidu v 3,2 ml tetrahydrofuranu se přidá suspenze 0,32 g sulfanilové kyseliny v 5 ml vody. Vytvořený čirý roztok se 2,5 hodiny míchá při teplotě místnosti, a pak se zahustí za sníženého tlaku. Vytvořený zbytek se rozpustí v 30 ml diizopropyléteru a po 2 dnech se filtruje za vzniku 0,86 g výsledné sloučeniny jako bílého prášku. _x

Hmotové spektrum: MH+ 356.

¹H-NMR δ ppm (DMSO-d₆): 13,1 (brs, 1H), 8,61 (brd, ΊΗ), 8,23, 8,08 (dvakrát 1/2AA’BB', 2H), 7,30 (1/2AA'BB’, 2H), 7,03, 6,88 (dvakrát 4ΑΑ'ΒΒ·, 2H), 6,78 (brs, 1H), 6,68 (brs, 1H), 6,60 (brs, 1H), 6,54 (1/2ΑΑΈΒ·, 2H), 6,02 (brs, 2H), 4,40, 3,76 (dvakrát brs, 1H), 4,23 (m, 1H), 4,09, 3,97 (ABX, 2H), 3,29, 3,12 (dvakrát brs, 2H), 2,28 (s, 3H), 1,28 (d, 3H), 1,24-1,00 (m, 9H).

Literatura: ' ‘ ~ ;

1) F.A .Turner, JE Gearien, J. Org. Chem., 1959, 1952.

2) T.A. Kelly, D.W. McNeil, Tetrahedron Lett., 1994, 35(48), 9003.

3) M.V. Sargent, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1982, 1095.

4) T. Kimio, S. Sumio, O. Masaru, Heterocycles, 1985, 23 (6), 1483.

Deriváty obecného vzorce I lze použít ve farmaceutických přípravcích, jejichž detailní popis výroby je následně uveden.

ldUi<JLV piv pciuianii ►λ α>4Α í P WCl I I I

A. Přímé lisování

	%hmotnostních
Účinná látka	32,7
Bezvodá laktóza	36,8
Mikrokrystalická celulóza	25,0
Želatina kukuřičného škrobu	5,0
Stearát horečnatý	0,5

Účinná látka se proseje a smísí s pomocnými látkami. Vytvořená směs se lisuje do tablet za použití tabletového lisu s vhodně zvoleným průměrem tablet.

Lze použít i tabletovačky rotační.

Tablety rozdílné velikosti účinku lze připravit změnou poměru léčiva a laktózy nebo změnou kompresní hmotnosti a za použití vhodných razidel. ^τ /

B. Tablety prášku zrněného za vlhka (i)

	%hmotnostních
Účinná látka	3,5
Laktóza	73,25
Škrob	15,0
Želatinový kukuřičný škrob	7,5
Stearát horečnatý	0,75

Účinná látka se proseje přes vhodné síto a smísí se s laktózou, škrobem a želatinou kukuřičného škrobu. Přidají se vhodně zvolené objemové podíly čištěné vody a prášek se nechá granulovat. Po sušení se granulát proseje a smísí se stearátem horečnatým. Prášek zrněný za vlhka se lisuje do tablet vhodně zvoleného průměru. Finální produkt neobsahuje vodu použitou během granulace za vlhka.

Lze použít i tabletovačky rotační.

Tablety rozdílné velikosti účinku lze připravit změnou poměru léčiva a laktózy nebo změnou kompresní hmotnosti a za použití vhodných razníků.

Tablety prášku zrněného za vlhka (ii) %hmotnostních

Účinná látka/laktóza, granulovina *93,0

Mikrokrystalická celulóza5,5

Sodná sůl sesítěné karmelózyTjO“

Stearát horečnatý0,5

Účinná látka/laktóza, granulovina* \	%hmotnostních
Účinná látka	50,0
Laktóza	50,0
Čištěná voda	quantum satis + (qs)
+ Finální produkt neobsahuje vodu	použitou během granulace za
vlhka. Obvykle 100-140 g / kg směsi.

