CS277170B6 - SpSsob kvantitativného "in vitro" stanovovania citlivosti baktérií a kvasiniek na antimikrobiálne látky - Google Patents

Description

1 CS 277170 B6 >

Oblast techniky

Vynález sa týká spósobu kvantitativného "in vitro" stanovo-vania citlivosti baktérií a kvasiniek v kultivačných pódacha biologickom materiáli na antimikrobiálne látky.

Doterajší stav techniky

Na "in vitro" stanovovanie citlivosti mikroorganizmov naantimikrobiálne látky sa v praxi používajú "difúzne" alebo"dilučné" metody. Pri difúznej metóde sa v pevnej pode v Petrihomiske s naočkovanými mikroorganizmarni vytvoří jamka, do ktorej sanapipetuje roztok s přesným množstvom antimikrobiálnej látky.Antimikrobiálna látka difunduje počas inkubácie do pódy a vytvořív okolí disku koncentračný gradient. Antimikrobiálny účinoktestovanéj látky sa hodnotí na základe vzniku "zóny zábranyrastu" mikroorganizmov v okolí jamky. Pri alternatívnom postupesa na povrch pódy prikladajú zásobné disky z inertnej sávejhmoty, zvyčajne filtračného papiera, impregnované přesnýmmnožstvom antimikrobiálnej látky, ktorá z disku difunduje do pódyv okolí disku. Kontakt medzi mikroorganizmom a antimikrobiálnoulátkou prebieha v kultivačnom médiu, mimo disku. Nevýhody difúz-nej metody sú predovšetkým v tom, že aj pri kvantifikovaní prie-meru inhibičnej zóny hodnotenie poskytuje len kvalitatívny výsle-dok. Na hodnotenie je potřebné dosiahnut makroskopicky zistitelnýrast mikroorganizmov na pode, preto sa test hodnotí po 24 hodi-nách. Okrem toho táto metoda vyžaduje velkú spotřebu kultivačnýchmédií a reagencií.

Pri kvantitativných dilučných metodách sa definovanémnožstvo antimikrobiálnej látky najskór rozpustí v pode v osobit-nej reakčnej nádobke. Okrem priameho pridania antimikrobiálnejlátky sa ako jej zdroj móžu použit aj zásobné disky zo savéhomateriálu impregnované požadovaným množstvom antimikrobiálnejlátky, ktoré sa před testom vložia do reakčných nádobiek s kulti-vačnou pódou. Po elúcii antimikrobiálnej látky z disku do pódy samusí disk z pódy odstránit, alebo sa kultivačná póda premiestnido inej, meracej nádobky. Nutnost odstraňovat disky z kultivačnejpódy eliminuje riešenie podlá patentu GB 1057000, pri ktorom sapoužívajú disky z materiálu rozpustného v kultivačnom médiu.Potom sa do nádobiek přidá testovaný mikroorganizmus, kultivujesa a rast sa vyhodnotí.

Nevýhodou tejto metody je, že vyžaduje technologicky náročnúpřípravu viacerých pod s róznymi riedeniami antimikrobiálnejlátky a skladovanie vopred připravených kultivačných pod s anti-mikrobiálnymi látkami je problematické; pokial roztok antimikro-biálnej látky v kultivačnej pode nie je před skladováním lyofyli-zovaný, jeho stabilita je obmedzená, a to aj pri skladovanív zmrazenom stave. Před vlastným testováním sú nutné ďalšie ope-rácie, napr. rozpúštanie a vytemperovanie zmrazených súprav resp.rozpustenie lyofylizovaných pod před testováním, alebo miešanievzoriek počas rozpúštania. V případe dávkovania antimikrobiálnej látky pomocou nosičov(tablety, disky) do základnéj kultivačnej pódy v reakčných nádob-kách tesne před testom pribúda manipulácia s velkým počtom róz- CS 277170 B6 2 nych nosičov. Postup je časovo náročný, málo efektívny a zvyšujesa riziko kontaminácie pod.

Podstata vynálezu

Uvedené, nevýhody odstraňuje spósob kvantitativného "invitro" stanovovania citlivosti baktérií a kvasiniek na antimikro-biálne látky pódia vynálezu, indikáciou rastu definovanéj koncen-trácie a objemu suspenzie mikroorganizmov v tekutom kultivačnommédiu pri róznych koncentráciách antimikrobiálnych látok nanese-ných na savom podklade. Podstata vynálezu spočívá v tom, žekultivácia mikroorganizmov sa uskutočňuje na savom podklade voformě jedného alebo viacerých mikroterčíkov umiestnených v obmed-zenom.uzavretom priestore, pričom mikroterčíky sú vzájomne oddě-lené tak, aby nedošlo k zmiešaniu jednotlivých vzoriek. Rastmikroorganizmov prebieha jednak na povrchu mikroterčíka a jednakv jeho póroch. Indikácia rastu sa móže uskutočnit róznymi spósob-mi, s výhodou pomocou redox indikátora (například sol tetrazólio-vého farbiva). Mikroterčíky sa před použitím napustia roztokoms definovaným množstvom antimikrobiálnej látky a rozpúštadlo saodstráni (napr. sušením). Výhodou spósobu pódia vynálezu je predovšetkým jeho jedno-duchost spočívájúca v nenáročnéj príprave testovacích súpravs velkým počtom róznych riedení antimikrobiálnych látok. Sklado-vateinost připravených súprav je jednoduchá (menšie nároky naskladovaciu teplotu); skladovaniesamotných antimikrobiálnychlátok v suchom stave umožňuje predížit dobu použitia a rozšířitvýběr antimikrobiálnych látok. Připravené testovacie súpravymožno použit priamo bez dalších operácií (rozmrazovanie, rozpú-štanie lyofylizátu). Okrem toho je tu možnost volby kultivačnějpódy priamo pri príprave suspenzie testovaných mikroorganizmov.

