CZ113593A3

CZ113593A3 - Pharmaceutical preparations for treating b-cellular malignities

Info

Publication number: CZ113593A3
Application number: CS931135A
Authority: CZ
Inventors: Jacques Banchereau; France Thierry De
Original assignee: Schering Plough Corp
Priority date: 1990-12-13
Filing date: 1991-12-10
Publication date: 1994-01-19
Also published as: IE914328A1; DE69117974D1; HU9301719D0; OA09788A; ATE135232T1; IE64157B1; CA2098509A1; EP0490006A1; DK0561927T3; AU9072191A; WO1992010201A1; FI932650A; SK59193A3; ES2084995T3; EP0490006B1; GR3019699T3; EP0561927B1; JPH06504767A; EP0561927A1; FI932650A0

Description

Předložený vynález se týká farmaceutických přípravků obsahujících IL-4 jako účinnou složku pro léčbu .^-buněčných malignit u savců postižených B-buněčnými malignitami. Vynález se dále týká použití. IL-4 pro výrobu léčiv pro léčbu

3-buněčných malignit u savců.

Dosavadní stav techniky

Interleukin-4 /zde? ^MIL-4, nazývaný ale také jako 3 Cell Stimulatory Factor 1,(BSF-1)/ byl původně popsán M.Ho· warderm a spol.., vr J.Exp.Med. (1982),vol.155>str.914-23 jako od T-buněk: odvozený růstový faktor, odlišný oď IL-2, který dovoluje- dlouhodobou tkáňovou kultivaci mormálníchL myších 3 lymfocytů, a který reaguje s aktivovanými B lymfocyty a způsobuje jejich, proliferacl po dobu delší než 4 měsíce. Jelikož B lymfoc.ytové vzorky byly použity k iniciování kultury, bylo zjištěno, že 3 lymfocyty s nezralým fenctvpem se specificky zvyšují působením IL 4 ve tkáňové kultuře. Viz například C.Peschel a spol., J.Immunol.(1989),vol.1 42,1558— 1563. Dále G.Treenn a spol., J.Immunol.(1988) vol.140, 1101-1106 popisují, že IL-4 stimuluje vývoj cytotoxických T-buněk z ^yt-2-subpopulace zbývajících myších T-lymfocytů.

Myší IL-4 gen. byl klonován a exprimován v COS-7 buňkách (viz T.Otsuka a spol., Nuc.ácids Res. (1987), vol.15, 333-334). Klonovaný faktor měl všechny aktivity tkáňové kultury pozorované pro faktor purifikovsný ze supernatantu T-buněčné kultury* Klonovaní a exprese genu bvi.y popsány N.áraiem a spol., J.Immunol Pronést!. /nad.Sci (1988,vol.142,274-282 a T (í956),vol.83,5844-5848 s okotaou a spol.

i faktorem cro-2dukovaným v OOS-7 buňkách, majícím podobné aktivity jsko nativní molekula, jak bylo studováno ns tkáňovékultuře. IL-4 byl studován jak na lidském tak na myším systému, navíc byly molekule přisouzeny in vitro aktivity: i) IL-4 hraje významnou roli v indukci a regulaci syntézy IgE, procesu vyskytujícím se v B-lymfocytové subpopulaci, je-li indukována k proliferaci. (viz Fene J., Proč.Nati.Acad.Sci (1988), vol.85, 6880-6884» ii) IL-4 indukuje nízkoafinitní Fc^ receptory (CD23) na normálních lidských 3 lymfocytech ve tkáňové kultuře (viz T.LeFran.ee a spol., J.Exp.Med. (1987),vo. 165, 145914571), iii) IL-4 interaguje s dalšími, lymfokiny, zejména interferonem-^ (viz: R.L. Ooffman a spol., Immunol.Res.' (1988), vol. 102., 5-27 a ^ene a spol., supra/ a T buňkami (viz. R»L. Ooffman. a spol.supra, Pene a spol., supra a M.D.Widmer· a spol., Nátuře (1987), vol. 326, 795-98) k vyvolání buněčné proliferaoe a alteraoe» iv) IL-4 zvyšuje sekreci specifických, protilátkových tříd tj.IgC II zbylými 3-buňkami (R.Noell.® a spol.,. PNAS 81, 6149-6153, 1984), T.R.Mosmann a spol., v J-Immuno., vol.138, 1813-1816 popisují, že lidský a myší IL-4, které jsou z 50 % homologní v aminokyselinové sekvenci 1-90 a 129-149 byly druhově specifické.

