CS340189A2 - Method of bivalent platinum derivatives production with polyanion of deoxyribonucleic acid - Google Patents

Description

-1- cJžeéločoný· Vynález se týká oblasti bioaňorganickéchemie a zejména se týká způsobu výroby nových látek,de-rivátů dvojmocné platiny s polyahiontem desoxýribohukleo-vé kyseliny,které vykazují antineoplastickou aktivitu av lékařství se používají při chemoterapii rakoviny vaječrniku,rakoviny plic a jater a rakoviny žlučníku'. V přítomnosti se zvyšuje úmrtnost obyvatelstva nazhoubné nádory rozdílné lokalizace;zejména všude mezi lidmi v mladém a středním věku.V závislosti na tomto se vě-nuje velká pozornost hledání a zkoušení léčiv s antiheo-plastickau účinností.

Jsou známy různé sloučeniny,které mají antineoplastickou aktivitu , a způsob jejich výroby, například slou-čeniny cis-dichlordiaminplatnaté,1,2-diaminooyklohexan/4-karboxyftalato/platnaté,1,1-diaminomethyleyklohexan/sul-fát o /platnaté , 1,2-diaminoeyklohexan/isocitrat/platnatéa jiné. /Handbuch .Synthese komplexer Verbindungen der Metalie der Platingruppe,1964,"Nauka", /Moskva// .Z uvede-ných sloučenin je zejména aktivní ois-dichlordiaminoplat- natá sloučenina./ Handbook of Cancer Combination Chemo-therapie,s. 85» Eleomycin,3?eplomycin,Cisplatin, HipponKayak 1986,s. 26 - 63/·

Způsob výroby uvedené látky spočívá v tom,že se ka-liumtetrachloroplatinid nechá zreagovat a oc taném amon-ným při zahřívání na teplotu varu s následující izolacíkonečného produktu. Všechny uvedené sloučeniny vykazují antineoplasti-ckou aktivitu,vyznačují se ale vysokou toxicitou a Vedlejšími účinky na organismus.Všechny uvedené preparáty potlačují kromě toho v tom či onom stupni imunologickou reak-tivitu organismu. V přihlášce vynálezu popisovaný způsob je nový a aždosud nebyl v literatuře popsán.

Vynález si klade za základní úlohu vyvinout způsobvýroby nových sloučenin,které vykazují vysokou antineo ·plastickuu aktivitu ve spojení s imunomodulující aktivi-tou a malou toxicitu. Úloha je vyřešena tím, že způsob výroby nových slou-čenin, derivátů dvojmocné platiny s polýaniontea desoky-ribonukleové kyseliny podle vynálezu spočívá v tom,žedesoxyribonukleová kyselina s molekulovou hmotností,kteránení nižší než 8.10 D se nechá zreagovat s cis-dichlor- 3- aminoplatnatou sloučeninou nebo s částečně hydrolytova-nou cis-dichlordiaminoplathatou sloučeninou ve vodnémprostředí nebo v pufračním roztoku s hodnou pH 7,0 až 7,5a iontovou silou 0,01 až 0,02 při teplotě,která se nepo-hybuje pod teplotou tání desoxyribonukleové kyseliny snásledující izolací konečného produktu. Získají se sloučeniny,které představují jemně krysta-lický prášek žluté barvy,bez zápachu,na vzduchu stálý,kte-ré se mohou skladovat beze změny vlastností po dobu je -dnoho roku.Teplota tání není pro ně charakteristická. Nárokovaná sloučenina poly^hexakis /“chloroamino-diakvaplatnato__7|j»-desoxyribonukleát následujícího vzor-cei

PtCl/NH3/J76/fí20/12^ n -LNS’m / sloučenina 1/, . ' -m kde DNS”e = 7 ¢39849032¾¾ /„ ’ n " 1900 i 90» m « 6n, ztrácí při zahřívání během 10 hodin při teplotě 180 až200 °C všechny molekuly vody.létka se dá špatně rozpouštětve vodě,methanolu, ethanolu a není hygroskopická.Její roz-pustnost ve vodě činí při 20 °C 0,002 %. Roztok 0,015 glátky v 1000 ml roztoku citrátové soli / 0,015 molů chlo- -4- ridu sodného + 0,0015 molů citrátu sodného/ při teplo-tě 20 °C vykazuje hodnotu pH 5»42 / pH stanoveno poten-ciometricky* UV spektrum 0,00184$ roztoku sloučeniny /1/ ve voděvykazuje v oblasti 230 až 300 nm absorpční maximum u268,8 + 0,2 nm / 1 g £ = 4,000, pocféno na 1 mol nukleo-tidu/· IR spektrum vykazuje absorpční pásy při 340 cm”1/Pt-Cl- skupina/, 1000-1300 cm“1 / P0^ skupina/, 1320 cm“1/PtRH^ skupina/, 1500 - 1700 cm”1 / C=C, C=N,C=O skupiny/,3100 - 3700 cm“1 / C-H,N-K,0-H skupiny/ a reflexní spek-trum pevné sloučeniny I vykazuje na extrémních bodech koefi-cientů spektrální reflexe 2^48 3 = 4,60 ; ^333 = 12,3 » ^400,6^^/ = 2^*4 » ^514,4^/ = θθ»^· «Rruměrnaviskožita molekulové hmoty nárokované sloučeniny I serovná 6,2.10θ L.

