CZ20003973A3 - Prostředek proti nachlazení obsahující isomalt jako účinnou látku - Google Patents

Abstract

Předkládaný vynález se týká použití směsí sacharidových alkoholů jako terapeutických účinných látek.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití směsi sacharidových alkoholů obsahující 6-0-a-D-glukopyranosyl-D-sorbitol-(1, β-GPS) a 1-0-a-D-glukopyranosyl-D-mannitol-(1,1-GPM) v lécích, potravinách a poživatinách jako terapeutické, zejména imunitu stimulující a/nebo antibakteriální účinné látky, zejména ve spojení se zinkem, a také výrobků obsahujících tyto substance.

Dosavadní stav techniky

Nachlazení je nemoc velmi rozšířená, která způsobuje nepříjemné obtíže. Nachlazení způsobují mikroorganismy, například bakterie jako Staphylococcus aureus nebo viry jako Rhinoviry, zdržují se v napadených organismech většinou v prostředí krku, hrtanu a nosu, kde mohou být obecně přímo zdolány účinnými látkami. Vhodné aplikační formy pro farmakologické účinné látky jsou například pastilky, žvýkačky nebo komprimáty. Tyto aplikační formy se vyznačují tím, že se jedná o pevné formulace, které se pomalu rozpouštějí v prostředí krku a hrtanu, a tím zabraňují mikroorganismům, nacházejícím se na povrchu sliznic, v jejich rozmnožování a rozšiřování.

Zinek je známý jako farmaceuticky účinná substance pro zdolávání mikroorganismů vyvolávajících nachlazení. Ve studii s rhinoviry mohlo být dokázáno, že antivirový efekt • · přímo závisí na množství nevázaných iontů Zn²⁺ (Merluzzi et al., v: Research Communications in Chemical Pathology and Pharmacology Vol. 66, (1989) 3, 425-440). Volné zinkové ionty, to znamená nevázané v komplexu, jsou dnes považovány za farmakologicky prostředek, který značně zmírňuje symptomy nemocí z nachlazení co se týká jejich trvání i jejich závažnosti. (Mossad et al., v: Annals of Internal Medicine, Vol. 125 (1996) 2, 81-87 a Godfrey et al., v: Alternativě Therapies, Vol. 2, (1996) 6, 63-72). Podstatným předpokladem pro pozorovaný terapeutický efekt zinku je nutnost, aby se farmaceutické nosiče obsahující ionty zinku, například pastilky, užívaly od začátku nástupu symptomů pokud možno nepřerušovaně, například každé 1,5 až 2 hodiny, v pravidelných intervalech a nechaly se rozpustit v ústech. Důvod pro to spočívá v tom, že ionty zinku působí topicky v prostředí úst, nosu a hrtanu.

Tento způsob kontinuální aplikace účinné látky v prostoru úst s sebou však přináší řadu závažných nežádoucích účinků, neboť monosacharidy a disacharidy obsažené ve většině případů ve farmaceutických nosičích způsobují tvorbu zubního kazu. Z tohoto důvodu je výhodné použít jako náhradu cukru, který způsobuje tvorbu zubního kazu, látky nepoškozující zuby, kterými lze cukr zaměnit. Jako látky, kterými lze v preparátech obsahujících zinek nahradit cukr, jsou známy sorbitol a mannitol. Použití sorbitolu a mannitolu s sebou nicméně přináší tu nevýhodu, že se v prostředí úst a hrdla rychle rozpouštějí, takže není vždy zaručena požadovaná co nejdelší a kontinuální doba působení iontů zinku. Dále je známo například z US patentu 5,409,905 a 5,002,970, že sorbitol a mannitol vykazují schopnost tvořit komplexy s kovy a také se zinkem.

Z Godfrey et al. v: The Journal of International Medical • · • · ·

Research 20 (1992), 234-246 a Zarembo et al., v Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 81, (1992) 2, 128-130, je také známo, že mannitol a sorbitol tvoří komplexy se zinkem a kromě toho, že pastilky obsahující mannitol, sorbitol a sůl zinku vykazují úměrně tomu značně snížené působení vzhledem k časovému zkrácení a zmírnění symptomů nachlazení (Smith et al., v: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 33 (1989) 5, 646-648). Tvořící se komplexy sorbitolu a mannitolu se zinkem převádějí zinek do farmaceuticky neúčinné formy.

