CZ20001750A3 - Pyridylpyrrolové deriváty - Google Patents

Abstract

Pyridylpyrrolová sloučenina obecného vzorce I nebo její farmakologicky přijatelná sůl, kde A znamená jednoduchou vazbu,kyslík, síru, CO, SO, SO2, C(R9)(R10), [kde R9, R10 je H, OH, halogen, alkyl], N(Rn), C=NOR" [R11 je H, alkyl]; D je jednoduchá vazba, C(R12)(R13) [R12, R13 je H, OH, halogen, alkyl]; R1 je substituovaný fenyl; R3 je halogen, alkyl, haloalkyl, alkoxy, haloalkoxy; R4, R5, R6, R7, R8 je H alkyl, kje 0 až 3, m je 1,2. Léčivo obsahující uvedenou sloučeninu pro léčbu zánětů, chronického revmatismu a chronické osteoartritidy.

Description

Inhibitory metaloproteinasy

Oblast techniky

Vynálezse zabýváN¹'[2,2-dimethyl-l S-(pyridin-2ylkarbamoyl)-propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3Smethoxy sukcinamidem a jeho farmaceuticky přijatelnými solemi, hydráty a solváty.

Dosavadní stav techniky

V předkládané mezinárodní patentové přihlášce WO 95/19956 (British Biotech Pharmaceuticals Ltd)je popsána a nárokována skupina sloučenin, které inhibují matriční m e t a 1 o p r o t e i n a s u (MMP) a výdej tumor nekrosis faktoru (TNF - a; kachektin) z buněk. Vynález se zabývá sloučeninami obecného vzorce (I)

O) kde

X je skupina - CO2H nebo -CONHOH;

RI je vodík; alkylová skupina o 1 až 6 uhlících;

alkenylová skupina o 1 až 6 uhlících; fenylová skupina; substituovaná fenylová skupina; fenylalkylová skupina o 1 až 6 uhlících; substituovaná fenylalkylová skupina o 1 až 6 uhlících; heterocyklylová skupina;

substituovaná heterocyklylová skupina;

• · ··· · · heterocyklylalkylová skupina o 1 až 6 uhlících;

substituovaná heterocyklylalkylová skupina o 1 až 6 uhlících; skupina BSOnA-, kde n je 0,1 nebo 2 a B je vodík nebo alkylová skupina o 1 až 6 uhlících, fenylová skupina, sub stituovaná fenylová skupina, heterocyklylová skupina, acylová skupina o 1 až 6 uhlících, fenacylová nebo substituovaná fenacylová skupina, a A je alkylová skupina o 1 až 6 uhlících; aminoskupina; chráněná aminoskupina; acylaminoskupina; OH; SH; alkoxylová skupina o 1 až 6 uhlících; alkylaminoskupina o 1 až 6 uhlících; dialkylaminoskupina o 1 až 6 uhlících; alkylthioskupina o 1 až 6 uhlících; arylalkylová skupina o 1 až 6 uhlících; am i n o al k y 1 o v á skupina o 1 až 6 uhlících;

hy d r o x y a 1 k y 1 o v á skupina o 1 až 6 uhlících;

merkaptoalkylo vá skupina o 1 až 6 uhlících nebo karboxyalkylová skupina o 1 až 6 uhlících, kde amino-, hydroxylová, merkapto- nebo karboxylová skupina jsou volitelně buď chráněny nebo je karboxylová skupina aimidována; nižší alkylová skupina substituovaná karbamoylovou skupinou,' nižší m o n o k ar b a m o y 1 al k y 1 o v á skupina, nižší dikarbamoylalkylová skupina, nižší diam i no a1ky1 o vá skupina nebo nižší karboxyalkanoylamino skupina;

R₂ je alkylová skupina o 1 až 6 uhlících, alkenylová skupina o 2 až 6 uhlících, alkynylová skupina o 2 až 6 uhlících, fenylalkylo vá skupina o 1 až 6 uhlících, heteroarylalkylová skupina o 1 až 6 uhlících, cykloalkylalkylová skupina o 1 až 6 uhlících, cykloalkenylalkylová skupina o 1 až 6 uhlících, přičemž každá z těchto skupin může být volitelně substituovaná jednou nebo více skupinami, a to alkylovou skupinou o 1 až 6 uhlících, -O-alkylovou • · ···· ···· • · · · ······ · · ·

- 3 - · · · · ····· ···· ···· ·· ·· ·· φ· skupinou ο 1 až 6 uhlících, -S-alkylovou skupinou o 1 až 6 uhlících, halo- skupinou a nebo kyano- (-CN) skupinou;

R₃ je skupina charakteristická pro esenciální nebo neesenciální α-aminokyselinu, ve které může být kterákoli funkční skupina chráněna;

R₄ je fenylová skupina nebo 5-ti nebo 6-ti členný heteroarylový kruh, ve kterém může být kterýkoli z kruhových atomů dusíku oxidován na oxid dusíku, který se může volitelně připojit k benzenovému jádru nebo k 5-ti, 6-ti nebo 7-mi člennému h e t e r o c y k 1 i c k é m u kruhu, přičemž každý z kruhů může být substituován:

(a) nezávisle jedním nebo více substituenty, kterými jsou hydroxylová skupina, halogen, -CN, CO2H, - CCHalkylová skupina o 1 až 6 uhlících, -(Ci C 6) a 1 k y 1 - C O 2 a 1 ky 1 o v á skupina o 1 až 6 uhlících, CONH2-, CONHalkylová skupina o 1 až 6 uhlících,CON((Ci -C₆)alkyl)₂, -CHO, -CH₂OH, perfluoroalkylová skupina o 1 až 4 uhlících, -Oalkylová skupina o 1 až 6 uhlících, -S-alkylová skupina o 1 až 6 u h 1 i c i c h , - S O - a 1 k y 1 o v á skupina o 1 až 6 uhlících, S02-alkylová skupina ol až 6 uhlících, -, NO2, -NH2, -NH- alkylová skupina o 1 až 6 uhlících, N(( C 1 - C 6) alky 1) 2 a -Ν H C O - a 1 k y 1 o v á skupina o 1 až 6 uhlících, nebo (b) jedním ze substituentů : alkylovou skupinou o 1 až 6 uhlících, alkenylovou skupinou o 2 až 6 uhlících, alkynylovou skupinou o 2 až 6 uhlících, cykloalkylovou skupinou o 3 až 8 uhlících, cykloalkenylovou skupinou o 4 až 8 uhlících, fenylovou, benzylovou, heteroarylovou nebo h e t e r o ar y 1 m e th y 1 o v o u skupinou, přičemž každá z těchto • · · · · · · 9 · ··« • · 9··· 99·· • 9 · · · ·99 · · · «

- 4 - · · · · 9 9 9 9 9

9999 9999 99 99 9· ·· skupin může být volitelně substituována jedním nebo více substituenty, a to halogenem, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, karboxylovou skupinou, prfluoroalkylovou skupinou o 1 až 4 uhlících, alkylovou skupinou o 1 až 6 uhlících, -O-alkylovou skupinou o 1 až 6 uhlících nebo -S-alkylovou skupinou o 1 až 6 uhlících;

R₅ je vodík nebo alkylová skupina o 1 až 6 uhlících;

nebo jejich solemi, hydráty a solváty.

