SK59193A3 - Pharmaceutical compositions for the treatment of b-cell malignancies - Google Patents

Description

Farmaceutické prípravky .na liečbu B-bunkových malignít

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka farmaceutických prípravkov obsahujúcich IL-4 ako účinnú zložku pre liečbu B-bunkových malignít u cicavcov postihnutých B-bunkovými malignitami. Vynález sa ďalej týka použitia IL-4 pre výrobu liečiv pre liečbu b-bunkových malignít u cicavcov.

Doterajší stav techniky

Interleukin-4 /tu IL-4, nazývaný ale tiež ako B Celí Stimulátory Factor 1, /BSF-1// bol pôvodne popísaný M.How.irdom a spol., v J.£xp.Med./1982/, vol.155, str.914-23 ako od T-buniek odvodený rastový faktor, rozdielny od IL-*·, ktorý dovoľuje dlhodobú tkanivovú kultiváciu normálnych myšacích B lymfocytov a ktorý reaguje s aktivovanými B lymfocytmi a spôsobuje ich bujnenie počas doby dlhšej ako 4 mesiace. Keďže B lymfocytové vzorky boli použité k iniciácii kultúry, bolo zistené, že B lymfocyty s nezrelým fenotypom sa špecificky zvyšujú pôsobením IL-4 v tkanivovej kultúre. Viď napríklad C.Peschel a spol., J.Immunol./1989/, vol.142, 1558t

1568. Ďalej G.Treen a spol., J. Immunol ./1988/,-vol. 140,

1LO1-11O6 popisujú, že IL-4 stimuluje vývoj cytotoxických ϊ-buniek z Lyt-2-subpopulácie zostávajúcich myšacích T-lynfocytov.

Myšací gén bol klonovaný a exprimovaný v COS-7 bunkách /viď T.Otsuka a spol., Nuc. acíqs Res. /1987/¹ vol.15,

333-334/. Klonovaný faktor mal všetky aktivity tkanivovej kultúry pozorované pre faktor purifikovaný zo supernatantu T-bunečnej kultúry. Klonovanie a expresia génu boli popísané N.Araiom •1 spol., J.Immunol. /1988,vol.142, 274-282 a T.Yokotaou a spol. Proc.Natl.Acad.Sci. /1986/, vol.83, 5644-5848 s faktorom pro-2dukovaným v COS-7 bunkách, majúcich podobné aktivity ako natívna molekula, ako bolo študované na tkanivovej kultúre. IL-4 bol študovaný ako na ludskom tak aj na myšacom systéme, naviac boli molekule prisúdené in vitro aktivity: i/IL-4 má významnú úlohu v indukcii a regulácii syntézy IgE, procesu, ktorý sa vyskytuje v B-lymfocytovej subpopulácii, ked je indukovaná pri bujnení /vid Pene J., Proc.Natl.Acad.Sci /1988/, vol.85, 6880-6884; ii/ IL-4 indukuje nízkoafinitné Fc receptory /CD>3/ ^na normálnych ludských B-lymfocytoch v tkanivovej kultúre /vid T.DeFrance a spol., J.Exp.Med. /1987/, vol.16/, 1459-1471/, iii/ IL-4 interaguje s dalšími lymfocytmi predovšetkým s interferonom- /vid R.L.Coffman a spol., Immunol.

Pes. /1988/, vol.102, 5-27 a Pene a spol., supra/ a T-bunkami /vid R.L.Coffman a spol. supra, Pene a spol., supra a M.Ľ.

V/idmer a spol., Náture /1987/, vol. 326, 795-98/ k vyvolaniu bunkového bujnenia a zmien, iv/ IL-4 zvyšuje sekréciu špecifických protilátkových tried tj.MHC II zvyšnými B-bunkami /R.iíoelle a spol., PNAS 81, 6149-6123, 1984/, T.R.Mosmann a spol., v J-Immuno, νο1.1·38, 1813-1816 popisujú, že ludský a myšací IL-4, ktoré sú na 50% homologické v aminokyselinovej sekvencii 1-90 a 129-149 boli druhovo špecifické.

