JPH06504767A - Ｂ−細胞悪性疾患の治療のための薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ−細胞悪性疾患の治療のための薬剤組成物発明の背景 本発明は、Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむ哺乳動物におけるＢ−細胞悪性疾患の治療 のための、活性成分としてのＩＬ−４より成る薬剤組成物に関する。本発明はさ らに、哺乳動物におけるＢ−細胞悪性疾患を治療するための薬剤を製造するため のＩＬ−４の使用法に関する。

序論 インターロイキン−４［本明細書中では今後“ＩＬ−４”と呼ぶが、またＢ細胞 刺激因子１．　（ＢＳＦ−１）としても知られているコは最初は、エム・ホワー ド（Ｍ、Ｈｏｗａｒｄ）らによってＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、（１９８２）、第１５ ５巻、第９１４−２３ページにＩＬ−２とは全（別なＴ細胞由来の成長因子とし て記載され、このものは正常マウスＢリンパ球の長期組織培養を可能にし、しか も活性化Ｂリンパ球と相互作用して、４力月もの間その増殖を保持した。混合Ｂ リンパ球外植片が培養を開始するために使用されたけれども、未成熟の表現型を もつＢリンパ球が特に、組織培養においてＩＬ−４によって増大されるように思 われる。例えば、シー・ペシュル（Ｃ，Ｐｅ５ｃｈｅｌ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。

±、（１９８９）、第１４２巻、１５５８−１５６８を参照されたい。さらに、 ジー・トレン（Ｇ、Ｔｒｅｎｎ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．　（１９８８）、 第１４０巻、１１０１−１１０６には、ＩＬ−４が休止ネズミＴリンパ球のＬｙ 　ｔ　−２＋副集団からの細胞毒性Ｔ−細胞の発生を刺激することが記載されて いる。

マウス■Ｌ−４遺伝子はクローン化されて、Ｃ０８−７細胞で発現される［ティ ー・オーツカ（Ｔ、０ｔｓｕｋａ）ら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８ ７）、第１５巻、３３３−３３４参照］。クローン化された因子は、Ｔ細胞培養 上澄みから精製された因子に対して見られる組織培養における活性をすべて有し ていた。ヒトＩＬ−４遺伝子のクローニングおよび発現は、エヌ・アライ（Ｎ。

Ａｒａｉ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８９，第１４２巻、２７４−２８２ およびティー・ヨコタ（Ｔ、Ｙｏｋｏｔａ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ Ｓ−７細胞中に産生された因子は、組織培養において研究された天然の分子に類 似した活性を有していた。ＩＬ−４は、ヒトおよびネズミの両方の細胞系におい て研究されたので、付加的な試験管内活性はその分子に起因するものとされた： （ｉ）ＩＬ−４は、Ｂリンパ疎開集団が増殖に誘導されるとき起こる過程である ＩｇＥ合成の誘発および調節に重要な役割を演じた［ペネ（Ｐｅｎｅ）、ジエイ （Ｊ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ　（１９８８）、第８５巻、 ６８８０−６８８４参照］；（ｎ）ＩＬ−４は、組織培養において正常なヒトＢ ＩＪンパ球上の低親和性ＦｃΣ受容体（ＣＤ２３）を誘発した［ティー・デフラ ンス（Ｔ、ＤｅＦｒａｎｃｅ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、（１９８７）、第１６ ５巻２１４５９−１４５７参照］；（ｆｆｌ）ＩＬ−４は、極めて正確に他のリ ンホカイン、とりわけインターフェロン−γ［アール・エル・コツマン（Ｒ，Ｌ 、Ｃｏｆ　ｆｍａｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｓ、（１９８８）、第１０２巻 、５−２７およ　。

びペネ（Ｐ　ｅ　ｎ　ｅ）ら、上記のもの、参照］およびＴ細胞［アール・エル ・コツマン（Ｒ，Ｌ、Ｃｏｆｆｍａｎ）ら、上記のもの、ペネ（Ｐ　ｅ　ｎ　ｅ ）ら、上記のもの、およびエム・ディー・ウィドマー（Ｍ、Ｄ、　Ｗｉ　ｄｍｅ 　ｒ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、（１９８７）、第３２６巻、７９５− ９８参照〕、と相互作用して、Ｂ細胞増殖および改変をひき起こした：そして（ ｆｖ）ＩＬ−４は、休止Ｂ細胞上でのＭＨＣクラス■抗原発現を増加させた［ア ール・ノニル（ＲｏＮｏｅｌｌｅ）ら、ＰＮＡＳ８１．６１４９−６１５３．１ ９８４］、ティー・アール・モスマン（Ｔ、Ｒ，Ｍｏｓｍａｎｎ）らはＪ、Ｉｍ ｍｕｎｏ、、第１３８巻、１８１３−１８１６に、アミノ酸配列１−９０および １２９−１４９で互旦％相同であるヒトおよびネズミＩＬ−４は種特異的である ことを記載した。