N^J^^-dimethyl-lS-Cpyridin-ž-ylkarb a m o y 1.) propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3S-methoxysukcinamid se řadí do třídy sloučenin, které jsou obecně popsány a nárokovány v patentové přihlášce WO 95/19956, jejich vlastnosti však nejsou blíže upře sněny.

V patentové přihlášce WO 9 5/ 1 99 5 6 je popsáno, že v této třídě sloučenin má aromatický nebo heteroarylový substituent R4 obecný neočekávaný a žádoucí účinek na zvýšení aktivity proti stromelysinu při současném zachování aktivity proti kolagenase a želatinase. Proti stromelysinu účinkují známé sloučeniny s podobnou strukturou, které ale mají jako substituent R4 jinou, obvykle methylovou, skupinu.

Jako člen této třídy N^tž^-dimethyl-lS-Cpyridin-žylkarbamoyl)-propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3Smethoxysukcinamid vykazuje tyto vlastnosti.

Vedlejším účinkem inhibitorů MMP je navození kosterně svalové bolesti v kloubech (někdy označované jako „tendinitida“), například v kloubu ramenním, která se vyskytuje u některých zvířat a lidí po • · • · ·' vysokých a nebo dlouhodobě podávaných dávkách MMP.

Ačkoli tento účinek zcela vymizí po ukončení podávání

MMP, přesto je to účinek nežádoucí. Mechanismus, jakým dochází k navození bolesti, není v současné době zcela znám. Souvislost mezi molekulární strukturou nebo profilem enzymové inhibice a sklonem sloučeniny navodit bolest není dostatečně prokázána. Pokud některý z inhibitorů MMP způsobí tento vedlejší účinek, jeho závažnost nelze předem určit a je třeba ji vyzkoušet empiricky.

Sklon N ¹ ‘ [ 2,2 - di m e thy 1 -1 S - (p y r i d i n - 2ylkarbamoyl)-propyI]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3Smethoxysukcinamidu navozovat kosterně svalovou bolest jako vedlejší účinek je velmi silně omezen. Tím se tato sloučenina liší od svých blízkých strukturálních analogů, například od N¹’[2,2-dimethyllS-(pyridin-3-ylkarbamoyl)-propyl]-N⁴-hydroxy-2Risobuty1-3S-hydroxysukcinamidu, který způsobuje tento ve-dlejší účinek v mnohem větší míře.

V patentové přihlášce WO 95/19956 je také popsáno, že.objevená třída arylamidových MMP inhibitorů zahrnuje sloučeniny, které jsou biologicky dostupné po perorálním podávání. Ne všechny sloučeniny obsažené v patentové přihlášce WO 9 5/ 1 99 5 6 jsou však při perorálním podávání biologicky dostupné v dostatečné míře, což je zřejmé například z vrcholu hladiny aktivity MMP inhibitorů nebo z prodloužené hladiny aktivity („ plocha pod křivkou“), která ukazuje hladinu léku v krvi zvířat po perorálním podání léku. Sloučenina podle předkládaného vynálezu N ¹ ’ [2,2-dimethy1-1S-(pyridin2-ylkarbamoyl)-propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3Smethoxysukcinamid je biologicky dostupná po perorálním podávání u lidí a u jiných savců.

φφφφ ····

Toto spojení biologické dostupnosti po perorálním podávání a snížené náchylnosti k vyvolání tendinitidy jako vedlejšího účinku otevírá široké terapeutické možnosti při léčbě onemocnění vyžadujících střednědobé nebo dlouhodobé systémové podávání inhibitorů MMP. Sloučenina podle vynálezu je proto indikována při léčbě například rheumatoidní artritidy, rakoviny, roztroušené sklerosy (RS), syndromu Guillan- Barre (GBS) a lupénky.

Podstata vynálezu

Vynález se zabývá N ^1-[2,2-dimethyl-lS-(pyridin-2ylkarbamoyl)-propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3Smethoxysukcinamidem vzorce (II)

a jeho farmaceuticky přijatelnými solemi, hydráty a solváty.

Sloučenina podle vynálezu obsahuje tři asymetrické atomy uhlíku, jejichž stereochemická konfigurace je specifikována v názvu sloučeniny a je zobrazena ve vzorci (II). Vynález ale zahrnuje'i směsi enantiomerů sloučeniny (II), pokud specifický ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · » · « · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 • · ·· ······ · « _v • · ·· » 9 9 9 9

9999 9999 99 99 99 99 enantiomer převažuje. Specifický enantiomer tvoří s výhodou 90 a více % hmotnosti směsí enantiomerů.

Součástí vynálezu jsou také farmaceutické přípravky obsahující N ¹'[2,2-d i m ethy1- 1S-(pyridin-2ylkarbamoyl)-propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3Smethoxy sukcinamid nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, hydrát nebo solvát spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem. Přípravky podle vynálezu jsou s výhodou ty, které jsou upraveny pro p e r o r á 1 η ί p od á v á η í.

Vynález dále zahrnuje použití N ¹' [ 2,2 - d i m e th y 1 lS-(pyridin-2-ylkarb am oyl)-propyl]-N⁴-hydroxy-2Ri so butyl - 3 S me tho xy-s ukc inamidu nebo jeho farmaceutickypřijatelné soli, hydrátu nebo solvátu pro výrobu farmaceutických přípravků určených k léčbě rheumatoidní artritidy, rakoviny, roztroušené sklerosy (RS), syndromu Guillan- Barre (GBS) nebo lupénky u savců, včetně lidí.

Vynález zahrnuje také způsob léčby rheumatoidní artritidy, rakoviny, roztroušené sklerosy (RS), syndromu Guillan- Barre (GBS) nebo lupénky u savců, včetně lidí, spočívající v podávání takového množství N¹'[2,2-dimethyl-lS-(pyridin-2-ylkarbamoyl)-propyl]N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3 S-methoxysukcin amidu nebo j eho farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu nebo solvátu, které účinně sníží symptomatickou a nebo patologickou manifestaci těchto onemocnění.

Soli podle vynálezu jsou fysiologicky přijatelné adiční soli, například hydrochlorid, hydrob romid, • · ·· ··

1' · · 4 » · · 4 » · · 4 • · · 4 ·· · · ···· · · · 4 sulfát, methansulfonát, p-toluensulfonát, fosfát, acetát, citrát, sukcinát, laktát, tartrát, fumarát a maleát. Soli mohou být také tvořeny s basemi, například sodná, draselná, hořečnatá a vápenatá sůl.