Podstata vynálezu

Technický problém, který je základem předkládaného vynálezu, spočívá tedy v tom, připravit produkt, který slouží k obecné stimulaci imunitní obrany a zmírnění a zdolávání nemocí z nachlazení, avšak současně působí proti vzniku zubních kazů a redukuje kalorickou hodnotu, a také zajišťuje dlouhodobě účinné uvolňování účinné látky. Předkládaný vynález řeší tento problém tím, že dává k dispozici používání směsi sacharidových alkoholů obsahující 1,6- GPS- a 11,1-GPM v léčivech, potravinách a poživatinách jako terapeuticky účinnou látku, zvláště jako imunostimulants a/nebo jako antimikrobiální účinnou látku. Překvapivě bylo totiž možno ukázat, že směs 1,6-GPS a 1,1GPM, zvláště přibližně ekvimolární směs těchto dvou sacharidových alkoholů obsahující 43-57 hmotnostních procent

1,1-GPM a 57-43 hmotnostních procent 1,6-GPS (vztaženo na SL, suchou látku), označovaná také jako isomalt, hydratovaná isomaltulosa nebo Palatinit®, působí antimikrobiálně, navíc však také snižuje kalorickou hodnotu a působí proti vzniku zubních kazů, vykazuje ale také velmi dobrou zpracovatelnost, také přechází pomaleji než sorbitol do roztoku, takže umožňuje prodloužené uvolňování účinné látky.

Překvapivě přitom vyšlo také najevo, že tato směs z 1,6-GPS a 1,1-GFM vykazuje imunostimulační působení a zvyšuje tělesnou i buněčnou imunitu a odolnost vůči infekcím.

Ve zvlášť výhodné formě provedení předkládaného vynálezu vykazuje směs sacharidových alkoholů obsahující 1,6-GPS a 1,1-GPM také 1,1-GPS (1-0-a-D-glukopyranosyl-Dsorbitol) a popřípadě malá množství hydratovaných nebo nehydratovaných mono-, di- a oligosacharidů, xylit, erythrit, maltit, hydratované glukozové a škrobové sirupy, laktit a také polydextrozu. Směsi sacharidových alkoholů použitelné podle vynálezu jsou například známy z EP 0 625 578 Bl, které jsou - pokud jde o podobné směsi sacharidových alkoholů a jejich přípravu - zahrnuty v obsahu odhalení tohoto objevu. Zejména se vynález týká výše uvedených směsí sacharidových alkoholů, přičemž tyto mohou obsahovat například 10-50 hmotnostních procent 1,6-GPS, 0,5-20 hmotnostních procent 1,1-GPS a 30-70 hmotnostních procent

1,1-GPM (vztaženo na SL) . V dalším upřednostňovaném způsobu provedení mohou zmíněné směsi sacharidových alkoholů obsahovat 5-10 hmotnostních procent 1,6-GPS, 30-40 hmotnostních procent 1,1-GPS a 45-60 hmotnostních procent

1,1-GPM (vztaženo na TS) .

V souvislosti s předkládaným vynálezem se léčivem hlavně rozumí prostředek posilující nebo obnovující zdraví lidského nebo zvířecího těla, který může být jak profylkaktické povahy, tak léčivé povahy a zahrnuje terapeutickou účinnou látku, která vyvolává tento účinek. Terapeutická účinná látka může v souvislosti s předkládaným vynálezem sloužit také k léčbě nemocí a poruch tělesných funkcí jakož i k profylaxi.

• *

V souvislosti s předkládaným vynálezem se pod pojmem potravina rozumí produkt sloužící převážně k výživě lidského nebo zvířecího těla jako například jogurt, marmeláda, zavařenina, včetně takzvaných „functional foods, zatímco pod pojmem poživatina se rozumí produkt sloužící převážně příjemným chuťovým pocitům jako například žvýkačka, bonbon, karamela, čokoláda, pečivo, sušenka, želatinový medvídek a nebo podobné. Právě tak jako zmiňované potraviny i poživatiny mohou být na základě svého obsahu terapeuticky působících látek, tedy 1,1-GPM a 1,6-GPS, výhodně v kombinaci se zinkem, označeny také jako léčiva.

Jak bylo zmíněno, působí podle vynálezu použitá směs sacharidových alkoholů, zvláště spolu se zinkem, jako antimikrobiální účinná látka případně jako směs účinných látek, to znamená že směs vykazuje níže uvedené definované vlastnosti antimikrobiální účinné látky. V souvislosti s předkládaným vynálezem se pod pojmem antimikrobiální účinná látka rozumí účinná látka, která působí na bakterie a sice jak na grampozitivní tak i na gramnegativní bakterie, protozoa, viry, bakteriofágy, retroviry, viroidy, kvasinky, řasy, houby a/nebo podobné mikroorganismy, přičemž působení spočívá v bránění růstu a/nebo rozmnožování a/nebo usmrcování mikroorganismů, tedy mikrobiostatickém a/nebo mikrobicidním působení. Ve zvláště výhodné formě provedení vynálezu vykazuje antimikrobiální účinná látka obzvláštní bakteriostatické a/nebo baktericidní a/nebo antivirové působení. Toto působení se rozvíjí především, obzvláště při použití účinné látky podle vynálezu, v pastilkách, topicky v prostoru úst a hrtanu.

Směs sacharidových alkoholů použitá podle vynálezu vykazuje, zvláště spolu se zinkem, imunostimulační působení, to znamená zlepšuje zejména tělu vlastní obrannyschopnost proti abnormálním a tělu cizím vlivům, zvláště parazitům nebo bakteriálním nebo virovým infekcím patogenními zárodky, včetně původců onemocnění dýchacího a gastrointestinálního traktu a působí proti vzniku tumorů. Imunostimulační působení se vyznačuje zvláště přichystáním a uvolněním imunoreaktivních látek. Toto působení se rozvíjí zvláště na základě spolknutého, to znamená v gastrointestinálním traktu se nacházejícího, produktu podle vynálezu.