Štúdia na ludoch ukázali, že IL-4 má vplyv na monoklonálne B-bunkové tumory. S.Karray a spol., v J.Exp. Med. /1958/, vol. 168, 85-94, popisujú, že ludský IL-4 suprimuje IL-2 depenoentná bujnenie chronickej myeloidnej leukémie typu B /B-CLL/ in vitro. T.DeFrance a spol., J.Exp.Med. /1988/, vol.168, 1321 popisujú, že IL-4 inhibuje in vitro bujnenie, ale nie diferenciáciu aktivovaných ludských buniek v odpovedi na IL-d. Vid tiež D.F.Jelinek a spol., J.Immunol. /1988/,vol.141, 164. C.M.Higuchi a so,-L. v Can.Pes. /1988/, vol.49, 6487-6492, popisujú, že u íudskýcr. periférnych lymfocytov preaktivevaných IL-2 indukuje IL-4 lymfokin-aktivovanú killer aktivitu /LAK/. J. J.Mule a spol. v J. Exp.Med. /1987/, vol. 166, 792-797, popisujú, že v myšacom systéme zostatkové splenocyty, podrobené pôsobeniu IL-4 samotného

-3alebo v kombinácii s IL-2, generuje LAK aktivitu proti čerstvým syngénnym bunkám tumoru in vitro. G.Forni a spol. v Int.

J.Can.Sup. /1939/, vol.4, 62-65 popisuje, že keč je IL-4 použitý v kombinácii s nonapeptidonr z ludského IL-1 , ύθ oozoro'v_uiá veimi aktívna lymfokiny aktivovaná nádorová inhibíciu ,· juiTI/. J.J,Mule o spol. v J.Immuno. /198?/, vol. 14^, 7-;ó-733 ropisujú, že majoritný fenotyp buniek indukovaných myšiam

IL-4 je povrchová expresia asialo-OM^, Thy⁺, Lyt ⁺, Τ’⁵ a že v LaK bunkách generovaných kombináciou IL-2 a IL-4 je zvýšenie v serínovej esteráze asociovanej v granuliach. D.J.Peace a spol. v J.Immuno. /1988/, vol.140, 3679-3685 popisuje, že IL-4 indukovaná LAK aktivita je spojená s dvoma rozdielnymi typmi buniek, jedným NK-nodobným /NK1.1⁺, Lyt^^-/ a druhým podobným T-bunkám /NK l.l”, Lyt^⁺/. R.I.Tepper a spol., v Celí /1989/, vol.57, 503-512, popisujú, že myšacie tumorové bunkové línie transfektované myšacím IL-4 sú inhibované v raste in vivo, ale že IL-4 transfektované tumorové bunky zmiešané s netransfektovanými tumorovými bunkami vedú k inhibícii netransfektovaného nádoru v raste in vivo, ke<3 boli tieto dva typy kolokalizované. R.I.Tepper a spol. tiež zistili, že keä netransfektovaný tumor bol vzdialenejší od IL-4 transfektovaného tumoru, nebola inhibícia pozorovaná. R.I.Tepper <3alej popisuje, že parentálne podanie cytokinu, napr. IL-2 alebo IL-4, živočíchovi s nádorom, je ohrozené krátkou dobou životnostôjfaktoru /ako v prípade IL-2/ a je tu potreba získania cytokinu v množstvách dostačujúcich pre dosiahnutie účinnej dávkovej hladiny. G.D.Orazi a spol., v Proceedings of the American Association for Cancer Research /marec 1990/, vol.31, str. JP2, abstrakt č. 1490 popisujú, že IL-4 indukuje protinádorovú odpoveH v modele nahých myší.

Metóda liečby pevných nádorov u cicavcov postihnutých tými to pevnými nádormi systematickým podávaním IL-4 týmto cicavcom je popísaná v US patentovej prihláške č. 07/496832, podané

21. marca 1990.

-4Fodstata vynálezu

Prekvacivo bolo zistené, že široká rada B-bunkových malignít môže byť liečená a ich rast inhibovaný podaním účinného množstva IL-4 cicavcom, ako sú ludia,postihnutými týmito B-bunkovými malignitami.

V súlade s tým,poskytuje predkladaný vynález farmaceutické prípravky na liečbu b-bunkových malignít u cicavcov takými B-bunkovými malignitami, kde uvedený prípravok obsahuje IL-4 ako aktívnu zložku.

Predkladaný vynález tiež poskytuje farmaceutické prípravky na inhibíeiu rastu B-bunkových malignít u cicavcov, postihnutých takýmito malignitami, kde uvedený prípravok obsahuje IL-4 ako aktívnu zložku.

Predložený vynález ešte áalej poskytuje farmaceutický prípravok na inhibíeiu bujnenia maligných B-buniek u cicavcov postihnutých malignými B-bunkami, kde uvedený prípravok obsahuje IL-4 ako aktívnu zložku.