Sloučenina podle vynálezu může být vyrobena způsobem popsaným zde v textu v Příkladu a může být připravena k podávání v jakékoli, formě, která respektuje její farmakokinetické vlastnosti. Přípravky k perorálnímu podávání mohou mít formu tablet, kapslí, prášků, granulí, pastilek, tekuté nebo gelové přípravky mohou být podávány jakperorálně, tak lokálně na kůži nebo parenterálně ve formě sterilních roztoků nebo suspensí. Tablety a kapsle k perorálnímu podávání mohou být ve formě jednotlivých dávek a mohou obsahovat běžná vehikula, jako jsou pojivá, plniva, kluzné látky, disintegranty nebo přijatelné zvlhčující látky. Tablety mohou být potahované způsobem běžným ve farmaceutické, praxi. Perorální tekuté přípravky mohou být ve formě, například, vodních nebo olejových suspensí, roztoků, emulsí, sirupů nebo elixírů, nebo mohou být ve formě suchého produktu, který se před podáváním ředí vodou nebo jiným vhodným rozpouštědlem. Tyto tekuté přípravky mohou obsahovat běžné přídavné látky jako jsou látky suspendující, e mul s i f i kuj í c ί, nevodná vehikula-(včetně jedlých olejů), konservanty a dle žádosti běžné příchutinebobarviva.

Aktivní látku je také možné podávat parenterálně ve sterilním médiu. Podle vehikula a použité koncentrace může být účinná látka ve vehikulu buď suspendována nebo rozpuštěna. Ve vehikulu mohou být ·· ·· ♦ · ·· ·· ·· • · · · · · · · ··« · • · ···· ···· -. 4 · 4 4 4 ··· 4 9 4 4 4

- 9 · · · · 9 4 · · ·

4499 4449 4· 44 44 44 rozpuštěny také přídavné látky jako je lokální anestetikum, konservační látka nebo pufrovací látky.

Dávka sloučeniny podle vynálezu se pro jednotlivé klinické indikace a pro různé způsoby podání stanoví na základě výsledků klinických studií v souladu se standardní praxí pro udělování souhlasu příslušných autorit. Obecně se očekává, že sloučenina podle vynálezu se bude podávat lidem perorálně v dávkových jednotkách 5 až 100 mg dvakrát až třikrát denně.

Následující příklad popisuje výrobu sloučeniny podle v y n ál e z u . V ýc ho z í sloučeniny kyselina 2R-(2,2dime thy 1 - 5 - oxo - [ 1 , 3 ] dioxo lan-4S-y 1)-4 methylpentanoová a L-tert-leucin-N-(2-pyridyl)amid byly vyrobeny tak, jak je popsáno v patentové přihlášce WO 9 5/ 1 996 1.

V příkladu jsou použity následující zkratky:

DMF dimethylformamid

EDO hydrochlorid N - e th y 1-N ' - (3dimethylaminopropyljkarbodiimid

HOBt 1-hydroxybenzotriazol

NMN N-methylmorfolin

THF tetrahydrofuran

Příklad provedení vynálezu ·· ·· ♦ · ·· · · to· ···· ···· · *·· • · ···· · » · · • ············ • · ·· ····· ···· ···· ·» ·· ·· ·<

- 10 N ¹' [2·, 2-dimethyl-lS-(pyridín-2-ylkarbamoyl)propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3S-methoxysukcinami d

KROK A:

dimethylester kyseliny 2S-hydroxy-3R-isobutylsukci no vé

Kyselina 2R-(2,2-dimethyl-5-oxo-[l,3]dioxolan4S-yl)-4-methylpentanoová (75.0 g; 0.326 mmol) byla rozpuštěna v methanolu (50 0 ml) a ochlazena na 0°C. Výsledný roztok byl nasycen plynným chlorovodíkem. Reakční směs se nechala ohřát na teplotu místnosti a poté byla přes noc míchána. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku bylo residuum rozpuštěno v dichlormethanu a promyto nejprve nasyceným hydrogenuhličitanem sodným a poté nasyceným roztokem chloridu sodného. Organická fáse byla usušena bezvodým síranem hořečnatým, přefiltrována a za sníženého tlaku do sucha odpařena, čímž byla získána žádaná sloučenina v podobě žlutého oleje (53 g. 75 g/l). ΉNMR;5(CĎClj),4.10(lH,d,J = 4.0Hz),3.60(3H,s),3,50(3H,

s),3.18(br s) , 2.7 8 (1 Η,m) 1 . 6 1 - 1.40 (2 Η,m), 1.2 8 ( 1 Η ,m) a

0.76 - 0.73 (6H,m).

- 11 • ft ftft ·· ftft ftft ·· • ftftft · · · · ftftftft • · · · · · ftftftft • · · · · ftftft ftft ftft ·' • · · · · · ftftftft • ftftft ftftftft ftft ftft ftft ftft

KROK B:

Dimethylester kyseliny 2 R-i s o but y 1 - 3 S m e t h o x y s u k c i n o v é

Dimethylester kyseliny 2 S - h y d r o x y - 3 R - i s o b u t y 1 sukcinové (23.9 g, 110 mmol) byl rozpuštěn v DMF (200 ml) a do směsi byl přidán destilovaný jo do methan (8.2 ml, 132 mmol) a následněoxid stříbrný (27.9 5 g, 121 mmol).. Reakční směs byla 7 dní míchána při teplotě místnosti a bez přístupu světla. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku bylo residuum čištěno chromatografií na koloně (silikagel, eluent dichlormethan) za zisku žádané sloučeniny v podobě v iskosního žlutého oleje (19.16 g, 75 g /1). ¹ H-N M R; 5(CDCl₃),3.83(lH,d,J = 7.5Hz),3.7 1(3H,s),3.62(3H,s),3. 3 0(3H,s),2.85(lH,m),1.65 -1.39(2H,m),1.10(lH,m) a 0.83-0.81(6H,m).

KROK C: .

Dilithiová sůl kyseliny 2R-isobutyl-3Sm e t h o x y s u k c i n o v é

Do roztoku d i m e t h y 1 e s t e r u kyseliny 2R-isobutyi3 S-methoxysukcinové (4.70 g, 20.0 mmol) v methanolu (30 ml) a vodě (30 ml) byl přidán hydroxid lithný (1.7 6 g, 42.0 mmol). Reakční směs byla 2 hodiny míchána při teplotě místnosti za sníženého tlaku a poté byla za sníženého tlaku odstraněna rozpouštědla, čímž byla získána žádaná sloučenina v podobě žluté pevné látky (4.4 0 g, kvant.). ‘HNMR; δ (C D ₃ O D ), 3 . 5 2 (1 Η, d, J = 5 . 1 Hz), 3.2 7 (3 H, s), 2.6 5 (1 H ,m), 1.5 6- 1 ,5 3 (2H,m), 1 .3 1 (lH,m) a 0.8 2 - 0.7 8 (6 Η, m).

·· ·· ♦ *.