Studie na lidech ukázaly, že IL-4 má vliv na monoklonální 3. buněčné tumory. S.Karray a spol., v J.Exp.Med.(1988), vol.168,85-94, popisují, že lidský IL-4 suprimuje IL-2 dependentní proliferaci chronické myeloidní leukemie typu 3 (B-CLL) in vitro. T. DeFrance a spol., J.Exp.Med.(1988),vol.168,1321 popisují, že IL-4 inhibuje in vitro proliferaci, ale ne diferenciaci. aktivovaných lidských buněk v odpovědi na IL-2. Viz také D.F.Jelínek a spol., J.Immunol. (1988), vol.141, 164. C.M.Higuchi a spol v Oan.Res. (1988), vol.49,6487-6492, popisují, že u lidských periferních lymfocytů preaktivovsných IL-2 indukuje IL-4 lymfokin-aktivovanou killer aktivitu (LAK). J.J.Mule a spol. v J.Exp.Med (1987), vol.166, 792-797, popisují,že v myším systému zbývající splenocyty, podrobené

-3působení buď IL-4 samotného nebo v kombinaci s IL-2, generují LáK aktivitu proti čerstvým, syngením buňkám tumoru in vitro. G.Forni a spol» v Int.ď.Jan.Sup. (1989), vol.4, 62— popisuje, že antitumorová aktivita může být indukována injekcí, myšího IL-4 do okolí spádových lymfatických uzlin nádoru a že když je IL-4 použit v kombinaci s nonapeptidem z lidského IL-1 , je pozorována velmi aktivní lymfokiny aktivovaná nádorová inhibice (LATI)» ď.J.Mule a spol. v ď. Immuno. (1989),vol.142,726-733 popisují, že majoritní fenotyp buněk indukovaných, myším IL-4 je povrchová exprese asialo,. Thy⁺, Lyt²⁺,T^“ a že v L< buňkách generovaných kombinací. IL-2. a IL-4 je zvýšení v sěrinové esterásy asociované v granulích*. D.J«J?eace a spol» v J.Immuno. (1988), vol.

140, 3679-3685 popisuje, že IL-4 indukovaná L/K aktivita je spojena s dvěma rozdílnými typy buněk, jedním NK-podobným: (NK1.1⁺,Lyt2”ů a druhým podobným T-buňkám (NK 1.1, Lyt²⁺). R.I.Tepperr ® spol., v Cell (1989), vol.57,503-51 2, popisují že myší tumorové buněčné linie: transfektované myším IL-4 jsou inhibovány v růstu in vivo, ale že IL-4 transfektované tumorové buňky smísené s netransfektovanými tumorovými buňkami vedou k inhibici ne transf ekt ováného, nádoru v růstu in vivo, když byly tyto dva typy kolokalizovány. R.I.Tepper a spol. také zjistili, že když netrasfektovaný tumor byl distálně od IL-4 transfektováného tumoru, nebyla inhibice pozorována. R.I.Tepper dále popisuje, že parenterální podání cytok inu, např.IL-2 nebo IL-4, živočichovi s nádorem., je ohrožen krátkou dobou životnosti faktoru (jako v případě IL-2) a je zde potřeba získání o.ytokinu v množstvích dostačujících pro dosažení účinné dávkyvé hladiny. G.D.Orazi a spol., v Proceedings of the Anerican Association for Cancer Research (březen 1990), vol.31,str. 252, abstrakt č. 1490 popisují, že IL-4 indukuje protinádorovou odpověď v modelu nahých myší.

Metoda léčby pevných nádorů u savců postižených těmito pevnými nádory systemickým podáváním IL-4 těmto savcům, j-e popsána v U3 oatentové přihlášce č. 07/496832,podané 21.března

1990.

-4Podstata vynálezu

Překvapivě bylo zjištěno, že široká řada B-buněčných malignit může být léčena a jejich růst inhibován podáním účinného množství IL-4 savcům, jako jsou lidé, postiženým těmito B-buněČnými malignitami.