Calej predložený vynález poskytuje metódu liečby B-bunkových malignít u cicavcov postihnutých B-bunkovými malignitami, ktorá zahrnuje podanie IL-4 týmto cicavcom v množstve účinnom pre túto liečbu.

Predložený vynález tiež poskytuje spôsob inhibície rastu B-bunkovej mulignity u cicavcov touto B-bunkovou malignitou nestihnutých, ktorý zahrňuje podanie IL-4 takémuto cicavcovi v množstve účinnom pre takúto inhibíeiu.

Preulo^oný vynález ešte ňalej poskytuje spôsob inhibície bujnenia ma i i g.ny ch B-buniek u cicavcov postihnutých malignými a-bunkani, ktorý zahrňuje podanie IL-4 takýmto cicavcom v množ štve účinnom rre túto inhibíeiu.

-ϊObjektom predloženéiio vynálezu je tiež použitie IL-4 nu výrobu liečiv pre liečbu B-bunkovej malignity u cicavcov postihnutých takouto malignitou.

Γoois obrá z kpy_na výkŕ e sp ch

Obr.l ilustruje krivku odpovede na dávku účinku rastovej inhibície in vitro IL-4 v súlade s týmto vynálezom na IL-z riadeného bujnenia cialigných B-buniek z lymfatických uzlín.

Obr.2 ilustruje krivku odpovede na dávku.účinku inhibície rastu IL-4 v súlade s týmto vynálezom na auti-Igíč indukovaného bujnenia malipných L—buniek z lyuifat kých uzlín.

Termín 3-bunkové ma Lignity a termín maligné B-bunky, ktorý je tu použitý, znamená širokú škáli; Eí-bunkových nádorov 3-bunkových neoplazmatíd nízkeho, stredného alebo vysokého stupňa malignity a zahrňujú, ale nie sú tým obmedzené, leukemické B-bunky ako sú B-bunky chronických lymfatických leukémií /dalej CLL/, B-bunky lymfomov, zahrňujúce B-bunky nonHodkinského maligného lymfómu, tu^oalej NHNÍL, centroblastic kého-ce-ntrocytického lymfómu, folikulárny málo diferencovaný /FOS -folicular small-e :.eaved celí/ B-bunkový lymfóm, di-'. fúzny málo diferencovaný /ĽSC -diffusa smali-cleaved celí/ B-bunkový lymfóm, malobunkový nediferencovaný /SNG -small. noncleaved celí/ b-bunkový lymfóm, imunoblastický velkobunkový /IBS/ B-bunkový lymfóm, malobunkový lymfocytárny /SC L/ B-bunkový lymfóm a difúzny velkobunkový /ĽLC/' B-bunkový lymfóm ako aj B-bunkové lýmfomy popísané R.A.Millerom a spol.,NĽJM /1989/ vol.321, 8bl-8>6.

V prebi!inických štúdiách prevedených in vitro bolo ziste ne, že IL-4 podaný v súlade s týmto vynálezom inhibuje interleukinom-2 /IL-2/ indukované bujnenie maligných B-buniek u pätnástich /Yz>/ zo šestnástich /16/ pacientov s chronickou

-6Ijmfatickou leukémiou /CLL/ a u siedmich z desiatich /10/ pacientov s lymfómami ranného štádia. V klinickej štúdii holo podané p mikrograniov/kg/deň IL-4 spôsobom intravenóznej injekcie desiatim pacientom s CLL a jednému s lymfónom ranného štádia. U pacienta s lymfónom ranného štádia bola rýchla reakcia v slezine a Lymfatických uzlinách a viac než trojnásobné zní-. ženie cirkulujúcich maiignít B-buniek v šiestich /6/ hodinách jednej p mikrogramovej/kg/ intravenóznej injekcie IL-4 u CLL pacientov.

V štúdiách in vitro je demonštrované, -že IL-4 inhibuje in vitro proliferatívnu odpoveÓ čerstvo izolovaných E-huniek non-Hodgkinského maligného lymfómu /tu aalej NHML/. Pre tuto in vitro antiproliferačnú skúšku boli leukemické NHML B-bunky aktivované neso.lubiiizovariými anti IgM-protilátkami alebo Stsphyiococus Aureus kmeňom Cowen 1 /tu ňn.lej ShC/.

