CS277033B6

CS277033B6 - A method of cultivating bacteria of the genus Rhizobium and Azotobacter

Info

Publication number: CS277033B6
Application number: CS893510A
Authority: CS
Inventors: Bohumil Ing Csc Bartonicek; Hana Rndr Csc Mareckova; Jaroslav Ing Padour; Jiri Ing Pipota; Jarmila Pohunkova
Original assignee: Bohumil Ing Csc Bartonicek; Hana Rndr Csc Mareckova; Jaroslav Ing Padour; Jiri Ing Pipota; Jarmila Pohunkova
Priority date: 1989-06-09
Filing date: 1989-06-09
Publication date: 1992-11-18
Also published as: CS351089A3

Abstract

Kultivace hlizkových bakterií na rašelinovém substrátu se provádí zaočkováním bakterii do hermeticky uzavřeného rešelinového substrátu, který byl sterilizován ionizujícím zářením dávkou 20 až 50 kGyCultivation of tuber bacteria on peat substrate is carried out by inoculating the bacteria into a hermetically sealed peat substrate that has been sterilized with ionizing radiation at a dose of 20 to 50 kGy.

Description

Oblast techniky • Vynález se týká způsobu kultivace bakterií rodu Rhizobium a Azotobacter na rašelinovém substrátu.TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for culturing Rhizobium and Azotobacter bacteria on a peat substrate.

Dosavadní stav technikyPrior art

Současná technologie výroby očkovacích látek např. podle čs. patentu č. 148327 zahrnuje výběr provozních kmenů Bacterium Rhizobium a vlastní technologii výroby, u které, vedle přípravy matečných kultur, je rozhodující pro kvalitu preparátu příprava nosného substrátu. Jako nosný substrát se používá směs mleté rašeliny s tuhou, upravená přídavkem mletého vápna na hodnotu pH 7. Prosátý substrát se sterilizuje v autoklávech pod tlakem páry 200 kPa po dobu 3 hodin. Vychladlý substrát se zaočkuje tekutou kulturou rhizobií a v uzavřené nádobě se skladuje při teplotě 28 °C k rozmnožení rhizobií tak, aby jejich titr nebyl nižší než 100 milionů buněk v 1 g. Tepelná sterilizace má ř^du nevýhod. Mezi ně patří zejména skutečnost, že sterilizace není dokonalá vzhledem ke špatným tepelně vodivostním vlastnostem rašeliny, dále že dochází k lokálnímu přehřívání, které vede k tepelnému rozkladu rašeliny za vzniku toxických látek negativně působících na vývoj hlízkových bakterií. Dosažený stupeň sterility při autoklávování je poměrně nízký, zbytek zárodků plísní dosahuje počtu 10² až 10⁴ živých buněk v 1 g a při následné kultivaci plísně konkurují bakteriím, čímž do určité míry omezují jejich rozmnožení. Takto připravený přípravek má titr rhizobií 10⁸ živých buněk v 1 g přípravku max. po dobu 6 měsíců a potom titr výrazně klesá a naopak stoupá titr plísní a kvasinek, což není žádoucí.Current technology of vaccine production, eg according to Czechoslovakia. No. 148327 includes the selection of operational strains of Bacterium Rhizobium and its own production technology, in which, in addition to the preparation of mother cultures, the preparation of the carrier substrate is decisive for the quality of the preparation. A mixture of ground peat with solids, adjusted to pH 7 by the addition of ground lime, is used as the carrier substrate. The sieved substrate is sterilized in autoclaves under a steam pressure of 200 kPa for 3 hours. The cooled substrate is inoculated with a liquid culture of rhizobia and stored in a closed vessel at 28 ° C to propagate the rhizobia so that its titer is not less than 100 million cells per 1 g. Heat sterilization has a number of disadvantages. These include, in particular, the fact that sterilization is not perfect due to the poor thermal conductivity properties of peat, as well as local overheating, which leads to thermal decomposition of peat to produce toxic substances that adversely affect the development of tuber bacteria. The achieved degree of sterility in autoclaving is relatively low, the rest of the fungal germs reach the number of 10 ² to 10 ⁴ viable cells in 1 g and in the subsequent cultivation of the fungus compete with bacteria, thus to some extent limiting their multiplication. The preparation thus prepared has a titer of rhizobia of 10 ⁸ viable cells in 1 g of the preparation for a maximum of 6 months and then the titer decreases significantly and, conversely, the titer of fungi and yeasts increases, which is not desirable.