ヒトにおける研究は、ＩＬ−４がモノクローン性Ｂ細胞腫瘍に効果を有すること を示した。ニス・カレイ（Ｓ、Ｋａｒｒａｙ）らは、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

（１９８８）、第１６８巻、８５−９４に、ヒトＩＬ−４は試験管内でＢ型慢性 リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）のＩＬ−２−依存増殖を抑制することを記載する 。

ティー・デフランス（Ｔ、ＤｅＦｒａｎｃｅ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、（１９ ８８）、第１６８巻、１３２１は、ＩＬ−４が、ＩＬ−２に反応した活性化ヒト 細胞の試験管内増殖を阻害するが、分化は阻害しないことを記載している。ディ −−エフージエリネク（Ｄ、Ｆ、Ｊｅｌｉｎｅｋ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、。

（１９８８）、第１４１巻；１６４をも参照されたい。シー・エム・ヒグチ（Ｃ 。

Ｍ、Ｈｉｇｕｃｈｉ）らはＣａｎ、Ｒｅｓ、（１９８９）、第４９巻、６４８７ −６４９２に、ＩＬ−２によってあらかじめ活性化されたヒトの末梢血液リンパ 球において、ＩＬ−４はリンホカイン−活性化キラー活性（ＬＡＫ）を誘発する いては、ネズミＩＬ−４単独またはＩＬ−２と組み合わせたネズミＩＬ−４で処 理した体止牌細胞は、試験管内で新しい先天性腫瘍細胞に対するＬＡＫ活性を発 のまわりにネズミＩＬ−４を注射することによって抗腫瘍活性がひき起こされ得 ること、およびＩＬ−４をヒトＩＬ−１βからのノナペプチドと組み合わせて使 用するとき、非常に活性なリンホカイン−活性化腫瘍阻害（ＬＡＴＩ）が観察さ れることを記載している。ジエイ・ジェイ・ミュール（Ｊ、Ｊ、Ｍｕｌｅ）らは Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、、（１９８９）、第１４２巻；　７２６−７３３に、ネズミ ＩＬ−４によってひき起こされた細胞の主表現型は、アシアロ（ａｓｉａｌｏ） −ＧＭ、、”ｒｈｙ”、　Ｌｙｔ”、Ｔ３＋の表面発現であることおよびＩＬ− ２プラスＩＬ−４の組み合わせによって発生するＬＡＫ細胞においては、顆粒関 連セリンエステラーゼの増加があること、を記載している。ディー・ジェイ・ピ ース（Ｄ。

Ｊ、Ｐｅａｃｅ）らは、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、（１９８８）、第１４０巻、３６７ ９−３６８５において、ＩＬ−４にひき起こされるＬＡＫ活性は、２つの異なる 細胞型と関連しており、その１つはＮＫ一様（ＮＫ１．１”、ｔ、ｙｔ”ａであ り、そして他方はＴ細胞様（ＮＫ１．１−、ｔ、ｙｔ”っであることを記載して いる。

アール・アイ・チッパ−（Ｒ，１，Ｔｅｐｐｅｒ）らはＣｅ　Ｉ　ｌ　（１９８ ９）。

第５７巻；５０３−５１２にネズミＩＬ−４でトランスフェクトされたネズミ腫 瘍細胞系統は生体内で成長が阻害されるが、トランスフェクトされない腫瘍細胞 と混合したＩＬ−４１−ランスフェクトされた腫瘍細胞は、２つの腫瘍細胞型が 同時に存在するときには生体内でのトランスフェクトされない腫瘍の成長を阻害 する結果となったことを記載している。アール・アイ・チッパ−（Ｒ，１，Ｔｅ ｐｐｅｒ）らは、また、トランスフェクトされない腫瘍がＩＬ−４でトランスフ ェクトされた腫瘍から遠位にあったときは阻害は観察されなかったことも記載し ている。アール・アイ・チッパ−（Ｒ，１，Ｔｅｐｐｅｒ）はさらに、サイトカ イン、例えばＩＬ−２またはＩＬ−４の腫瘍をもつ動物への非経口的投与は、因 子の短い半減期（ＩＬ−２の場合であるカつおよび有効な用量水準を達成するの に十分な量のサイトカインを得ることの必要性によって“難しい０ことを記載し ている。ジー・ドラジ（Ｇ、Ｄ’　０ｒａｚｉ）らはブロシーデインダス・オブ ・ジ・アメリカン・アソシエイション・フォー・カンサー・リサーチ（ｐｒ□ｃ ｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　 ｆｏｒＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、（１９９０年３月）、第３１巻、第 ２５２ページ　アブストラクトＮ’１９４０に、ＩＬ−４が、ヌードマウスモデ ルにおいて抗腫瘍反応をひき起こしたことを記載している。