Pre 8 a 9 Leukemických ^niviL B-buniek bol IL-2 jediný cytokin /B-bunkový tropný faktor, ktorý signifikantne a reprodukovateľné st imuluje syntézu DNA v týchto NHML B-bunkách aktivovaných cez ich povrchové Ig. IL-4 silno supŕimoval proliferačné signály dané NHML B-bunkami buá anti-Ig činidlom samým alebo v kombinácii L L-2 a anti-Ig činidiel. Tieto in vitro údaje napovedajú, že IL-4 rozhodne poskytuje sygnály’ na inhibíciu rastu NHML B-buniek, kde uvede*né B-bunky sú aktivované prostredníctvom ich povrchových Ig receptorov.

Na základe týchto in vitro výsledkov sa predpokladá, že IL-4 môže byt užitočný v klinickej liečbe zrelých B-bunkových maLignit.

Fráza liečba B-bunkových maiignít, ako je tu použitá, znamená širokú škálu B-bunkových odpovedí, vyplývajúcich z podania IL-4 v súlade s týmto vynálezom, zahrňujúcu: 1/regresívne pôsobenie na b-bunkové mulignity, 4/ INhibíciu rastu maligných B-buniek, 3/ inhibíciu bujnenia maligných b-buniek,

4/ indukciu účinnej imunitnej odpovede na inhibíciu rastu maiigných b-buniek alebo účinnej regresie maligných B-buniek, p/ zvýšenie účinnej imunitnej odpovedi v zmysle inhibície alebo

-7regresie maiigného B-bunkovénó rastu u cicavcov. Imunitná odpoveň niektorých cicavcov za neprítomnosti podania IL-4 v súlade 5 týmto vynálezom nemusí byť dostatočne silná alebo dostatočne rýchla pre efekt inhibície rastu maligných b-buniek aiebo regresií mulignych B-buniek, ale teraz bola nájdená účinná metóda, ktorá z.hrňuje podanie množstva IL-4 cicavcom, nesúcim . B-bunkovú malignitu, prednostne IL-4 účinného pre tento účel.

Akýkoľvek vhodný IL-4 môže byť použitý v predkladanom vynáleze. Komplementárne DNA /'cDNA/ pre IL-4 boli nedávno klonované a sekvenované v mnohých laboratóriách, napr. Yokotaou a spol Proc.Natl. Acud.Sci. USA /1986/, vol.83, >894->398, Leem a spol. , Proc.Natl.Acad.Sci. USA /1986/, vol.83, <061-2065 /myš/, Noma a spol. , Náture /1986/, vol.319, 640-646 /myš/ a Genzýme Corporation, Boston, Maseachusetts /ludský a myšací/. Naviac bol nerekombinantný IL-4 čistený z rôznych supernatantov kultúr, napr. Cr.abstein a spol., U.Lxp.Med. /1985/ vol. I03, 14O>1413 /myšací/ a Ohara a spol., J.Immunol. /198?/, vol. 135, < .,18-2023 /'myšací BSF-1/. Popisy všetkých vyšie citovaných článkov sú tu uvedené ako odkazy pre ich objasnenie DNa a aminokyselir.ových sekvencií a metódy získavania vhodných iL-4 materiálov pre použitie v predkladanom vynáleze.

í

Výhodne je IL-4 užívaný v tomto vynález'e ludský IL-4 a ešte Lepšie to je ludská verzia sa sekvenciou popísanou Yokotaou a snol., Proc.Natl.Acad.Sci. USA /1986/, vol.83, >894-5398 a PCT patentovej prihláške č, 87/02, publikovanej 21. mája 1987, ktorý je exprimovaný a izolovaný z N.coli /US patentová prihláška č. 079666, podaná 29. júla 1987 a US patentová prihláška č. 194799, podaná 12. júla i983/.. Produkcia iL-4 z OHO buniek je popísaná v US patentovej prihláške SN 386937, podanej 23. júla 1989. Produkcia IL-4 z L.coli je popísaná v US patentovej prihláške SN 4i9>88, podanej 31-októbra 1989. Popisy vyššie uvedeného článku ^:1CT prihlášky a US patentových prihLášok sú tu citované ak) odkazy.