Sloučenina póly bis /"hydroxochloróaminoakvaplatnato7-tetrakis /~chloroaminoaktaplatnato__7j^^r- desoxyribonukleétpodle vynálezu;následujícího*vzorce : , [Z“PtCl/BH3/_76 /0H/2/H20/10l n

- DUS -m /sloučenina II/, kde DRS - / C39H5i°32K15P4 η při n = 2000 + 100 ,m = 4n,

ztrácí při zahřívání během 8 hodin při teplotě 180 až 200 C -5- všeehny molekuly vody. Rozpustnost sloučeniny II ve vo-dě při 20 °C činí 0,0075 Roztok obsahující 0,018 glátky v 1000 ml roztoku citrátové soli vykazuje při20 °C hodnotu pE 5,38. UV spektrum 0,002$ roztoku sloučeniny II ve voděvykazuje v oblasti 230 až 300 nm absorpční maximum při265,7 + 0,2 nm / lg £ = 4,000, počítáno na 1 mol nukleo-tidu/. IR spektrumvykazuje absorpční pásy u 340 cm"1/Pt-Cl-skupina /, 1000 - 1300 cm1 /P0^ skupina/, 1340 cm"/ptNH^ skupina, /, 1500 - 1700 cm1 /C=C,G=N,C=O skupiny/,3100 - 3700 cm"1 /0- K,H-H ,0-E skupiny/, 3295 cm”1/PtOE skupiny/.

Průměrná viskožita molekulové hmoty sloučeniny IIz β podle vynálezu se rovná 6,0 .10:D.

Sloučenina poly£hexakis /“chloroaminoakvaplatna-to__7 - ^g-desoxyribonukleát podle vynálezu následují-ho vzorce : ^~Ρ101/ΕΗ3/^6/Ε20/6^η - LES"m / sloučenina III/ kde DES"m « /¾¾0 32^15*4 n “ 2100 * 100 > m - 6 n se při zahřívání po dobu 12 hodin při teplotě 180 až200 °C ve své hmotě nemění.látka se dá špatně rozpouštět -6- ve vodě, methanolu a ethanolu.Její rozpustnest ve vo-dě činí při 20 °C 0,0005 $ a v roztoku,který obsahuje18 mmolů/1 natriumchloridu a 1,8 mmolů natriumcitrátu,0,005 1°· Roztok sestávající z 0,015 g látky v 1000 mlroztoku ctrétové soli vykazuje při 20 °C hodnotu pH5,44. UV spektrum 0,002$ roztoku sloučeniny IIIv roztokueitrátové soli vykazuje v oblasti 230 až 300 nm absorp-ční maximum u 266,2 + 0,2 nm / 1 gt= 4,000, počítánona 1 mol nukleotidu/. IR spektrum vykazuje absorpční pásy při 340 cm”1/JHCl skupina/, 1000 - 1300 cm“1 / 10skupina/, 1340 cm“1/itNH^ skupina/, 1500 - 1700 cm“1 / C=G, C=R,C=O skupi-ny/, 3000 - 3700 cm“1 /C-H, N-H, 0-H skupiny /.

Reflexní spektrum pevné sloučeniny III se vyzna-čuje ^267,1 = θ»97 , ^33,0^^/ = 26,28.

Sloučeniny podle vynálezu vykazují antineoplasti-ckou účinnost ve spojení s imunomudulující aktivitou.Nárokované sloučeninybyly zkoušeny na zvířatech a kli-nicky na lidech.Byla zkoušena jejich antineoplastickáaktivita vůči přeočkované Shvetz-erytromyelose.Anti -neoplastická aktivita všech látek podle vynálezu sevyhodnocovala podle výsledků pokusů, které se provádě- -7- ly na bílých krysách,které nepatřily k žádné rase, a je-jichž hmotnost byla 150 až 200 g / ve skupinách vždy po

O 10 zvířatech /. Zvířatům se vpravilo do boku 2.10 - 2.10^θ buněk přeočkovaného kmene Shvetz-erytromyelosya to subkutánně.4. až 6 den po inokulaci nádorových bu-něk, to znamená v období logaritmické fáze růstu nádoruse začaly zvířatům zavádět sloučeniny podle vynálezu.Sloučeniny podle vynálezu se zavádělě intraperitoneál-ně, třikrát, v časovém odstupu 24 hodin ve formě vod -ných roztoků popřípadě vodných suspensí. Nárokované látky byly zaváděny v následujících dáv-kách : sloučenina I - 17,1 mg/kg sloučenina II - 17,1 až 27,3 mg/kg sloučenina III - 27,3 mg/kg

Antineoplastická účinnost sloučenin podle vynále-zu byla zkoušena ve srovnání s kontrolou / bez použitípreparátu / a ve srovnání s OLEP a DUS preparáty.Zave-dené dávky CDEP činily 8,1 mg/kg a uíiitgS 18,0 mg/kg.

Antineoplastická účinnost se vyhodnocovala podlenásledujících biologických charakteristických dat í stupně inhibice růstu nádoru, schopnost přežití zvířat 10týden po inokulaci buněk nádoru jakož i délka života zví- w -8- řat. Výsledky zkoušek jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1 látky stupeň inhibice schopnost délka života růstu nádoru,$ přežití ve dnech. ..................zvířat',#......... 2 3 4 CDDJ? 78 DUS 0 sloučenina I podle vynálezu 84 sloučenina II podle vynálezu 94 80 11,5 + 0,5 100 18,5 + 0,5 100 21,5 +0,5 100 11,5 +0,5 sloučenina III podle vynálezu kontrola 95 0 100 21,0 + 1,0 100 14,5 + 0,5

Jak je z tabulky 1 zřejmé nejsou látky podle vynálezuméně účinné než preparát CDD3? , ale podle charakterických datjej v antineoplastické aktivitě převyšují.Jako zejména účin-ná se projevuje sloučenina III, která potlačuje růst nádoruúčinněji než CLDř, a zvyšuje schopnost přežití zvířat o 20 # -9- Λ a délku života o 10 dní, to znamená o dvojnásobek.