V jedné obzvlášť výhodné formě provedení předkládaného vynálezu se stanoví, že se směsi sacharidových alkoholů obsahující 1,6-GPS a 1,1-GPM použité podle vynálezu kombinují se zinkem, zvláště s anorganickými nebo organickými solemi zinku jako je glukonát zinečnatý nebo octan zinečnatý. Překvapivě se ukázalo, že přestože - jak je z literatury známo - sorbitol a mannitol tvoří komplexy se zinkem, a proto produkty obsahující sorbitol a mannitol s obsahem zinku nemají žádnou podstatnou funkci ve zdolávání nachlazení nebo stimulaci imunity, rozpuštěné směsi sacharidových alkoholů obsahující 1,6-GPS a 1,1-GPM použité podle vynálezu, které navíc obsahují zinek, vykazují podobné komplexotvorné chování, které lze pozorovat i u produktů na bázi směsí sacharózy/glukózy, a proto se ionty zinku vyskytují převážně ve formě nevázané v komplexu a podle toho mohou rozvíjet svou antimikrobiální a imunostimulační funkci. Toto zjištění je třeba shledávat překvapujícím mimo jiné proto, že sacharidové alkoholy 1,6-GPS a 1,1-GPM jsou deriváty sorbitolu eventuelně mannitolu, které by musely podle očekávání tvořit ve velké míře komplexy se zinkem. Vynález se proto týká také použití směsi zmíněných sacharidových alkoholů a iontů zinku jako antimikrobiální účinné látky eventuelně jako antimikrobiální kombinace účinných látek, zvláště jako prostředku proti nachlazení, jakož i jako imunostimulans.

V souvislosti s předkládaným vynálezem se volnými nebo v komplexu nevázanými ionty zinku rozumí takové ionty zinku, které ve vodném roztoku tvoří jen labilní aquakomplexy, jak je vykazuje každý ion ve vodném médiu ve formě solvatační sféry. Volné nebo v komplexu nevázané ionty zinku nejsou podle toho asociované s jinými substancemi ve formě komplexu.

Ve výhodné formě provedení tohoto vynálezu činí podíl zinku ve směsi sacharidových alkoholů 0,5-10 mg zinku na g sacharidového alkoholu, především 1-5 mg zinku na g sacharidového alkoholu. Předkládaný vynález se týká také použití jmenovaných směsí sacharidových alkoholů, zvláště

1.1- GPM a 1,6-GPS, s výhodou v kombinaci se zinkem a/nebo

1.1- GPS, k přípravě léčiva, které působí imunostimulačně a/nebo antimikrobiálně.

Předkládaný vynález se podle toho týká také produktů, zvláště léčiv, potravin a poživatin, které obsahují zmíněné směsi sacharidových alkoholů, zvláště směsi sacharidových alkoholů obsahující 1,1-GPM a 1,6-GPS ve spojení se zinkem, zvláště organickými nebo anorganickými solemi zinku. V obzvláště výhodné formě provedení vynálezu činí poměr hmotností sacharidových alkoholů 1,1-GPM a 1,6-GPS obsažených v produktu, téměř 1:1, to znamená, že v produktu obsažená směs sacharidových alkoholů z 1,1-GPM a 1,6-GPS je isomalt. Podle vynálezu lze ale předpokládat, že se směs sacharidových alkoholů skládá z 1,1-GPM, 1,6-GPS a 1,1-GPS, po případě obsahuje směs těchto směsí sacharidových ·· *·. _ ♦ 99« » 9 9

9 99 9· · _β · 9 9 · • 9 9 9 9 ·

99 99 · alkoholů, eventuelně spolu se zbytkovým množstvím jiných sacharidových alkoholů a oligosacharidů.

Produkty podle vynálezu mohou být k dispozici ve formě orálních aplikačních forem jako jsou pastilky, tablety, komprimáty, šťávy, tvrdé nebo měkké karamely nebo jako suspenze, spreje, inhalační směsi nebo podobné.

Použití podle vynálezu eventuelně produkty podle vynálezu se vyznačují také matricí zvláště chránící zuby ve formě směsi sacharidových alkoholů použité podle vynálezu z 1,1-GPM ' a 1,6-GPS, eventuelně v kombinaci s 1,1-GPS, přičemž eventuelně přítomné zinečnaté ionty nemají tvorbou komplexů poškozenou svou účinnost proti mikroorganismům způsobujícím nemoci z nachlazení jako jsou rhinoviry nebo účinnost jako imunostimulans. Produkty podle vynálezu, zejména provedené jako prostředek proti nachlazení, respektive jejich použití podle vynálezu, se vyznačují kromě toho nízkou rychlostí uvolňování ve srovnání se známými produkty, takže účinná látka může být poskytována po dlouhý čas na žádaném místě působení. Konečně mají směsi sacharidových alkoholů použité podle vynálezu redukovanou kalorickou hodnotu, jsou vhodné i pro diabetiky a dovolují přípravu produktů s dobrou skladovatelností, takže umožňují méně nákladné balení. Na základě své zlepšené skladovatelností, například oproti produktům obsahujícím cukr, se produkty podle vynálezu hodí obzvláště také pro nasazení ve vlhkých tropických oblastech, které jsou často oblastmi s nedostatkem zinku a vysokým nebezpečím infekce.