V souladu s tím, poskytuje předkládaný vynález, farmaceutické přípravky pro léčbu B-buněČných malignit u savců takovými.. 3-buněčnými malignitami postižených, kde uveden# přípravek obsahuje IL-4 jako aktivní složku.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutické přípravky pro inhibici růstu B-buněčných malignit u savců, postižených takovými malignitami, kde uvedený přípravek obsahuje IL-4 jako aktivní složku.

Předložený vynález ještě dáie poskytuje farmaceutický přípravek pro inhibici proliferace: maligních B-buněk u savců postižených maligními B-buňkami, kde uvedený přípravek obsahuje LL-4 jako aktivní složku.

Dále předložený vynález poskytuje metodu léčby B-buněčných malignit u savců postižených 3-buněčnými malignitami, která zahrnuje podání těmto savcům IL-4 v množství účinném pro tuto léčbu.

Předložený vynález také poskytuje způsob inhibice růstu

3-buněčné malignity u savců touto 3-buněčnou malignitou posti zených, který zahrnuje podání takovému savci IL-4 v množství účinném pro takovou inhibici.

Předložený vynález ještě dále poskytuje způsob inhibice proliferace maligních 3-buněk.u savců postižených maligními

3-buňkami, který zahrnuje podání IL-4 takovým savcům v množství účinném pro tuto inhibici.

-5Objektem předloženého vynálezu je také použití IL-4 pro výrobu léčiv pro léčbu 3-buněčné malignity u savců postižených takovou malignitou.

Popis obrázků na výkresech.

Obr.1 ilustruje křivku odpovědi na dávku účinku růstové inhibice in vitro ÍL-4 v souladu s tímto vynálezem na IL-2 řízené proliferaci maligních 3-buněk z lymfatických uzlin,.

Obr.2 ilustruje křivku odpovědi na dávku účinku inhibice růstu IL-4 v souladu s tímto vynálezem, na anti-IgM-indukované proliferaci. maligních 3-buněkúz: lymfatických. uzlin.

Termín B-buněčné malignity” a termín maligní 3-buňky” jak je zde použit, znamená širokou řadu 3-buněčných nádorů a 3-buněčných neoplasdtat nízkého, středního nebo vysokého stupně malignity a zahrnují, ale nejsou tím omezeny, leukemické 3-buňky jako jsou 3-buňky chronických lymfatických leukémií (dále ”GLL”), 3-buňky lymfomů, zahrnující 3-buňky non-Hoúžkinského maligního lymfomu, zde dále NHML”, centroblastického-centrocytického lymfomu, folikulární málo diferencovaný (”FGS” -folicular small-óleaved cell) 3-buněčný lymfom, difúzní málo diferenoovaný (DSC”- diffuse small-clffived cell) buněčný lymfom, malobuněčný nediferencovaný (”3NC”-small noncleaved cell) 3-buněčný lymfom, imunoblastický velkobuněčný (IBS”) 3-buněčný lymfom, malobuněčný lymfocytární (”SCL”) 3-buněčný lymfom a difúzní velkobuněčný (DLC”) 3-buněčný lymfom ^akož i 3-buněčné l.ymfomy popsané H. A.i4illerem a spol., NEJM (1989) vol321,851-858.

V preklinických studiích prov těno, že IL-4 podaný v souladu s t terleukinem-2 (IL-2) indukovanou p buněk u patnácti (15) ze šestnácti edených in vitro ímto vynálezem i roliferaci malig (16) pacientů 3 bylo zjišnhibuje inních 3chronickou —o— lymfatickou leukémií (CLL) a u sedmi (7) z deseti (10) pacientů s lymfomy raného stadia. V klinické studili bylo podáno 5 mikrogramů/kg/den IL-4 bolusem subkutánní injekce deseti pacientům s GLL a jednomu s lymfomem raného stadia. U pacienta s lymfomem raného stadia byla rychlá reakce ve slezině a lymfatických uzlinách a více než trojnásobné snížení cirkulujících maligních 3-buněk v šesti (6) hodinách jedné 5 mikrogramové/kg/subkutánní injekce IL-4 u GLL pacientů.

Ve studii, in vitro je demonstrováno, že IL-4 inhibuje in vitro proliferativní odpověd čerstvě izolovaných B-buněk non-Hodgkinského maligního lymfomu (zde dále NHML). Pro tuto. in vitro antiproliferační zkoušku byly leukemické NHML B-buňky aktivovány nesolubilizovanými anti-IgM-protilátkami nebo. Staphylococcus Aureus kmenem Gowan 1 (zde sále SAG).

