CZ20001765A3 - Způsob přípravy pyrrolo[3,2-b]pyridinu a meziprodukty - Google Patents

Abstract

Způsoby a meziprodukty obecného vzorce (I), kde X a R mají specifický význam pro přípravu 5-amino-3-(lmethylpiperidin-4-yl)-pyrrolo[3,2-b]-pyridinu

Description

2/00Způsob přípravy pyrrolo(3,2-b)pyri dinu a meziprodukty

Oblast techniky

Tento vynález náleží do oblasti farmaceutické chemie a syntetické organické chemie a poskytuje způsoby a klíčové meziprodukty pro syntézu N-/propionyl/-5-amino~3~( 1-methyl~pi per i di n-4-yl ) pyrro 1 o/3,2-b/pyr i di nu a selektivního 5-HTj.f agonisty.

Dosavadní stav techniky

Serotonin (5-HT) vykazuje různé fyziologické aktivity zprostředkované přinejmenším sedmi třídami receptorů, z nichž nejvíce heterogenní se zdá 5-HTi . Lidský gen, který představuje jeden z těchto receptorů subtypu 5~HTi nazývaný HTif, izoloval Kao a spolupracovníci (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, .90, 408 až 412 ( 1993). Tento 5-HTif receptor vykazuje farmaceutický profil rozdílný od jakéhokoliv již popsaného serotonergického receptorů.

Moskowitz navrhl, že v současné době neznámé spouštěče bolestí stimulují trigeminá1 ní ganglie, která povzbuzují vaskulaturu v cefalícké tkáni, čímž dochází k uvolnění vazoaktivních neuropeptidů z axonů na vaskulatuře. Tyto uvolněné neuropeptidy potom aktivují sérii dějů, jejichž následkem je bolest. Tento neurogenický zánět je blokován sumatri pianovými a námelovými alkaloidy mechanizmem, který zahrnuje 5-HT receptory, o kterých se předpokládá, že úzce souvisí s podtypem 5-HTio, umístěným na trigeminovaskulárních vláknech (Neurology, 43 (suppl.3) 16 až 20 (1993). Bylo ukázáno, že agonisty 5~HTip receptorů inhibují extravakaci peptidů vlivem stimulace trigeminální ganglie (Audia a Nissen, US patent č. 5 521 198).

• · · · · 9 9 9 9 »9 99 • · · 9 9 · 9 9 · 9 9 • · 99999 9999 • 999 9 99* 99 9 ·· ·· · 9 9 9 9 ··· 9999 99 999 99 99

Sloučeniny vykazující afinitu pro 5-HTif receptor poskytují nový přístup pro léčení nemocí spojených s abnormální serotonergickou neurotransmisí. Sloučeniny selektivní pro receptor podtypu 5-HTif jsou, navíc, pro léčení takových nemocí potencionálně vhodné, protože způsobují menší množství nežádoucích vedlejších účinků. N-/Propi ony 1 / -5-ami no-3-{1-methy1píperidin-4-yl )-pyrro1o/3,2-b/pyridin je selektivní 5-HTif agonista, který lze připravit acylací 5-amino-3~(1-methy 1 pi per idin-4 ~yl)pyrrolo[3,2-b]piperidinu.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje způsob přípravy 5-amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo3,2-b]pyridinu (A) zahrnující následující kroky:

i) kondenzaci l-hydroxy-S-ídimethylaminomethylenimino)-pyrro1o/3,2-b/pyridi nu (F) s 1-methyl-4-pi per idinonem za přítomnosti báze, čímž vznikne 1-hydroxy-5-(dimethy1-amí nomethy 1 en i mi no)~3~(1-methyl-1,2,3,8™tetrahydropyridin-4-y1)pyrro 1 o[3,2-b]pyridin (J), ii) případné odstranění chránící skupiny (J), čímž vznikne 1-hydroxy-5-ami no-3~(1-methyl-1,2,3,8-tetrahydropyridin-4-yl)pyrro 1o[3,2-b]pyridi η (H) a iii) hydrogenací bud” (J) nebo (H).

* · ♦ ·»···· ·· · · • · · · · « · · * · * • · ····· · · · · • ···· ·«*··« • » · · »·»·· ··· ···· ·· ·«· ·· ··

Předložený vynález rovněž poskytuje způsob přípravy

5-ami no~3~(1-methy1pi per i d i n-4-yl)pyrro1 o[3,2-b]pyri di nu (A) zahrnující následující kroky:

i) kondenzaci 1~hydroxy~5~amínopyrro1o/3,2-b/pyridinu (G) s 1-methyl~4~piper idinonem v přítomnosti báze, čímž vznikne 1-hydroxy-5-ami no-3-(1-methy1-1,2,3,6-tetrahydro-pyridin-4-y1)pyrro1o/3,2-b/pyridin ( H) a i i) hydrogenac i ( H) .

Předložený vynález poskytuje navíc způsob přípravy

5- ami no-3~(1-methylp i per i d i n-4-yl)pyrrolo-[3,2~b]pyridinu (A), zahrnující následující kroky:

i) nitraci 6-amino-2-piko1 i nu za vzniku mononitrováného

6- amino-2-piko1 i nu, skládající se ze směsi 3-nitro— a 5-nitro-6-amino-2-piko1 inů (B), i i) případné dělení směsi 3-nitro- a 5-nitro-6-amino-2-pikolinů (Β), čímž vznikne mononitrováný 6-amino-2-piko1 in skládající se z vpodstatě čistého 3~nitro-6-amino-2-piko1 i nu (C), iii) reakci mononitrováného 6-amino-2-piko1 i nu vybraného z ( B) nebo (C) s dimethy1aminoformylaČním činidlem, čímž vznikne 2~(2-dimethylaminoethen~1-yl)-3-nitro“

-6-( d i methyl ami nomethyl en i mi no) pyr i d i η (E) a i v) hydrogenaci (E) v přítomnosti kyseliny za vzniku

1-hydroxy-5-d i methy1ami nomethyleni mi nopyrrolo[3,2-b]~

-pyr i d i nu (F), • · ·

v) reakci (F) s 1-methyl-4-piper idinonem v přítomnosti báze, čímž vznikne 1-hydroxy-5~(dimethy1aminomethy1eni mi no)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4~yl)pyrro 1 o[3,2-b]~ pyr i d i n ( J) , vi) případné odstranění chránící skupiny (J) za vzniku 1-hydroxy-5-ami no-3~(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyr idin-4-y1)pyrro1 o[3,2~b]piridi nu ( H) a vii) hydrogenaci bud' (J) nebo (H) .

Dalším ztělesněním předloženého vynálezu je způsob přípravy N~/propi onyl / -5-ami no-3~(1-methylpi per i di n-4-yl)~ pyrro 1o/3,2-b/pyridi nu zahrnující acylaci 5-amino-3~(1 -methylpiperidin-4-yl)pyrrolo[3,2-b]pyridinu (A) připraveného jakýmkoliv z dříve popsaných způsobů.

Předložený vynález rovněž poskytuje způsob přípravy 1-hydroxy-5-di methy1ami nomethy1en i mi nopyrro 1 o[3,2-b]pyr ί d i nu (F), zahrnující následující kroky:

i) nitraci 6-amino-2~piko1 i nu čímž vznikne mononitrovaný 6-amino~2~piko1 in, skládající se ze směsi 3-nitroa 5-nitro-6-amino-2-piko 1 i nu (B), ii) případné dělení směsi 3-nitro- a 5-nitro~6~amino-2-pikolinu (B) za vzniku vpodstatě čistého 3~n i tr o-6-ami no-2 -p i ko1 i nu (C), iii) reakci mononitrováného 6-ami no-2-p i ko 1 i nu vybraného z (B) nebo (C) s dimethy1aminomethylačním činidlem, čímž vznikne 2-(2-dimethylaminoethen~1-yl)-3-nitro-6• · ···· ·« · · • * · · · # « · c« * · · t • · ··· 9 · 9·

-(dimethylaminomethylenimi no)pyridiη (E) a i v) hydrogenaci (E) v přítomnosti kyseliny.