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Podstata způsobu kultivace bakterií rodu Rhizobium a Azotobacter na rašelinovém substrátu spočívá podle vynálezu v tom, že se uvedené bakterie zaočkovávají do hermeticky uzavřeného rašelinového substrátu, který byl sterilizován ionizujícím zářením v dávce 20 až 50 kGy.The essence of the method for culturing Rhizobium and Azotobacter bacteria on a peat substrate according to the invention consists in inoculating said bacteria into a hermetically sealed peat substrate which has been sterilized by ionizing radiation at a dose of 20 to 50 kGy.

Způsobem podle vynálezu je přírodní rašelina smíchána s mletým vápencem v takovém poměru, aby výsledná hodnota pH byla v rozmezí 6,2 až 6,9. Po přidání fosforu, draslíku a stopových prvků se rašelina suší v sušárně na konečný obsah vody max. 10 % hmotnosti. Usušená rašelina se mele a prosévá, aby se zbavila zbytků dřeva a hrubších zrn a současně se na sítech třídí tak, aby alespoň 70 % částic mělo velikost menší než 60 μm. Vytříděná rašelina se mísí s tuhou a v míchačce se zvlhčuje na obsah vody 20 až 25 % hmotnosti. Takto připravený substrát je pak sterilizován ionizujícím zářením, tj. gama zářením, nebo urychlenými elektrony a sterilizace probíhá za teploty 20 až 25 °C. Sterilizující dávky se pohybují v rozmezí 25 až 50 kGy v závislosti na počátečním počtu zárodků plísní, aktinomycet a kvasinek. Rašelina je sterilována přímo v zatavených sáčcích z polyethylenu a po ozáření je dosaženo úplné sterility, kterou lze udržet v hermeticky uzavřeném sáčku po 18 měsíců beze změny. Na rozdíl odIn the process according to the invention, the natural peat is mixed with the ground limestone in such a ratio that the resulting pH value is in the range of 6.2 to 6.9. After the addition of phosphorus, potassium and trace elements, the peat is dried in an oven to a final water content of max. 10% by weight. The dried peat is ground and sieved to remove wood residues and coarser grains and at the same time sieved so that at least 70% of the particles have a size of less than 60 μm. The sorted peat is mixed with solids and moistened in a mixer to a water content of 20 to 25% by weight. The substrate thus prepared is then sterilized by ionizing radiation, i.e. gamma radiation, or accelerated electrons, and sterilization takes place at a temperature of 20 to 25 ° C. Sterilizing doses range from 25 to 50 kGy depending on the initial number of fungal, actinomycete and yeast germs. The peat is sterilized directly in sealed polyethylene bags and after irradiation complete sterility is achieved, which can be maintained in a hermetically sealed bag for 18 months without change. Unlike

tepelné sterilizace neobsahuje substrát ani jiné cizí látky, např. toxické produkty pyrolýzy rašeliny. Zaočkování tekutou kulturou se provádí propíchnutím sáčku sterilní dutou jehlou a napuštěním kultury do substrátu. Díky nepřítomnosti konkurenčních mikroorganizmů a toxických pyrolýzních produktů se dosahuje počtu vypěstovaných bakterií např. Rhizobium Meliloti D 41*7 nad hodnotu 10⁹ v 1 g přípravku.heat sterilization does not contain substrate or other foreign substances, eg toxic products of peat pyrolysis. Inoculation with liquid culture is performed by piercing the bag with a sterile hollow needle and impregnating the culture into the substrate. Due to the absence of competing microorganisms and toxic pyrolysis products, the number of bacteria grown, eg Rhizobium Meliloti D 41 * 7, exceeds 10 ⁹ in 1 g of the preparation.

Kontrola přípravku po 16ti měsících od data výroby zjistila 1,51 x 10¹² živých buněk rhizobií v 1 g přípravku (Rhizobium Meliloti D 417).Inspection of the formulation 16 months after the date of manufacture revealed 1.51 x 10 ¹² viable rhizobia cells per gram of formulation (Rhizobium Meliloti D 417).

Podobných výsledků bylo dosaženo i pro ostatní kultury, tj. hrách, pelušku, vikev, bob a jetel.Similar results were obtained for other cultures, ie peas, crayfish, vetch, beans and clover.