哺乳動物にＩＬ−４を全身投与することによって充実性腫瘍に苦しむ哺乳動物の 充実性腫瘍を治療する方法が、１９９０年３月２１日に出願された普通に譲渡さ れた米国特許出願番号０７／４９６．８３２に記載されている。

発明の要約 驚くべきことに我々は、Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむヒトのような哺乳動物に有効 量のＩＬ−４を投与することによって、広い範囲のＢ−細胞悪性疾患を治療する ことができ、そしてその成長を阻害することができることを発見した。

従って、本発明は、Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむ哺乳動物においてそのＢ−細胞悪 性疾患を治療するための薬剤組成物を提供するが、ここでこの組成物は活性成分 としてのＩＬ−４より成る。

本発明はまた、Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむ哺乳動物においてそのＢ−細胞悪性疾 患の成長を阻害するための薬剤組成物をも提供するが、ここでこの組成物は活性 成分としてのＩＬ−４より成る。

本発明はさらに、悪性のＢ−細胞に苦しむ哺乳動物において悪性Ｂ−細胞の増殖 を阻害するための薬剤組成物を提供するが、ここでこの組成物は活性成分として のＩＬ−４より成る。

さらに、本発明は、治療に有効な量のＩＬ−４を哺乳動物に投与することより成 る、Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむ哺乳動物におけるＢ−細胞悪性疾患を治療する方 法を提供する。

本発明はまた、下記哺乳動物に阻害に有効な量のＴＬ−４を投与することより成 る、Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむ哺乳動物においてＢ−細胞悪性疾患の成長を阻害 する方法をも提供する。

本発明はさらにその上、下記哺乳動物に阻害に有効な量のＩＬ−４を投与するこ とより成る、悪性Ｂ−細胞に苦しむ哺乳動物における悪性Ｂ−細胞の増殖を阻害 する方法を提供する。

そして本発明はまた、悪性疾患に苦しむ哺乳動物におけるＢ−細胞悪性疾患を治 療するための薬剤の製造のためのＩｔ−４の使用法をもその目的とする。

図面の簡単な説明 図１は、ＩＬ−２で誘発されたリンパ節からの悪性Ｂ−細胞の増殖に対する、本 発明に従うＩＬ−４の試験管内での成長−阻害効果の用量−反応曲線を示す。

図２は、抗−ＩｇＭで誘発されたリンパ節からの悪性Ｂ−細胞の増殖に対する、 本発明に従うＩＬ−４の成長−阻害効果の用量−反応曲線を示す。

細胞”という言葉は、広い範囲の、低、中間または成熟グレードの悪性のＢ−細 胞腫瘍およびＢ−細胞新生物を指し、慢性リンパ性白血病（本明細書中では今後 “ＣＬＬ”とよぶ）Ｂ−細胞のような白血病Ｂ−細胞、非ホジキン悪性リンパ腫 （本明細書中では今後“ＮＨＭＬ”とよぶ）Ｂ−細胞、中心芽球性−中心細胞性 リンパ腫、小胞性小分割細胞（“ＦＳＣ”）Ｂ−細胞リンパ腫、散在小分割細胞 （“ＤＳＣ”）Ｂ−細胞リンパ腫、小非分割細胞（“ＳＮＣ”）Ｂ−細胞リンパ 腫、免疫芽球性大細胞（“ＩＢＳ”）Ｂ−細胞リンパ腫、小細胞リンパ球（“Ｓ ＣＬ”）Ｂ−細胞リンパ腫および散在大細胞（“ＤＬＣ”）Ｂ−細胞リンパ腫な らびにアール・ニー・ミラー（Ｒ，Ａ、　Ｍｉ　Ｉ　Ｉ　ｅ　ｒ）ら、ＮＥＪＭ 　（１９８９）、第３２１巻、８５１−８５６によって開示されたＢ−細胞リン パ腫を含むＢ−細胞リンパ腫を包含するが、これらに限定されない。

試験管内で行なわれた前臨床研究において、我々は、この発明に従って投与され たＩＬ−４が、慢性リンパ性白血病（“ＣＬＬ”）をもつ患者１６人のうち１５ 人、そして低グレードリンパ腫をもつ患者１０人のうち７人、においてインター ロイキン−２（”ＩＬ−２”）にひきおこされる悪性Ｂ−細胞の増殖を阻害した ことを発見した。ある臨床研究では、５マイクログラム／ｋｇ／日のＩ　Ｌ−４ をポーラス皮下注射によって、ＣＬＬをもつ患者１人および低グレードリンパ腫 をもつ患者１人を含む１０人の患者に投与した。低グレードのリンパ腫患者にお いては迅速なリンパ節および膵臓の収縮があり、そしてＣＬＬ患者においては■ Ｌ−４の１回の５マイクログラム／ｋｇ皮下注射から６時間で循環性悪性Ｂ−細 胞において３倍以上の低下があった。