Předložený vynález dále poskytuje 1-hydroxy-pyrroio[3, 2~b]pyridiny obecného vzorce I:

kde:

X je aminoskupina nebo ( CHj )2 WCH« N- a

R je vodík nebo 1-methyl-1,2,3,4-tetrahydropyridin-4-yl a jeho adiční soli s kyselinou.

Meziprodukt 1~hydroxy~5~{dimethylaminomethylenimino)pyrro1o[3,2-b]pyridi nu (F) se připraví pokud se vychází z 6-ami no-2-p i ko 1 i nu (6-amino~2-methylpyridi nu) postupem znázorněným ve schématu syntézy I.

Schéma syntézy I

Příprava mononitrováného 6~amino~2~-piko1 i nu

Nitrace 6-amino-2-piko1 i nu (6~amino~2~methylpiridinu) může být provedena standardními způsoby nitrace (Parker a Shive, Journal of Am. Chem. Soc., 69, 63 až 67 (1947)). Přednostně se přidá přibližně 1 ekvivalent koncentrované kyseliny dusičné v přibližně stejném objemu koncentrované kyseliny sírové k roztoku 6-amino-2-piko1 i nu v přibližně 2,5 až přibližné 10 objemech koncentrované kyseliny sírové vzhledem k objemu roztoku kyseliny dusičné. Zvláště se upřednostňuje způsob, kdy 6~ami no~-2“pi ko 1 i n je rozpuštěn v přibližně 5 objemech koncentrované kyseliny sírové vzhledem k objemu roztoku kyseliny dusičné.

Teplota roztoku 6~amino~2~piko1 i nu před přidáním roztoku kyseliny dusičné je přibližně od -15 °C do přibližně -5 ®C.

Teplota tohoto roztoku před přidáním roztoku kyseliny dusičné

• 9 · • · · · · • · • 9 • · · · ft • · ··· · • ·

je přednostně od přibližně -15 °C do přibližně -10 °C.

Zvláště se upřednostňuje, když je teplota tohoto roztoku přibližně -15 °C. Roztok kyseliny dusičné se přidává takovou rychlostí, aby se teplota reakční směsi udržovala na hodnotě od přibližně -15 °C do přibližně 160 °C. Teplota reakční směsi během přidávání roztoku kyseliny dusičné se přednostně udržuje na hodnotě od přibližně -15 °C do přibližné teploty místnosti. Více se upřednostňuje, když se teplota reakční směsi během přidávání roztoku kyseliny dusičné udržuje na hodnotě od přibližně -15 °C do přibližně 0 °C. Obzvláště se upřednostňuje, když se teplota reakční směsi během přidávání roztoku kyseliny dusičné udržuje na hodnotě od přibližně -1 °C do přibližně -2 °C. Rovněž se upřednotňuje, když je roztok kyseliny dusičné před přidáním roztoku 6~amino-2-piko1 i nu předchlazen na teplotu přibližně 0 °C.

Jakmile se přidá veškerý roztok kyseliny dusičné, reakční směs se postupně ponechá zahřát na teplotu místnosti, v obvyklém případě za déle než přibližně dvě hodiny, a potom se míchá přibližně dvě hodiny při teplotě místnosti. Upřednostňuje se, když proces ohřívání probíhá po etapách, přičemž se teplota reakční směsí udržuje na hodnotě od přibližně -1 °C do 0 °C po přibližně jednu hodinu od okamžiku, kdy bylo přidávání ukončeno. Zahřívání reakční směsi na přibližně 10 °C trvá přibližně jednu hodinu, přičemž teplota reakční směsi se udržuje přibližně 1 hodinu na asi 10 °C, potom se reakční směs zahřívá asi jednu hodinu na asi 20 °C a teplota reakční směsi se udržuje přibližně 1 hodinu na 20 «C.

Jakmile je reakce ukončena, pH reakční směsi se upraví přídavkem báze na hodnotu nejméně pH 9. Upřednostňuje se upravení pH reakční směsi na hodnotu okolo 9. Bází může být δ * · * φΦφφφφ ·· »t φφφφφφφ · φ « ' • · φφφφφ φ · · φ • φφφφ φφφφφφ • · φφ ΦΦ··· φφφ φφφφ φφ φφφ ·· ·· jakákoliv ve vodě rozpustná báze schopná neutralizovat kyselinu a upravit pH reakční směsi na potřebnou hladinu.

V obvyklém případě je báze hydroxidová zásada, jako hydroxid lithný, hydroxid draselný, hydroxid sodný nebo ammonium hydroxid amonný. Přednostně je zásadou hydroxid amonný. Produkt (B) se v obvyklém případě izoluje standardními technikami, přednostně filtrací.

Nitrační krok poskytuje směs, 3~nitro~6~amino“2-pikolinu: 5~n i tr o ~6~ami no-2-~p i ko i i nu obvykle v rozsahu přibližně 2:1. Tyto izomery mohou být před použitím pro další reakce, podle přání, odděleny, čímž vznikne vpodstatě čistý 3~-ni tro-6~ami no-2~pi ko 1 i n (C).

Výraz mononitrováný 6-amino-2-pi kol i η, jak je použit v předloženém vynálezu, se uvažuje bud^v jako směs 3~nitro-e-amino~2~piko1 i nu a 5~nitro-6-amino~2~piko1 i nu nebo jako vpodstatě čistý 3~ni tro~6~ami no-2-pi ko 1 i n.

Výraz vpodstatě čistý 3-nitro-S-amíno~2~piko1 i η, jak je v předloženém vynálezu použit, se uvažuje jako 3-nitro-6-amino~2~piko1 in, obsahující od 0 % do přibližně 2 S 5 ~ni tro~8-ami no-2-p iko 1 inu.

Vpodstatě čistý 3-nitro~6~amino-2-pikol in může být ze směsi nitračních produktů izolován přeháněním vodní parou, jak popisuje Parker a Shive, viz výše. 3~Nitro izomer může být dalším způsobem izolován sublimací. Přednostně může být vpodstatě čistý 3-nitro-6-amino-2-piko1 in ze směsi mononitrovaných izomerů izolován rekrystalizací z vhodného rozpouštědla. Vhodná rozpouštědla pro rekrystalizací zahrnují methylalkohol a toluen. Upřednostňované rekrysta1 i začni rozpouštědlo je toluen.

• · ···« « · • « · · « · • · · • · · • · · • · · ···· • · · · 9 ·

449 44 44

Př í prava 2-(2-dimethylaminoethylen-1-yl)-3~nitro-6“

-(di methylaminomethy1en i mi no)pyrrolo/3,2-b/pyridinu (E)

Mononitrovaný 6-amino-2-pikol in reaguje s dimethylaminoformylačním činidlem, v obvyklém případě dimethylformamiddi methylacetá1em nebo tris(dimethylamino)methanem ve vhodném rozpouštědle, obvykle v dimethylformamidu. Tato reakční směs· se po dva dny zahřívá pod refluxem na svoji teplotu varu, přičemž se během této doby reakční směs ochladí na teplotu místnosti.

V případě, kdy mononitrovaným 6-amino-2-piko1 inem je vpodstatě čistý 3-nitro-6-amino-2-piko1 in (C), může být produkt izolován odpařením dimethylformamidu a následnými násobnými koevaporačními cykly s toluenem. Přednostně se produkt z reakční směsi vysráží přidáním přibližně dvou objemů isopropanolu poté, co byla rekční směs ochlazena na teplotu místnosti.