~C·V súlade s týmto vynálezom je cicavcom podané účinná množstvo IL-4 k iuhibícii malifxiého B-bunkového rast« alebo efektu regresie muligných B-buniek alebo k zvýšeniu účinnej imunitnej odpovedi v zmysle inhibície rastu solídneho tumoru alebo regresie solídneho tumoru. Výhodne je podávané od asi 0,25 do asi 15 ••J. krogramov IL-4, prednostne ľudského IL-4 /'*hIL-4/ produkov u ieho z E.coli alebo OHO bunkami, výhodnejšie z E.coli odvodeného rekombinantného hIL-4 na kilogram telesnej hmotnosti na deň. Výhodnejšie je cicavcom podávať od 0,25 do asi 15 mikrogramov rekombinantného hIL-4 na kilogram telesnej hmotnosti na deň, a najlepšie je cicavcom podávať od asi 5 do asi 10 mikrouromov rekombinantného hIL-4 na kilogram telesnej hmotnosti na •deň v jednej alebo v niekoľkých dávkach.

Množstvo, frekvenciu a perióda podávania budú veľmi závislé na faktoroch ako sú hladina neutrofilov a monocytov /t.j. závažnosti monocytopénie alebo granulocytopénie/, veku pacienta, výžive atň. Obvykle bude podávanie IL-4 denné a môže pokračovať periodicky behom doby pacientovho života. Dávkové množstvo a frekvencia môže byť určená v priebehu počiatočného sereeningu počtom neutrofiliv a veľkosťov účinnku IL-4 na zvýšenie protilátok.

Podanie dávky môže byť intravenózne, parentálne, podkožné, intramuskulárne alebo akoukoľvek inou systémovou metódou. IL-4 môže byť podaný v akejkoľvek z mnohých bežných dávkových foriem. Parentálne prípravky obsahujú sterilné roztoky a suspentie. Dávky viac než asi 10 až 15 m.i.krogramov rekombinantného IL-4 na kilogram telesnej hmotnosti sú výhodne podávané ľuňom intravenózne alebo podkožné /napr. bolusom s.c./.

Formulácia farmaceutických prípravkov zamýšľaných pre uvedené dávkové formy môžu byť pripravené s obvyklými farmaceutický vhodnými prísadami a expicientami za použitia obvyklých techník.

-9V súčásnoíľ-ti j c IL-4 prednostne podávaný injekčnou cestou systémovo, výhodnejšie cestou subkutánneho bolusu alebo intra:-e tritoneálnych injekcii alebo aj intravenóznych injekcii. Podávaný roztok môže byť rekonštituovaný lyofilizovaný prášok a :r.ôže naviac obsahovať ochranné látky, pufre, disperganty atá.

výhodne je IL-4 rekonštituovaný s 10 milimolárnym citrátovým pufrom a sterilnou vodou bez chrániacich látok v maximálnej koncentrácii neprevyšujúcej 100 mikrogramov na mililiter a je podávaný sastémovo cestou subkutánnej injekcie, intra peritoneáInou injekciou alebo cestou kontinuálnej intravenóznej infúzie alebo intravenóznou injekciou. Pre kontinuálnu infúziu môže byť denná dávka pridaná k 5 ml normálneho fyziologického roztoku o roztok infundovaný mechanickou pumpou alebo kvapkadlom.

Vplyv IL-4 na B-bunkové raalignity môže byť určený zmenšením lymfatických uzlín a sleziny, znížením počtu cirkulujúcich maligných B-buniek ako aj redukciou objemu nádoru /ktorý môže byť meraný použitím štandardných techník, ako sú meranie pohmatom, RTG, 14b 1/ ako aj predĺžením doby života alebo prežitia takýchto cicavcov po skúšobnom pokuse.

í

Materiály s metódy

Izolácia a purifikácie malignýuh /leukemických/ B-buniek

Patologické vzorky boli poskytnuté oc Pr.Sotto /Hospital Albert MichalLon, Crenoble, Francúzsko/., Ľr.J.F.Kossi /Kcspital Val d'nurelle, Montpellier, Francúzko/ a Ľr. J.P.Magaudem /Hospital kdouard Herriot, Lyon, Francúzko/. Deväť pacientov s diagnózou non Hodkinova, non Burkittova maligného lymfómu /HHML/ nízkeho stupňa z B-buniek v súlade s Karlovou klasifikáciou, ktorí neobdržali chemoterapiu počas posledných štyrochmesiacov pred chirurgickým výkonom, bolo vybraných na túto štúdiu. Vhodné vzorky zahrňovali ? lymfatických uzlín /EMZ, GAN PP, MAI, PRO/ a 4 sleziny /BOU, DLL, BRE, THE/. Mononukleárne ounky boli získ.-mé po rozrušení orgánov na oceľovom site a od-10ztredením bunkovej suspenzie nad Ficoll/Hypa}ue gradientom. íía B-bunkovú purifikáciu boli mononukleárne bunky najprv podrobené zrážaniu do E-roset s ovčími erytrocytami. Bunky, ktoré netvoria rosety /E“ frakcia/ boli Óalej inkubované so zmesou anti-T-buniek /anti-CD3, anti-CD2/ a anti-monocytárnou /anti-CDl/ó monoklonálnou protilátkou. Zvyšné ncn-B-bunky boli potom vyňaté z E~ populácie po inkubácii s magnetickými guličkami /Dynabeads, Dynal, Oslo, Nórsko/, obalenými anti-my33 c im IgC.