Vynález se v další formě provedení týká také dříve jmenovaných použití a dříve jmenovaných produktů obsahujících zinek, přičemž směs sacharidových alkoholů je ·· • · to · * « · ·· · • ·· · · · • · · · · ·· ·· směsí obohacenou buď 1,6-GPS nebo 1,1-GPM, jak je popsáno v DE 195 32 396 C2 obsahovat 1,6-GPS a procent procent

Taková směs obohacená 1,6-GPS může

1,1-GPM v poměru od 57 hmotnostních 43 hmotnostním procentům až do 99 hmotnostních 1 hmotnostnímu procentu (vztaženo na SL) . Taková směs obohacená 1,1-GPM může například obsahovat 1,6-GPS a v poměru od 1 hmotnostního procenta

1,1-GPM rychlosti obzvláště součástí, kinetiky : 99 hmotnostním procentům až do 43 hmotnostních procent : 57 hmotnostním procentům (vztaženo na SL) . Variací vzájemných poměrů množství sacharidových alkoholů umožněnou podle vynálezu lze nastavit požadovanou rychlost rozpouštění připravených produktů. Podle požadovaného použití a pro aplikaci účinné látky může být nastaven určitý vzájemný poměr směsí sacharidových alkoholů, takže mohou být nastaveny téměř libovolné rychlosti rozpouštění a tím i uvolnění farmakologicky účinných zinku. To spočívá v tom, že se rozpouštění sacharidových alkoholů 1,6-GPS a 1,1-GPM a 1,1GPS značně navzájem liší. Tak se 1,1-GPM vyznačuje podstatně nižší rychlostí rozpouštění než 1,6-GPS nebo jiných substancí přicházejících v úvahu pro toto použití. V případech, kdy se požaduje rychlé uvolnění účinné látky, zvláště zinku, jsou podle vynálezu nasazovány směsi obohacené 1,6-GPS s jeho zvýšenou rychlostí uvolňování, zatímco v případech, ve kterých jde o časově prodloužené uvolňování farmaceutika, jsou v první řadě nasazovány směsi obohacené 1,1-GPM.

Dále se vynález v upřednostňované formě provedení týká použití směsi sacharidových alkoholů z minimálně 98 hmotnostních procent 1,6-GPS a 1,1-GPM, ve které je obsaženo až 85 hmotnostních procent 1,6-GPS a 25 až 15 hmotnostních procent 1,1-GPM a která se označuje jako • · fe· ·· • fefe · • · ·· • fefe · • · · fe ·· fefe

isomalt GS. Dodatečně mohou být ve směsi sacharidových alkoholů k dispozici malá množství mannitolu a sorbitolu, na příklad právě 0,5 hmotnostních procent.

V další výhodné formě provedení může být směs sacharidových alkoholů, která - vztaženo na celkové množství směsi - obsahuje více než 90 hmotnostních procent 1,1-GPM a

1.6- GPS, přičemž nejvyšší množství mannitolu je stanoveno na 3 hmotnostní procenta a sorbitolu na 6 hmotnostních procent. Taková směs isomaltu se označuje jako isomalt HC.

V jedné z dalších výhodných forem provedení je směs sacharidových alkoholů, která vykazuje více než 95 hmotnostních procent 1,6-GPS a 1,1-GPM, přičemž z toho je 43 až 57 hmotnostních procent 1,6-GPS. V této formě provedení se stanovuje nejvyšší množství mannitolu 1 hmotnostní procento a sorbitolu 2 hmotnostní procenta. Takový isomalt se označuje jako isomalt HB.

Potom se v další výhodné formě provedení předpokládá směs sacharidových alkoholů, která vykazuje více než 98 hmotnostních procent 1,6-GPS a 1,1-GPM, z čehož je 75 až 85 hmotnostních procent 1,1-GPM a 25 až 15 hmotnostních procent

1.6- GPS. V takové formě provedení jsou nejvyšší množství mannitolu stanovena na 0,5 hmotnostních procent a sorbitolu na 0,5 hmotnostních procent. Tato směs sacharidových alkoholů se označuje jako isomalt GS.

Výše zmíněné směsi sacharidových alkoholů mohou být s výhodou aplikovány při použití podle vynálezu a v léčivech podle vynálezu, přičemž obzvláště výhodné je, že se nepoužívá žádné další sladidlo, cukr nebo náhražky cukru.