V případě, že mononitrovaným 6-amino-2-piko1 inem je směs 3~nitro~ a 5-nitro-6-amino-2-piko1 i nu (Β), se ochlazená reakční směs nalije za intenzivního míchání do přibližně 20 objemů vody o teplotě asi 10 °C. Po míchání, které trvá nejméně asi 10 minut, se reakční směs zfiltruje a získá se 2~(2-d i methylaminoethyien-1-yl)~3-nitro-6“(dimethylamino~ methylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridín (E).

Upřednostňuje se, že mononitrovaný 6-amino-2-ρiko1 in, použitý v di methylaminoformylačním stupni je vpodstatě čistý 3-nitro-6-amino-2~piko1 in (C).

• · * · · · · * ftft ftft • ··· · · · · • · ···· · ftft · fc · · · · · · ftft ft • · · · ftftftft • ftft · · ftftft ftft ftft

Hydrogenace

2-~(2~Dimethylaminoethylen~1“yl)~3~nitro~6“

-(di methy1aminomethy1eni mi no)pyrroIo/3,2-b/pyridi η (E) se hydrogenuje za přítomnosti kyseliny na katalyzátoru ze vzácného kovu za vzniku 1~hydroxy~5~(di methylaminomethyl en i mi no) pyr r o 1 o/3 , 2-h/pyr i di nu (F). Substrát (E) se rozpustí ve vhodném rozpouštědle obsahujícím katalyzátor ze vzácného kovu. Vhodná rozpouštědla zahrnují nižší alkanoly, jako methylalkohol, ethylalkohol, propyla 1 koho 1 nebo isopropylalkohol a jejich směsi. Upřednostňovaná rozpouštědla zahrnují methylalkohol, ethylalkohol a jejich směsi. Methylalkohol a směsi methylalkoholu a ethylalkoholu jsou obzvláště upřednostňovaná rozpouštědla.

Odborník zkušený v oboru ocení, že při hydrogenaci substrátu (E) bude účinná celá řada běžně užívaných katalyzátorů ze vzácného kovu. Vhodné katalyzátory zahrnují platinu a palladium. Upřednostňovaným katalyzátorem je palladium. V případě, že katalyzátorem ze vzácného kovu je palladium, upřednostňuje se, aby byl vzácný kov nanesen na uhlí. Katalyzátory nanesené na uhlí obsahují v obvyklém případě od přibližně 5 do přibližně 10 X palladia. Obzvláště se upřednostňuje, že katalyzátor ze vzácného kovu je 10% pa 11 ad i um na uhlí.

Jakmile je substrát v rozpouštědle rozpuštěn, uvede se reakční směs do styku s přibližně od dvou do deseti ekvivalenty kyseliny. Pro způsob podle předloženého vynálezu je vhodná jakákoliv kyselina schopná dostatečného protonování aniž by byla tvorbě produktu na překážku. Vhodné kyseliny zahrnují, ale bez omezení, kyselinu trifluoroctovou, kyselinu methansu1fonovou, kyselinu trif1uormethansulfonovou, kyselinu f

1

9999

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9

9 9 9 9 9 9

999 chlorovodíkovou, kyselinu bromovodíkovou a podobně.

Upřednostňuje se, když je kyselinou kyselina chlorovodíková. Rovněž se upřednostňuje, že se k reakční směsi přidává od přibližně 5 do přibližně 10 ekvivalentů kyseliny. Obzvláště se upřednostňuje, když se k reakční směsi přidává od přibližně 9 do přibližně 10 ekvivalentů kyseliny.

Reakční směs se poté hydrogenuje při počátečním tlaku od přibližně 88,9 kPa do 344,5 kPa při počáteční teplotě rovné přibližně teplotě místnosti, obvykle při 20 °C.

Upřednostňovaný počáteční tlak vodíku je přibližně 207 kPa. Reakce je exothermní a může probíhat v rozsahu od počátečnní teploty přibližně 20 °C do přibližně 40 °C. Upřednostňuje se, aby rozsah teplot byl v rozmezí od přibližně 20 °C do přibližně 27 »C.

Když je hydrogenace ukončena, reakční směs se zředí ethylalkoholem a pevný produkt se izoluje za standardních podmínek, jako filtrací nebo odstřeďováním. Produkt může být od nerozpustného katalyzátoru oddělen rekrystalizací z vhodného rozpouštědla, s výhodou z methylalkoholu. Dále může být produkt čištěn mícháním ve směsi methyl a 1 koho 1u a ethylalkoholu za přítomnosti kyseliny po dobu asi 4 hodin a při teplotě blízké teplotě místnosti. 1-Hydroxy~5-~(di me thy lamino methylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyr idin (F) se izoluje standardními technikami, s výhodou filtrací nebo odstřeďováním.

Př í prava 5-ami no-3-(1-methylpi per i di n-4-y 1 )pyrrol o~ [3,2-b]pyridi nu (A) vycházející z 1-hydroxy-5~(dimethylaminomethy1eni mi no)pyrrol o/3,2-b/pyridi nu (F) je znázorněna na schématu syntézy II.

• ·· ·· · · · · · · · · ··· to to 4 9 4 9 9 4 • · · · ··· to·#· • · · · · ······ ·· ·· · *··· ··· ···· ·· ··· ·« _M

Schéma syntézy II

Roztok 1-hydroxy~5~(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo~ [3,2-bjpyridinu (F) a 1 -methy i -4 ~p i per i d i nonu ve vhodném rozpouštědle se smísí s vhodnou bází za vzniku 1-hydroxy~3~(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyr idin-4~yl)~5~(dimethylamino™ -methy1eni mi no)pyrro 1 o[3,2~b]pyridinu (J). Vhodná rozpouštědla zahrnují nižší alkoholy, jako methylalkohol, ethylalkohol, propyla 1 koho 1, isopropy1 a i koho 1 a jejich směsi. Upřednostňovaná rozpouštědla jsou methylalkohol·, ethylalkohol a jejich směsi. Obzvláště upřednostňovaným rozpouštědlem je ethy1 a 1 koho 1.

K reakční směsi se přidá nejméně od 1 do 5 ekvivalentů 1-methy1-4~piper idinonu. S výhodou se přidávají asi 2 až asi 3 ekvivalenty. Obzvláště se upřednostňuje přidání přibližně 3 ekvivalentů 1-methyl-4-piper idinonu k reakční směsi.

Vhodnými bázemi jsou jakékoli báze, které reakci

3 • ft ftftftft > · · » ftftftft • ft ftftftft • ft ftft > ftft · > · · · usnadňují, aniž by byly tvorbě produktu na překážku. Vhodné zásady zahrnují hydroxid lithný, hydroxid draselný, hydroxid sodný a hydroxyd amonný. Upřednostňuje se, že když je bází amin, je to sekundární dialkylamin nebo sekundární cyklický amin. Sekundární dialkylaminy zahrnují dimethylamin, diethylamin, methy1 ethylamin a podobně. Cyklické sekundární aminy zahrnují pyrrolidin, piperidin, piperazin, morfolin a podobně. Upřednostňovanou bází je sekundární amin a obzvláště se upřednostňuje dimethylamin.

Reakční směs se míchá při přibližné teplotě místnosti dokud není reakce zcela ukončena. Když je reakce zcela ukončena produkt se izoluje standardními způsoby, s výhodou filtrací nebo odstřeďováním.