činidlá

Nesolubilizované anti-IgM protilátky boli získané od BioRad Laboratories /Richmond, CA/ a boli použité v konečnej koncentrácii 10 /ug/ml. Formalizovane častice Staphylococus aut reus kmeň Cov.nn I /SAC/ boli získané ako Pansorbin od Calbicchem-Behring Corporation /La Jolla, CA/. SAC bol použitý v konečnej koncentrácii 0,005½ /hinotn./ob j./.

Cytokiny x 6

Čistený rekombinantný IL-2 /3 x 10 j./ml/ bol získaný od Amgen Biologicals /Thousand Oaks, CA/ a'použitý v konečnej koncentrácii 20 j./ml, ktorá bola určená ako optimálna pre rast normálnych B-buniek ko-stimulovaných nesolubilizovanými antiIgM protilátkami. Purifikovaný rekombinovaný ľudský IL-4 /získaný z L.coli, 1x10 j./ml/ bol poskytnutý doktormi P.Trottom a T.L.Nagabhushanom /Schering-Plough Research, bloomfield, NJ/. 7 experimentoch bol použitý IL-4 v konečnej koncentrácii 500 “./ml, pretože táto koncentrácia poskytuje maximálnu stimuláciu B-bnnkového rastu, ako bolo odhadnuté na normálnych B-bunkách aktivovaných insolubilizovanými anti-IgM protilátkami.

-11Kultúry

Deväť čistených leukemických NHML E-biniek bolo kultivovaných v Iscovelovom médiu /Flow Laboratories, Irvine, CA/ obohatenom >0 /Ug/ml ľudského transferínu /Sigma Chemical Co., St. Louis, MO/, O, 776 hovädzieho sérového albumínu /Sigma/, 7 /Ug/ml hovädzieho inzulínu /Sigma/, 5 % selektovaného teplom inaktivovaného fetálneiio teľacieho séra, 100j./ml penicilínu, 100 “ ť) /ug/ml streptomycínu /všetky od Flow Laboratories/ a 10 M ' * 5 yQ-raerkaptoethanolu /Sigma/. Pre poliferačnú štúdiu bolo 1 x 10 Leukemických B-buniek umiestnených do 100 ^ul kultivačného média v mikrojamkách s guľatým dnom a inkubované v ô % 00 zvlhčovanej atmosfére pri 37°C počas piatich dní za prítomnosti colyk Lonáln.veh B-bunkových aktivátorov PSA-SAC, a Lebo insolubilizovaných anti-IgM protilátok alebo faktorov IL-4 /700 j./ml/ Kilebo XL-2 /20 j./ml/, ktoré sa pridávajú na počiatku kultivácie. DNA syntézy boli stanovené pulzovaním buniek s /3H/thymidínom /tu ”/3K/TdR/ po konečných 16 h kultivačnej periódy, vonka heterogenite odpovedí vzoriek leukemických B-buniek bola DNA syntéza hodnotená v štyroch odlišných časových intervaloch /v dňoch .3,4,7 a 6/ od začiatku kultivácie. Výsledky uvedené v tabuľke 1 zodpovedajú časovému bodu, ktorý poskytol maximálne známky stimulácie. Počet za minútu /3H/TdR inkorporácie /apm x 1C / je vyjadrený ako priemer trojnásobného stanovenia. Štandardná odchýlka nikdy nepresiahla 10 h priemeru. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.