Rovněž byla zkrušena akutní toxicita nárokovanýchsloučenin.

Akutní toxicita nárokovaných sloučenin se zkoušelave srovnání s CLLP na bílých krysách,nepatřících k žádnérase, s hmotností 150 až 200 g a na bílých nelineárníchmyších s hmotností 30 + 3 g,které byly vystaveny po dobu20 dnů karanténě.Nárokované sloučeniny I a II se zavá-děly třikrát intraperitoneálně ve formě vodných suspen-sí a ve formě vodných roztoků , a sloučenina III a CLÍTve formě suspensé s citrátovou solí popřípadě ve ďmrměroztoků s citrátovou solí / pH 7,0 až 7,5 a iontovou si-lou 0,01 až 0,02/ v časovém odstupu 2 hodin v objemechvždy po 0,5 ml pro myši a po tX,2,0ml pro krysy. Celkovédávky sloučenin I,II, a TU podle vynálezu činily 34,0 ;68,0 i 84,0 $ 102,0 a 136,0 mg/kg, u CLLP - δ,Ο'-ψΐί’,Ο ;16,0 a 18,0 mg/kg-Počet uhynutých zvířat v každé skupiněbyl registrován každých 24 a 48 hodin,V každé skupině by-lo 12 zvířat / 6 samců a 6 samic/, pokusy se dvakrát opa-kovaly. Výsledky pokusů jsou uvedeny v tabulce 2. Výsledky zkoušek ukazují,že látky podle vynálezujsou méně toxické než CLLP, Z uvedených látek nejméně to-xická je sloučenina III podle vynálezu,Toxicita sloučeniny

I -lo- ni podle vynálezu klesá zejména tehdy,když se tato po-užívá v raztoku aniž by se reakční směs vystavila lyo -filnímu sušení a následujícímu odstranění sodných solí*

Uhynulá zvířata byla pitvána a histologicky se zkou-maly ledviny a střeva· Zvířata,která dostala látky podlevynálezu v množstvích nacházejících se pod toxickou dáv-kou, byla po 14 dnech usmrcena· Jejich vnitřní orgány by-ly podrobeny autopsii. ...........Tabúl'k'a'2..................... charakteristická CDLk...... sloučeniny. sloučenina sloučenina data toxicity v roztoku I podle vy- II podle vy-III podle vy- .............. ................nálezu.........nálezu.......nálezu -V - rozto ku v - SUS, pen- v - roz-toku v sus- pen- V roz- toku v suspen- si Sl ** 1 ....... 2 3 4 5 6 7 8 ^50 11,3 51,8 51,8 66,0 66,0 102,8 82,5 IDioom8/ke 18,3 84,0 84,0 100,0 csj — o o H 136,0 120,0 lodle histologických vyšetření byly příčiny uhynutí zví- řat ,která dostala toxické dávky preparátu CLDP a látek podle Vy- -11- nálezu, různé.Při zavádění CDDP v toxických dávkách sepozoruje výrazná dystrofie vnitřních orgánů, akutní pseu-donefróza, masivní nekrózy malých kloubů a otoky stromy.Ve střevě se pozoruje nikterak výrazná dysplazie epitelu. Při zavedení látek podle vynálezu v toxických dáv -kéch se zjistí v ledvinách nepodstatné vratné změny: ni-kterak výraznýotoky stromy,' jedno tlivé povrchové výronyv malých kloubech, dystrofické změny kanálků. Při tom lzeale zaznamenat dysplasii a deskvamaci střevního epitelu,poškození jeho regenerační funkce a redukci poětu mitóz. Při zaváděnílátek podle vynálezu v množstvích podtoxickými dávkami jsou shora uvedené změny v ledvinácha střevě vratné a během 14 dnů dochází k naprosté rege-neraci.

Byla zkoušena imunologická aktivita látek podlevynálezu.Imunologická aktivita se zjišťovala pomocí cha-rakteristických dat,která charakterizují vliv nárokova-ných látek na funkci imunitních systémů: celulérní a hu-morální imunita.

Vliv na celulárroí imunitu se vyhodnocoval podle do-by odloučení allotransplantátu kůže nositele nádoru.

Vliv na humorální imunitu / antiteloge nese / se vy-hodnocoval podle množství buněk tvořících ve slezině anti« tělíska a podle titru aglutininu a hemolysinu v krevnímséru.

Vliv nárokovaných, látek na celulární imunitu bylzkoušen na samčích krysách linie Wistar s hmotností 150až 200 g. Zvířatům byl transplantován kožní kryt rozměrů(2 x 3) cm2 odebraný krysám linie August,do hřbetní krajiny.Potom byly těmže zvířatům inokulováhy do kyčli subkután-

O ně 2.10 buněk Shvetz-erytromyelosy. 4. a 6 den po pře- očkování nádoru se zavedla zvířatům intraperitoneálně třikrát v časovém odstupu 24 hodin sloučenina I podle vynálezu v dávce 17,1 mg/kg , sloučenina II v dáice 17»1

mg/kg a sloučenina III v dávce 27,3 mg/kg· Sloučeniny I a II se zaváděly ve formě vodného roztoku a sloučenina + 0,0015 molu citrátu sodného III ve formě roztoku 0,015 molů chloridu sóďného^Jakosrovnání se používaly preparáty DNS a CD1P, které se za-váděli v solném roztoku podle stejného schématu v dáv -kách 12,0 a 8,1 mg/kg. Jako kontrola sloužila intaktnízvířata. Čas odloučení kožního krytu se fixoval podlezměny jeho teploty, barvy a elasticity. Výsledky pokusů jsou uvedeny v tabulce 3.