- 12 »· ·· ·· • · · · * • · · · · ··· 4 4 9 9 4

4 9 9 4

94 49

KROK D:

4-methylester kyseliny 2R-isóbutyl-3Smethoxysukcinové

Lithnatá sůl kyseliny 2 R - i s o b u t y 1 - 3 S methoxysukcinové (25.14 g, 116 mmol) byla rozpuštěna v suchém THF (150 ml) a roztok byl ochlazen na 0°C.

Po přidání anhydridů kyseliny trifluoroctové (30 ml) byla směs další 4 hodiny míchána při 0°C. Za sníženého tlaku bylo odstraněno rozpouštědlo, residuum bylo při 0°C rozpuštěno v bezvodém methanolu (2 0 0 ml) a roztok byl přes noc míchán při teplotě místnosti. Poté bylo za sníženého tlaku odstraněno rozpouštědlo, čímž byla získána žádaná sloučenina v podobě žlutého oleje (54.3 g, včetně 2 ekvivalentů trifluoracetátu lithného), která byla bez dalšího čištění použita v kroku E. ’HNMR;5(CD₃OD),7.71(lH,d,J = 7.5Hz),3.65(3H,s),3.24(3H ,s),2,72(lH,m),1.56-1.42(2H,m),1.06(lH,m) a 0.810.79(6H,m).

KROK E:

Methylester kyseliny 3R-[2,2-dimethyl-lS(pyridylkarbamoyl)-propylkarbamoyl]-2S-methoxy-5methylhexanoové

Produkt z kroku D (2 5.06 g, ekvivalent 53.7 mmol 4-methy lesteru kyseliny 2 R-i s o b u t y 1 - 3 Smethoxy sukcinové) byl rozpuštěn v DMF (200 ml) a v průběhu přidání HOBt (8.70 g, 53.7 mmol) a následně EDC (12.35 g, 64.4 mmol) byl roztok ochlazen na 0°C. Reakční směs byla míchána a ohřívána na teplotu ·· « · · « • · • · • ft ···· ftftft·

- 13 ftft ftft ·· • · · · • · · · • · ··· ftft · • ft ftft ftft ftft • ftft · • ftft · • ftft · • ftft · • ft ftft místnosti po 2 hodiny. Takto připravený roztok aktivního esteru byl ochlazen na 0°C a po přidání Lt e r t -1 e u c i η - N - (2 - p y r i d y 1) am i d u (11.11 g, 53.7 mmol) byla směs přes noc míchána při teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku a residuum bylo rozpuštěno v ethylacetátu. Roztok byl postupně promýt nejprve 1M roztokem uhličitanu sodného a pak nasyceným roztokem chloridu sodného, usušen bezvodým síranem hořečnatým, přefiltrován a do sucha odpařen. Po vyčištění residua chromatografií na koloně (silikagel, 0 až 5 g/l methanolu v dichlormethanu)-by 1 a získána žádaná sloučenina v podobě bílé pevné látky (13.41 g, 61 g/l).

N M R; δ (C D C1₃) ,

9.61(lH,s),8.47(lH,m),8.24(lH,d,J = 8.4Hz),7.74(lH,m), 7.0 7 (1 Η, m), 6.9 7 (1 Η, d, J = 8.9Hz) ,4.6 4 (1 Η, d, J = 8.9 Η z) , 4.0 1 (1 Η, d, J - 7.6 H z), 3 .7 6 (3 Η , s), 3.4 1 (3 Η , s), 2.7 5 (1 Η , m), 1 . 7 9(1 H,m), 1 .5 1 (lH,m), 1 . 1 1 (1 H,m), 1 . 0 2 (9 Η, s), 0.8 4 (3 Η , d, J = 6.3Hz), a 0.82 (3 Η , d, J = 6.3 Hz).

KROK E:

Lithná sůl kyseliny 3R-[2,2-dimethyl-lS-(pyridin2-ylkarbamoyl)-propylkarbamovl]-2S-methoxy-5methylhexanoové

Methylester kyseliny 3 R - [ 2,2 - d i m e t h y 1 -1 S(pyridin-2-ylkarbamoyl)-propylkarbamoyl]-2Sm e tho xy - 5 - me t hy 1 he x ano v é (13.4 g, 32.9 mmol) byl rozpuštěn ve směsi THF (265 ml) a vody (65 ml) a do reakční směsi byl přidán monohydrát hydroxidu lithného (1.396 g, 3 3.3 mmol). Roztok byl 2 hodiny míchán při teplotě místnosti a poté za sníženého tlaku odpařen za zisku žlutého oleje, který byl dále sušen azeotropií toluenem. Produkt (13.4 g, obsahující zbytek rozpouštědla) byl ihned bez dalšího čištění použit. ’Ή-NMR; ó(CD₃OD,směs diastereoisomerů 3.5:1),

8.31(lH,m),7.9 9(lH,d,J = 8.3Hz),7.66(lH,m),7.00(lH,m) , 4.4 9 (0.2 3 H , s ; m e n š í diastereoisomer),4.37(0.77H,s,větší diastereoisomer),3.68(0.23H,d,J = 7.6Hz; menší diastereoisomer),3.52(0.77H,d,J = 7.6Hz; větší diastereoisomer),3,21(0.69H,s; menší diastereo isomer),3.20(2.3 1 H,s ; větší diastereoisomer),

2.64 (1 H,m) , 1 . 5 3 (2 H,br

m), 1 . 1 8 (1 H, m), 1 . 0 1 (9 H, s), 0.8 5 (3 H, d, J = 6.4Hz) a 0.8 1 (3H,d,J = 6.3Hz).

KROK G:

N⁴-benzyloxy-N¹-[2,2-dimethyl-lS-(pyridin-2ylkarbamoyl)-propyl]-2R-isobutyl-3Sme t ho x y s uk c i n am i d

Produkt z,kroku F (13.4 g, ca. 33 mmol) byl rozpuštěn v suchém THF (25 0 ml), umístěn do atmosféry argonu a za stálého míchání ochlazen na -10°C. Do roztoku byl po kapkách přidán e t h y 1 c h 1 o r o f o r m á t (3.47 ml, 36 mmol) a následně NMM (1.8 ml, 16.5 mmol). Směs byla 30 minut míchána a poté do ní byl po kapkách přidán Obenzylhydroxylamin (6 g, 49 mmol) v DMF (10 ml). Reakční směs se nechala ohřát na teplotu mítnosti a přes noc byla míchána. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku bylo residuum rozděleno mezi ethylacetát a nasycený roztok chloridu sodného. Organická vrstva byla promyta 1M roztokem uhličitanu sodného, usušena síranem hořečnatým, p ře f i 11 r o v án a a odpařena. Residuum bylo vyčištěno flash ···· ···· ·· ·· ·* ··* chromatografií (silikagel, 5 g/1 methanolu v dichlormethanu). Frakce obsahující žádaný produkt byly spojeny a odpařeny. K odstranění lehce barevné nečistoty byl produkt třen diethyletherem. Výtěžek:

9.44 g(58 g/1,>10:1 směs d i a s t e r e o i s o m e r ů). ’HN M R ; δ (C D C13, v ě t š í d i a s t e r e o i s o m e r),

10.26(lH,s),9.93(lH,s),8.32(lH,m),8.23(lH,d,J = 8.2Hz) ,7,63(lH,m),7.25(5H,m),7.12(lH,d,J = 9.2Hz),7.0 2(lH,m ),4.94(lH,d,J=10.8Hz),4.76(2H,d,J = 3.8Hz),3.88(lH,d,J = 5.5Hz),3.32(3H,s),2.91(lH,m),1.72(lH,m),1.55(lH,m), 1 .35(lH,m)ml . 0 2 (9 Η, s), 0,8 9 (3 Η, d, J = 6.5 Hz) a

0.8 5 ( 3 H-3 d, J = 6.5 H z).