Pro 8 a 9 leukemických. NHML B-buněk byl IL-2 jediný cytokin/B-buněčný tropní faktor, který signifikantně a reprodukovatelně stimuluje DNA syntézu v těchto NHML B-buňkách aktivovaných přes jejich povrchové Ig. IL-4 silně suprimoval proliferační signály dané NHML 3-buňkami bučí anti-Ig činidlem samotným nebo v kombinaci IL-2 a anti-Ig činidly. Tato in vitro data napovídají, že IL-4 rozhodně poskytuje signály pro inhibici růstu NHML 3-buněk, kde uvedené 3-buňky jsou aktivovány prostřednictvím jejich povrchových Ig receptorů. Na základě těchto in vitro výsledků se předpokládá, že IL-4 může být užitečný v klinické léčbě zralých 3-buněčných malignit.

Fráze léčba 3-buněčných malignit jak znamená širokou řadu 3-buněčných odpovědí, podání IL-4 v souladu s tímto vynálezem, za je zde vyplývaj hrnující sivní působení lipních 3-ouně 4) indukci úči nich 3-buněk n lení účinná im se maligního 3 na 3-buněčné malignity, 2) inhibici ,«ζ ^Λ· 'h Ů ’ '7 Ή ’ h* -j ·ρ p f* ^: ·1.·. ; m ,* P ' I f'

né imunitní odpcvě	di na	inhibici	•3 -I'
bo účinné regrese	maligní	ch 3-oun	g >
.nitni odpovědi ve	smyslu	inhibice	r* o
buněčného růstu u	savců.	Imunitní	ú C.

použita ících z í 1 ) regrerůstu ma3- :nněk, υ Li zrl-L i. T —

5) zvýbo regre.oověň nšk-7 terých savců za nepřítomnosti . podání IL-4 v souladu s tímto vynálezem nemusí být dostatečně silná nebo dostatečně rychlá pro efekt inhibice. růstu maligních 3-buněk nebo regresi maligních B-buněk, ale nyní byla nalezena účinná metoda, která zahrnuje podání savcům, nesoucím B-buněčnou malignitu, množství IL-4, přednostně IL-4, účinného pro tento účel.

Jakýkoliv vhodný IL-4 může být použit v předkládaném vynálezu. Komplementární DNA (cDNA) pro IL-4 byly nedávno klonovány a sekvenovány v mnoha laboratořích, např. Yokotaou a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1986), vol.83, 5894-5898, Leem a spol.., Proc.Natl.Acad.Soi USA (1986), Vol.83,2061-2065 (myš), Noma a spol., Nátuře (1986), Vol.319,640-645 (myš.) a Genzyme? Corporation, Boston, Mass.achusetts (lidský a myší). Navíc byl nerekombinantní IL-4 čištěn z různých, supernatantů kultur, např. Grabstein a spol·., J.^xp.Med. (1985) vol.163, 1405-1413 (myší) a Ohara a spol., J.Lnmunol·. (1985), vol. 135, 2518-2423 (myší BSF-1). . Popisy všech výše citovaných článků jsou zde uvedeny jako odkazy pro jejich objasnění DNA a aminokyselinových sekvencí a metody získání vhodných IL-4 materiálů pro použití v předkládaném vynálezu.

Výhodně je IL-4 užívaný v tomto vynálezu lidský IL-4 a ještě lépe to je lidská verze se sekvencí popsanou Yokotaou a spol., Proč.Nati. Aoad.Sci.USA (1986), vol.83, 5894-5898 a PCT patentové přihlášce, č. 87/02, publikované 21.května 1987, který je exprimován a izolován z 2.coli (US patentová přihláška č. 079666, podaná 29.Července 1987' a US patentová přihláška č. 194799, podaná 12.července 1988). Produkce IL-4 z CHO buněk je popsána v US patentové přihlášce SN 3S6937, podané 28.července 1989, Produkce IL-4 z E.coli je popsána v US patentové přihlášce. SN 429588, podané 31 .října 1989. Popisy výše uvedeného článku PCT přihlášky a US patentových přihlášek jsou zde citovány jako odkazy.