• · ·· ♦·

I * « «

I · ·4

Β · · ·

Β · · 1 • · 4 · že produkty podle vynálezu případně podle vynálezu použitá směs sacharidových alkoholů z 1,1-GPM a 1,6-GPS obsahují navíc intenzivní sladidla jako acesulfam-K, aspartam, cyklamát, glycirrhizin, neotam, neohesperidin DHC, steviosid, sukralóza, thaumatin, sacharin nebo podobné. S výhodou k tomu obsahují produkty podle vynálezu popřípadě podle vynálezu použitá směs sacharidových alkoholů 1,1-GPM a

1,6-GPS pochutiny a aromatické látky jako aroma citronu nebo máty. Produkty podle vynálezu popřípadě podle vynálezu použitá směs sacharidových alkoholů z 1,1-GPM a 1,6-GPS mohou obsahovat také s potravinami slučitelné kyseliny jako kyselinu askorbovou, kyselinu jablečnou nebo kyselinu glukonovou, jakož i jako kluzné látky mastné kyseliny nebo jejich soli jako stearan hořečnatý nebo stearan sodný. Konečně může být, že v produktech podle vynálezu popřípadě ve směsi sacharidových alkoholů z 1,1-GPM a 1,6-GPS použité podle vynálezu jsou obsažena barviva a/nebo rozvolňovadla jako modifikované škroby, polyvinylpyrrolidony (PVP) nebo karboxylmethylcelulóza. Taková směs se označuje jako isomalt GS.

Podle vynálezu mohou být ve výhodné formě provedení vedle sacharidových alkoholů 1,1-GPM a 1,6-GPS podle vynálezu zahrnuty v produktech nebo použitích také enzymy, koenzymy, minerální látky, vitamíny, antibiotika, nikotin, kofein, eukalyptus, kodein, fenacetin, paracetamol, acetylaminofenoly, kyselina acetylosalicylová, mentol nebo jiné farmakologicky aktivní účinné látky (srovnej Smít M.B.H. a Feldmann W. „Over-the-counter cold medications; viz: A critical review of clinical trials between 1950 and 1991, v: JAMA 269, (1993) 2258-2263). Farmaceuticky aktivní účinné látky, zvláště zinek, jsou v množství, které způsobuje požadovaný farmakologický efekt.

• ·

Vynález v upřednostňované formě provedení také stanovuje, že potraviny, léčiva a pochutiny obsahující 1,1GPM a 1,6-GPS, zvláště také zinek, právě tak jako popřípadě

1,1-GPS a eventuelně další jmenované látky jsou úplně nebo v podstatě bez cukru, to znamená zvláště bez sacharózy a/nebo fruktózy a/nebo glukózy. Pod pojmem v podstatě bez cukru se rozumí, že se vyskytuje maximálně 10 hmotnostních procent, s výhodou 5 hmotnostních procent a zvláště výhodně maximálně 1 hmotnostní procento cukru (vztaženo na celkovou hmotnost produktu).

Produkty podle vynálezu se ve výhodné formě provedení vyznačují tím, že neobsahují cukr, pečují o zuby, nevyvolávají karies a nepůsobí proto tvorbu matricí plaku. Navíc produkty podle vynálezu jsou na rozdíl od lehce stravitelných produktů obsahujících glukózu vhodné pro diabetiky, neboť isomalt je enzymy tenkého střeva jen pomalu a neúplně štěpen a tím skoro nebo vůbec nezvyšuje hladinu glukózy v krvi. Glykemický index a insulinová odpověď jsou díky tomu nízké. Dále je isomalt, který dospěl do tlustého střeva , fermentován na mastné kyseliny s krátkým řetězcem a působi tím proti zácpám, kterými často trpí zvláště starší lidé.

Další výhodné úpravy vynálezu vyplývají z nároků.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude blíže vysvětlen prostřednictvím konkrétních příkladů provedení a příkladů znázorněných na obrázcích, na kterých představuje ·

4 4 ·

9 44 • 4 4 9 9

4 4 ·

49

444 49 4 obr. 1 Vliv isomaltu a soli zinku jakož i srovnávacích substancí na růst Staphylococcus aureus obr. 2 Poměr odumírání Staphylococcus aureus v 60 % roztoku isomaltu (80 dílů 1,6-GPS / 20 dílů 1,1GPM) .

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Antibakteriální účinek isomaltu

Staphylococcus aureus byl kultivován při 37 °C v CASOmédiu, kam byl kromě zdroje uhlíku glukózy (5 %) přidán dodatečně isomalt (0,58 M) . Růst bakteriálních kultur v třepací baňce se určil po 16 h na základě optické hustoty (OD₅78 ) a porovnával s kontrolou (CASO-médium bez isomaltu).Přitom se ve všech pokusech zjistilo, že růst kultur pěstovaných v isomaltu je zbrzděn o více než 50 %. V porovnání s tím byl růst v ekvimolárních množstvích sorbitolu (0,58 M) redukován pouze na 75 % (viz obr. 1, vzorky 1, 2 a 5).