KROK H:

N¹-[2,2'dimethyl-lS-(pyridin-2-ylkarbamoyl)propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3S-methoxysukcinamid

N⁴-benzyloxy-N¹'[2,2-dimethyl-lS-(pyridin-2ylkarbamoyl)-propyl]-2R-isobutyl-3Smethoxysukcinamid byl rozpuštěn ve směsi methanolu (75 ml) a ethanolu (75 ml) a umístěn do atmosféry argonu. Do roztoku bylo přidáno 10% palladium na dřevěném uhlí a 2 hodiny roztokem probublával plynný vodík. Analysou TLC bylo ukázáno spotřebování všech startovních látek. Systém byl očištěn argonem a katalysátor byl odfiltrován. Po odstranění rozpouštědel za sníženého tlaku byl získán žádaný produkt v podobě bílé pevné látky (8.8 g, kvant; směs d i a s t e r e o i s o m e r ů 12:1), b.v. 163-164°C. *ΗNMR;5((CD₃)₂SO),10.67(1H,s),10.13(1H,s),8.90(1H,s), . 1 5 (1 Η ,m), 7.8 9 (1 Η, d, J = 8.4Hz),7.8 1 (1 Η, d, J = 8.. 8 H z), 7.6 (1 Η,m),6.9 3 ( 1 Η,m)4.5 3 (0.1 2H,d, J = 9.4Hz),4.4 3 (0.8 8H₃ d,J = 8.8Hz),3.74(0.12H,d,J=10.0Hz),3.32(0.88H,d,J = 9.8

Hz),2.98(0. 3 Η, s) ,2.9 6 (2.64H, s),2.7 8 ( 1 H,m), 1 .23(2H,m)

- 16 99 ·9 ,0.84(10H,s a m),0.65(3H,d,J = 6.4Hz) a

O . 5 6 ( 3 Η, d, J = 6.3 H z). ¹³ C NMR;Ó(CD₃OD ),172.6,170.0,166.0,151. 5,147.9,136.0,11 9.5 ,1 13.6,61 .2,60.6,56.7,46.2,37.0,34.0,26.5,25.2,23.7 a 2 1 . 7 .

IR; v_max( Kb r),325 5,2957,1 700,1 6 45,1 524,1 467,1 43 5,1 3 7 0,1301,1213 a 1152 cm'¹. Nalezeno: C 5 8.40, H 7.92, N 13.61%; C 2 0 H 3 2 N₄O₅. 0.2H₂O vyžaduje C 5 8.2 9, H 7.92, N 13.60%.

BIOLOGICKÝ PŘÍKLAD A

Inhibiční účinnost sloučeniny podle, vynálezu na intersticiální kolagenasu byla stanovena metodou podle Cawstona a Barretta, (Anal. Biochem, 9 9,3 403 4 5,1 979). 1 mM roztok zkoušené sloučeniny (nebo jeho ředění) byl 16 hodin inkubován při 37°C s kolagenem a kolagenasou (pufrováno 25mM Hepes, pH ‘7.5 s obsahem 5 mM CaCL, 0.05 g/1 Brij 3.5 a 0.02 g/1 NaNs). Kolagen byl acetylován ¹⁴C kolagenem způsobem podle Cawstona a Murphyho, (Methods in Enzymology, 80, 711,1981), viz odkazy. Nenaštěpený kolagen byl ve vzorcích sedimentován centrifugací, radioaktivní supernatant byl odebrán a na scintilačním počítači v něm byla měřena hydrolysa. Aktivita kolagenasy v přítomnosti 1 mM zkoušené sloučeniny (nebo jejího ředění) byla porovnávána s aktivitou kontrolních vzorků bez inhibitoru a výsledky byly zaznamenány jako koncentrace inhibitoru inhibující 50% aktivity kolagenasy (IC50).

Inhibiční účinnost sloučeniny podle vynálezu na s t r o m e 1 y s i η -1 byla stanovována metodou podle

- 17 Cawstona a kol., (Biochem. J., 195, 15.9-165, 1981). 1 mM roztok zkoušené sloučeniny (nebo jeho ředění) byl 16 hodin inkubován při 37°C se stromelysinem a ¹⁴C acetylátem kaseinu (pufrováno 25 mM Hepes, pH 7.5 s obsahem 5mM CaCU, 0.05 g/1 Brij a 0.02 g/1 NaN₃). Kasein byl acetylován ^I4C kaseinem připraveným způsobem podleCawstonaa kol.(táž citace). Aktivita stromelysinu v přítomnosti 1 mM zkoušené sloučeniny (nebo jejího ředění) byla porovnávána s aktivitou kontrolních vzorků bez inhibitoru a výsledky byly zaznamenány j ako koncentrace inhibitoru inhibuj ící 50% aktivity stromelysinu (IC50).

I nh i b i č η í ú č i η n o s t sloučeniny podle vynálezu na 72 kDa želatinasu byla stanovována metodou podle Se Her se a kol..(Biochem. J. 171. 4 9 3 -496,1 979). 72 kDa želatinasa. získaná z buněk RPMI-7295 byla vyčištěna chromatografií želatina - agarosa. Po aktivaci enzymu jeho inkubací s aminofeny 1 acetátem rtuťnatým by 1 o asi 0,05 jednotek 16 hodin inkubováno při 3 7 ⁰ C s 50 p g želatiny značené radioaktivním [¹⁴ C ] v příslušném pufru. Na konci inkubace byl.o přidáno 50pg bovinního sérového albuminu s kyselinou trichloroctovou (konečná koncentrace 16 g/1), čímž došlo k zastavení reakce a k precipitaci nedegradovaného substrátu. Reakční zkumavky byly ná 15 minut umístěny na led a poté 15 minut centrifugovány při 1 0,000 g k sedimentaci precipitovaného substrátu. 200 pl reakčního supernatantu bylo odebráno a byla v něm změřena radioaktivita. Účinek inhibitorů byl stanoven podle vztahu ke křivce odpovědi na dávku. IC 5o (koncentrace inhibitoru nutná ke snížení enzymové aktivity o 50%) • · • · · · • · • · • ·

- 18 byla získána porovnáním křivky s daty a vypočtením koncentrace inhibitoru potřebné k dosažení 50% inhibice enzymu. Pro každé stanovení 'IC50 bylo zkoušeno alespoň 8 koncentrací inhibitorů aktivity želatinasy. Inhibitory byly rozpuštěny a ředěny DMSO.