Účinná látka a laktóza se smísí a přidáním čištěné vody se připraví granulovina, která se suší a proseje se a vytvořený prášek se smísí s ostatními pomocnými látkami používanými při výrobě tablet. Směs se lisuje do tablet.

Lze použít i tabletovačky rotační.

Tablety lze opatřit filmovým obalem (hydroxypropylmetylcelulóza) a pigmentem začleněného do přípravku běžnými postupy. Tablety lze eventuálně opatřit sacharidovým nebo enterosolventním obalem.

Obalová suspenze	%hmotnostních
Hydroxypropyl-metylcelulóza	10,0
Opaspray	5,0
Čištěná voda	k 100,0++

nebo

Obalová suspenze	%hmotnostních \|
Opadry	10,0
Čištěná voda	k100. 00++

++ Finální produkt neobsahuje vodu použitou během granulace za vlhka.

Lisované obalované tablety

Účinnou látku a pomocné látky (plnidla, pojidla, látky usnadňující rozpadavost a kluzné látky) lze začlenit do jádra tablety, které se vlisuje do vnějšího obalu tablety (obalování jádra lisováním) za použití pomocných látek (na pH nezávislých hydrofilních polymerů, plnidel, pojidel, látek usnadňujících rozpadavost a kluzných látek). Vnější obal může obsahovat i účinnou látku. Lisování jádra i vnější obalové vrstvy se provádí běžnými technologickými postupy.

Šumivé tablety

%hmotnostních
Účinná látka i	8,75
Bikarbonát sodný i	41,03
Bezvodý citrát sodný	41,22
Aspartam í	2,5
Polyvinylpyrolidon j	2,0
Benzoát sodný	3,0
Pomerančová příchuť í	1,0
Citrónová příchuť j	0,5
Absolutní alkohol ke granulaci	qs

Účinná látka, bezvodý citrát sodný, bikarbonát sodný a aspartam se smísí a přidáním polyvinylpyrolidonu v alkoholu se směs zpracuje na granulovinu, která se suší a proseje. Granulát se smísí s benzoátem sodným a látkami na úpravu chuti. Granulát se lisuje do tablet vhodně zvoleného průměru. Lze použít i tabletovačky rotační.

Tobolky plněné kapalinou pro perorální podání

Kapalný přípravek se připraví za stálého míchání pomalým přidáváním účinné látky do ostatních činidel.

Příklad	A %hmotnostních	B %hmotnostních
Účinná látka	18,2	18,2
Kyselina olejová	60,985	68,485
Polyetylen-glykol 600	7,3.	7,3
Polyetylen-glykol	6,00	6,00
Polysorbat 80	7,5	-
Askorbyl-palmitát	0,015	0,015

Tekutý přípravek se plní do želatinových tobolek. Velikost tobolek a použité plnidlo ovlivňují poměr hmotnosti k objemu a tím dávky účinné látky v jedné tobolce. ’

Tobolky plněné práškem

	%hmotnostních
Účinná látka	24,5
Laktóza	75,0
Stearát horečnatý	0,5

i,,¹

Účinná látka se proseje a smísí s pomocnými látkami. Směs se plní do tvrdých želatinových tobolek za použití vhodné techniky. Dávkování se určí hmotností náplně a velikostí tobolky.

Sirup

	mg/5 ml dávky
Účinná látka	49,0
Hydroxypropyl-metylcelulóza	22,5
(typ dle viskosity 4000)
Pufr	qs
Příchuť	qs
Barvivo	qs
Konzervační látka	qs
Sladidlo	qs
Čištěná voda	k 5,0 ml

Hydroxypropyl-metylcelulóza se uvede do disperze v horké vodě, zchladí se, a pak se smísí s vodným roztokem obsahujícího účinnou látku a ostatními složkami přípravku. Objem se upraví a sirup se přefiltruje.