試験管内研究で、我々はＩＬ−４が新しく単離した非ホジキン悪性リンパ腫（本 明細書中では今後“ＮＨＭＬ”とよぶ）Ｂ−細胞の試験管内増殖反応を阻害する ことを証明した。この試験管内抗増殖評価のために、白血病性ＮＨＭＬ　Ｂ細胞 を不溶化抗−１ｇＭ抗体または黄色ブドウ球菌コーワン株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ ｏｃｃｕｓ　Ａｕｙｅｕｓ　５ｔｒａｉｎ　Ｃｏｗａｎ）１（本明細書中では今 後“ＳＡＣ”とよぶ）で活性化した。９つの白血病性ＮＨＭＬ　Ｂ細胞のうちの ８つについて、ＩＬ−２は、それらの表面１ｇＳによって活性化されたこれらの ＮＨＭＬ　Ｂ−細胞におけるＤＮＡ合成を有意にそして再現可能に刺激する単独 のサイトカイン／Ｂ細胞刺激因子であった。ＩＬ−４は、抗−１ｇ試薬単独また はＩＬ−２および抗−Ｉｇ試薬の組み合わせ物によってＮＨＭＬ　Ｂ細胞に送ら れる増殖信号を強く抑制した。これらの試験管内データは、ＩＬ−４が事実上、 ＮＨＭＬ　Ｂ−細胞に成長阻害信号を与え、そこではこのＢ−細胞はそれらの表 面１ｇ受容体によって活性化されることを示唆している。これらの試験管内結果 にもとづいて、ＩＬ−４が成熟Ｂ−細胞悪性疾患の臨床治療に有用であるであろ うということが期待される。

本明細書中で使用される“Ｂ−細胞悪性疾患を治療する”という句は、本発明に 従うＩＬ−４の投与から生ずる広範囲の抗−Ｂ細胞反応を意味し、これには次の ものが包含される：　（１）Ｂ−細胞悪性疾患の退縮を起こさせる；　（２）悪 性Ｂ−細胞の成長を阻害する：　（３）悪性Ｂ−細胞の増殖を阻害する；　（４ ）悪性Ｂ−細胞の成長を阻害するかまたは悪性Ｂ−細胞の退縮を起こさせるため の有効な免疫反応を誘発する；および（５）哺乳動物における悪性Ｂ−細胞の成 長の阻害または退縮を起こさせるための有効な免疫反応を増大させる。本発明に 従ってＩＬ−４を投与されていないい（つかの哺乳動物の免疫反応は、悪性Ｂ− 細胞の成長阻害または悪性Ｂ−細胞の退縮を起こさせるのに十分に強くなくまた は十分に速（ないかもしれないが、我々は、悪性Ｂ−細胞をもっている哺乳動物 にこのような目的の各々に対して有効な量のＩＬ−４、好ましくは組換え型ＩＬ −４、を投与することより成る有効な方法を発見した。

本発明においてはどのような適当なＩＬ−４でも使用することができる。ＩＬ− ４に対する相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）は最近多くの研究所、例えばヨコタ（Ｙ ｏｋｏｔａ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ、（１９ ８６）、第８３巻；５８９４−５８９８　（ヒト）：リー（Ｌｅｅ）　ら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８６）、第８３巻；２０６ １−２０６５（マウス）：ノ７　（Ｎｏｍａ）ら、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ） （１９８６）。

第３１９巻；６４０−６４６　（マウス）；およびゲンザイム・コーポレーショ ン（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ボストン、マサチューセッツ 州（ヒトおよびマウス）、によってクローン化され、配列決定された。その上、 非組換え型ＩＬ−４は、種々の培養、上澄みから精製された、例えば、グラブシ ャタイン（Ｇｒａｂｓ　ｔｅ　ｉｎ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、（１９８５）、 第１６３巻：１４０５−１４１３　（マウス）；およびオハラ（Ｏｈａｒａ）ら 、上２±ｍｍｕｎｏ１．（１９８５）、第１３５巻；２５１８−２５２３　（？ ウスＢＳＦ−１）。すべての上記の記事の記載は、そのＤＮＡおよびアミノ酸配 列、および本発明に使用するために適するＩＬ−４物質を得るための方法の教示 について本明細書中で参照されている。