• · · · · ··· · · · · · • · · · · · · · · ···· ···· ·« ·· ·· ··

Výsledky výše uvedených zkoušek se sloučeninou podle vynálezu byly následující:

Enzym	IC50 (nM)
Kolagenasa	1 0
Želatinasa 72kDa	7 0
Stromelysin	30

BIOLOGICKÝ PŘÍKLAD B

V tomto příkladu byla měřena koncentrace sloučeniny podle vynálezu v krvi laboratorních zvířat po jejím podání. Sloučenina byla podána zkušební skupině 6 samců laboratorního potkana (3 00 g) žaludeční sondou. Vzorky krve byly odebírány z ocasní žíly za 0.5, 1.0, 2.0, 6.0 a 24 hodin po podání sloučeniny. Do 4.5 ml zkumavek obsahujících 0.1 ml kyselého citrátu dextrosy (ACD), coby antikoagulačního činidla, byly umístěny 0.4 ml krve. Pro extrakci bylypřidány 3 ml methanolu a precipituj í cí krev byla centrifugována (30 minut při 3000 rpm). Poté byly odebrány 2 ml supernatantu a zkoncentrovány lyofilisací. Extrakt byl znovu rozpuštěn ve 200 μΐ DMSO a v 10 μΐ dílu byla zkoušena inhibiční aktivita na kolagenasu. Inhibiční aktivita v extraktech byla stanovována stejným způsobem jako • · v biologickém příkladu A, tak jak je popsáno výše, a kocentrace inhibitoru (lék plus libovolný aktivní metabolit) byla určena porovnáním se standardními křivkami. Výsledky byly vyjádřeny jako vrcholová koncentrace v ng/ml, jako plocha pod křivkou (AUC) v ng/ml * hodiny, za 0.5-24 hodin, a jako AUC v počtu IC 5 o ‘ s * hodiny.

Výsledky;

Vrcholová kocentrace	AUC (0.5 - 24 h)	AUC (0.5 - 24h)
ng/ml	ng/ml * h	η I C 5 o ‘ s * h
2 12	2966	674

Sloučenina podle vynálezu byla zkušebně podávána také chvostnatým opicím a zdravým dobrovolníků z řad lidí. I u těchto subjektů byly po perorálním podání sloučeniny podle vynálezu nalezeny v krvi významné hladiny inhibiční aktivity.

BIOLOGICKÝ PŘÍKLAD C

Sloučenina podle vynálezu byla zkoušena na dvou zvířecích modelech nádorového bujení s těmito výsledky;

Model myších B 16 melanomových buněk

V tomto modelu bylo myším C57/BL6J podkožně inokulováno ΙΟ⁵ B16 myších melanomových buněk.

Tumor se nechal růst 18 dní, přičemž hmotnost tumoru byla měřena kaliperem podle následujícího vzorce;

- 20 hmotnost (mg)-délka (mm) * šířka (mm) + 4. Skupině myší (a = 1 9) byla podána sloučenina, a to mini osmotickou pumpou implantovanou podkožně v opačné slabině, než se nacházel tumor z Β 1 6 buněk. Pumpa byla myším implantována den před inokulací tumoru a sloučenina byla podávána v dávce 360 pg/den.

Kontrolní skupině myší (a=17) byl stejnými podkožními pumpami podáván odpovídající objem vehikula.

Střední hmotnost kontrolních tumorů 18.den byla 1145 ± 97 mg (obrázek 15). Hmotnost tumorů léčených zkoušenou sloučeninou byla 774 ± 50 mg. .Toto snížení hmotnosti (32% u zkoušené sloučeniny) bylo statisticky významné (p < 0.005). Vyšetření vzorků na konci studie ukázalo, že hladina zkoušené sloučeniny v plasmě byla 26.8±3.2 ng/ml.

M o d e 1 s buňkami karcinomu prsu MDA - 435

V tomto modelu byly zvířatům inokulovány buňky MDA - 4 3 5 ( 1 0⁶ buněk/myš), tumory se nechaly čtyři dny růst a potom byla zvířata podle hmotnosti tumoru rando m i so vána do tří léčebných skupin (n=15 na skupinu). 5. den byly zvířatům chirurgicky implantovány mini pumpy obsahující bud’ zkoušenou sloučeninu nebo vehikulum v koncentraci 15 mg/ml nebo 60 mg/ml, takže dodávaly 180, respektive 720 pg každémyši za den. Pumpy byly odstraněny 19. den, studie byla ukončena 32. den. Byla prokázána inhibice růstu tumoru v závislosti na dávce, a to 19 % inhibice při 180 pg/myš/den a 33% inhibice při 720μg/myš/den. Inhibice růstu při vyšší dávce byla statisticky významná (p < 0.00 5). Vyšetření vzorků krve po • 0 00 0 0 00 0« «0 0 0' 0 0 · 0 0 · 0' · 0 ' 0

0 0 00 0 0 0 0 · 0'

0 00 0 00000 0 0 0

- 21 - · · ·· 00000

0000 0000 00 00 00 00 ukončení studie ukázalo, že hladiny zkoušené sloučeniny byly 99±6 ng/ml u skupiny s nižší dávkou a 1 3 6 ± 4 2 ng/ml u skupiny s vyšší dávkou.

BIOLOGICKÝ PŘÍKLAD D

U sloučeniny podle vynálezu byla zkoušena její vlastnost vyvolat u potkanů pozorovatelné známky tendinitidy. Tento účinek způsobovat tendinitidu byl porovnáván u sloučeniny podle vynálezu („sloučenina A“) a u jejího blízkého strukturálního isomeru N¹-[2,2dimethyl-1 S-(pyridin-.3-ylkarbamoyl)-propyl]-N⁴hydroxy-2R-isobutyl-3S-hydroxysukcinamidu („sloučenina B“).

Byly použiti potkani kmene Male Lewis. Každá studie zahrnovala do 30 potkanů. Tato zvířata byla podle své hmotnosti randomisována do skupin, n = 6 ve skupině. V každé studii měla každá terapeutická skupina svoji odpovídající skupinu s vehikulem.

Sloučenina A byla podávána ve formě mesylátové soli, zatímco sloučenina B ve formě volné base. Vehikulem byl pro sloučeninu A při koncentraci 15 mg/ml 50% DMSO, 37% 0.1M kyselina methansulfonová, 13% sterilní voda; při koncentraci 30 mg/ml 50% DMSO, 37% 0.2M kyselina methansulfonová, 13% sterilní voda. Pro sloučeninu B byl při koncentraci 15 mg/ml vehikulem 50% DMSO/voda.