Ve srovnání k intaktním zvířatům se zvětšila doba odlou-čení kožního krytuu neošetřených nositelů nádoru o 5,5dní. To svědčí o xsi snížení celulární imunity organis-mu za podmínek vývinu nádoru. -13-

Tabulka 3

Doba odloučení / ve dnech / kožního krytuýč u intaktních zvír řat a u nositelů nádoru bez léčení a u léčených látkami podle vynálezu intaktní zvířata» . nositelé ~nádoru bezléčení léčení nositelé nádorů

CLDD DUS látkami podle vynálezu

I........II.......III 9,5-+ 1,0?. .15,0 + 1,0 -13,05+0,5- 12,5 + 0,5 6,0+1,0 -6,5+0,5 6,5+0,5

Zavedení preparátu GDDP a DUS neovlivňuje praktickycelulární imunutu nositele nádoru /CDL3?/ nebo ji ovlivňujejen nepodstatně /DUS/. Zavedení nárokovaných látek zkracujedobu odmítnutí kožního krytu o 3 dny ve srovnání s intaktnímizvířaty a o 8,5 dnů ve srovnání s neléčenými hositely ná -doru. Tím stimuluje zavádění nárokovaných sloučenin značnouměrou celulární imunitu nositele nádoru a to tak, že sejejí hladina zvýší nad hladinu zdravého zvířete, což se přizavádění CDEP a DUS nepodařilo. -14-

Vliv látek podle vynálezu na humorální imunitu bylrovněž zkoumán Ve srovnání s CDLř a DUS. Iro tento účelbyly použity krysy, nositelé Shvetz-eřytromyelósy’, linieWistar. 4 den po přeočkování nádoru se počalo s jejich lé-čením podle stejného schématu jako při zkoumání eelulárníimunity. 8 den po přeočkování nádoru se provedla imuniza-ce zvířat, tím že se jim zavedly Hammelovy erytrocyty v g dávce 2.10 buněk. Za 4 dny po imunizaci se zvířata usmr-tila dekapitací za použití narkózy etherem a zjišťoval seobsah buněk tvořících antitělíska ve slezině pomocí Erne-ho metody a aggkutinační a hemolysinový titr v periferníkrvi se zjišioval o sobě známými způsoby·

Obsah buněk tvořících antitělíska se zjišioVal V6 přepočtu na 10 splenočytů a na celkovou hmotnost slezi-ny. Výsledky pokusů jsou shrnuty v tabulce 4. látky podle vynálezu snižují humorální imunitu nositelenádoru. Tyto látky zmenšují rovněž počet buněk tvořícíchantitělíska a snižují agglutinační a hemolysní titr.Sní-žení humorální imunity vlivem látek podle vynálezu nastá-vá ale jen v menší míře než je tomu při působení CDDÍ. DUSpreparát prakticky neovlivňuje humorální imunitu. -15-

Tabulka 4

Skupinyzvířat charakteristické intaktní zvířata nositeléhodnoty humorální nádoru neimunity léčení léčení nositelénádoru CDDř 1. 2. obsah buněk tvoří· cích antitělíska 16 po 10 spelnocytů obsah buněk tvoří·cích antitělíska ·počítáno na hmotusleziny 2530 + 550 283,7 + 22,5 20,37 + 2.03 3. 4. agglutinační titrhemolyzní.titr .. /1828 + 250/x 103 /250,3 + 16,8/x 103 /36,42 + + 2,03/x 10 1 : 512 1 : 160 1 í 64 1 : 4064.......... ..1.i 2235...... 1 : 128 pokračování tabulky 4 skupiny'žvířát léčení nositelé nádoru

DKS látkami podle vynálezu

I

II

III -16- pókračovéní tabulky 4 li 6 7 8 9 1. 292,5 + 30,7 68,4+9,38 73,21 + 14,2 69,2 + 12,7 2. /302,7 + /78,96 + /84,21 + +45,-3/x 10^ -3,72/xlO3 + 3,31/ío3 /56,25 +10,0/ q “ x 10^ 3. 1 ϊ 128 1 : 128 I s 128 1 : 100 4. 1 : 2560 1 : 256 1 : 650 1 : 512

Vliv látek podle vynálezu na antitelogenesi byl zkou-šen i na dvou na Hammelovy^erytrocyty opaěáě reagujícíchliniích myší: CBA a C^BJ^ťloužila se zvířata s hmotností20 + 2 g, která byla vystavena po dobu nejméně 20 dnů karan-téně .Intaktním zvířatům se zavedly jednou intraperitoneél-ně látky podle vynálezu v dávkách 13,6 mg/kg, DBS v dávce 6,0 mg/kg a CDDB v dávce 8,1 mg/kg. Za hodinu byla zvířataft imunizována tím, že se jim intraperitoneálňě navedlo 10buněk Hammelových erytrocytů.7·, 14. a 30. den še zvířatausmrtila a zjistil se obsah aglutijí/nů v krevním séru a topomocí známých metod. Výsledky byly vyjádřeny ve formě lggtitrů antitělísek.Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5*