好ましくは、本発明で使用するＩＬ−４は、ヒトＩＬ−４であり、そして最も好 ましくはそれは、大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ　Ｉ　ｉ）で発現され、これから単離され る（１９８７年７月２９日提出の米国特許出願Ｎ’　０７９，６６６および１９ ８８年７月１２日提出の米国特許出願Ｎ”　１９４，７９９）、ヨコタ（Ｙｏｋ ｏｔａ）５８９４−５８９８および１９８７年５月２１日発行のＰＣＴ特許出願 Ｎ″″８７１０２９９０に記載された配列をもつヒト変種である。ＣＨＯ細胞か らのＩＬ−４の産生は、１９８９年７月２３日に提出された普通に所有された米 国特許出願番号３８６．９３７に記載されている。大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ　ｌ　ｉ ）からのＩＬ−４の産生け、１９８９年１０月３１日提出の普通に所有された米 国特許出願番号４２９．５８８に記載されている。上記記事、ＰＣＴ出願および 米国特許出願の記載は、参照により本明細書中に包含される。

本発明に従えば、哺乳動物に、悪性Ｂ−細胞の成長を阻害し、悪性Ｂ−細胞の退 縮を起こし、有効な免疫反応を誘発するのに有効な量のＩＬ−４を投与して、悪 性Ｂ−細胞の成長を阻害するかまたは悪性Ｂ−細胞の退縮を起こさせるかまたは 、充実性腫瘍の成長阻害または充実性腫瘍退縮を起こすのに有効な免疫反応を増 大させる。１日に体重１キログラムあたり約０．２５ないし１５マイクログラ好 ましくは、哺乳動物に、１日に体重１キログラムあたり約５ないし約１５マイク ログラムの組換え型ｈ　Ｉ　Ｌ−４を投与し、そして最も好ましくは哺乳動物に 単一または分割用量で１日に体重１キログラムあたり約５ないし約１０マイクロ グラムの組み換え型ｈ　Ｉ　Ｌ−４を投与する。

投与の量、頻度および期間は、好中球および単球計算値の水準（例えば単球減少 症または顆粒球減少症の重さ）、患者の年令、栄養、などのような因子によって 変化するであろう。通常はＩＬ−４の投与ははじめは毎日であり、そして患者の 一生の間周期的に続くであろう。投与の量および頻度は、好中球計算値およびま たは抗体水準の増加に関するＩＬ−４の効果の大きさの最初のスクリーニング中 に決定することができる。

用量の投与は、静脈内、非経口的、皮下、筋肉内、またはいずれかの他の受容で きる全身系の方法であることができる。ＩＬ−４は、通常行なわれている投与形 のどれで投与することもできる。非経口製剤には、無菌の溶液または懸濁液が包 含される。体重１キログラムあたり約１０ないし約１５マイクログラムより多い 投与量の組換え型ＩＬ−４は、好ましくは静脈内または皮下的に（例えば皮下ポ ーラスによって）ヒトに投与される。

上記の投与形によって意図される薬剤組成物の処方物は、通常の技術を使用して 、通常の薬学的に受容できる賦形剤および添加物を用いて製造することができる 。現在ではＩＬ−４は好ましくは、注射により、好ましくは皮下ポーラスまたは 腹腔内注射またはさらに静脈内注射によって全身的に投与される。投与されるべ き溶液は、再形成された凍結乾燥粉末であることができ、これらは付加的に防腐 剤、緩衝液、分散剤などを含有することができる。

好ましくは、ＩＬ−４は、１ミリリツトルあたり１００マイクログラムをこえな い最大濃度で、１０ミリモルのクエン酸塩緩衝液および防腐剤を含まない無菌水 を用いて再形成されて、皮下注射、腹腔内注射により、あるいは連続静脈内注入 によるかまたは静脈内注射によって全身的に投与される。連続注入用には、日用 量を５ｍｌの生理食塩水に加えることができ、そしてこの溶液を機械的ポンプま たは重力によって注入することができる。

Ｂ−細胞悪性疾患へのＩＬ−４の効果は、下記の試験プロトコルによって、なか んず（リンパ節および肺臓の収縮、循環の悪性Ｂ−細胞の低下により、ならびに 腫瘍の体積（これはキャリパ−測定、Ｘ−線およびＭＲＩのような標準的な技術 を用いて測定することができる）の減少によりそしてこのような哺乳動物の増大 した寿命または生存によって決定することができる。

病理学試料は、ソットー教授（Ｐｒ、５ｏｔｔｏ）［アルバート・ミカロン病院 （Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａｌｂｅｒｔ　Ｍｉｃｈａｌｌｏｎ）、グルノープル。

フランス］、ジエイ・エフ・ロッジ博士（Ｄｒ、Ｊ、Ｆ、Ｒｏｓｓｉ）［ヴアル ・ドーレル病院（Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｖａｌ　ｄ’　Ａｕｒｅｏｌｅ）、モンペ リエ。

フランス］およびジエイ・ピー・マゴード博士（Ｊ、Ｐ、Ｍａｇａｕｄ）［ニド アート・ヘリオツド病院（Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｅｄｏｕａｒｄ　Ｈｅｒｒｉｏｔ ）、リヨン、フランス］によって提供された。手術前の最後の４ケ月間化学療法 を受けていない、キール（Ｋｉｅｌ）分類に従って低グレード非ホジキン、非バ ーキット悪性リンパ腫（ＮＨＭＬ）Ｂ−細胞の診断をうけた９人の患者をこの研 究のために選んだ。入手し得る試験片としては、５つのリンパ節（ＥＭＺ、ＧＡ Ｎ。