K podání zkoušených sloučenin byly použity osmotické minipumpy značky Alzet (2ML2, 14 dní 5pl/hod., od Alza Corp., Palo Alto CA 943 03 ), které • · · ·

- 22 • · · · · · · · • · · · · · φ · • · · · · · • · · · · · ·» · · · · · ········ · · · ·

·* ·· byly zváženy plné a prázdné k ověření správného plnícího objemu. Před implantací se naplněné pumpy nechaly v inkubátoru při 37°C. Celková anestesie byla potkanům navozena halothanem. Po oholení a desinfekci zátylku byl na připraveném místě veden kožní řez, přibližně 2 cm dlouhý a za pomoci herno statických kleští byla pod kůží vytvořena podkožní kapsa. Do kapsy byla vložena minipumpa východem obrácená ven zrány. Po uzavření řezu sešitím bylo okolí rány opět desinfikováno. Ihned po ukončení operace byla zvířatům podána analgesie, Temgesic (značka, Reckitt a Colman) 0.1 mg/kg podkožně do slabiny. Při zotavování z anestesie byla zvířata vrácena do-klecí se suchou podestýlkou, aby se .nezhojená rána neznečistila. Následující den byla zvířata umístěna zpět do standardních klecí, a to vždy po třech do jedné klece, aby bylo možno dobře pozorovat známky tendinitidy.

Po implantaci minipump byla zvířata zvážena a monitorována, aby byl zachycen nástup tendinitidy. Nástup a závažnost tendinitidy byly měřeny skórovacím systémem založeným na pozorování (viz níže). Potkani byli pozorování denně po 16 dní. Za významné bylo považováno střední skóre > 2. Skórovací systém byl následující:

Stoj :

Normální	0
N a 1 no z e	1
Nestojí	2

- 23 Chůze:

Normální	0
Vyhýbá se použití 1 zadní nohy	1
Vyhýbá se použití obou zadních nohou	2

Při stimulaci k pohybu zvíře vykazuje:

Normální pohyb	0
Neochotu se hýbat	1
Mírný odpor k pohybu	2
Silný odpor k pohybu	3

Výsledky ukázaly, že upotkanů, kterým byla podávána sloučenina A (15 mg/ml a 30 mg/ml) a vehikulum, se neprojevily žádné významnéznámky tendinitidy, zatímco u potkanů, kterým byla podávána sloučenina. B se projevily významné známky tendinitidy od 8.dne dále (střední skóre > 2 se objevilo 8.den a vzrostlo na hodnotu kolem 6 ve dnech 15 a 16).

Bylo potvrzeno, že u potkanů, kterým byly v předchozích zkouškách podávány sloučeniny A a B, docházelo k průniku plasmy do sloučenin z minipump. Vzorky krve byly odebírány potkanům v lehké halothanové anestesii z ocasní žíly 3. a 10.den po implantaci minipump. Krev (0.5 ml) byla umístěna do zkumavek s 3.0 ml methanolu, který extrahoval a navázal volnou sloučeninu. Koncentrace sloučenin A a B byla stanovována fluorometrickou zkouškou za použití kumarínového peptidového substrátu Mca-ProLeu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 (Mca = (7m e t h o x y kum ar ί n - 4 - y 1) a c e t y 1, Dpa = N-3-(2,49 9 « 9' ·· * * * * · * · · · · · · · · · 9· 9 ♦

9 · 9 9 · · · 9 · » 9 · · 9 99 9 · 9 99 · . 94 - · · ·· 999·· «9999999 ·· ·· · *. · · dinitrofenyl)-L-2,3-diaminopropyl) (viz Knight a kol., FEBS Lett.2 96, 263-266, 1 9 92J. 16.nebo 17.den po implantaci byly studie ukončeny, potkani byli usmrceni halothanem a ze srdce byly odebrány vzorky krve (0.5 ml), v nichž byly stanoveny koncentrace sloučeniny A n e b o B .

BIOLOGICKÝ PŘÍKLAD E φφ φφ φφ

Φ·

- 25 • φ φ φ

Účinek sloučeniny podle vynálezu byl zkoušen na zvířecím modelu GBS

Φ· φφ • φ · · φ φ φ φ φ φ φφφφ · · φ φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φφφ • · · φφ ··

Experimentální autoimunitní neuritis (EAN) je autoimunitní onemocnění periferního nervového systému zprostředkované T lymfocyty. Model znázorňuj e mnoho patologických rysů GBS, který provázejí symptomy ataxie, slabost aparalysa. EAN je možné u zvířat vyvolat injekcí myelinu z periferních nervů nebo injekcí proteinových komponent myelinu, jako je Protein 0 v adjuvantní látce. Lése se při EAN objevují v míšιϊích kořenech a v periferních nervech a jsou charakterisovány perivaskulární mono nukleární i nf i 11 r a c ί,. d e m y e 1 i ni s ac í axonů a úbytkem vedení v nervech. V patologii. EAN a GBS hraje významnou roli TNFa; u pacientů s GBS jsou hladiny T-NFa zvýšeny a protilátky, anti-TNFa snižují závažnost onemocnění při EAN (Hartung HP., A η n a 1 s o f Neurology, 33,563-567,1993).

Sloučenina podle vynálezu byla zkoušena na modelu EAN u potkana, kdy symptomy nemoci byly vyvolány injekcí myelinu z periferních nervů v adjuvantní 1 átce.

Sloučenina podle vynálezu byle podávána chirurgicky implantovanými mimipumpami v koncentraci 15 a 30 mg/ml rychlostí 5pl/hodinu (viz Biologický příklad D), takže podaná dávka byla 7, respektive 14 mg/kg/den. Léčba sloučeninou podle vynálezu v průběhu celého pokusu (t.j. od l.do 15.dne) významně snížila rozvoj klinických symptomů, a to v závislosti na dávce. Ke snížení rozvoje klinických • · · to toto · · · · · · • ' · to · · * to · · ·> to · • · * to · · tototo·¹ to to » · · tototo ·· ·« to

- 26 - · · · · ·♦··· • ••••tototo ·· to·' ·· ·· symptomů v závislosti na dávce došlo na modelu EAN také tehdy, když byla sloučenina podávána od 8.do 15.dne v koncentraci 15 nebo 3 0 mg/ml rychlostí 10 :μ l/h o dinu, tedy v dávce 14, respektive 28 mg/kg/den.