Konverze 1-hydroxy~3~(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyr i d i n~4 ~y1)-5~(di methy1aminomethy1en i mi no)pyrro 1 o[3,2-b]pyridinu (J) na 5-amino-3~(piper idin-4~y1)pyrro 1 o[3,2-b]pyridin (A) se dosahuje hydrogenací za přítomnosti katalyzátoru vzácného kovu. Substrát (J) se rozpustí ve vhodném rozpouštědle obsahujícím katalyzátor ze vzácného kovu. Vhodná rozpouštědla zahrnují nižší alkanoly, jako methylalkohol, ethylalkohol, propyla 1 koho 1 a isopropylalkohol. Upřednostňovaným rozpouštědlem je methylalkohol. Upřednostňovanými katalyzátory ze vzácných kovů jsou, jak je popsáno výše, 10% palladium na uhlí. Reakční směs se hydrogenuje při počátečním tlaku, který je od přibližně 69 kPa do přibližně 345 kPa. Upřednostňovaný počáteční tlak je od přibližně 207 kPa do přibližně 345 kPa. Obzvláště se upřednostňuje počáteční tlak přibližně 345 kPa. Reakční směs se hydrogenuje při přibližné teplotě místnosti. Produkt se izoluje standardními separačními technikami.

4 • · φ φ · φ · · φ · φ • φφφφ φ φ φ φ · φ φ φ

φ φ φφφφ

Zkušený odborník v oboru ocení, že alternativní způsoby pro přípravu 5-amino~3~(1-methy1piper idin-4-yl)pyrro1o[3,2bjpyridinu (A) jsou, podle přání, dostupné případnou modifikací 5-di methylaminomethy1eni mi nové části sloučenin (F) nebo (J) za vzniku odpovídajících 5-aminos 1oučenin (G) nebo (H) před následujícími reakcemi. Sloučenina (F) může být podrobena refluxování s nižším alkoholem, s výhodou methylalkoholem nebo ethy1 a 1 koho 1em za vzniku

1-hydroxy-5-aminopyrro 1 o[3,2-b]pyridi nu (G). Sloučenina (H),

1-hydroxy-3~(1,2,3,6-tetrahydropyri d i n-4-y1)-5-ami nopyrro 1 o [3,2-b] pyr i d i n muže být přípraven buďreakcí (G) s 1-methy1-4-pi per idinonem za podmínek popsaných dříve nebo podrobením (J) hydrolyze v kyselém prostředí. Sloučenina (H) se poté hydrogenací ve vodě, za podmínek popsaných výše, přemění na (A). Upřednostňuje se, aby se 5-di methylaminomethy 1 en i mi no vá část sloučenin (F) a (6) přeměnila na odpovídající aminovou část před hydrogenací za vzniku 5-amino-3-(1-methy1piper idin~4-yl)pyrro1o[3, 2-b]pyridi nu ( A) .

1-Hydroxypyrro1o[3,2~b]pyridiny (F), (6), (H) a (J) jsou zahrnuty do obecného vzorce I:

X

R

HO (I)

X je aminoskupina nebo (CH3)2NCH~N~ a

R. je vodík nebo 1-methyl-1,2,3,4~tetrahydropyridyn-4-yl • · • · • ft tttt • ftft • ftftft ftftft • ftftft ·*· • ftftftft · • · ftft · ftftft ftftftft ftft ftftft • ft • · • · • · • ft • · • · • ft a jeho adiční soli s kyselinou. Sloučeniny obecného vzorce

I jsou nové a představují další ztělesnění předloženého vynálezu.

5-HTif agonista W-/propionyl/-5-amino-3~( 1-methyl pi per idin-4~yl)pyrro1o/3,2-b/pyridinu se připraví reakcí 5-aminopyrro 1 o[3,2-b]pyridi nu (A) s příslušným propyonylchloridem, propionyíbromidem, propi ony1jodidem nebo s anhydridem, případně za přítomnosti acylačního katalyzátoru, jako je dimethy1aminopyridin, v přítomnosti vhodné báze. Vhodné báze zahrnují aminy, užívané zajména jako lapače kyseliny, jako je pyridin nebo triethylamin nebo komerčně dostupné báze vázané na polymer, jako pólyviny1pyridin. Reakce může být alternativně provedena v pyridinu, který slouží jako rozpouštědlo a jako báze.

V obvyklém případě může být produkt izolován promýváním reakční směsi vodou a zahuštěním zbývajících organických látek za sníženého tlaku. V případě, kdy se použije přebytek acylačního činidla, mohou se však bez problému přidat polymerně vázané primární nebo sekundární aminy, jako je aminomethylováný polystyren, aby s přebytkem reakční látky zreagovaly. Izolace produktů z reakcí v případě, že byla použita polymerně vázaná činidla, je značně zjednodušeno a vyžaduje pouze filtraci reakční směsi a následující zahuštění filtrátu za sníženého tlaku. Produkt z těchto reakcí se může čistit chromatograficky a rekrystalizací, podle přání z vhodného rozpouštědla. Za určitých okolností může dojít k diacylaci 5~aminové části. Když diacylovaný produkt se podrobí hydrolyze bud^v v bazickém nebo v kyselém prostředí dostane se při teplotě prostředí N-/propi ony1/-5 ami no-3--( 1 -methyl pi per i di n-4-y1 ) pyrrol o[3,2-b] pyr i d i n .

5~aminopyrro1o/3,2-b/pyridin (A) může rovněž reagovat <· 9999

V ·· *

• « · « · « ·

s kyselinou propionovou v přítomnosti obvyklých kondenzačních činidel pro peptidovou vazbu, jako jsou Ν,N¹-karbonyldiimidazol (CDI), Ν,N'~dicyk1ohexy1 kar bod i i mid (DCC) a hydrochlorid 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodii midu (EDC). Forma EDC vázaná na polymer byla popsána (Tetrahedron Letters, 34 (48), 7685 (1993)) a je velmi užitečná pro přípravu W-/propi ony 1 /-5-ami no-3~( p i per i di n-4-y 1 )pyrrolo~ [3,2-b]pi per idi nu, který byl izolován a čištěn jak bylo popsáno výše.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Mononitrovaný 6-amino-2-piko1 in

110 g (1,02 molu) roztaveného 6-ami no~2~pi ko 1 i nu se přidává po kapkách do 500 ml koncentrované kyseliny sírové, která byla předchlazena na -15 °C takovou rychlostí, aby se teplota roztoku kyseliny sírové udržovala pod 20 °C. Roztok se potom ochladí na přibližně -6 °C a potom se po kapkách po dobu delší nežli 30 minut přidává na asi 0 °C předchlazený roztok 49 ml (1,16 mol) 90% kyseliny dusičné v 49 ml kyseliny sírové, přičemž se teplota udržuje přibližně na 0 °C. Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě okolo 0 °C a potom se zahřívá po dobu 1 hodiny při teplotě přibližně 10 °C. Teplota reakční směsi se udržuje po dobu 1 hodiny na hodnotě přibližně 10 °C a potom se zahřívá přes 1 hodinu na teplotu přibližně 20 °C. Na teplotě okolo 20 °C se reakční směs udržuje po 2 hodiny. 2a intenzivního míchání se reakční směs nalije na 8 litrů ledu. Přidáním 1,5 litru koncentrovaného hydroxidu amonného se pH reakční směsi nastaví na asi 9, přičemž teplota reakční směsi se případným přidáváním ledu € · ý · * • · · · ··· ···· • · · · · · · · · ♦ # • · · · · $*·«»· ·· · · >···· «·····» tt · · · · * · tt udržuje asi na 24 °C. Výsledná kaše se zfiltruje a pevná látka se několikrát promyje vodou. Pevná látka se 3 dny suší za vakua při 70 °C a získá se 135,4 g (87 %) 2:1 směsi

3~-nitro~: 5~ni tro-6-ami no~2~pi ko 1 i nu ( B) .