-8V souladu s tím to vynálezem je savcům podáno účinné množství IL-4 k inhibici maligního S-buněČného růstu nebo efektu regrese maligníajfe B- buněk, .aebo ke zvýšení účinné imunitní odpovědi ve smyslu inhibice růstu solidního tumoru nebo regrese solidního tumoru. Výhodně je podáváno od asi 0,25 do asi. 15 mikrogramů IL-4, výhodně lidského IL-4 (hIL-4) produkovaného od E.coli nebo CHO buňkami, výhodněji od E. coli odvozeného rekombinantního hIL-4 na kilogram, tělesné hmotnosti a den. Výhodněji je savcům podáno od do asi 15 mikrogramů rekombinantního hIL-4 na kilogram tělesné hmotnosti a den, a nejlépe je savcům podáno od asi 5 do asi 10 mikrogramů rekombinantního hIL-4 na kilogram, tělesné hmotnosti a den v jedné nebo v několika dávkách.

Množství, frekvence a perioda podání buou velmi závislé na faktorech jako jsou hladina neutrofilů a monocytů (tj. závažnosti monocytopenie nebo granulocytopenie), věku pacienta, výživě atd. Obvykle bude podávání IL-4 denní a může pokračovat, periodicky během doby pacientova života. Dávkové množství a frekvence může být určeno v průběhu počátečního screeningu počtu neutrofilů a velikosti účinku IL-4 na zvýšení protilátek.

Podání dávky může být intravenosní, parenterální, subkutánní, intramuskulární nebo jakoukoliv jinou systémovou metodou. IL-4 může být podán v jakékoliv z mnoha běžných dávkových forem. Parenterální přípravky obsahují sterilní roztoky a suspenze. Dávky více než asi 10 až 15 mikrogramů rekombinantního IL-4 na kilogram tělesné hmotnosti jsou výhodně podávány lidem intrsvenozně nebo subkutánně (např. bolusem s · c ·) ·

Formulace farmaceutických přípravků zamýšlené pro uvedené dávkové formy mohou být připraveny s obvyklými farmaceuticky vhodnými přísadami a excipienty za použití obvyklých technik.

-97 současnosti je IL-4 přednostně podáván systémově injekční cestou, lépe cestou subkutánního bolusu nebo intrapetritoneálních injekcí, nebo i intravenozní injekcí. Podávaný roztok může být rekonstituovaný lyofilizovaný prášek, a může navíc obsahovat ochranné látky, pufry, disperganty std.

Výhodně je IL-4 rekonstituován s 10 milimolárním citrátovým pufrem a sterilní vodou bez chránících látek v maximální koncentraci nepřevyšující 100 mikrogramů na mililitr a je podáván, systémově cestou subkutánní injekce, intraperitoneální injekce nebo cestou kontinuální intravenozní infuze nebo intravenozní injekcí. Pro kontinuální infuzi může být denní dávka přidána k 5 ml normálního fyziologického roztoku a roztok infundován mechanickou pumpou nebe kapačkou.

Vliv IL-4 na S-buněčné malignity může být určen inter alia zmenšením lymfatických uzlin, a sleziny, snížením počtu cirkulujících maligních B-buněk jakož i redukcí objemu nádoru (který může být měřen, použitím standardních technik jako je měření pohmatem, RGT, a MRI) jakož i prodloužením doby života nebo přežití takových savců po zkušebním pokusu.

Materiály a metody

Izolace a purifikace maligních (leukemických 3-buněk

Patologické vzorky byly poskytnury od Pr.Sotto (Hosoital ALbert Michallon, Grenoble, Francie), Dr.J.P.Rossi (Hospital Val d*Airelie, ^ontpellier, Francie) a Dr. J.P.Áíagaudem (Hosoital Sdouard Herriot, Lyon, Francie). Devět pacientů s diagnosou non Hodkinova, non Burkittova maligního lymfomu (HHHL) nízkého stupně z B-buněk v souladu s Kieiekott klasifikací, kteří neobdrželi, chemoterapii pc poslední siyn měsíce před chirurgickým výkonem, bylo vybráno pro tuto studii. Vhodné vzerkv zahrnovaly 5 lymf atických uzlin PP,