Uvedené výsledky ukazují , že DBS zvyšuje obsah antitělísekvůči Hammelovým erytrocytům v krevném séru a CDDB a látky po-le vynálezu tento obsah snižují, přičemž antidepresivní úěi- -17- nek sloučenin podle vynálezu je méně výrazný než u GDD3?· T a b u l k a- 5 zaváděné látky,dávka délka dobypozorování /dny · lgg titru antitělísek linie myší CBA............... linie myší C57BI*6 1 2 3 ....... 4..... kontrola /bez zav/téní látek 7 8,95 + 0,15 7,25 + 0,20 14 9,42 +0,23 7,72 + 0,20 .....30 ’ 9,20 + 0,20..... 6,24+0,60 CDEP / 8,1 mg/kg 7 5,30 + 0,15 3,80 + 0,24 14 5,80 + 0,19 4,04 + 0,12 30 ...... 5,10+0,30 . 4,21 +0,37 sloučenina X po- dle vynálezu /13,6 mg/kg/ 7 7,30 + 0,12 6,40 + 0,15 14 7,30 + 0,31 6,82 + 0,38 30 8,10 + 0,40 6,25+0,31 sloučenina II podle vynálezu /13,6 mg/kg/ 7 7,20 + 0,30 6,60 + 0,32 14 7,60 + 0,32 6,81 + 0,30 .....30 6,40+0,42 6,48 + 0,15 -18- pokračování tabulky § 1...............2 3...............4 sloučenina III podlevynálezu- - /13,6 mg/kg/ 7 8,10 + 0,23 6,41 + 0,21 14 8,40 + 0,42 6,68 + 0,29 .....30...... ......8,50 + 0,30 6,32 + 0,24 DUS /6,0 mg/kg/ 7 9,42 + 0,37 7,92 + 0,31 14 10,8 + 0,24 7,80 + 0,50 30 10,0 + 0,12 6,49 + 0,50

Prováděly se také zkoumání vlivu látek podle vynálezu, vesrovnání s CDDP a DKS preparáty, na tvorbu buněk tvořících anti-tělíska ve slezině dvou linií myší reagujících opačně na Hammelovyerytrocyty. ιΛ

Myším linií CBA a C^Bý^jS hmotností 20 + 2 g se zavedla jednouCDDB v dávce 8,1 mg/kg, DBS v dávce 6,0 mg/kg a látky podle vyná-lezu v dávce 13,6 mg/kg.

Za 1 hodinu byla zvířata imunizována, tím že se jimintraperitoneálně zavedlo 10 buněk Hammelových erytrocytů. 4» den se zjištoval počet buněk tvěřících antitělíska ve sle-zině zvířat pokusných a kontrolních skupin / bez zavedenípreparátu/. Obsah buněk tvořících antitělíska se počítal -19- 6 na 10 splenocytů a na celou slezinu. Výsledky vyšetřo-vání jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6 óbšáh buněk tvořících aňtitělíská Zaváděné látky linie myší OBA linie myší °57B^ na 10^ ’ na celou na 10 na celou buněk slezinu buněk slezinu x 1000 x 1000 1 2 3 4 5 kontrola * 160,0 + 7,0 240,0+10,02. 72,0+4^0 9,4 +0 1,3 ODLB · /8,1 mg/kg/ 42,0 + 3,8 63,0+ 2,2 13,3+1,24 2,2 + 0,96 DUS ·...... /6,0 mg/kg/ 240,8 + 3,2 500,φ +17,4 81,2+4,1 10,3 + 1,12 1 / sloučenina' podlevynálezu/13,6 mg/kg/ 51,0 + 2,8 76,5 +7,3 25,3+2,8 3,89+ 0,7 sloučenina II po-dle vynálezu/13,6 mg/kg/ 52,7 + 4,18 79,05+6,42 30,27+3,7 3,94 + 0,8 sloučenina III po-dle vynálezu/13,6 mgAg/ 54,8 + 5,82.82,20 +7,24 32,724,02. 4,26+0,8 i -20 Z údajů uvedených v tabulce 6 je zřejmé,že DNS zvy-šuje obsah buněk tvořících antitělíska ve slezině u myší,které reagují bučí méně nebo více na Eammelovy erytrocytylinií myší,CDDB a látky podle vynálezu snižují obsah buněktvořících antitělíska ve slezině u myší jak CBA linie taki linie,imunodepresivní účinek látek podle vynálezu

je ale méně výrazný než imunodepresivní účinek CDDBA Tím dokazují jak látky podle vynálezu tak i CDDB výraz-ný imunodepresivní účinek na systém humorální imunity jaku intaktních zvířat tak i u nositelů nádorů. Snižují tvorbubuněk ,producentů antitělísek,čímž se snižuje póčet anti -tělísek v krevním séru.Imunodepresivní účinek látek podlevynálezu je méně výrazný než imunodepresivní účinek CDDB.

Zkoumaly se charakteristická data funkčních aktivitjater nebo ledvin krys. Intaktním zvířatům se zavedly tři-krát , ve stejných dávkách s časovým odstupem 1 hodiny vod-né roztoky nárokovaných látek I a II a roztoky citrátovýchsolí CDDB jakož i nárokované sloučeniny III při toxickýchmezidávkách rovných 1/2 IiD^q, což pro CDDB činilo celkem9,0 mg/kg, u nárokovaných sloučenin I ,11 a III - 25,54 mg/kg33,0 mg/kg a 50,1 mg/kg* Za 24 hodin a za 7 dní se usmrtilazvířata a zjistily se některé biochemické charakteristickéveličiny krve,které charakterizují funkční stav jater aledvin.Výsledky poksů ukázaly,že první den po zavedení CDDB -21- a látek podle vynálezu v dávkách rovnajících se 1/2IiD^q dochází ke staticky přípustnému zvýšení transami-náz / alaninaminotransferáz a aspartajháminotransferáz/,hladinyibilirubinu jakož i ke zvýšení množství močovinyv krevním séru . 7 den po zavedení látek podle vynále -zu se tato charakteristická data normalizovala.U přeží-vajících zvířat, která dostala CDDEP, "byla tato charak -teristická data vyšší než normální. Zjištěné výsledkyukazují, že látky podle vynálezu v toxických mezidáv -kách, rovných 1/2 vykazují vratný nefrotoxický a hepatotoxický účinek.Normalizace charakteristických datfunkčních aktivit jater a ledvin u zvířat,krerým bylapodána CDDP,7 den nenastala. Výsledky provedených biochemických zkoušek byly po-tvrzeny histologickým vyšetřením tkáně jater a ledvin.