Subli mace g podílu nitrační směsi se dvakrát sublimuje, vždy po dobu 6 hodin za vakua při teplotě 125 °C. 5-Nitro isomer se jako jasný, žlutý prášek vysublimuje a odloží. 3-Nitroizomer, který zůstane na dně sublimačního zařízení se sebere. Sublimací celkem 121 g se získalo 60,9 g (75,5 &) surového 3~nitroizomeru. 58 g surového 3-nitroizomeru se převede do 200 ml horké směsi ethyl a 1 koho 1:voda (v poměru 95:5). Směs se ochladí na teplotu místnosti a zředí 200 ml vody. Po 2 hodinách se sraženina oddělí filtrací a několikráte promyje vodou. Po vysušení pevné látky při teplotě místnosti a ve vakuu se získá 38 g (65 &, vztaženo na 58 g surového produktu) 3~n i t r o ~-6~ami no ~-2-p i ko 1 i nu (C).

MS (M/e) : 153 ( M⁺ ),

Analýza pro CeH?N3O2: Vypočteno: C, 47,05, H, 4,61, N, 27,44, Nalezeno: C, 47,08 H, 4,53 N, 27,53.

Rekrysta 1 i zace

Při jiné možnosti se 20 g nitrační směsi a 800 ml toluenu zahřívá po dobu 15 minut pod refluxem. Směs se při 95 ⁰C zfiltruje a matečný roztok se ochladí na teplotu místnosti. Po 4 hodinách se pevná krystalická látka zachytí, promyje 100 ml toluenu a suší při teplotě 50 °C ve vakuu po dobu 16 hodin. Získá se 13,7 g (88 &) vpodstatě čistého 3~nitro~6~amíno“2~piko1 i nu (C).

• * • · • · · · • 9

9999999 99 999 ·

» 9 9 · 9 9

9999 9 99 ♦

9 9 « « 9 «

Teplota tání - 190,4 °C.

Příklad 2

2(2-Di me thylaminoet hen~1~yl)-~3-nitro ~6 ~(di methy lamino methy leni mi no)pyrro1c/3,2-b/pyridίη (E)

Směs 80 g (0,39 molu) 3-nitro-8-amino-2-piko1 i nu (C) ve 260 ml dimethylformamidu se smísí s 260 ml (1,83 mol) 94% di methylformamiddimethy1acetaiu a roztok se zahřívá 48 hodin pod refluxem. Reakce se za sníženého tlaku odpaří a zbylá pevná látka se suspenduje v toluenu. Toluen se odpaří za sníženého tlaku. Tento postup se 5- krát opakuje. Konečný zbytek se suspenduje s 300 ml methyl-terč.butyletheru a poté zfiltruje. Tato pevná látka se 3- krát promyje 300 ml methyl-terč.butyletheru a tmavá pevná látka se nakonec suší za sníženého tlaku. Získá se 90,6 g (88 %) požadované sloučeniny.

MS (m/e) : 263, 1 (M+ ),

Analýza pro C12H17N5O2: Vypočteno: C, 54,74, H, 8,51, N, 26,

60,

Nalezeno: C, 54,84, H, 6,49, N, 26,79.

Isolace pomocí krystalizace

Roztok 38,8 g (0,25 mol) 3-nitro-6-amino-2-piko1 i nu (C) ve 172 ml dimethy1formamidu se smísí se 172 mí dimethyl formamiddimethylacetálu a směs se zahřívá 42 hodin při teplotě asi 97 °C. Reakční směs se poté ochladí na teplotu místnosti a zředí 850 ml isopropanolu. Reakční směs se ponechá stát 18 hodin při teplotě místnosti a poté se za • · · · ft ft • ftftftft ftft ftftft míchání 2 hodiny chladí na 3 až 5 °C. Kaše se odfiltruje, pevná látka se promyje 2- krát 75 ml isopropylalkoholu a suší za sníženého tlaku po dobu 16 hodin při teplotě 45 °C. Získá se 58,9 g (88 %) uvedené látky.

Příklad 3

Alternativní syntéza 2-( 2-di methylaminoethen~1-yl)-3-nitro-6~(d i methy1ami nomethy1en i mi no)pyrrolo[3,2-b]piridinu (E)

Směs 133 g (0,86 molu) mononitrováného δ-amino~2~ -pikolinu ( B) v 500 ml dimethylformamidu se smísí s 500 ml (3,5 mol) 94% dimethy1 formamiddiacetá 1 u a zahřívá 40 hodin pod refluxem. Po ochlazení na teplotu místnosti se reakční směs rozdělí na dvě poloviny a každá polovina se za intenzivního míchání vlije do 10 litrů vody při 0 °C. Po 10 minutách se směs zfiltruje a tuhá látka se suspenduje/vypláchne s 3~krát 1 litrem vody. Pevná látka se 2,5 dne suší za vakua při 65 °C. Získá se 183 g (81 %) v nadpisu uvedené látky ve formě červené pevné látky.

Příklad 4

D i hydrochlor i d 1-hydroxy-5-(dimethylaminomethylimino)pyrro 1 o(3,2-b]pyridi nu (F)

Směs 23,4 g (89 mmol) 2~( 2-di methyl ami noethen-~2~yl ) -3-nitro-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]piridinu (E) a 0,7 g 10% palladia na uhlí ve 234 ml bezvodého methylalkoholu se smísí se 140 ml 5,9N chlorovodíku v ethanolu. Výsledná směs se 1,5 hodiny hydrogenuje při počátečním tlaku vodíku 206,7 kPa. Reakce je exothermní a dosáhne teploty 42 °C. Reakční směs se zředí 585 ml

4

4 4 4 · · 9 4 • 4 4 <4 4 4 ethylalkoholu a míchá 1 hodinu při teplotě místnosti.

Sraženina se odfiltruje a propláchne 50 ml ethylalkoholu. Pevná látka se vyjme, přidá k 1,1 litru methylalkoholu, zfiltruje a poté se při sníženém tlaku odpaří. Zbývající pevná látka se suší za sníženého tlaku. Získá se 20,5 g (83 žádané sloučeniny (obsahující 5 % 5~(dimethylaminomethy 1eni mi no)pyrro 1 o[3,2-b]pyridi nu ve formě žluté pevné 1átky.

3,6 g části žádané sloučeniny se suspenduje ve 36 ml methylalkoholu, přidá se 90 ml bezvodého ethylalkoholu a 10,8 ml 5,9N chlorovodíku v ethanolu. Směs se míchá 4 hodiny při teplotě místnosti, potom se zfiltruje a pevná látka se promyje 2-krát 5 ml ethylalkoholu. Výsledná žlutá pevná látka se suší při sníženém tlaku při 45 °C. Získá se 3,39 g (94,2 %) uvedené sloučeniny (obsahující 3 % 5~(dimethyl~ ami no methylenimino)pyrrolo[3,2-b ({pyridinu) .

Teplota tání ~ 213 až 214 °C,

MS(m/e) - 205 (M + 1).

Příklad 5

Alternativní postup přípravy dihydrochloridu 1-hydroxy-5“(dimethylaminomethylenimino)pyrroloC3,2-b]pyridi nu (F)

Vychází se z 1,0 g (3,8 mmol) 2-(2~dimethylaminoethen~2yl)-3-nitro-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo(3, 2-b]piridinu (E), reakční podmínky příkladu 4 se opakují s výjimkou toho, že reakční teplota se řídí tak, aby nepřestoupila hodnotu 27 °C. Získá se 0,95 g (90 %) výše v názvu uvedené sloučeniny.

