CS277033B6 - Způsob kultivace bakterií rodu Rhizobium a Azotobacter - Google Patents

Abstract

Kultivace hlizkových bakterií na rašelinovém substrátu se provádí zaočkováním bakterii do hermeticky uzavřeného rešelinového substrátu, který byl sterilizován ionizujícím zářením dávkou 20 až 50 kGy

Description

Oblast techniky • Vynález se týká způsobu kultivace bakterií rodu Rhizobium a Azotobacter na rašelinovém substrátu.

Dosavadní stav techniky

Současná technologie výroby očkovacích látek např. podle čs. patentu č. 148327 zahrnuje výběr provozních kmenů Bacterium Rhizobium a vlastní technologii výroby, u které, vedle přípravy matečných kultur, je rozhodující pro kvalitu preparátu příprava nosného substrátu. Jako nosný substrát se používá směs mleté rašeliny s tuhou, upravená přídavkem mletého vápna na hodnotu pH 7. Prosátý substrát se sterilizuje v autoklávech pod tlakem páry 200 kPa po dobu 3 hodin. Vychladlý substrát se zaočkuje tekutou kulturou rhizobií a v uzavřené nádobě se skladuje při teplotě 28 °C k rozmnožení rhizobií tak, aby jejich titr nebyl nižší než 100 milionů buněk v 1 g. Tepelná sterilizace má ř^du nevýhod. Mezi ně patří zejména skutečnost, že sterilizace není dokonalá vzhledem ke špatným tepelně vodivostním vlastnostem rašeliny, dále že dochází k lokálnímu přehřívání, které vede k tepelnému rozkladu rašeliny za vzniku toxických látek negativně působících na vývoj hlízkových bakterií. Dosažený stupeň sterility při autoklávování je poměrně nízký, zbytek zárodků plísní dosahuje počtu 10² až 10⁴ živých buněk v 1 g a při následné kultivaci plísně konkurují bakteriím, čímž do určité míry omezují jejich rozmnožení. Takto připravený přípravek má titr rhizobií 10⁸ živých buněk v 1 g přípravku max. po dobu 6 měsíců a potom titr výrazně klesá a naopak stoupá titr plísní a kvasinek, což není žádoucí.

Podstata vynálezu

Podstata způsobu kultivace bakterií rodu Rhizobium a Azotobacter na rašelinovém substrátu spočívá podle vynálezu v tom, že se uvedené bakterie zaočkovávají do hermeticky uzavřeného rašelinového substrátu, který byl sterilizován ionizujícím zářením v dávce 20 až 50 kGy.

Způsobem podle vynálezu je přírodní rašelina smíchána s mletým vápencem v takovém poměru, aby výsledná hodnota pH byla v rozmezí 6,2 až 6,9. Po přidání fosforu, draslíku a stopových prvků se rašelina suší v sušárně na konečný obsah vody max. 10 % hmotnosti. Usušená rašelina se mele a prosévá, aby se zbavila zbytků dřeva a hrubších zrn a současně se na sítech třídí tak, aby alespoň 70 % částic mělo velikost menší než 60 μm. Vytříděná rašelina se mísí s tuhou a v míchačce se zvlhčuje na obsah vody 20 až 25 % hmotnosti. Takto připravený substrát je pak sterilizován ionizujícím zářením, tj. gama zářením, nebo urychlenými elektrony a sterilizace probíhá za teploty 20 až 25 °C. Sterilizující dávky se pohybují v rozmezí 25 až 50 kGy v závislosti na počátečním počtu zárodků plísní, aktinomycet a kvasinek. Rašelina je sterilována přímo v zatavených sáčcích z polyethylenu a po ozáření je dosaženo úplné sterility, kterou lze udržet v hermeticky uzavřeném sáčku po 18 měsíců beze změny. Na rozdíl od

tepelné sterilizace neobsahuje substrát ani jiné cizí látky, např. toxické produkty pyrolýzy rašeliny. Zaočkování tekutou kulturou se provádí propíchnutím sáčku sterilní dutou jehlou a napuštěním kultury do substrátu. Díky nepřítomnosti konkurenčních mikroorganizmů a toxických pyrolýzních produktů se dosahuje počtu vypěstovaných bakterií např. Rhizobium Meliloti D 41*7 nad hodnotu 10⁹ v 1 g přípravku.

Kontrola přípravku po 16ti měsících od data výroby zjistila 1,51 x 10¹² živých buněk rhizobií v 1 g přípravku (Rhizobium Meliloti D 417).

Podobných výsledků bylo dosaženo i pro ostatní kultury, tj. hrách, pelušku, vikev, bob a jetel.

Po zaočkování nosného substrátu kulturou Azotobactera kmenem A 27 bylo při kontrole po 14ti měsících od data výroby zjištěno 1,32 x 10⁹ živých buněk Azotobactera v 1 g přípravku.

Způsobem podle vynálezu probíhá kultivace mikroorganizmů na zcela sterilním rašelinovém substrátu, připraveném radiační sterilizací.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 kg vytříděné rašeliny o hodnotě pH 6,2 a počáteční vlhkosti 7 % kg tuhy se smíchá a přidá se 15 1 vody.

Uvedená směs se plní do 100 polyethylenových sáčků o síle folie 0,10 mm, zataví a radiačně sterilizuje dávkou záření 25 kGy. Takto připravený substrát se inokuluje tekutou kulturou Rhizobium Meliloti D 417 v množství 300 ml/1 sáček o titru minimálně 10¹⁰ živých buněk v 1 ml. Kultivace probíhá při teplotě 20 až 25 °C po dobu 10 dnů. Po namátkové kontrole, kdy se ověří očekávaná výše titru min. 10⁹ živých buněk v 1 g přípravku, se hotový přípravek do roka použije. Bylo ověřeno, že u takto připraveného přípravku ani po 18 měsících skladování neklesne titr bakterií řádově pod 10⁹ živých buněk v 1 g přípravku.

Příklad 2

Podle postupu v příkladu 1 se připravily sáčky se substrátem, který byl jednotlivě zaočkován těmito tekutými kulturami:

Rhizobium Trifolii	D 15 , D 20 , D 544	, T 16
Leguminosarum	D 560 , D 564 , T 97	, T 117
	D 28 , E 23 , N 30	, T 79
Japonicum Lupini	D 538 , D 344 , D 536 D 75 , D 51 , D 52	, D 563
Meliloti Azotobacter kmen	D 469 , D 470 , D 472 A 27 , A 33 , A 36	, D 557

Všechny použité kultury mikroorganizmů jsou uloženy ve sbírce ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby v Praze - Ruzyni.

Průmyslová využitelnost

Způsob kultivace hlízkových bakterií rodu Rhizobium a Azotobacter na radiačně sterilizovaném substrátu umožňuje sterilní inokulaci každé dávky očkovací látky, při dosažení titru pěstovaných bakterií řádově nad 10⁹ živých buněk v 1 g přípravku a udržení tohoto titru po dobu více než 12 měsíců.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Způsob kultivace bakterií rodu Rhizobium a Azotobacter na rašelinovém substrátu, vyznačující se tím, že se uvedené bakterie zaočkovávají do hermeticky uzavřeného rašelinového substrátu, který byl sterilizován ionizujícím zářením v dávce 20 až 50 kGy.