Dále mohl být dokázán antibakteriální efekt 60 % roztoku obohaceného 1,6-GPS (80/20 dílů 1, 6-GPS/l,1-GPM) (viz obr. 2 pro poměr odumírání Staphylococcus aureus).

Vysoce koncentrovaný 60 % roztok isomaltu byl kontaminován asi 1000 zárodky různých bakterií (Staphylococcus aureus a Streptococcus pneumoniae) a v různých časových intervalech byly odebírány vzorky.

Zárodky, které v roztoku přežily, byly zviditelněny filtrací *· ·· .··.

« * · * · · • · ·· · ;

« 1 » · · « ’ • · · · · ·· ·· »· ·» • t • · « * <

• · přes filtr (0,45 μπι) a inkubací filtru na selektivních agarových živných půdách. Mohlo být ukázáno, že právě po 30 minutách se značně zredukoval počet zárodků a po jednom dni (1140 min) se bakterie skoro vůbec nedaly dokázat.

Příklad 2: Antibakteriální účinek zinku/isomaltu

Tvrdé karamely isomaltu, do kterých byl zapracován glukonát zinečnatý eventuelně octan zinečnatý (2,5 mg zinku na g isomaltu), byly rozpuštěny 20 % (w/v) v CASO-médiu a naočkovány čerstvou kulturou Staphylococcus aureus. Růst bakterií při 37 °C v třepací baňce byl stanoven na základě optické hustoty (OD₅7g) po 16 h a porovnán s kontrolou (CASOmédium bez tvrdé karamely). Ani kombinace isomalt-glukonát zinečnatý ani isomalt-octan zinečnatý nedopustila růst bakterií. Ve všech kulturách byla naměřena optická hustota 0,0 (viz obr. 1, vzorky 3 a 4).

Příklad 3: Stanovení volných iontů zinku v roztocích cukru, sacharidového alkoholu a tvrdé karamely ml roztoku glukonátu zinečnatého (2 g glukonátu zinečnatého v 250 ml vody zcela zbavené solí) se smíchá s 10 ml roztoku polyolu (1,0 cukru eventuelně sacharidového alkoholu v 25 ml vody zcela zbavené solí) a 2 ml acetátového pufru (pH =6,0) a temperuje se v kyvetě na 35 °C.

Potom se v malých množstvích přikapává 1 molární roztok NaHCCh a pomocí fotometru měřícího zakalení se určí zákal.

V tabulce jsou porovnány isomalt, sacharóza, glukóza, tvrdé karamely isomaltu, glukonát zinečnatý použitý jako zdroj zinku jakož i dva obchodní výrobky, přičemž celkové množství iontů zinku odpovídá pokaždé 26 mg v 50 ml roztoku.

• 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0

00 0 0 0 0 O 0 0 «0 00 ·· 000 0· ®00

Volné ionty zinku a jejich procentuální podíl (celkového množství) ukazují, že za přítomnosti isomaltu (i jako tvrdé karamely) existuje relativně mnoho volných iontů zinku v porovnání s jinými polyoly.

Cukr/sacharidový alkohol/ tvrdá karamela	Ionty zinku volné v roztoku* (v mg v 50 ml roztoku)	Procentuální podíl
volných (v nevázaných) (v %)	komplexu iontů
ísomalt	15,11	58
Glukóza	13, 00	50
Sacharóza	12,40	48
Isomalt/tvrdé karamely	10,40	40
Tvrdé karamely obchodního produktu A	3, 90	15
Tvrdé karamely obchodního produktu B	3,80	15
Glukonát zinečnatý	14, 62	64

* Normováno na stejnou koncentraci iontů zinku ee ·· φ φ · · · • · · · ···· ··· ···· ··· ·· φ φ · ·>♦ φ · · · · φφφφ φφ · φφ • · ·· β· ·* φ φφ φ

Tabulka: Nefelometrické stanovení volných iontů zinku v přítomnosti polyolů (obchodní produkt A: tvrdá karamela ze sacharózového a glukózového sirupu smísená s gíukonátem zinečnatým;

obchodní produkt B: tvrdá karamela ze sacharózového a glukózového sirupu smísená s gíukonátem zinečnatým a citrónovým aromátem.)

Příklad 4: Antirhinovirová aktivita isomalt-zinkových preparátů

Výchozí suroviny a testovací postupy:

S ohledem na jejich možnou antivirovou aktivitu byly společně s 5 mg/ml isomaltu (ekvimolární směs 1,1-GPM a 1,6GPS) testovány čtyři různé koncentrace zinku (0,125 mM, 0,1 mM a 0,075 mM a 0,05 mM) ve formě glukonátu zinečnatého a octanu zinečnatého. Pro každou z kombinací byly provedeny tři identické násady pro tři různé rhinovirové typy sér, jakož i pokaždé jedna kontrola za vložení EDTA (v ekvimolárním množství k soli zinku). Další kontroly zahrnovaly isomalt bez soli zinku a každou koncentraci soli zinku bez isomaltu.