• · to · · · t · v k · · to « k » · » · · ·· ···

Příklad 6

Hydrochlorid 1-hydroxy-5-aminopyrro1o[3,2-b] pyridinu (6)

Směs 0,06 g 10% palladia na uhlí, 2 g (0,76 mmol) d i hydrochlor i du 1-hydroxy-5~(dimethy laminomethyl imino)-pyrro 1 o[3,2™b]pyridinu (F) a 7,5 ml 9,1N ethanolového roztoku chlorovodíku ve 40 ml methylalkoholu se podrobí po dobu 1,5 hodiny katalytické hydrogenací při počátečním tlaku vodíku 68,9 kPa. Když je hydrogenace zcela ukončena, reakční směs se 3 hodiny zahřívá při teplotě 70 °C. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti a zfiltruje. Zbylá pevná látka se promyje methyl a 1 koho 1em a filtrát se při sníženém tlaku odpaří. Výsledná pevná látka se suší za vakua po dobu 6 hodin při 50 °C. Získá se 2,64 g (80 %) výše uvedené sloučeniny ve formě světle pevné, hnědé látky. Analytický vzorek se překrysta1uje z ethanolového roztoku chlorovodíku.

Teplota tání - 227 až 228 °C,

MS(m/e) = 150 (M+1).

Vypočteno na C? H? N:j O. HC 1 : Teorie: C, 45,40, H, 4,32 N, 22,

70, O, 8,65, Cl, 19,10. Nalezeno: C, 45,49, H 4,26, N, 22,63, 0, 8,47, Cl, 18,90.

Příklad 7

1-Hydroxy-5-ami no-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyr idin-4-yi)pyrro 1o[3,2-b]pyridi η ( H)

K roztoku 31,4 g (169 mMo 1 ) hydrochloridu 1-hydroxy~5~ -aminopyrro1o[3,2-b]-pyridi nu (6) v 1,33 litru vody se přidá 100 g uhličitanu draselného po dávkách. Reakční teplota se • · • · · · · · ft · · «ftftft • · 4 • ft · · · • ftftft « ft · ft ftftft ftft • ft ··· • ft udržuje ledovou lázní pod 25 °C. K tomuto roztoku se potom přidá 150 ml N-methyl-2-pí per idinonu a reakční směs se intenzivně míchá při teplotě místnosti po dobu 6 hodin. Poté se reakční směs odfiltruje a filtrační koláč se dvakrát promyje 100 ml vody. Pevná látka se suší při 50 °C za vakua po dobu 90 hodin. Získá se 20,8 g (83 %) výše uvedené sloučeniny ve formě žluté pevné látky. Pro analýzu se připraví dihydrochlori dová sůl.

Teplota tání ~ 282 až 283 °C (rozklad),

MS (m/e) = 245 (M+1).

Vypočteno pro C1. 3 Hi 6 N« 0.2HC1 : Teorie: C, 49,37, H, 5,70, N, 17,72, 0, 5,06, Cl, 22,35 Nalezeno: C, 49,27, H, 5,71,

N, 17,39, O, 5,38, Cl, 21,70.

Příklad 8

1-Hydroxy-5~(di methylami nomethyli mi no)-3~(1-methyl -1,2,3,6-tetrahydropyr i d i n-4 -yl)pyrro 1o[3,2-b]pyridin (J)

Směs 13,5 g (48,7 mmol) dihydrochloridu 1-hydroxy-5-(dimethylaminomethylenimino)pyrrolo[3,2-b]pyridinu (F) a 17,5 g (155 mmol) 1-methyl-4-piper i donu v 270 ml bezvodého ethyl a 1 koho 1u se míchá dokud není roztok homogenní. V tomto okamžiku se přidá 19,4 ml (109 mmol)

5,6N dimethylaminu v ethylalkoholu a reakční směs se míchá po 4 hodiny při teplotě místností. Žlutá sraženina se odfiltruje, promyje 2-krát 27 mi ethylalkoholu a suší při 45 °C při sníženém tlaku. Získá se 13,4 g (92 %) žádaného produktu ve formě žluté pevné látky.

9 9 9 ·

9 φ 9 9 99 9 · 9 ·

9 »9999 9999

999 9 999 99 9

99 9 9999

999 «999 99 999 99 <9

Teplota tání : 212 až 213 <>C,

MS(m/e) = 300 (M + 1) ..

Příklad 9

5-Amino-3-(1-methyi pi per id i n-4~yi)pyrrolo[3,2-b]pyridin (A)

Směs 0,28 g (0,94 mmol) 1-hydroxy-5-(dimethy1amino-methylenimino)-3~(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4~yl)pyrro 1o[3,2-bjpyridi nu (J) a 0,10 g 10¾ palladia na uhlí ve 20 ml methylalkoholu se hydrogenuje asi 18 hodin při počátečním tlaku vodíku 344,5 kPa. Reakční směs se zfiltruje a filtrát se při sníženém tlaku odpaří. Získá se 0,21 g (96 %) v názvu uvedené sloučeniny.

Příklad 10

Alternativní syntéza dihydrochloridu 1-hydroxy-5-amino-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyr idin-4~yl)pyrrolo/3,2-b/pyridinu(H)

Suspenze 0,85 g (2,8 mmol) 1-hydroxy-5-(di methylaminomethylenimino)-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin~4~yl)~ pyrro1o/3,2-b/pyridi nu (J) v 18 ml ethylalkoholu obsahujícího 1,2 ml (14,5 mmol) koncentrované kyseliny chlorovodíkové se zahřívá pod refluxem po dobu 7 hodin. Reakční směs se nechá ochladit na teplotu místnosti a poté se míchá po dobu 18 hodin. Suspenze se zfiltruje, pevná látka se promyje 2-krát 1,8 ml bezvodého ethylalkoholu a poté suší při 45 <>C při sníženém tlaku. Získá se 0,84 g (93 %} v názvu uvedené s1oučení ny.

t> * · a· · · · · · · «<

··* ft · ·· * · · · • · ····· · · « · • · « · · ♦'····· ·· ·· * ···· ··· ···· ·* ··· ·· ft*

Příklad 11

Alternativní syntéza 5~amino~3~(1~methylpiperidin~4-yl)~ pyrro1o[3,2~b]pyridinu (A)

Suspenze 1 g (3,15 mol) dihydrochloridu l-hydroxy-5--ami no-3~( 1 -methyl -1,2,3,6 -tetrahydropyr idin-4-yl )pyrro1o[3,2-b]pyridinu (H) a 0,20 g 10% palladia na uhlí v 10 ml deminera1 izováné vody se hydrogenuje při teplotě místnosti a počátečním tlaku vodíku 310 kPa. Po 4 hodinách se reakční směs zfiltruje a filtrát se smísí s 6 ml 2N vodného hydroxidu sodného. Po přidání 0,2 ml tetrahydrofuranu se reakční směs 3 hodiny míchá a výsledné sraženina se oddělí filtrací. Pevná látka se suší při 50 °C při sníženém tlaku. Získá se 0,59 g (94 %) v názvu uvedené sloučeniny.

Příklad 12

N-/Propi ony1/-5-ami no-3-(1-methylpi per i di n-4-y1)pyrro1o[3,2b]pi per idin

Suspenze 0,5 g (2,17 mmol) 5~amino~3~(1-methy1piper idin~

-4-y1)pyrro1 o[3,2-b]piridi nu (A) a 0,30 g (2,27 mmol) anhydridů kyseliny propionové v 3,5 ml tetrahydrofuranu se míchá 18 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se poté zředí deminera1 izovanou vodou a roztok se pří sníženém tlaku odpaří za vzniku 7,5 g vodného zbytku. K tomuto žlutému roztoku se postupně přidává 1,4 ml 2N vodného hydroxidu sodného a 1 ml tetrahydrofuranu. Směs se míchá 3 hodiny při teplotě místnosti a výsledná suspenze se zfiltruje. Pevná látka se promyje 4 ml vody a suší při 55 °C při sníženém tlaku. Získá se 0,59 g (94 %) v názvu uvedené sloučeniny.

