CS277170B6 - SpSsob kvantitativného "in vitro" stanovovania citlivosti baktérií a kvasiniek na antimikrobiálne látky - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká spósobu kvantitativného "in vitro" stanovovania citlivosti baktérií a kvasiniek v kultivačných pódach a biologickom materiáli na antimikrobiálne látky indikáciou změny rastu definovanej koncentrácie a objemu suspenzie mikroorganizmov v tekutom kultivačnom médiu. Kultivácia mikroorganizmov sa uskutočnuje na savom podklade vo formě jedného alebo viacerých mikroterčíkov v obmedzenom uzavretom priestore, pričom mikroterčíky sú vzájomne oddělené, aby nedošlo k zmiešavaniu jednotlivých vzoriek. Indikácia rastu sa uskutečňuje róznymi spósobmi, napr. pomocou redox indikátora. Mikroterčíky sa před použitím napustia roztokom antimikrobiálnej látky a rozpúštadlo sa po napuštění odstráni.

Description

Oblast techniky

Vynález sa týká spósobu kvantitativného in vitro stanovovania citlivosti baktérií a kvasiniek v kultivačných pódach a biologickom materiáli na antimikrobiálne látky.

Doterajší stav techniky

Na in vitro stanovovanie citlivosti mikroorganizmov na antimikrobiálne látky sa v praxi používajú difúzne alebo dilučné metody. Pri difúznej metóde sa v pevnej pode v Petriho miske s naočkovanými mikroorganizmarni vytvoří jamka, do ktorej sa napipetuje roztok s přesným množstvom antimikrobiálnej látky. Antimikrobiálna látka difunduje počas inkubácie do pódy a vytvoří v okolí disku koncentračný gradient. Antimikrobiálny účinok testovanéj látky sa hodnotí na základe vzniku zóny zábrany rastu mikroorganizmov v okolí jamky. Pri alternatívnom postupe sa na povrch pódy prikladajú zásobné disky z inertnej sávej hmoty, zvyčajne filtračného papiera, impregnované přesným množstvom antimikrobiálnej látky, ktorá z disku difunduje do pódy v okolí disku. Kontakt medzi mikroorganizmom a antimikrobiálnou látkou prebieha v kultivačnom médiu, mimo disku. Nevýhody difúznej metody sú predovšetkým v tom, že aj pri kvantifikovaní priemeru inhibičnej zóny hodnotenie poskytuje len kvalitatívny výsledek. Na hodnotenie je potřebné dosiahnut makroskopicky zistitelný rast mikroorganizmov na pode, preto sa test hodnotí po 24 hodinách. Okrem toho táto metoda vyžaduje velkú spotřebu kultivačných médií a reagencií.

Pri kvantitativných dilučných metodách sa definované množstvo antimikrobiálnej látky najskór rozpustí v pode v osobitnej reakčnej nádobke. Okrem priameho pridania antimikrobiálnej látky sa ako jej zdroj móžu použit aj zásobné disky zo savého materiálu impregnované požadovaným množstvom antimikrobiálnej látky, ktoré sa před testom vložia do reakčných nádobiek s kultivačnou pódou. Po elúcii antimikrobiálnej látky z disku do pódy sa musí disk z pódy odstránit, alebo sa kultivačná póda premiestni do inej, meracej nádobky. Nutnost odstraňovat disky z kultivačnej pódy eliminuje riešenie podlá patentu GB 1057000, pri ktorom sa používajú disky z materiálu rozpustného v kultivačnom médiu. Potom sa do nádobiek přidá testovaný mikroorganizmus, kultivuje sa a rast sa vyhodnotí.

Nevýhodou tejto metody je, že vyžaduje technologicky náročnú přípravu viacerých pod s róznymi riedeniami antimikrobiálnej látky a skladovanie vopred připravených kultivačných pod s antimikrobiálnymi látkami je problematické; pokial roztok antimikrobiálnej látky v kultivačnej pode nie je před skladováním lyofylizovaný, jeho stabilita je obmedzená, a to aj pri skladovaní v zmrazenom stave. Před vlastným testováním sú nutné ďalšie operácie, napr. rozpúštanie a vytemperovanie zmrazených súprav resp. rozpustenie lyofylizovaných pod před testováním, alebo miešanie vzoriek počas rozpúštania.

V případe dávkovania antimikrobiálnej látky pomocou nosičov (tablety, disky) do základnéj kultivačnej pódy v reakčných nádobkách tesne před testom pribúda manipulácia s velkým počtom róz nych nosičov. Postup je časovo náročný, málo efektívny a zvyšuje sa riziko kontaminácie pod.

Podstata vynálezu

Uvedené, nevýhody odstraňuje spósob kvantitativného in vitro stanovovania citlivosti baktérií a kvasiniek na antimikrobiálne látky podlá vynálezu, indikáciou rastu definovanéj koncentrácie a objemu suspenzie mikroorganizmov v tekutom kultivačnom médiu pri róznych koncentráciách antimikrobiálnych látok nanesených na savom podklade. Podstata vynálezu spočívá v tom, že kultivácia mikroorganizmov sa uskutečňuje na savom podklade vo forme jedného alebo viacerých mikroterčíkov umiestnených v obmedzenom.uzavretom priestore, pričom mikroterčíky sú vzájomne oddělené tak, aby nedošlo k zmiešaniu jednotlivých vzoriek. Rast mikroorganizmov prebieha jednak na povrchu mikroterčíka a jednak v jeho póroch. Indikácia rastu sa móže uskutečnil: róznymi spósobmi, s výhodou pomocou redox indikátora (například sol tetrazóliového farbiva). Mikroterčíky sa před použitím napustia roztokom s definovaným množstvem antimikrobiálnej látky a rozpúštadlo sa odstráni (napr. sušením).