Komplex vlastnostídokázaný jako výsledek provede-ných zkoušek : vysoká chakteristická data stupně inhi-bice růstu nádoru, schopnost zvířat přežít a délka živo-tazvířat při současném snížení toxicity vytváří perspek-tivy u láek podle vynálezu pro vývoj efektivních prepa-rátů při léčení zhoubných nádorů.

Další přednost nárokovaných látek spočívá v eixten-ci výrazných imunomodulujících vlastností těchto látek -22- v důsledku stimulace celulérní imunity a značného sníržení humorální imunity, což rovněž umožňuje zvýšitúčinnost při chemoterapii zhoubných nádorů.

Byly provedeny klinické zkoušky léčiva s antineo-plastickým účinkem,které obsahuje jako účinnou látkunárokovanou - sloučeninu III. Klinické zkoušky se pro -váděly u· 102 pacientek s rakovinou vaječníků a u 32 pa-cientů s rakovinou jater ve 4. klinickém stádiu onemocnění ve stáří od 14 až do 68 let. U rakoviny vaječníků ve «4. klinickém stádiu byluvedený preparát zaváděn ve*formě roztoku / pH = 7iOaž 7,$ Z, s iontovou silou 0,02/ do břišní dutiny 3tíaž 5tý den po neúplné operaci.Preparát se zaváděl tři-krát po 380 mg v objemu 250 ml v průběhu 1 až 1,5 hodiny/ u pacientů s hmotneští 75 kg/ s přerušením na 2 až 4dny v závislosti na stavu právě ošetřovaného pacienta.Celková dávka uvedeného preparátu činily 1150 áž 1500 mgúčinné látky za celou dobu léčení, což je ekvivalentní675 až 850 mg čistého preparátu GLDP a převyšuje 4 až6krét maximálně přípustnou dávku při léčení CDDP, kteráse rovná 120 až 150 mg.

Ve třech případech se zaváděl preparát na bázi lát-ky podle vynálezu ve stejných dávkách a za stejnýchpodmínek 4 až 6 týdnů před operací neoperovatelných ra- -23 kovin vaječníku .Toto vyvolalo lysi hlavní hmoty ná-doru a částečné vymizení vzdálených metastéz, cožumožnilo později provést chirurgický zásah, iotom sepokračovalo v chemoterapii s uvedeným preparátem.ia-cientý s rakovinou vaječníku,popsané skupiny,byly 1až 4krát léčeny chamoterapeuticky 'v časovém odstupu2 až 4 měsíců bez neodvratné hydratace a zvýšené diu-rézy. TJ primárního a metastatického nádoru jater ve 4. klinickém stádiu byl uvedený preparát zaváděn pokapkách ve formě roztoku v průběhu 6 až 8 hodin dojaterní arterie nebo do pupeční žíly. V 10 případechbyl uveený preparát zaváděn ve formě vodné suspenseselektivně za kontroly echolokace dvakrát nebo tři-krát v dávkách 380 až 760 mg u pacienta s hmotností75 až 80 kg a v objemu 10 až 50 ml.iodle údajů echo-grafie zůstávají látky po dobu 4 až 8 týdnů po jejichzavedení v ložisku nádoru*

Za 4 až 6 týdnů po provedeném léčení infuzí nebomístním léčení uvedeným preparátem se zmenšila veli-kost jater, tato se stala měkkými, nebolestivými,syndrom bolesti se prakticky zcela zkrátil.To dovo-lilo provést chirurgický zásah , a sice krydestrukci. -24- Během léčení pacientů s rakovinou, válečníku a ra-kovinou jater ve 4. klinickém stádiu, uvedeným prepará-tem se pozorovalo zlepšení celkového stavu,nálady a chu-ti k jídlu#

Provedené klinické zkoušky ukázaly,že účinnost po-užití uvedeného preparátu u pacientů s rakovinou vaječ-níku ve 4. klinickém stádiu dosahuje 90 přičemž by-la prokázána úplná remise / vymizení příznaků nemoci/ve 35 $ případů, částečná remise a stabilizace procesuv 55 $ případů, u 10 # pacientů se prokázalo,že použi-tí uvedeného preparátu nebylo efektivní* Při úplné kli-nické remisi dosahuje délka života pacientů 2,5 roků přineustáléjá kontrole. Při léčení rakoviny jater ve 4. klinickém stádiuza použití uvedeného preparátu činila délka života 7»5až 11 měsíců od počátku léčení. U třech pacientů pře-stoupila délka života 18 měsíců při trvalé kontrole.

Způsob výroby nových sloučenin , derivátů dvojmoc-né platiny s polyaniontem desoxyribonukleovou kyseli -nou se provádí následovně.