LAl, PRO) a 4 sleziny (30U, DEL, 3RE, THE). Hononukieární buňky bvly získány po rozrušení orgánů na ocelovém sítě a od-10středěním buněčné suspenze nad Ficoll/Hypaque gradientem. Pro 3-buněěnou purifikaci byly mononukleární buňky nejprve podrobeny srážení do E-roset s ovčími erytrooyty. Buňky netvořící rozety (E frakce) byly dále inkubovány se směsí anti-Tbuněk (anti-CD3, anti-CD2) a anti-monoc.ytární (anti-CD14) monoklonální protilátkou. Zbylé non-3 buňky byly pak vyjmuty z E populace po inkubaci s magnetickými kuličkami (Dynabeads, Dynal, Oslo, Norsko), obalenými anti-myším IgG.

Činidla

Nesolubilozavané anti-IgM protilátky byly získány od BioNad Laboratories.. (Sichmond, CA) a byly použity v konečné koncentraci. 10 /ug/ml. Eormalizované částice Staphylococcus: aureus kmea Cowaa I (SAC) byly získány jako Pansorbin od Calbiochem-Behring Corporation (La Jolla, CA). SAC byl použit v konečné koncentraci 0,005 % (hmotn./obj.).

Cy tokiny čištěný rekombinantní IL-2 (3 x 10° j./ml) byl získán od. Angen Biologicals' (Thousand Oaks, CA) a použit v konečné koncentraci 20 j./ml, která byla určena jako optimální pro růst normálních B-buněk ko-stimulovaných nesolubilizovanými anti-IgM protilátkami. Purifikovaný rekombinantní lidský IL-4 (získaný z E.coli, 1x10' J./ml) byl poskytnut doktory P. Trottou a T.L.Nagabhushanem (Schering-Plough Research, Bloomfield, NJ). 7 experimentech byl použit 1^-4 v konečné koncentraci 500 j./ml, neboř tato koncentrace poskytuje maximální stimulaci 3-buněčného růstu, jak bylo odhadnuto na normálních 3-buňkách aktivovaných insolubilizovánými antilgM pro tilátkami.

-1 1Kultury

Devět čištěných leukemických NHML B-buněk bylo kultivováno v Iscove-ově mediu (Flow Laboratories, Irvine, OA) obohaceném 50 /Ug/ml lidského transferinu (Sigma Chemical. Co., St.Louis. MO),. 0,5 $ hovězího sérového albuminu (Sigma), 5 /Ug/ml hovězího inzulínu (Sigma), 5 % selektovaného teplem, inaktivovaného fetálního telecího séra, 100 j./ml penicilinu,^ 100 /Ug/ml Střep torny činu (všechny od Flow Laboratories.) a 10”⁵M fo -merkaptoethsnolu (Sigma). Pro proliferační studu bylo 1 x 10 leukemických S-buněk umístěno do 100 /ul kultivačního media v mikrojamkách s kulatým dnem. a inkubováno v 5% CC>₂ zvlhčované atmosféře při. 37 °C po pět dní za přítomnosti, polyklonálních. B-buněčných aktivátorů PBA-3AC, nebo insolubilizovaných anti-IgM protilátek; a/nebo faktorů IL-4 (500 j./ml) a/nebo IL-2 (20 j./ml), které se přidávají na počátku kultivace;. DNA syntézy byly stanoveny pulsováním buněk. se. (3H)thymidinem (zde ”(3H)TdR”) po konečných 16 h kultivační periody. Díky hetérogenitě odpovědí vzorků leukemických B-buněk byla DNA syntéza hodnocena ve čtyřech, odlišných časových intervalech (ve dnech 3,4,5 a 6) po počátku kultivace. Výsledky uvedené v tabulce 1 odpovídají časovému bodu, který poskytl maximální známky stimulace. Počet za minutu (3H)TdP inkorporace (apm X10“·³) je vyjádřen jako průměr trojnásobného stanovení. Standardní odchylka nikdy nepřestoupila 10 % průměru. Výsledky jsou uveden?/ v tabulce· .