Působení jmenovaných preparátů na rhinoviry se testovalo na HeLa buňkách (získaných z ATCC Rockville MD, katalogové číslo CRL-1958). HeLa buněčné linie byly kultivovány na Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM), supiementovány fetálním hovězím sérem (5 % konečná koncentrace) a gentamycin sulfátu (50 gg/ml konečná koncentrace). Buněčné kultury se inkubovaly při 37 °C ve vlhké 5 % atmosféře CO2. Při přítomnosti viru byla inkubační teplota snížena na 33 °C.

Φ Φ »· ·· φ ·· • ΦΦΦ · φ · · * φ φ φ φ φφ · * φ ·· φ φφ < · · · » φφ φ

Rhinovirové kmeny se ponechaly růst na HeLa buňkách a TCID50 (titr s 50 % infekčností tkáňové kultury) se zjišťoval pomoci postupného zřeďování.

Buňky se sklízely za ošetření trypsinem, spočítaly a do každého prohloubení mikrotitrové destičky s 96 jamkami bylo vyseto v koncentraci 25.000 buněk na jamku. Po naočkování se destičky inkubovaly přes noc při 37 °C ve vlhké 5 % atmosféře CO₂ a následující den bylo médium z buněk odstraněno a nahrazeno 175 μΐ 1,143 x koncentrace odpovídající kombinace testovaných substancí. Destičky byly inkubovány při 37 °C ve vlhké 5 % atmosféře CO2 po dobu jedné hodiny.

Po této inkubaci byly jamky přemístěny pro vyhodnocení antivirové aktivity pokaždé s 25 μΐ roztoku DMEM s 100 TCID₅₀ příslušného viru. Jako virová kontrola ( bez preparátu zinku) sloužilo 6 jamek 'a deska a 6 dalších jamek jako buněčná kontrola (bez preparátu zinku a bez viru). Destičky byly potom inkubovány při 37 °C v 5 % atmosféře CO2 a zkoumány pod mikroskopem na cytopatogenní efekty.

Výsledky:

Antivirová aktivita byla určena jako snížení cytopatogenního účinku rhinovirů v HeLa buňkách. Stanovení se provedla mikroskopicky eventuelně za použití kolorimetrických testů. Určení bylo stanoveno k časovému okamžiku, kdy virové kontroly (bez přídavku zinekisomaltových preparátů) vykazovaly plnou symptomatiku virového cytopatogenního účinku. Pro rhinovirový typ 7 se hodnocení antirhinovirové aktivity provádělo tři dny po infekci a pro typy sér 1 A a 2 čtyři dny po infekci. Buněčné • · • · · · • β ·

I «ι χ * ·· λ · « kontroly (HeLa buňky bez viru) nevykazovaly žádné symptomy virové infekce, zatímco virové kontroly (HeLa buňky s virem bez zinek-isomaltového preparátu) vykazovaly plnou symptomatiku virové infekce.

Virová infekce tkáňových kultur HeLa vede k histologickým změnám buněk. Ty mohou být pozorovány mikroskopicky například podle změny buněčného tvaru a desorpce povrchů. V průběhu virové infekce mohou být buňky totiž zničeny a/nebo odděleny od substrátu. Přítomnost symptomatiky existující virové infekce byla analyzována jak mikroskopicky tak i prostřednictvím barvivových metod. Při barevné analýze se využívá toho, že se infikované buňky oddělují a vymývají ze substrátu. Jamky s buňkami, které jsou chráněné proti virové infekci, vykazují potom v barevném testu tmavěji zabarvenou buněčnou vrstvu než jamky s nechráněnými buňkami, neboť v druhém případě se vyskytuje méně buněk, které by mohly přispívat k zabarvení buněčné vrstvy.

Proti rhinoviru typu la bylo pozorováno antivirové působení 0,1 mM glukonátu zinečnatého ve spojení s isomaltem proti infekci rhinovirem typu IA. Právě tak se dosáhlo antivirové aktivity proti rhinoviru typu IA pro 0,1 mM octan zinečnatý ve spojení s isomaltem a 0,075 mM glukonát zinečnatý ve spojení s isomaltem. Tyto aktivity byly vsak nižší než aktivita dosažená s 0,1 mM glukonátem zinečnatým ve spojení s isomaltem.

Proti rhinoviru typu 2 se dosáhlo antivirového účinku s

0,1 mM octanem sodným spolu s isomaltem právě tak jako s 0,1 mM glukonátem zinečnatým ve spojení s isomaltem, jakož i, i když ve slabším rozsahu, s 0,075 mM glukonátem zinečnatým ve

spojení s isomaltem, jakož i 0,1 mM glukonátem zinečnatým bez isomaltu.

Proti rhinoviru typu 7 byl pokaždé s 0, 05, 0,075 a 0,1 mM octanem sodným ve spojení s isomaltem, jakož i 0,05 mM glukonátem zinečnatým ve spojení s isomaltem pozorován antivirový efekt, který odpovídal cca rozsahu účinku 0,075 mM glukonátu zinečnatého ve spojení s isomaltem proti rhinoviru 2.