Desoxyribonukleová kyselina s molekulovou hmot «·ností ,která není: rsar nižší než 8.10 L se nechá zre-agovat s cis-dichloraminoplatnatou sloučeninou nebo -25 s částečně hydrolysovanou cis-dichlordiaminoplat -natou sloučeninou ve vodném prostředí popřípadě v pu-fračním roztoku s hodnotou pH 7,0 až 7,5 a s ionto-vou silou0,01 až 0,02 při teplotě ,která není nižší než teplota tání kyseliny desoxyrihonukleové s násle-dující izolací konečného produktu. nárokovaná sloučenina I , poly^hexakis/”"chlo-roaminodiakvaplatnato__7j^-^*- desoxyrihonukleát, a ná-rokovaná sloučenina /111/,'pólyhexakis /“chloroami-noakvaplatnato_7^^-jjbt-desoxyrihonukleát , se získá re-akcí nativní desoxyrihonukleové kyseliny s cis-dichlo- rodiaminoplatnatou sloučeninou a nárokovaná sloučeni-na II , póly ^feie /“hydroxychloroaminoplatnato^tetra-kis /“chloroaminodiakvaplatnato/J^j^4*- desoxyrihonukleát,át, se získá reakcí desoxyrihonukleové kyselin^ částečně hydrolysovanou cis-dichlorodiaminoplatňatousloučeninou.

Proces se provádí ve vodném prostředí s hodnotoupH 7,0 až 7,5 a s iontovou silou 0,01 až 0,02 při te-plotě,která není nižší než teplota tání DKS až do celkového proběhnutí reakce.Ukončení reakce se kontrolu-je spektrofotometricky podle dosažených parametrů UVspekter. Z reakční směsi se vyloučí konečný produkt,tím že -26- se chlorid amonný a přebytek vody odstraní lyofilním sušením.Konečný produkt se může vyloučit i ve formě roz toku.Chemické složení nárokovaných látek v roztoku a v usušeném stavu je identické.

Pro lepší vysvětlení předloženého vynálezu jsouuvedeny následující příklady realizace způsobu výrobysloučenin podle vynálezu. Příklad 1 K roztoku 500 mg nativní DUS s molekulovou hmot-£ ností 8,5 . 10 D ve 375 ml vody,který se zahřeje nateplotu tání DUS /78,0 °C/, se piřdá roztok 675 mg cis-dichlorodiaminoplatnaté sloučeniny ve 375 nil vody,kteráse zahřeje na stejnou teplotu.Beakční směs se nechástát 15 minut za míchání a při teplotě 78 °C,potom seochladí na teplotu místnosti a přeruší se lyofilní su-šení. Získá se 1105 mg / 90 # / póly-^hexakis /""chlorp-aminodiakvaplatnato__Ťj -^tu- desoxyribonukleát ve formě jemně krystalického žlutého prášku,který je ve vodětěžko rozpustný, s následujícími parametry UV spektra 0,002# roztoku ve vodě ^max - 268,8 nm, E268 8 e —1 —1 * 610080 l.mol cm" a molekulovou hmotností 6,2.10 D. -27-

Nalezeno,^: Pt 38,46; Cl 7,38 ; C 15,61 } N 9,36 ; H 3,09 i P 4,67. ψΛ

Vypočteno·,% : Pt 38,31; Cl 6,94 ; C 15,25 ; N 9,58 ; H 2,97 } P 4,17 . Příklad 2

Vedení procesu je analogické jako v příkladu 1 s tímrozdílem, že se konečný produkt nevyloučí z reakéní smě-si, UV spektrum získané látky v roztoku je charakterizo-váno A. = 268,8 nm a a 88 10000 1 . mol*1, cm’1 · Jéjí molekulová hmotnost v roztoku činí 6,0 .ÍO^^D .Získa-ná látka má identické ehemické složení jako látka získanáv příkladu 1. Příklad 3

Vedení procesu je analogické jako v příkladu 1, s tou výjimkou,že se jako nativní desoxyribonukleová kyselinapoužije nativní DUS s molekulovou hmotností 10,6. 10^D. Získá se produkt, jehož UV spektrum v roztoku je charak-terizováno následujícími parametry Λ ___ = 268,7 nm , > - - - ... -, 21gL£ z fi ^268 7 s Ιθθθθ a molekulová hmotnost je rovná 6,2.10 D. Získaná látka je svým chemickým složením identická s lát-kou získanou v příkladu 1. -28- Příklad 4

Roztok 405 mg cis-dichlorodiaminoplatnatá slouče-nina ve 250 ml vody,který se připraví při teplotě míst-nosti, se zahřívá až na teplotu tání nativní DNS /78,5 °0/během jedné hodiny, tento roztok se přidá k roztoku 333 mgnativní DNS s toolekulovou hmotností 11,2.10θΡ ve 250 mlvody,které se rovněž zahřeje na $8,5 °C, a směs se necháza míchání stát při téže teplotě 15 minut. Směs se ochla-dí na teplotu místnosti a přeruší se lyofilní sušení. Získá se 730 mg /93 $/ póly^bis /“hydroxochloro -aminoakvaplatnatoJ7tetrakis chloroaminodiakvaplatnato_7j*Mtt- desoxyribonukleát ve 'formě jemně krystalického žlu -tého prášku,který je ve vodě těžko rozpustný, s parametry UV spektra 0,0075$ roztoku ve vodě λ max = 265,7 nm, E265 ? -1 —1 fi * 99θΟ 1 . mol" . cm" , s molekulovou hmotností 6,0.10°Da intenzivním absorpčním pásemv IR spektru při 3295 cm"\které odpovídá kolísání valence OH skupinyve skupiněPtOH .

Nalezeno ,$í Pt 39,97 ; Cl 7,38 ; C 15,53| H 9,38 } H 2,98 ; P 4,07 . ^Η^ΛχΟΐ^Ρ^.