ＰＰ、ＭＡＩ、ＰＲＯ）および４つの肺臓（ＢＯＵ、ＢＥＬ、ＢＲＥ、ＴＨＥ） が包含された。スチールメツシュ上での器官の切裂法およびフィコール（Ｆ　ｉ 　ｃｏｌｌ）／ハイバック（Ｈｙｐａｑｎｅ）勾配上での細胞懸濁液の遠心分離 の後、単核細胞を得た。Ｂ−細胞の精製のためには、単核細胞に最初に羊の赤血 球細胞を用いてＥロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）を行なった。非−ロゼ ッティング細胞（Ｅ−分画）を次に抗−丁細胞（抗−ＣＤ３．抗−ＣＤ２）およ び抗−単球（抗−ＣＤ１４）単クローン性抗体のカクテルとともに培養した。残 りの非−Ｂ細胞を次に、抗−マウスＩｇＧで被覆した磁気ビーズ［ダイナビーズ （Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）、オスロ、ノールウェー］を 用いて培養した後、Ｅ−集団から除去した。

試薬 不溶化抗−ＩｇＭ抗体をバイオラッド・ラボラドリース（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（カリフォルニア州すッチモンド）から購入して、最終マ リン化粒子を、カルビオケムーベーリング社（Ｃａ　Ｉ　ｂｉ　ｏｃｈｅｍ−Ｂ ｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）［カリフォルニア州、ラジョラ（Ｌａ 　Ｊｏｌｌａ）］からパンソルビン（Ｂａｎｓｏｒｂｉｎ）として購入した。Ｓ ＡＣを０．００５％最終濃度（Ｗ／Ｖ）で使用した。

サイトカイン 精製した組換え型ＩＬ−２（３Ｘ１０’Ｕ／ｍｌ）を、アムゲン・バイオロジカ ルス（Ａｍｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）［カリフォルニア州すウザンドオ ーク７．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ）３から購入して、最終濃度２０Ｕ／ｍ Ｌで使用したが、この濃度は、不溶化抗−ＩｇＭ抗体で同時刺激された正常Ｂ細 胞の成長に対して最適であることが決定されたものであった。精製された組換え 型ヒトＩＬ−４［大腸菌（Ｅ、Ｃｏ　Ｉ　ｉ）から誘導された。　１　ｘ　１０ ’Ｕ／ｍｇｌは、ティー・トロツタ（Ｔ、　Ｔｒｏ　ｔ　ｔ　ａ）およびティー ・エル・ナガブシャン（Ｔ、Ｌ、Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ）両博士［ニューシャ ーシー州、ブルームフィールド、ンエリングーブラウ・リサーチ（Ｓｃｈｅｒｉ ｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ）］によって提供された。この実験にお いては、ＩＬ−４を最終濃度５００Ｕ／ｍｌで使用したが、この濃度は、不溶化 抗−ＩｇＭ抗体で活性化された正常Ｂ細胞に関して評価するときＢ細胞の成長の 最大刺激を与える。

培養 ９つの精製された白血病ＮＨＭＬ　Ｂ細胞を、５０μｇ／ｍＬのヒトトランスフ ェリン、　［ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）１０．５％ウシ血清アルブミン［ジグ？　（Ｓ　ｔ 　ｇｍａ）］、５μｇ／ｍＬのウシインシュリン［シグマ（Ｓｉｇｍａ）３．５ ％の選択された熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μ ｇ／ｍｌのストレプトマイシン［すべてフロー・ラボラドリース（Ｆｌｏｗ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのもの］および１０−’Ｍのβメルカプトエタノ ール［シグマ（Ｓｉ　ｇｍａ）］に富むイスコープの培地（Ｉｓｃｏｖｅ’　ｓ ｍｅｄｉｕｍ）中で培養した。増殖評価のために１×１０６の白血病Ｂ−細胞を 丸底マイクロウェル内の１００μＬの培地中で平板培養し、培養のはじめに加え られたポリクローナルＢ細胞活性化剤ＰＢＡ−８ＡＣ，または不溶化抗−１ｇＭ 抗体および／または因子ＩＬ−４（５００Ｕ／ｍＬ）および／またはＩＬ−２（ ２０Ｕ／ｍＬ）の存在において５％Ｃｏｔ給湿雰囲気中、３７℃で５日間保温し た。ＤＮＡ合成を、培養期間の最後の１６時間の間（３Ｈ）チミジン（本明細書 中で以後“（３Ｈ）ＴｄＲ”とよぶ）で細胞をパルスすることによって決定した 。白血病Ｂ細胞試料の反応の不均一性のために、ＤＮＡ合成は、培養の開始後に ４つの異なる時間間隔（３，４，５および６日）で評価した。表Ｉに示した結果 は、最大刺激示数を提供した時点に相当する。（３Ｈ）ＴｄＲ組み込みの１分あ たりの係数（ｃｐｍｘｌｏ−３）を三重反復測定の平均として表わしている。標 準偏差はこの平均値の１０％をこえることはなかった。結果を表■に挙げる。