Antivirové aktivity proti rhinoviru typu la a 2 mohly být zvýšeny přidáním EDTA v množství ekvimolárním k soli zinku. To spočívá v „hypotéze volných iontů diskutované v úvodním popisu. Octan zinečnatý a glukonát zinečnatý samotné vykazují jen relativně slabě vyjádřenou antivirovou ochranu 0,1 mM glukonátem (bez isomaltu). Ochrana dosažená 0,1 mM glukonátem zinečnatým byla však signifikantně slabší než ochrana dosažená 0,1 mM octanem zinečnatým nebo glukonátem zinečnatým, jakož i ochrana dosažená ve spojení s isomaltem.

Tyto údaje ukazují, že farmaceutické preparáty obsahující isomalt a glukonát zinečnatý nebo octan zinečnatý poskytují lepší ochranu proti rhinovirovým infekcím než samotné preparáty zinku.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití směsi sacharidových alkoholů obsahující 1, 6-GPS-(6-O-a-D-glukopyranosyl-D-sorbitol a 1,1-GPM-(l-0-αD-glukopyranosyl-D-marmitol v potravinách, lécích, a poživatinách jako terapeutické účinné látky.
2. 2. Použití podle nároku 1, přičemž účinná látka je antimikrobiální účinná látka.

   terapeutická
3. 3. Použití podle nároku 1 účinná látka je imunostimulans.

   přičemž terapeutická
4. 4. Použití podle některého z předchozích nároků, přičemž 1,β-GPS a 1,1-GPM ve směsi sacharidových alkoholů jsou v přibližně ekvimolárních množstvích.
5. 5. Použití podle některého z nároků 1 až 3, přičemž směs sacharidových alkoholů je směs obohacená o 1,6-GPS nebo 1,1-GPM.
6. 6. Použití podle nároku 5, přičemž ve směsi sacharidových alkoholů je obsaženo 75 až 85 % hmotn. 1,6-GPS a 25 až 15 % hmotn. 1,1-GPM.
7. 7. Použití podle nároku 5, přičemž ve směsi sacharidových alkoholů je 75 až 85 % hmotn. 1,1-GPM a 25 až 15 % hmotn. 1,6-GPS.
8. 8. Použití podle některého z nároků 1 až 3 nebo 5 až 7, přičemž směs sacharidových alkoholů navíc obsahuje (1,1GPS)-1-0-a-D-glukopyranosyl-D-sorbitol) .

   ·· «· ·· * ·· ···· · « »· · · • · ·« · » 1 · · « · · · * « · · 11 1

   19 11 11 1 11

   19 99 91 191 11
9. 9. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, přičemž směs sacharidových alkoholů obsahuje navíc zinek.

   10. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, přičemž zinek je ve formě organických nebo anorganických solí. 11. Použití podle kteréhokoli z předcházej ících nároků, přičemž zinečnatá sůl je glukonát zinečnatý nebo octan zinečnatý. 12. Použití podle kteréhokoli z předcházej ících

   nároků, přičemž směs sacharidových alkoholů obsahuje navíc barviva, aromatické látky, pochutiny, poživatinové kyseliny nebo malé podíly dalších sacharidových alkoholů.
10. 13. Použiti podle kteréhokoli z předcházejících nároků, přičemž potravina, poživatina nebo léčivo je tvrdá karamela, měkká karamela, komprimát, pastilka nebo žvýkačka.
11. 14. Léčivo pro lidskou nebo zvířecí konzumaci, obsahující 1,1-GPM a 1,6-GPS jakož i 0,5 - 10 mg zinku na jeden gram sacharidového alkoholu.
12. 15. Léčivo podle nároku 14, přičemž léčivo navíc obsahuj e 1,1-GPS.

    16. Léčivo podle některého z nároků 14 nebo 15, přičemž léčivo obs ahuj e 1,1-GPM a 1,6-GPS v přibližně ekvimolárních množstvích. 17. Léčivo podle některého z nároků 14 nebo 15,

    • a ·· « · · ·· · • a a · · · a a « a a ·· • · · a a » · · a a a a a a * « a a a a a a 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9» 99 99 999 99 999 přičemž léčivo obsahuje 1,1-GPM a 1,6-GPS ve formě směsí obohacených 1,1-GPM nebo 1,6-GPS.
13. 18. Léčivo podle nároku 17, přičemž léčivo obsahuje 75 až 85 % hmotn. 1,1-GPM a 25 až 15 % hmotn. 1,6-GPS.
14. 19. Léčivo podle nároku 14 nebo 15, přičemž léčivo obsahuje 15 až 25 % hmotn. 1,1-GPM a 75 až 85 % hmotn. 1,6-GPS.
15. 20. Léčivo podle kteréhokoli z nároků 14 až 19, přičemž zinek je ve formě anorganických nebo organických solí.

    Β· Β * Β · • ♦ · · 4 • Β Β * '

    ZnGlu = glukonát zinecnatý ZnAc « octan zinečnatý