Vzhiadom na skutočnost, že rast prebieha v minimálnom reakč-nom objeme (mikroterčík), odpadá nutnost pouzívania osobitnýchreakčných nádobiek a možno pracovat s extrémně malým množstvomreagencií. S tým súvisí najma zníženie nárokov na likvidáciuinfekčného biologického odpadového materiálu. Příklad uskutočnenia vynálezu Příklad

Kvantitativné stanovenie citlivosti G-baktérií na antibioti-ká netilmycín, cefalotín, ofloxacilín a tetracyklín.

Na platničku z nezmáčavej umelej hmoty s hydrofóbnympovrchom sa pripevnia mikroterčíky z bieleho filtračného papiera,ktorý bol vopred premytý najprv lkrát v 0.1 NHC1 a potom a 2krátv deionizovanej vodě. Rozměry mikroterčíkov sa volia tak, aby naplatničke vznikli 4 rady po 10 mikroterčíkov, každý s plochou cca 0,8 cm2, oddělených priestormi bez filtračného papiera o šírke1,5 mm. Pomocou lepiacej pásky sa na platničku upevní rovné vieč-ko z umelej hmoty s hydrofóbnym povrchom. Platnička sa sterilizu-je etylénoxidom.

Po vysterilizovaní platničky sa za sterilných podmienok dokaždého mikroterčíka mikropipetou přidá 4 μΐ roztoku vyšetrova- 3 CS 277170 B6 ných antibiotik v destilovanéj vodě tak, aby jednotlivé mikroter§číky obsahovali 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005a 0,000 μ9 antibiotika. Do posledného mikroterčíka v radě sa akokontrola zábrany rastu přidá vhodný roztok azidu sodného (výsled-ný obsah v mikroterčíku je 100 μ9). Platnička sa po přidaníroztokov umiestni do sušičky a pri 37 °C sa suší 30 minút. Potomsa viečko uzavrie a platnička sa zataví do plastického neprieduš-ného vrecúška.

Pri vykonaní spósobu stanovenia citlivosti podlá vynálezu sapřipraví suspenzia vyšetřovaného kmeňa baktérií (například Esche-richia coli v Mueller-Hintonovej bujóne) a koncentrácia mikroor- ganizmov sa upraví na Ix 106/ml. Rúrkovým aplikátorom sa prenesiedo každého mikroterčíka 10 μΐ pripravenej suspenzie, platnička sapřikryje viečkom a hermeticky uzavrie do těsného plastickéhosáčku, aby sa zabránilo odparovaniu vody z mikroterčíkov. Plat-nička sa inkubuje pri 37 °C 4 až 6 hodin. Potom sa do každéhomikroterčíka rúrkovým aplikátorom přidá 2 μΐ farebného indikátora- roztoku MTT (5 mg/ml 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenylte-trazolium bromid vo fyziologickom roztoku), platnička sa opatuzavrie do plastikového vrecúška a inkubuje 30 minút pri 37 ’C.

Po inkubácii sa platnička vyberie z vrecúška a podlá změnyfarby indikátora sá hodnotí rast mikroorganizmov v jednotlivýchmikroterčíkoch. Zmodranie mikroterčíka indikuje rast baktérií(nedošlo k ovplyvneniu antimikrobiálnou látkou), nezmenená farbaznamená antibakteriálny účinok vyšetrovanej látky pri danejkoncentrácii. Podlá prvého mikroterčíka s nezmenenou farbouv radě klesájúcich koncentrácii testovaného antibiotika sa určíjeho minimálna inhibičná koncentrácia.

Oblast priemyselnei využitelnosti

Vynález je možné využit v mikrobiologickéj diagnostike(zdravotnickéj, veterinárnej, priemyselnej a potravinárskej).

Claims (2)

1. CS 277170 B6 4 PATENTOVÉ NÁROKY •Μ

   1. Spósob kvantitativného "in vitro" stanovovania citlivostibaktérii a kvasiniek v kultivačných pódach a biologickom mate-riáli na antimikrobiálne látky indikáciou změny rastu defino-vanej koncentrácie a objemu suspenzie mikroorganizmov v teku-tom kultivačnom médiu pri róznych koncentráciách antimikro-biálnych látok nanesených na savom podklade, vyznačujúci satým, že kultivácia mikroorganizmov sa uskutočňuje na savompodklade vo formě jedného alebo viacerých mikroterčíkovv obmedzenom uzavretom priestore, pričom mikroterčíky súnavzájom oddělené tak, aby nedošlo k zmiešavaniu jednotlivýchvzoriek.
2. 2. Spósob podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že po napuštěnímikroterčíkov roztokom antimikrobiálnej látky sa rozpúšisadloodstráni. Konec dokumentu