ＩＬ−４を、そのＩＬ−２に対するＮＨＭＬ　Ｂ−細胞の増殖反応に拮抗する能 力について分析した。ＮＨＭＬ　Ｂ−細胞の９試験片の各々は、そのため、活性 化のために最適であるように先に定義した抗−１ｇ試薬の存在においてＩＬ−２ （２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）と同時培養された。白血病 の試料もまたＩＬ−２の成長促進効果に対する応答の時間速度論がお互いに異な るので、ＤＮＡ合成は培養の開始後４．　５．　６および７日で測定された。表 Ｉに示されたデータは、各クローンについて、ＩＬ−２に対する増殖反応のピー クに相当する時点で得られた（３Ｈ）ＴｄＲ取り込みの水準を表わす。１つのク ローン（ＭＡＩ＞は、両活性化系においてＩＬ−２またはＩＬ−４に対して有意 な成長反応を示さなかったため表１には含まれない。

８つのうちの７つにおいて、ＩＬ−４は、ＮＨＭＬ　Ｂ−細胞からのＤＮＡ合成 を支持する抗−１ｇ試薬と相乗作用しなかった。しかしながら、１つのクローン （ＢＲＥ）は、反対の反応型を示し、ＩＬ−４および抗−ＩｇＭｇ体とともに培 養すると増殖した。クローンＢＲＥを除いては、すべてのＮＨＭＬ　Ｂ−細胞試 料がＨ，−２に対する成長反応を示した。すべてのＩＬ−２反応性クローンに対 して、ＩＬ−４は、ＩＬ−２によってひき起こされた細胞の増殖を有意に阻害す ることがわかった。ＩＬ−２に関するＩＬ−４の成長−阻害効果の滴定は、系列 的に希釈したＩＬ−４の不在または存在下において０．００５％のＳＡＣおよび ＩＯＵ／ｍＬのＩＬ−２で同時刺激された白血病クローンＧＡＮの１×１０１Ｉ の細胞の反応をもたらした。（３Ｈ）ＴｄＲの取り込みは４日目に評価された。

図１は、３つの実験の代表例である用量−反応曲線であり、ＩＬ−２に対する完 全な阻害は１６Ｕ／ｍＬのような低いＩＬ−４の濃度ですでに達成されることを グラフによって示している。

図２は、４つの実験をグラフによって要約している用量反応曲線であって、抗− ＩｇＭに誘発されたクローンＰＲＯの増殖に関するＩＬ−４の成長阻害効果を示 している。これらの白血病Ｂ−細胞（Ｉ　Ｘ　ｔ　ｏ’のＰＲＯ）は、系列的に 希釈したＩＬ−４の不在または存在下において不溶化抗−１ｇＭ抗体（１０μｇ 　／　ｍＬ）で刺激された。（３Ｈ）ＴｄＲは、４日の培養期間の最後の１６時 間中に加えられた。未刺激培養における（３Ｈ）ＴｄＲの取り込みは３４６±２ ８ｃｐｍであった。その上、ＩＬ−４はまた、すでにＳＡＣまたは抗−ＩｇＭ抗 体とそれらの表面１ｇとの結合を行なって有意の増殖反応を示した３つの他のＮ ＨＭＬＢ−細胞試験片（ＢＯＵ、ＥＭＺ、ＰＲＯ）の成長をも阻害した（表■１ 図２）。

本研究において、我々は、それらの表面Ｉｇｇ容体によって活性化されたＮＨＭ ＬＢ−細胞の大部分は、ＩＬ−２によってＤＮＡ合成を刺激されることを示す。

いくつかの腫瘍試験片（９のうちの３）においては、増殖反応はまた、外部成長 因子がなくても表面Ｉｇの結合のみによっても誘発されることができた。ＩＬ− ４は、ＩＬ−２に対するこれらの細胞の成長反応のみならず抗−１ｇ試試薬体に 対するこれらの細胞の成長反応をもかなり抑制した。

表■ ＩＬ−２によりひき起こされた新しく単離した非ホジキン悪性リンパ腫（“ＮＨ ＭＬ”）Ｂ細胞１の成長に対するＩＬ−４の抗−増殖効果１．５日後に測定され 、三重反復測定の平均として表現されている３　（Ｈ）　ＴｄＲ取り込み（ｃ　 ｐｍｘ　１０−３）　。