• ···

	mg/5 ml dávky
Účinná látka	.49,0
Stearát hlinitý	75,0
Sladidla	qs
Barviva	9^S
Příchuť	qs
Frakcionovaný kokosový olej	k 5,0 ml

Stearát hlinitý se uvede do disperze v přibližně 90% frakcionovaného kokosového oleje. Vytvořená suspenze se za stálého míchání zahřívá na teplotu 115°C, a pak se zchladí. Přidá se sladidlo, vhodná příchuť a barvivo a účinná látka se uvede do disperze. Zbylým frakcionovaným kokosovým olejem se upraví objem suspenze a vše se promíchá.

Tablety pro sublinqvální podáni

	%hmotnostních
Účinná látka/laktóza granulát*	49,0
Lisovatelný cukr	50,5
Stearát hořečnatý	0,5

Účinná látka se proseje přes vhodné síto, smísí se s pomocnými látkami a lisuje se. Tablety různé síly účinku se připraví změnou

hmotnosti obsahu lisované tablety a za použití vhodných velikostí razníků.

Lze použít i rotačních tabletovaček.

Rektální čípky

Účinná látka	j 490 mg
*Witepsol W32	1,0 g

* Adeps Solidus Ph Eur

Suspenze účinné látky v tekutém Witepsolu se plní za použití vhodné techniky do forem k výrobě 1g čípků.

Injekční přípravky

	% hmotnostně/objemových
Účinná látka _____ _	- - - -i-	_______________________LO___________________________
Injekční voda Β. P.	I	k 100

Do roztoku se přidá chlorid sodný k úpravě tonicity roztoku a pH lze upravit k dosažení maximální stability a/nebo vlastnosti roztoku lze také zlepšit přidáním kyseliny, zásady nebo vhodného pufru. Lze také přidat antioxidační činidla a chelatační soli kovů. Roztok se čistí, přidáním vody se upraví ke konečnému objemu a eventuálně se změří a upraví hodnota pH.

Roztok se asepticky plní do uzavřených ampulí, vialek nebo injekčních stříkaček (roztok se sterilizuje filtrací a plní se do sterilních ampulí za

-5 C λ +ip. bn.r- !-> HArlmínaL·'! ο/πλΚλ ca ctarili^i lia fwahřívá n ím v ailtaklávill QQ G L· llUI\y Vi I |J VVÍ I Η 11 I Vl\y V4/ I I VM V W V* ní L V· I I I !£-. VI j V» V* I I I IVMIIIIII V M w k v t\i VÍ v w y .

Roztok se balí v inertní atmosféře dusíku.

Preferujeme roztoky plněné do ampulí, uzavřené zatavením sklem a následně sterilizované.

Inhalační přípravky

Práškové inhalační lékové formy:

	mg/tobolka
Účinná látka (míkronizována)	0,56
Laktóza	25,00

Účinná látka se mikronizuje v koloidním mlýnu na jemné částice, a následně se smísí s laktózou pro výrobu tablet za použití vysokoenergetického mísícího zařízení. Prášek se plní do tobolek z tvrdé želatiny č. 3 za použití vhodné techniky. Obsah takto připravených tobolek se aplikují vhodným inhalátorem (Glaxo Rotahaler).

Dávkovaný aerosol v tlakovém balení ,

suspenzni aerosol	mg/ naměřená dávka	na 1 balení
Účinná látka (mikronizovaná)	0,280	73,92 mg
Kyselina olejová	0,020	5,28 mg
Izopentan	23,64	5,67 g
Tetrafluoretan	61,25	14,70 g

UCinna laika 3Θ niíkroniZujG V kolOidriÍHi mlynU Πια ΐθΓΠΓιθ CaStlCC, 3 následně se smísí kyselinou olejovou při teplotě 10-15°C za použití vysokoenergetického mísícího zařízení.

Suspenze se odměří do hliníkových zásobníků, které se opatří vhodnými ventily k aplikaci odměřené, 85 mg dávky suspenze a balení se naplní dichlordifluormetanem.

Nosní aerosol

	% hmotnostně/objemových
Účinná látka	7,0
Chlorid sodný	0,9
Čištěná voda	k 100
hmotnost 1 dávky	100 mg (odpovídá 7 mg účinné látky)

---------------------Účinná látka a chlorid sodný se rozpustí v části vody₇ objem se upraví přidáním vody a důkladně se promíchá.