IL-4 byl zkoumán na svou kapacitu antagcnizovat proliferativní odezvu NHML 3-buněk na IL-2. Každý z 9 vzorků NHML 3-buněk byl proto společně kultivován s IL-2Í20 j/ml) a IL-4 (500 j/ml) za přítomnosti anti-Ig činidla dříve definovaného jako. optimálního pro aktivaci. Protože se leukemické vzorky také jeden kách odpovědi na r od druhého liší ve ůst-proaotující úč ,nek I časových kinetii-2, byla DNA syntéza měřena 4,

5, ó a 7 dnů po počátku kultivace

6'daje v ta-12bulce 1 představují, pro každý klon., hladiny (3H)TdR inkorporace získané v době, odpovídající píku proliferativní odezvy na IL-2. Jeden klon (Mál) neodráží výraznou odezvu růstu na IL-2 nebo IL-4 v obou aktivačních systémech a proto není zahrnut do tabulky 1.

V 7 z 8 případů, IL-4 je neúspěšný k synergizaci s anti-Ig Činidly pro podporu DNA syntézy z NHML 3-buněk. Nicméně jeden klon (BRS) vykazuje opačný průběh odezvy a proliferace za kultivace s IL-4 a anti-IgM protilátkami. S Výjimkou klonu BRS, všechny NRML 3-buňkyvé vzorky odrážejí růstovou odezvu na IL-2. ^ro všechny IL-2 odpovídající klony bylo nalezeno, že IL-4 výrazně inhibuje IL-2 řízenou, proliferací buněk.

Titrace účinku inhibice růstu IL-4 na IL-2 indukovanou odez5 vu 1 x 10 buněk leukemického klonu GAN ko-stimulovaného; s 0,005 % SAC a 1Q j/ml IL-2 za nepřítomnosti nebo za přítomnostiseriových ředění IL-4. Inkorporaoe (3H)TdR byla stanovena 4.ďen. Obr. 1 je křivka dávkové odezvy, která je reprezentativní pro tři pokusy a graficky ukazuje, že kompletní inhibioe odezvy na IL-2 je vždy dosaženo u koncentrací IL-4 tak nízkých jako 16 j/ml.

Obr. 2 je křivka dávkové odezvy, která' graficky shrnuje čtyři pokusy a ukazuje vliv IL-4 na inhibici růstu na anti-Ig M-indukovanou proliferací klonu PRO. Tyto leukemioké 3-bunky (1 x 10 PRO) byly stimulovány s nesolubilizovanými anti-^Ig M protilátkami (10 /Ug/ml) za nepřítomnosti nebo za přítomnosti sériových ředění IL-4. (3H)TdR byl přidán během posledních 16 hodin 4.den kultivační, periody (3H)TdR inkorporace v nestimulováných kulturách byla 346+ 28 opm. Navíc IL-4 také inhibuje růst tří jiných NHML 3-bunščných láaahků (3ou, SMI, PRO) které vždy vykazují významnou prolif erativní OdpověS za ligace tří povrchových Ig s SAC nebo anti-ígM . Za přítomné .studie bylo iny, NHivíL 3-buňky aktivované protilátkami (tabulka 1, obr.2) prokázáno, že/jejich velké větš

13přes jejich povrchové Ig receptory mohou být stimulovány pro DNA syntézu IL-2. V některých vzorcích tumorů (3 ' z 9), by mohla být proliferativní odezva také indukována spodní ligací povrchových Ig za nepřítomnosti faktorů exogenního růstu. IL-4 výzmamně potlačuje nejen růstovou odezvu těchto, buněk na IL-2 ale takéi na anti-Ig činidlo samotné.

Tabulka 1

Anti-proliferativní účinky IL-4 na IL-2 indukovaný růst čerstvě izolovaných ne Hocj£inských. maligních lymfomových (NHML)

B bunělsJ

PBA=	SAC	PBA?	anti-IgM. ’
NHML. B. buňky³:	BOU	THE	PP	DEL,	GAN	EMZ	PRO	BRE
medium.'	0,5	0$-3	0,2.	1,2	0,6	0,2	0,3	0,2
PBA⁴	21,4	2,3	6,2	0,6	0,6	18,2	64,8	2,4
PBAHL*4^P	1 1,9	2,0	3,0	1,6	4,0	7,8	30, T	9,1
PBAřIL-2	35,5	7,9	47,2	3,4	22,2	56,8	72,3	4,5
PBAHL-2+
IL-4	12,8	3,9	9,5	3,7	9,5	13,6	27,8	11, t
1(3H)TďR inkorporace	(cpm x	10³	měřena	po. pí	Šti dnech a v;

jádřena jako průměr tří stanovení.