Vypočteno,$: Pt 38,11 } Cl 6,94 i C 15,25 } N 9,58 } H 2,97 i P 4,17 .

X -29- Příklad 5

Vedení procesu se provádí analogicky jako v příkla-du 4 s tou výjimkou,že se konečný produkt nevyloučí z roz-toku. UV spektrum získané látky v roztoku je charakteri -zován následujícími parametry » 265,8 nm, θ « IOO5O 1 . mol. cm“1. Molekulová hmotnost získané látkyv roztoku činí 6,2.10¾) . Získaná látka má identické síekchemické složení jako látka z příkladu 4. Příklad 6

Vedení procesu je analogické jako v příkladu 4 stou výjimkou,že se jako nativní DUS použije nativní LNSs molekulovou hmotností 9,6 .10 D. Získá se produkt s mo-lekulovou hmotností 5,9.10 D, jehož UV spektrum je charak-terizováno následují čími parametry λ = 265,7,E^<[- „ =9990 14 mol“1, cm“1. Získaná látka má identické chemickésložení jako látka získaná v příkladu 4· Příklad 7 K roztoku citrátové soli / 15 mmolů/1 chloridu sodrného + 1,5 mmolu/1 citrátu sodného ve vodě /, který ob-sáhuje 500 mg nativní LNS s molekulovou hmdsností 10,6.10 Dve 375 ml nro z toku, který byl zahřát na teplotu tání nativ-ní DNS /78,0 °C/, přidá se 675 mg cis-dichlorodiamino - -30 platnaté sloučeniny ve 375 ml analogického roztoku ci -trátové soli,která ee zahřeje na stejnou teplotu.Beakčnísměs se nechá stát 15 minut při stejné teplotě a za mí-chání,potom se ochladí na teplotu místnosti a přerušíse lyofilní sušení. Získá se 1,8 g lyofilizátu, kterýpředíavujesměs nárokované sloučeniny III , chlarridu éod-ného a citrátu sodného. K 250 mg lyofilizátu se přidá50 ml destilované vody a pečlivě se promíchá.Vyloučenásuspense se odstředí při teplotě místnosti rychlostíotáček 7000 o/min během 15 minut. Boztok se ze sraženiny zdekantuje,sraženina se promyje vodou, ethylalkoholem, ethyletherem a usuší na vzduchu;Získá se 90 mg /60 $teorie / čistého póly ^hexakis/^hloroaminoakvaplatnato/J^j·-^-desoxyribonukleátu ve formě jemně krystalického tma- vě žlutého prášku,který je ve vodě omezeně rozpustný, sparametry UV spektra 0,05$ roztoku ve vodě,která obsahu-je 18 mmolů/1 chloridu sodného a 1,8 mmolu/1 citrátu sod- néhq jmn-r = 266,2 nm, ^£66 2 “ ^-θθθθ 1· mo- lekulová hmotnost činí 6,2.10¾.

Nalezeno Pt 39,81, Cl ; 7,40 } C 15,62;E 10,11} H 2,88 ; P 4,33 . C^a^O^N^ClgP^tg

Vypočteno Pt 39,58 } Cl 7,21 } C 15,88 } H 9,95 IH 2,67 } P 4,19. -31- Příklad 8

Vedení procesu probíhá analogicky jako v příkladu 7s tou výjimkou,že se konečný produkt zreakční směsi nevy-loučí.UV spektrum získané látky v roztoku je charakterizo-váno následujícími parametry: λΜχ = 266,/2.nm,E2gg^2 -10100£mol“3-cm“\ Jeho molekulová hmotnost je rovná 5,9.10 D. Chemické složení získané látky je identické sesložením látky získané v příkladu 7· Příklad 9

Vedení procesu probíhá analogicky jako v příkladu7 s tou výjimkou,že se jako nativní LKS použije nativní LNS g s molekulovou hmotností 9,6.10 D. g Získá se produkt s molekulovou hmotností 6,0.10 D aUV spektrem ,které je charakterizováno 2 = 266,2 nm , . ΙΠ.&amp;Χ ^266 2 = 10020 1 · m°l*"· em~ · Chemické složení získanélátky je iidentieké s chemickým složením látky získané vpříkladu 7.

Claims (1)

1. -32- ADVOKÁTNÍ PORADNA 2.10 J15 04 PRAHA 1, Žitná 25 PŘELMÍJT V ϊ N í I B 2 7 Způsob výroby derivátů dvojmocné platiny s po-lyaniontem desoxyribonukleové kyseliny obecného vzorce {/“ptCl/KH3/_76/0H/x/H20/y^ n -DNS’e , kde DUS' • ΤΠ 4· C39H55- .^32¾¾ 4 -ffi XL , n = 2000 + 200 , ' při X = 0, y = 12 , m « 6n, r = 6 » při X = 2, y = 10 , m = 4n, r = 4 9 při X = o, y = 6, m β·6n, r = 6 9 vyznačující se tím, že se reakce desoxyribonukleové ky -seliny s molekulovou hmotností,která není nižší než 8 mi-lionů daltonů;s cis-dichloroplatnatou sloučeninou nebo sčástečně hydrolyzovanou cis-dichlorodiaminoplatnatousloučeninou provádí ve vodném prostředí^popřípadě v pu -fračním roztoku s hodnotou pH 7,0 až 7,5 a iontovou silou0,01 až 0,02 při teplotě ,která není nižší než teplota tání kyseliny desoxyribonukleové,.« náol-odující izolací ko — JUDr. Miloš vš: Advokátní pořádná 115 04 PRAHA 1,