· *

»•99 · · · · ·

Schopnost ří~/propí onyl /-5-ami no-3-( 1 -methyl pi peridin~4y1)pyrro 1 o[3,2-b]pyridi nu vázat receptor podtypu 5-HTif se měří způsobem popsaným vpodstatě v US patentu č. 5 521 196.

Příprava membrány: Membrány se připravují z transfekovaných Ltk-buněk, které se vypěstují do 100% konfluence. Buňky se dvakrát promyjí fyziologickým roztokem obsahujícím fosfátový pufr, odstraní se z živných misek do 5 ml ledově studeného fyziologického roztoku obsahujícího fosfátový pufr a odstřeďují se 5 minut při 200xg a při teplotě 40 °C. Pelety se resuspendují do 2,5 ml ledově studeného Tris-pufru (20 mM Tris HCI, pH - 7,4 při 23 °C, 5mM EDTA) a homogenizují pomocí Wheatonova drtiče tkání. Lyzát se následně po dobu 5 minut odstřeďuje při 200xg a 4 °C, aby se vytvořily velké fragmenty pelet, které se vyřadí. Supernatantní tekutina se sebere o odstřeďuje při 40 OOOxg po dobu 20 minut při 4 °C. Pelety, získané tímto odstřeďováním, se jednou promyjí v ledově studeném promývacím tlumiči Tris a resuspendují do konečného pufru obsahujícího 50 mM Tris HCI a 0,5 mM EDTA, pří = 7,4, při 23 °C. Membránové preparáty se uchovávají v ledu a použijí do 2 hodin pro rad i o 1 igandové vazební zkoušky. Koncentrace proteinů se určuje způsobem, který navrhl Bradford (Anal. Bi ochem. ,.72,.. 240 až 254 ( 1976)).

Vazby radioligandu: [^sH-5-HT] vázání se provádí použitím drobných modifikací podmínek zkoušky 5-HTio, jak uvádí Herrick-Davis a Titeler (J.Neurochem., .5.0, 1624 až 1631 (1988)) s vynecháním maskovacích ligandů. Studie vazeb radioligandu se provádějí při 37 °C v celkovém objemu 250 μΐ pufru (50 mM Tris, 10 mM chloridu hořečnatého, 0,2 mM EDTA 10 μΜ pargylinu, 0,1 % askorbátu, pH ~ 7,4, při 37 °C) na mi krotitrační destičce s 98 jamkami. Saturační studie se φ· · ·· φ φ φ φφ · ·· φ • · · · φ • · · · · φ φφφφ φ φ · φ φ φφφφφ φ · φ · φ φφ φφ * φ ♦ 4 » Φ Φ 4 ► Φ Φ 4 provedou použitím [³Η]5~ΗΤ při 12 různých koncentracích v rozmezí od 0,5 nM do 100 nM. Studie přemístění se provedou použitím 4,5 až 5,5 nM [³H]5-HT. Vazebný profil léčiv při kompetičních pokusech se provede použitím 6 až 12 koncentrací sloučeniny. Inkubační doby jsou 30 minut jak pro saturační, tak pro přemist^vovací studie založené na původních výzkumech, které určily rovnovážné podmínky vazeb. Nespecifické vazby se definují v přítomnosti 10 μΜ 5~HT. Vazby se iniciují přidáním 50 μΐ homogenátu membrány (10 až 20 pg) . Reakce se ukončí rychlou filtrací přes předem nasáklé (0,5% po 1yethy1eni minem) filtry použitím 48R sběrače buněk Brandel Hsrvsster (Gaithersburg, MD). Filtry se následně 5 sekund promývají ledem ochlazeným pufrem (50 mM Tris HCI. pH - 7,4, při 4 °C), suší a umístí do lékovek obsahujících 2,5 ml Readi-Safe (Beckman, Fullerton, CA) a radioaktivita se měří použitím kapalinového scintilačního čítače Beckman LS 5000TA. Průměrná účinnost čítání (³H]5-HT je mezi 45 až 50 %. Vazebná data se analyzují pomocí nelineární regresní analyzy použitím počítače (Accufit and Accucomp, Lunden Software, Chagrin Falls, OH). Hodnoty ICso se přemění na hodnoty Ki použitím rovnice, kterou navrhl Cheng~Prusoff (Biochem. Pharmacol.,

22, 3099 až 3108 (1973)). Všechny pokusy se třikrát opakují.

Měřením podle výše uvedeného postupu se zjistilo, že N-/propionyl/-5~amino-3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo-/3,2-b/pyr i di n má afinitu pro 5~HTip receptor.

Jak uvádí R.L. Weinshank a kol., W093/14201 je 5-HTif receptor funkčně vázán s G-proteinem, jak bylo změřeno schopností serotoninu a serotonergických léčiv inhibovat forskolin stimulovaný cAMP produkcí v buňkách NIH3T3 transfekovaných 5-HTip receptorem. Aktivace agonisty G-proteinem spojených receptorů má rovněž za následek

9 9 9	9 9		9 9 9·		9 9	99
9 9 9 9	9	9	9	•	•	9	♦
9 9	9	9	• M	9	9	9	•
							9
9 9	• 9 9	•	9 999	•	9 9 ·	9 9 9	9

uvolňování GDP z a pod jednotky G proteinu a následné vázání

GTP. Vázání stabilního analogu F^sS]GTPtS je indikátorem této aktivace receptoru.

Příprava membrány

Myší LM(tk-) buňky stabilně transfekováné lidským receptorem 5-HTif a pěstované v suspenzi se sklízejí odstřeďováním, resuspendují se v 50mM Tris-HCl, pH 7,4, na alikvotní podíl 2 x 10⁸ buněk a uchovávají se ve vymraženém stavu při -70 °C až do dne zkoušek. V den zkoušek se alikvotní část buněk rozmrazí, resuspenduje v 35 ml 50mM Tris-HCl, pH 7,4, a odstřeďuje 10 minut při 39 800xg a při teplotě 4 °C. Výsledné granule se resuspendují v 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, inkubují 10 minut při 37 °C a odstřeďují při 39 800xg po dobu 10 minut při teplotě 4 °C. Pelety se resuspendují a ještě jednou odstředí, přičemž konečné pelety se resuspendují ve 4 mM chloridu hořečnatého, 160 mM chloridu sodného, 0,267 mM EGTA, 67 mM Tris-HCl, pH 7,4, takovým způsobem, že 200 μΐ alikvotní části obsahují přibližně 15 až 25 pg proteinu.

Vazby [³⁵S]GTPrS

Všechny inkubace se provedou třikrát v celkovém objemu 800 μΐ. Ředění léčiva ve vodě, 200 μΐ, v rozpětí 6 řádů se přidá k 400 μΐ Tris-HCl, pH 7,4, obsahujícímu 3 mM chloridu hořečnatého, 120 mM chloridu sodného, 0,2 mM EGTA, 10 μΜ GDP a 0,1 nM SJGTPtS. Přidá se 200 μΐ membránového homogenátu a zkumavky se potom 30 minut inkubují při 37 °C. Použitím Brandellova sběrače buněk (model MB-48R, Brandel,

Gaithersburg, MD) se poté inkubace ukončí vakuovou filtrací přes Whatmanovy GF/B filtry, které byly smočeny vodou nebo • · · · · · ·· • 4 · · · ♦ • 4 · · · ······ • · · · * · · 9 9 ······« ·· ·»· »· 49 mM pyrofosforečnanu sodného a předchladí 4 ml ledově studeného 50 mM Tris-HCl, pH 7,4. Filtry se potom rychle promyjí 4 ml ledově studeného 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.