2. SAC= Staphylococcus Aureus kmen Cowan 1.

3. 1 x 10⁵ NHML buněk inkubováno při 37 °C po 5 dnů.

4. PSA - golyklonální 3 buněčný aktivátor

5. 500 j./ml IL-4

6. 20 j./ml IL-2

Claims

1,2 nebo 3 ve formě upravené

6. Přípravek podle, nároku 1,2 nebo nou složkou je lidský IL-4.

3, kde uvedenou účin

7.

nou

Přípravek podle nároku.1,2 složkou je od S.coli odvozený nebo 3, kde uvedenou účinrekombinantní lidský IL-4.

8. Přípravek podle nároku 1,2 nebo 3, vyznačuj íc í se t í m, že uvedené účinné množství IL-4 je v rozmezí od asi 0,25 do asi 15 mikrogramů na kilogram tělesné iimotnosti na den.

9. Způsob lé touto malignitou zahrnuje podání oostižených m, želéčení.

-1510» \ Způsob podle nároku 9, v.y znač u j/í c í se t í m,\e: léčení zahrnuje inhibi.ci růstu 3-hdněčné malignity u savců postižených. B-buněČnou malignitou/podáním. takovému savci, množství IL-4 účinné/^ro tuto inhýfbici

11. Způsob pndle nároku 9, vyznačující se tí m, že- léčení \ahrnuje inhibicx proliferace maligních Bbuněk. v. savcích postižených maLťgními 3-buňkami podáním těmto savcům množství\lL-4 účinného pro tuto inhibici.

12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 9, 10 nebo 11, vyznačující s/e\t í m, že- IL-4 je podán intrávenosně..

1J. Způsob podlil kteréhokoli^ z: nároků 9, 10 nebo 11, v y z n a č u j í/c í se t í m, pes je podán lidský IL-4.

14., Způsobypodle- kteréhokoliv z nároků 9, 10 nebo 11, vyznačtyjící se ť í m, že je\podán od E.coli odvozený rekomoinantní lidský IL-4,

15« Zjóůsob podle kteréhokoliv z nároků 10 nebo 11, v y z n/a č u j ί o í se t í m, že IL-4 je\odán subkutánnš♦

16. / Způsob podle kteréhokoliv z nároků 9, 10 nelioýl, v • značující se tím, že množství podaného IL-<

jé v rozmezí od asi 0,25 do asi 15 mikrogramů na kilogramX 'tělesné hmotnosti na den.

Použití IM pro výrobu léčiva pro léčbu 3-buněčné malignity v savců postižených takovou malignitou.

18^ Použití IL-4 pro výrobu léčiva pro inhibici růstu

3-bunečné malignity u savců postižených 3-buněčnou malignito

-1641

Použití IL-4 pro výrobu léčiva pro inhibici proliferace maligních 3-buněk u savců postižených maligními 3-buňkami.

4v U

2&. Použití podle nároku 1V nebo ve kterém j'e uvedené léčivo ve formě upravené pro intravenozní nebo intraperitoneální podání.

&· léčivo lidský IL-4.

Použití podle_; nároku nebo kde uvedené je v.e formě upravené pro subkutánní podání.

Použití podle nároku to nebo ij^, kde IL-4 je:.

' 4 44

1. Farmaceutický přípravek pro léčení 3-buněčné malignity u savců postižených 3-buněčnou malignitou, vyznačující se tím, že obsahuje. účinné množství IL-4 jako účinné složky»

2. Přípravek podle nároku 1 pro inhibici růstu ..3-buněčné malignity u savců postižených 3-buněčnou malignitou.

3·. Přípravek podle nároku 1 pro inhibici proliferace maligních B-buněk u davců postižených maligními 3-buňkami.

4. Přípravek podle nároku 1,2 nebo 3 ve formě upravené pro intravenosní nebo intraperitoneální podání.

5. Přípravek podle nároku pro subkutánní podání.

2^ Použití podle nároku 1^ nebo kde IL-4 je od E.coli odvozený rekombinantní lidský IL-4.

ziG Ί 4® Ή

Použití podle: nároku Ifc. (fe nebo kde uvedené léčivo obsahuje množství IL-4 v rozmezí od asi 0,25 do asi 15 mikrogramů na kilogram tělesné hmotnosti pro denní podání.