BIOLOGICKÝ PŘÍKLAD F

Aktivita sloučeniny podle vynálezu -na experimentálním modelu RS:

Metodika

V pokusu byl použit model opožděného typu přecitlivělosti při RS popsaný Matyszakem a Perrym (Matyszak MK a Perry VH, Demyelinisace vcentrálním nervovém systému po opožděném typu přecitlivělosti při odpovědi na bacillus Calmette - Guerin,

N eurosci ence, 64,967-977,1995). Same i potkanů kmene Lewis byli uvedeni do celkové anestesie a poté jim byl injekcí do striata levé hemisféry vpraven 1 μΐ fosfátem pufrovaného solného roztoku obsahujícího 10⁵ teplem usmrcených bakterií bacillus, Calmette - Guerin (BCG). BCG byly injikovány stereotakticky skrze 27G, 10 μΐ stříkačkou. Koordináty pro injekci byly: bregma +1.2 mm, laterálně +0.3 mm a hloubka 4.5 mm. Po 4 týdnech bylo zvířatům do zadní končetiny intradermálně injikováno 200 μΐ roztoku, který obsahoval 10 teplem usmrcených BCG bakterií v kompletním Freundově adjuvantu.Po dalších 15 dnech bylá potkanům podána nitrožilní injekce 2 75 0U křenové peroxidasy typu II (HRP). Po 30 minutách byli potkani p e nt o b ar b i t o n e m sodným uvedeni do hluboké anestesie a transkardiálně perfundováni 100 ml 0.9g/l NaCl s 5 000 U/l heparinu, následně 200 ml fixativu parformaldehyd - lysin • ft «· ftft 99 99 99 ·' · 9 9 9 9 9 9 ft ftft φ · ftft·· · · v · ft • 9 · ft · ft·· ftft ftft ·

- 77 - · · · · ··>··

9999 ···· ·· ft· ·· ·· periodátu (PLP) s obsahem 2 g/l paraformaldehydu a 0.05 g/l g 1 u t ar a 1 d e h y d u . Mozky byly odstraněny, fixovány další 4 hodiny v PLP, přes noc ponořeny do 3 0 g/l sacharosy při 4°C, poté uloženy do Tissue - Tek O.C.T. (miles inc Elkhart USA) a zamrazeny v tekutém dusíku. Pro lokalisaci HRP byly Hanker - Yatesovou metodou (Perry VH a kol., 1 992) vytvořeny věnčité volně plovoucí 50pm silné řezy. Hypersensitivní reakce opožděného typu v mí stě stereotaktické injekce BCG je charakterisována následujícími změnami: místní porušeηí hematoencefa 1 ické bariéry zobrazené extravaskulární přítomností HRP; infiltrace lymfocytů prokázané nastříknutím protilátkou OX - 22 specifick-ou pro běžný leukocytární antigen s vysokou molekulární hmotností; aktivace leukocytů prokázaná nastříknutím protilátkou OX - 6 specifickou pro velký h i s t o k o m p a t i b i 1 η í ant i g en . t ří d y II; a porušení myelinu prokázané nastříknutím protilátkou proti myelinovému basickému proteinu. Tyto patologické rysy jsou .charakteristické pro aktivní lése nebo plaky, které se vyskytují v centrálním nervovém systému u nemocných s RS. Počet lymfocytů odpovídal počtu OX - 2 2.... positivních buněk v oblasti s nejsilnějším nastříknutím protilátkou. Počet buněk v jednom zorném poli byl zaznamenán a vyjádřen jako buňky / mm . Oblast s výskytem MHC třídy II, porušení hematoencefalické bariéry a demyelinisace byly počítány pomocí počítačové analysy a získaná data byla vyjádřena jako mm².

Účinky sloučeniny podle vynálezu byly ověřovány perorální léčbou potkanů 30 mg/kg dvakrát denně od

5.dne po druhé injekci BCG nepřetržitě do 15.dne.

Sloučenina podle vynálezu byla podávána ve fosfátem

Ψ V w w » · · «

I · · «

I · · <

- 28 ·· ··

0.01 g/1 *· ·· · · ♦ · • · • · · • · ···· ···· pufrovaném solném vehikulu obsahujícím

Tween 80. Kontrolní zvířata dostávala jen vehikulum.

Plochy porušené hemato.encefalické bariéry, exprese MHC třídy II, demyelinisace a T lymfocyty u zvířat léčených sloučeninou podle vynálezu byly porovnávány se vzorky kontrolních zvířat za pomoci Studentova T testu.

Výsledky

U kontrolních zvířat léčených pouze vehikulem byla odpověď na DTH c h ar akt e r i s o v án a porušením h e m a t o e n c e f a 1 i c k é bariéry, lymfocytární infiltrací, expresí MHC třídy II a d e m y e 1 i n i s a c í. U zvířat léčených sloučeninou podle vynálezu došlo k významnému zmenšení plochy s porušenou hematoencefalickou bariérou (p < 0.05) a k významnému snížení počtu infiltruj ících T lymfocytů (p < 0.0001). Zmenšení plochy demyelinisace a exprese MHC třídy II nedosáhly statistické významnosti.

Účinek sloučeniny podle vynálezu v modelu DTH u

RS :

• 9

- 29 99 99 '99 99

9 9 9 9 9 9

4 9 · 9 9 9

999 9 · · 9 9 • 9 9 9 9 9

99 99 99

	Vehikulum	Sloučenina
Porušení hematoencefalické bariéry	6.3 2 5± 1.953	2.042±0.487
Infiltrace T lymfocytů	85 1 . 1±66.5	3 4 1.2 ±2 1 . 9
Exprese MHC třídy II	1.7 6 3 ±0.3 70	1.318±0.300
demyelinisace	0.9 60±0.3 29	0.758±0.227

Hodnoty jsou střední ± směrodatná odchylka

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1 . bP-fŽ^-dimethyl-l S-(pyridin-2-ylkarbamoyl)propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3S-methoxysukcinamid vzorce (II) nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, hydrát nebo solvát.
2. 2. Farmaceutický přípravek obsahující N¹-[2,2dimethyl-lS-(pyridin-2-ylkarbamoyl)-propyl]N⁴-hydroxy-2R-isobutyl-3S m ethoxy-sukcinamid nebo jeho farmaceuticky přijtatelnou sůl, hydrát nebo solvát spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
3. 3. Přípravek podle nároku 2, vyznačuj ící se t í m, že -je upravený pro perorální podávání.
4. 4. Použití N ¹ - [2,2 -dime thy 1 -1 S - (pyr i din-2 ylkarbamoyl)-propyl]-N⁴-hydroxy-2R-isobutyl3 S - me tho x y - s uk c i n am idu nebo jeho • ·

   - 31 farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu nebo solvátů při léčbě reumatoidní artritidy, rakoviny, roztroušené sklerosy, syndromu

   Gui.lkan - Barré nebo lupénky u savců, včetně lidí.

   ·· ··

   0 0 · ·

   0000 0000

   00 ·· ·· *· • · * 0 0 ·

   0 0 0 0 «0 0

   0 »00 0 0 00 0

   0 0 · 0 » 0 »

   00 00 00 0*
5. 5. Způsobléčby reumatoidní artritidy, rakoviny, roztroušené sklerosy, syndromu Gu.il lan - Barré nebo lupénky u savců,, v.četně lidí v y z n.a č u jící se ti m, zeje savcům podáváno urrčité množství N ¹ - [2,2-dimethy 1-1 S _:(pyridin2 - y 1 k a r b‘a m o y 1) - p r o p y 1 ] - N⁴ - h y d r o x y - 2 Κι s o b u t y 1 - 3 S - m e th o x y - s uk c i n am i du nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, hydrátu nebo solvátů účinného snížit symptomatickou a nebo patologickou manifestaci onemocnění.