Množství radioaktivity, zachycené na filtrech, se určí kapalinovou scintilační spektrometrií použitím LS6000IC (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Nespecifické vazby se definují GTPrS, 10 μΜ. Protein se určí způsobem, který navrhl Bradford (Anal. Biochem., .7.2, 248 až 254 (1956)).

Statistické analyzy

Účinné hodnoty pro testované látky se vyjádří jako procento vazeb, vzhledem k 10 μΜ 5-HT. Byla provedena nelineární regresní analýza na koncentračních odezvových křivkách použitím čtyřparametrové logistické rovnice, kterou popisuje De Lean a kol., (Mol. Pharmacol., .2...1.., 5 až 16 (1982)). Provede se variační analýza, následovaná Tukey-Kramerovým testem významné odchylky (JMP, SAS Institute Inc., Cary, NC) na pECso hodnotách a hodnotách E max.

Výše popsanými pokusy bylo nalezeno, že N-/propionyl/-5-amino-3-(1-methylpi per idin-4-yI)pyrroIo[3,2-b] pyridin je agonista 5-HTif receptorů.

Claims (12)

1. Způsob přípravy 5-amino-3-(1~methylpiperidin~4-yl)pyrrolo[3,2-bjpyridi nu (A), vyznačující se t í m, že zahrnuje následující kroky:

i) kondenzaci 1~hydroxy-5~(dimethylamÍnomethylenimíno)~ pyrrolo[3,2~bjpyridinu (F) s 1-methyl-4-piper idinonem v přítomnosti báze za vzniku 1-hydroxy-5-( dimethy1aminomethyl en i mi no)-3-( 1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-4~yl)~ pyrrolo[3,2~b]pyridinu (J), ii) případné odstranění chránící skupiny (J) za vzniku hydroxy-5-ami no-3-(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyr i di n~4~yl) pyrro 1 o[3,2-b]pyridi nu ( H) a iii) hydrogenaci buď (J) nebo (H) .

2. Způsob podle nároku 1 , v y z n a č u j í c í se tím, že 1-hydroxy-5-(d i methy1ami nomethy1an i mi no)-3-(1-methyl -1,2,3,6-tetrahydropyr i di n-4-y1)pyrro1 o[3,2-bjpyridin (J) se odštěpí za vzniku 1-hydroxy-5-amino-3-(1-methy1 -1,2,3,6-tetrahydropyr i di n-4-y1)pyrro1o[3,2-b]pyr i di nu (H).

3. Způsob přípravy 5-ami no-3-( 1-methy 1 p i per i d i n-4-y 1 ) pyr ro 1 o-[3,2-bjpyridi nu (A) vyznačující se t í m, že obsahuje následující kroky:

i) kondenzaci 1-hydroxy~5~aminopyrro I o[3,2-b]pyridinu (6) s 1-methyl-4-piper idinonem v přítomnosti báze za vzniku

1-hydroxy-5-ami no-3~(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyr idin-4-y1)pyrro1o[3,2-bjpyridi nu (H) a ft ·· ftft ftftft· ftft ftft • ftftft ftftft ftftftft • · · ftftftft ftftftft • · ftft · ftftft ftft · • ft ftft · ftftftft • ftft ftftftft ftft ftftft ftft ftft i i) hydrogenací (H).

4. Způsob přípravy 5~amino~3-(1-methylpiperidin-4-yl)pyrrolo~ ~[3,2~b]pyridinu (A) vyznačující se tí m, že zahrnuje následující kroky:

i) nitraci 6-amino-2~piko1 i nu za vzniku mononitrováného 6-ami no-2~p i ko 1 i nu skládajícího se ze směsi 3-nitroa 5-nitro-6-amino-2-piko1 i nu (Β), ii) případné dělení směsi 3-nitro- a 5-nitro~6~amino -pikolinu za vzniku mononitrováného 6-amino-2-piko1 i nu skládajícího se z vpodstatě čistého 3-nitro-6-amino-2pi ko1 i nu (C), iii) reakci mononitrováného 6-amino-2-piko1 i nu vybraného z (B) nebo (C) s dimethy1aminoformylačním činidlem za vzniku

2-(2“dimethylaminoethen1-yl)~3~nitro~6~di methylami no-methyleni mi no)pyridinu (E), iv) hydrogenací (E) v přítomnosti kyseliny za vzniku

1-hydroxy-5-d i methylaminomethyleniminopyrrolo[3,2-b]pyr i di nu (F),

v) reakci (F) s 1-methy1™4~piper idinonem v přítomnosti báze za vzniku 1-hydroxy-5-(dimethylaminomethy1eni mi no)—3-(1-methyl-1,2,3,6-t etrahydropyridin-4-yl)pyrrolot3,2~bJpyr i di nu (J), vi) případné odstranění chránící skupiny (J) za vzniku 1-hydroxy-5-ami no-3-(1-methyl-1,2,3,6~tetrahydropyridin-4-yl)pyrro 1 o[3,2-bjpyridinu (H) a

4 4 4 44 9

9 · • 4 9

9 4 9 9 9

4 4 4 4 4

4 4 9 49 vii) hydrogenací bud^{iii) * v} (J) nebo (H).

5. Způsob podle nároku 4, v y z n a č u j í c í se tím, že mononitrovaný 6-amino-2~piko1 in je vpodstatě čistý

3-nitro-6-amino-2-ρikoi in (C).

6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4a 5, v y z n a č u~ jící se t í m, že (H) se hydrogenuje v kroku vii).

7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6 vyznačující se t í m, že zahrnuje dál© krok acylace 5-amino-3-(1-methylpiperidin-4~y1)pyrro 1 o[3,2-b]pyridinu (A) za vzniku N~/propionyl/~5~amino-3-( 1-methyl™

-pi per i di n-4-y1)pyrrolo[3,2-b]pyr i di nu.

8. Způsob přípravy 1-hydroxy-5-di methylaminomethyleni mínopyrr o 1 o [ 3 , 2-b] pyr i d i nu (F) vyznačující se t í m, že zahrnuje následující kroky:

i) nitraci 6-amino-2-piko1 i nu za vzniku mononitrováného 6-amino-2-piko1 i nu skládajícího se ze směsi 3-nitroa 5-nitro-6-amino-2~piko1 i nu (B), ii) případné dělení směsi 3~nitro~ a 5-nitro-6-aminopikol inu za vzniku mononitrováného 6-amino-2-piko1 i nu skládajícího se z vpodstatě čistého 3-nitro-6-amino-2-p i ko1 i nu (C), iii) reakci mononitrovaného 6-amino-2-piko1 i nu vybraného z (B) nebo (C) s dimethylaminoformylačním činidlem za vzniku

2-(2~d i methy1ami noethen-1-yl)-3-n i tro~6~( d i methyl ami no32 ftft ftftftft • · • ftftft • ft ftft ► ftft ft » ftft ft ► ftft · ► ftft ft ftft ftft

-methyleni mi no)pyridi nu (E) i v) hydrogenaci (E) v přítomnosti kyseliny.

9. 1-Hydroxypyrro1o[3,2-b]pyridin obecného vzorce I:

kde:

X je aminoskupina nebo (CH3)2NCH=N- a

R je vodík nebo 1-methyl-1,2,3,δ-tetrahydropyridin-4 -yl nebo její adiční sůl s kyselinou.

10. Sloučenina podle nároku 9, kde X je aminoskupina.

11. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 9 a 10, kde R je vodík.

12. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 9 a 10, kde R je 1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyr i di n-4~yl.