IL-4 bol skúmaný pre svoju kapacitu antagonizovaf proliferatívnu odozvu NHML B-buniek na IL-2. Každá z 9 vzoriek NHML B-buniek bol preto spoločne kultivovaná s IL-2 /20 j./ml/ a IL-4 /700 j./ml/ za prítomnosti anti-IgM činidla predtým definovaného ako optimálne na aktiváciu. Pretože sa leukemické vzorky tiež jedna od druhéj..líšia v svojich časových kinetikách odpovedí na rast-promotujúci účinok IL-2, bola DNA syntéza meraná 4, 7, 6 a 7 dní od začiatku kultivácie. Údaje v ta-.12buľke 1 predstavujú, pre každý kloň, hladiny /3H/TdR inkorporácie získané v dobe, zodpovedajúcej piku proliferatívnej odozvy na IL-2. Jeden kloň /MAI/ neodráža výraznú odozvu rastu na IL-2 alebo IL-4 v obidvoch aktivačných systémoch a preto nieje zahrnutý do tabuľky 1.

V 7z8 prípadov, IL-4 je neúspešný k synergizácii s anti-Ig činidlami pre podnoru DNA syntézy z NHML b-buniek. Naproti tomu jeden kloň /BFE/ vykazuje opačný priebeh odozvy a proliferácie za kultivácie s IL-4 a anti-IgM protilátkami. S výnimkou klonu. BF:L, všetky NHML B-bunkové vzorky odrážajú rastovú odozvu na IL-2. Pre všetky IL-2 zodpovedajúce klony bolo zistené, že IL-4 výrazne inhibuje IL-2 riadenú proliferéciu buniek. Titrácia účinku inhibície rastu IL-4 na IL-2 indukovanou odozvou 1 x 10^? buniek leukemického klonu CAN ko-stimulovaného s 0,005 % SAO a 10 j./ml IL-2 za neprítomnosti alebo za prítomnosti sériových riedení IL-4. Inkorporácia /3H/TdR bola sta novená 4. deň. Obr. 1 ke krivka dávkovej odozvy, ktorá je reprezentatívna pre tri pokusy a graficky ukazuje, že kompletná inhibícia odozvy na IL-2 je vždy dosiahnutá pri koncentráciách IL-4 tak nízkych ako 16 j./ml.

, * *

Obr. z je krivka dávkovej odozvy, ktorá graficky zhrňuje štyri pokusy a ukazuje vplyv IL-4 na inhibíciu rastu na antiIgM-indukovanú proliferáciu klonu PRO. Tieto leukemické B-bunky /1 x 10⁹ PRO/ boli stimulované s nesolubilizovanými antiIgM protilátkami /10 ^ug/'ml/ za neprítomnosti alebo za prítomnosti sériových riedení IL-4. /3H/TdR bol pridaný behom posledných 16 hodín 4.deň kultivačnej periódy /3H/TdR inkorporácie v nestimulovaných kultúrach bola 346 + z8 opm. Naviac IL-4 tiež inhibuje rast troch iných NHML B-bunkových vzoriek /Bou, LMI, PRO/ ktoré vždy vykazujú významnú proliferatívnu odpoveó za ligácie troch povrchových Igs SAC alebo anti-IgM protilátkami /tabuľka 1, obr.2/. Z predloženej štúdie bolo dokázané, že z väčšiny, NHML B-bunky aktivované cez ich povrchové Ig

-13receptory môžu byť stimulované pre DNA syntézu IL-2. V niektorých vzorkách tumorov /3 z 9/, by mohla byť proliferatívna odoz va tiež indukovaná spodnou ligáciou povrchových Ig za neprítomnosti faktorov exogénneho rastu. IL-4 významne potlačuje nielen rastovú odozvu týchto buniek na IL-2 ale tiež na anti-Ig činidlo samotné.

Tabuľka 1

Anti-proliferatívne účinky IL-4 na IL-2 indukovaný rast čerstvo izolovaných na Hodgkinských maligných lymfových /NHML/ b-buniek¹

PĎA=	SAG2	PBA=	anti-IgM
NHML B bunky3:	BOU	THE	PP	DEL	c-an	EMZ	PRO	BR E
médium	0,5	0,13	0,2	1,2	0,6	0,2	0,3	0,2
4 ľ ,	21,4	2,3	6, d	0,6	0,6	18,2	64,8	2,4
PBA+IL-43	11,9	2,0	3,0	1,6	4,0	7,8	30,1	9,1
FBa+IL-^6	33, 5	7,9	47,2	8,4	22,2	56,8	72,3	4,5
PBA+IL-2+ IL-4	12,8	3,9	9,3	3,7	9,5	13,6	27,8	11,2 ,

Claims (15)

1. /3H/TČR inkorporácia /epm x 10 / meraná po piatich dňoch a vyjadrená ako priemer troch stanovení. d. SAC= Staphylococus Aureus kmeň Cowyn 1

3. 1 x 10^ NHML buniek inkubovaných pri 37°C počas 5 dní

4. PBA= pplyklonálny B bunkový aktivátor

5. >00 j./ml IL-4

6. 200 j./ml IL-2 ρμ ΡΉ - ?3

PATENTOVÉ NÁHOKY

1. J Farmaceutický prípravok na liečenie B-bunkovej malignity aavcov postihnutých B-bunkovou malignitou, vyznačujúci sa tym, že obsahuje účinné množstvo IL-4 ako účinnej zložky.