２．５ＡＣ＝黄色ブドウ球菌コーワン株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　Ａｕ ｒｅｕｓ　５ｔｒａｉｎ　Ｃｏｖａｎ）１゜ ３．３７℃で５日間培養されたｌＸｌ０’のＮＨＭＬ細胞。

４、ＰＢＡ＝多クローりＢ細胞活性化剤（ＰｏｌｙｃｌｏｎａＬ　Ｂ　Ｃｅ１ｌ ＾ｃｔｉｖａｔｏｒ）。

５．５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４゜ ６．２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２ 春ｄり 八ｄ。

国際調査報告 階１０／Ｉ蘭ｅ１ｍ−習Ｉ油−１２トＭ４１２−鵠廟フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰｌ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、　ＳＵ 、　ＵＳ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．活性成分としての有効量のＩＬ−４より成る、Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむ哺 乳動物におけるＢ−細胞悪性疾患を治療するための薬剤組成物。
2. ２．Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむ哺乳動物においてＢ−細胞悪性疾患の成長を阻害 するための、請求の範囲第１項に記載の組成物。
3. ３．悪性Ｂ−細胞に苦しむ哺乳動物において悪性Ｂ−細胞の増殖を組害するため の、請求の範囲第１項に記載の組成物。
4. ４．静脈内または腹腔内に投与されるように適合させた形の、請求の範囲第１， ２または３項に記載の組成物。
5. ５．皮下に投与されるように適合させた形の、請求の範囲第１，２または３項に 記載の組成物。
6. ６．活性成分がヒトＩＬ−４である、請求の範囲第１，２または３項に記載の組 成物。
7. ７．活性成分が、大腸菌由来の組換え型ヒトＩＬ−４である、請求の範囲第１， ２または３項に記載の組成物。
8. ８．ＩＬ−４の有効量が１日の投与について体重１キログラムあたり約０．２５ ないし約１５マイクログラムの範囲内である、請求の範囲第１，２または３項に 記載の組成物。
9. ９．治療のために有効な量のＩＬ−４を投与することより成る、Ｂ−細胞悪性疾 患に苦しむ哺乳動物におけるＢ−細胞悪性疾患を治療する方法。
10. １０．治療が、阻害に有効な量のＩＬ−４を哺乳動物に投与することによってＢ −細胞悪性疾患に苦しむ哺乳動物におけるＢ−細胞悪性疾患の成長を阻害するこ とより成る、請求の範囲第９項の方法。
11. １１．治療が阻害のために有効な量のＩＬ−４を哺乳動物に投与することによっ て悪性Ｂ−細胞に苦しむ哺乳動物における悪性Ｂ−細胞の増殖を阻害することよ り成る、請求の範囲第９項の方法。
12. １２．ＩＬ−４を静脈内に投与する、請求の範囲第９，１０または１１項のいず れか１項の方法。
13. １３．ヒトＩＬ−４を投与する、請求の範囲第９，１０または１１項のいずれか １項の方法。
14. １４．大腸菌由来の組換え型ヒトＩＬ−４を投与する、請求の範囲第９，１０ま たは１１項のいずれか１項の方法。
15. １５．ＩＬ−４を皮下に投与する、請求の範囲第９，１０または１１項のいずれ か１項の方法。
16. １６．投与するＩＬ−４の量が１日に体重１キログラムあたり約０．２５ないし 約１５マイクログラムの範囲内である、請求の範囲第９，１０または１１項のい ずれか１項の方法。
17. １７．Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむ哺乳動物においてＢ−細胞悪性疾患を治療する ための薬剤の製造におけるＩＬ−４の使用法。
18. １８．Ｂ−細胞悪性疾患に苦しむ哺乳動物におけるＢ−細胞悪性疾患の成長を阻 害するための薬剤の製造におけるＩＬ−４の使用法。
19. １９．悪性Ｂ−細胞に苦しむ哺乳動物にあける悪性Ｂ−細胞の増殖を阻害するた め薬剤の製造におけるＩＬ−４の使用法。
20. ２０．薬剤が、静脈内または腹腔内に投与されるように適合させた形である、請 求の範囲第１７，１８または１９項に記載の使用法。
21. ２１．薬剤が、皮下に投与されるように適合させた形である、請求の範囲第１７ ，１８または１９項に記載の使用法。
22. ２２．ＩＬ−４がヒトＩＬ−４である、請求の範囲第１７，１８または１９項に 記載の使用法。
23. ２３．ＩＬ−４が大腸菌由来の組換え型ヒトＩＬ−４である、請求の範囲第１７ ，１８または１９項に記載の使用法。
24. ２４．薬剤が、１日の投与に対して体重１キログラムあたり約０．２５ないし約 １５マイクログラムの範囲内の量のＩＬ−４より成る、請求の範囲第１７，１８ または１９項に記載の使用法。