Výhodou spósobu podlá vynálezu je predovšetkým jeho jednoduchost spočívájúca v nenáročnéj príprave testovacích súprav s velkým počtem róznych riedení antimikrobiálnych látok. Skladovatelnost připravených súprav je jednoduchá (menšie nároky na skladovaciu teplotu); skladovaniesamotných antimikrobiálnych látok v suchem stave umožňuje predížit dobu použitia a rozšířit výběr antimikrobiálnych látok. Připravené testovacie súpravy možno použit priamo bez dalších operácií (rozmrazovaní^, rozpúštanie lyofylizátu). Okrem toho je tu možnost volby kultivačněj pódy priamo pri príprave suspenzie testovaných mikroorganizmov.

Vzhladom na skutečnost, že rast prebieha v minimálnom reakčnom objeme (mikroterčík), odpadá nutnost pouzívania osobitných reakčných nádobiek a možno pracovat s extrémně malým množstvem reagencií. S tým súvisí najma zníženie nárokov na likvidáciu infekčného biologického odpadového materiálu.

Příklad uskutočnenia vynálezu

Příklad

Kvantitativné stanovenie citlivosti G-baktérií na antibiotiká netilmycín, cefalotín, ofloxacilín a tetracyklín.

Na platničku z nezmáčavej umelej hmoty s hydrofóbnym povrchom sa pripevnia mikroterčíky z bieleho filtračného papiera, ktorý bol vopred premytý najprv Ikrát v 0.1 NHC1 a potom a 2krát v deionizovanej vodě. Rozměry mikroterčíkov sa volia tak, aby na platničke vznikli 4 rady po 10 mikroterčíkov, každý s plochou cca 0,8 cm², oddělených priestormi bez filtračného papiera o šírke 1,5 mm. Pomocou lepiacej pásky sa na platničku upevní rovné viečko z umelej hmoty s hydrofóbnym povrchom. Platnička sa sterilizuje etylénoxidom.

Po vysterilizovaní platničky sa za sterilných podmienok do každého mikroterčíka mikropipetou přidá 4 μΐ roztoku vyšetrova ných antibiotik v destilovanéj vodě tak, aby jednotlivé mikroter§ číky obsahovali 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005 a 0,000 μ9 antibiotika. Do posledného mikroterčíka v radě sa ako kontrola zábrany rastu přidá vhodný roztok azidu sodného (výsledný obsah v mikroterčíku je 100 μ9). Platnička sa po přidaní roztokov umiestni do sušičky a pri 37 °C sa suší 30 minút. Potom sa viečko uzavrie a platnička sa zataví do plastického nepriedušného vrecúška.

Pri vykonaní spósobu stanovenia citlivosti podlá vynálezu sa připraví suspenzia vyšetřovaného kmeňa baktérií (například Escherichia coli v Mueller-Hintonovej bujóne) a koncentrácia mikroorganizmov sa upraví na lx 10⁶/ml. Rúrkovým aplikátorom sa prenesie do každého mikroterčíka 10 μΐ pripravenej suspenzie, platnička sa přikryje viečkom a hermeticky uzavrie do těsného plastického sáčku, aby sa zabránilo odparovaniu vody z mikroterčíkov. Platnička sa inkubuje pri 37 °C 4 až 6 hodin. Potom sa do každého mikroterčíka rúrkovým aplikátorom přidá 2 μΐ farebného indikátora - roztoku MTT (5 mg/ml 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazolium bromid vo fyziologickom roztoku), platnička sa opat uzavrie do plastikového vrecúška a inkubuje 30 minút pri 37 °C.

Po inkubácii sa platnička vyberie z vrecúška a podlá změny farby indikátora sá hodnotí rast mikroorganizmov v jednotlivých mikroterčíkoch. Zmodranie mikroterčíka indikuje rast baktérií (nedošlo k ovplyvneniu antimikrobiálnou látkou), nezmenená farba znamená antibakteriálny účinok vyšetrovanej látky pri danej koncentrácii. Podlá prvého mikroterčíka s nezmenenou farbou v radě klesájúcich koncentrácii testovaného antibiotika sa určí jeho minimálna inhibičná koncentrácia.

Oblast priemyselnej využitelnosti

Vynález je možné využit v mikrobiologickéj diagnostike (zdravotnickéj, veterinárnej, priemyselnej a potravinárskej).

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spósob kvantitativného in vitro stanovovania citlivosti baktérii a kvasiniek v kultivačných pódach a biologickém materiáli na antimikrobiálne látky indikáciou změny rastu definovanej koncentrácie a objemu suspenzie mikroorganizmov v tekutom kultivačnom médiu pri róznych koncentráciách antimikrobiálnych látok nanesených na savom podklade, vyznačujúci sa tým, že kultivácia mikroorganizmov sa uskutečňuje na savom podklade vo forme jedného alebo viacerých mikroterčíkov v obmedzenom uzavretom priestore, pričom mikroterčíky sú navzájem oddělené tak, aby nedošlo k zmiešavaniu jednotlivých vzoriek.
2. 2. Spósob podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že po napuštění mikroterčíkov roztokem antimikrobiálnej látky sa rozpúšisadlo odstráni.

   Konec dokumentu