2. / Prípravok podlá nároku 1 na inhibíciu rastu B-bunkovej malignity aavcov postihnutých B-bunkovou malignitou.

3. / prípravok pódia nároku 1 na inhibíciu bujnenia maligných B-buniek aavcov postihnutých malignými B-bunkami.

4. J Prípravok pódia nárokuí 1,2 alebo 3 v upravenej forme na.- intravenózne alebo intraperitonálne podávanie.

5. y Prípravok podlá nároku 1,2 alebo 3 v upravenej forme na subkutánne podávanie.

6. J Prípravok pódia nároku 1,2 alebo 3, kde uvedennou účinnou zložkou je iudský IL-4.

7. J Prípravok pódia nároku 1,2 alebo 3, kde uvedennou účinnou zložkou je rekombinantný iudský IL-4 odvodený od Ľ.coli.

8. y Prípravok podie nároku 1,2 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že uvedenné účinné množstvo IL-4 je v rozmedzí od aai 0,25 do asi 15 mikrogramov telesnej hmotnosti na deň.

9. \J Spôsob liečenia B-bunkovej malignity savcov postihnutých touto malignitou, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie účinného množstva IL-4 na takúto liečbu.

10. J Spôsob pódia nároku 9,vyznačujúci sa tým , že liečba zahrňuje inhibíciu rastu B-bunkovej malignity savcov postihnutých B-bunkovou malignitou podávaním takého množstva IL-4 ,ktorý je účinný pre túto inhibíciu.

11. j Spôsob podlá nároku 9,vyznačujúci sa t ý m , že liečba zahrňuje inhibíciu bujnenia maligných B-buniek savcov postihnutých malignými B-bunkami podávaním týmto savcom množstvo IL-4, ktoré je účinné pre túto inhibíciu*

12. j Spôsob podía ktorehokoívek z nárokov 9,10 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že IL-4 je podávaný intrav venózne.

13· j Spôsob podía ktoréhokolvek z nárokov 9, 10, alebo 11, vyznačujúci satým, že je podávaný ludský IL-4.

14.J Spôsob podía ktoréhokolvek z nárokov 9,10 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že je podávaný rekombinantný íudský IL-4 , odvodený od E.coli.

154 Spôsob pódia ktoréhokolvek z n árokov 9,10 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že IL-4 je podávaný aubkutánne.

i

16. J Spôsob podía ktoréhokolvek z nárokov 9,10 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že množstvo podávaného IL-4 je v rozmedzí od asi 0,25 do asi 15 mikrogramov na kilogram telesnej hmotnosti na deň.

•

17. Použitie IL-4 na výrobu liečiva na liečbu B-bunkovej malignity savcov touto malignitou postihnutých.

18. Použitie IL-4 na výrobu liečiva na inhibíciu rastu B-bunkovej malignitidy savcov postihnutých B-bunkovou malignitou.

19. Použitie IL-4 na výrobu liečiva na inhibíciu bujnenia maligných buniefc savcov postihnutých malignými tí-bunkami.

20. Použitie podlá nárokov 17, 18 alebo 19 ,v ktorom ,je ·; uvedené liečivo upravené vo forme na intravenózne alebo intraperitonálne podávanie.

21. Použitie podlá nárokov 17,18, alebo 19, kde uvedené lie čivo je yo forme upravenej na subkutánne podávanie.

22. Použitie podlá nárokov 17,18 alebo 19, kde IL-4 je ludský IL-4.

23. Použitie podlá nárokov 17, 18 alebo 19 , kde IL-4 je rekombinantný ludský IL-4 odvodený od E.coli.

24. Použitie podlá nárokov 17, 18, alebo 19, kde uvedené liečivo obsahuje množstvo IL-4 v rozmedzí od asi 0,25 do asi

15 mikrogramov na kilogram telesnej hmotnosti na denné podávanie.