Hodnotu pH lze upravit k dosažení maximální stability roztoku přidáním kyseliny, zásady nebo vhodného pufru. V případě přípravku obsahujícího více dávek se do přípravku přidá vhodné konzervační činidlo (benzalkanium-chlorid a fenyletylalkohol).

Claims

PATENTOVÉ NAROK Y

1. Benzamidové deriváty obecného vzorce I:

(l) , kde R¹ je Ci_4alkyl nebo C₃-8cykioalkyl,

R² je C-|.4aíkyl nebo C₃.4alkenyl,

R³ je atom vodíku, Ci-3alkyl nebo atom halogenu,

R⁴ je Ci.6alkyl a jejich farmaceuticky vhodné deriváty nebo solváty.
2. Benzamidový derivát obecného vzorce I podle nároku 1, kde R je metyl, nebo jeho farmaceuticky vhodný derivát nebo solvát.
3. Benzamidový derivát obecného vzorce I podle nároku 1, kde R⁴ je metyl, nebo jeho farmaceuticky vhodný derivát nebo solvát.
4. Benzamidový derivát obecného vzorce I podle nároku 1 ze skupiny:

N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxyJbenzamid,

N,N-diizopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin4-ylamino)-propoxy]benzamid,

N-izopropyl-3,N-dimetyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxyJ-benzamid,

3,N-dimetyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid,

3-metyl-N,N-dipropyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]-benzamid,

-benzamid,

N-butyl-3-metyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxyj-benzamid,

N-cyklohexyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxyj-benzamid,

N-izopropyl-3-metyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]benzamid,

3-chloro-N-izopropyl-N-propyl-5-[2S-(pyridin-4-ylamino)-propoxy]benzamid,

3-chloro-N,N-diizopropyl-5-[2-(pyridin-4-ylamino)-butoxy]-benzamid a jejich farmaceuticky vhodné deriváty nebo solváty.
5. Benzamidový derivát obecného vzorce I podle nároku 1, kterým je 4-metylbenzensulfonát N-etyl-N-izopropyl-3-metyl-5-[2S-(pyridin-4ylamino)-propyloxy]-benzamidu nebo jeho farmaceuticky vhodný derivát nebo solvát.
6. Způsob terapie a/nebo profylaxe savců, včetně člověka, trpícího stavy, které lze ovlivnit podáním inhibitorů trombinu vyznačující se tím, že se pacientovi podá účinné množství benzamidového derivátu obecného vzorce I podle nároků 1-5 nebo jeho farmaceuticky vhodný derivát nebo solvát.
7. Použití benzamidového derivátu podle 'nároků 1-5 nebo jeho farmaceuticky vhodného derivátu nebo solvátu v terapii.
8. Použití benzamidového derivátu podle nároků 1-5 nebo jeho farmaceuticky vhodného derivátu nebo solvátu k výrobě lékového přípravku pro terapii stavů, které lze ovlivnit podáním inhibitorů trombinu.
9. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje benzamidový derivát obecného vzorce I podle nároků 1-5 nebo jeho farmaceuticky vhodný derivát nebo soivát spolecne s jedním nebo více vhodnými nosiči.
10. Způsob výroby benzamidového derivátu obecného vzorce I podle nároků 1-5, v y z n a č u j í c í se tím, ž e se stává z jednoho z následujících kroků:

A) odstranění ochranné skupiny derivátu obecného vzorce II:

, kde P¹ je vhodná ochranná skupina,

B) reakce derivátu obecného vzorce III s derivátem obecného vzorce IV:

(IV) , kde R⁷ je atom vodíku a L je hydroxyl.

C) reakce derivátu obecného vzorce III s derivátem obecného vzorce IV, kde R⁷ je atom vodíku a L je vhodná odštěpitelná skupina, za přítomnosti zásady nebo

D) reakce derivátu obecného

VI:

vzorce V s derivátem obecného vzorce ,kde R⁷ je atom vodíku, za přítomnosti aktivačního činidla nebo činidel a zásady.