Po zaočkování nosného substrátu kulturou Azotobactera kmenem A 27 bylo při kontrole po 14ti měsících od data výroby zjištěno 1,32 x 10⁹ živých buněk Azotobactera v 1 g přípravku.After inoculation of the carrier substrate with a culture of Azotobactera strain A 27, a control after 14 months from the date of production revealed 1.32 x 10 ⁹ live Azotobactera cells in 1 g of the preparation.

Způsobem podle vynálezu probíhá kultivace mikroorganizmů na zcela sterilním rašelinovém substrátu, připraveném radiační sterilizací.According to the method of the invention, the microorganisms are cultured on a completely sterile peat substrate prepared by radiation sterilization.

Příklady provedení vynálezuExamples of embodiments of the invention

Příklad 1 kg vytříděné rašeliny o hodnotě pH 6,2 a počáteční vlhkosti 7 % kg tuhy se smíchá a přidá se 15 1 vody.Example 1 kg of sorted peat with a pH value of 6.2 and an initial moisture content of 7% kg of graphite is mixed and 15 l of water are added.

Uvedená směs se plní do 100 polyethylenových sáčků o síle folie 0,10 mm, zataví a radiačně sterilizuje dávkou záření 25 kGy. Takto připravený substrát se inokuluje tekutou kulturou Rhizobium Meliloti D 417 v množství 300 ml/1 sáček o titru minimálně 10¹⁰ živých buněk v 1 ml. Kultivace probíhá při teplotě 20 až 25 °C po dobu 10 dnů. Po namátkové kontrole, kdy se ověří očekávaná výše titru min. 10⁹ živých buněk v 1 g přípravku, se hotový přípravek do roka použije. Bylo ověřeno, že u takto připraveného přípravku ani po 18 měsících skladování neklesne titr bakterií řádově pod 10⁹ živých buněk v 1 g přípravku.The mixture is filled into 100 polyethylene bags with a film thickness of 0.10 mm, sealed and radiation sterilized with a radiation dose of 25 kGy. The substrate thus prepared is inoculated with a liquid culture of Rhizobium Meliloti D 417 in an amount of 300 ml / 1 bag with a titer of at least 10 ¹⁰ viable cells in 1 ml. Cultivation takes place at a temperature of 20 to 25 ° C for 10 days. After a random check, when the expected amount of the titer of min. 10 ⁹ live cells in 1 g of the preparation, the finished preparation is used within a year. It was verified that in the preparation thus prepared, even after 18 months of storage, the titer of bacteria did not fall below the order of 10 ⁹ viable cells in 1 g of the preparation.

Příklad 2Example 2

Podle postupu v příkladu 1 se připravily sáčky se substrátem, který byl jednotlivě zaočkován těmito tekutými kulturami:Following the procedure of Example 1, bags were prepared with a substrate that was individually inoculated with the following liquid cultures:

Rhizobium Trifolii Rhizobium Trifolii D 15 , D 20 , D 544 D 15, D 20, D 544 , T 16 , T 16 Leguminosarum Leguminosarum D 560 , D 564 , T 97 D 560, D 564, T 97 , T 117 , T 117 D 28 , E 23 , N 30 D 28, E 23, N 30 , T 79 , T 79 Japonicum Lupini Japonicum Lupini D 538 , D 344 , D 536 D 75 , D 51 , D 52 D 538, D 344, D 536 D 75, D 51, D 52 , D 563 , D 563 Meliloti Azotobacter kmen Meliloti Azotobacter strain D 469 , D 470 , D 472 A 27 , A 33 , A 36 D 469, D 470, D 472 A 27, A 33, A 36 , D 557 , D 557

Všechny použité kultury mikroorganizmů jsou uloženy ve sbírce ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby v Praze - Ruzyni.All used cultures of microorganisms are stored in the collection at the Research Institute of Plant Production in Prague - Ruzyně.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Způsob kultivace hlízkových bakterií rodu Rhizobium a Azotobacter na radiačně sterilizovaném substrátu umožňuje sterilní inokulaci každé dávky očkovací látky, při dosažení titru pěstovaných bakterií řádově nad 10⁹ živých buněk v 1 g přípravku a udržení tohoto titru po dobu více než 12 měsíců.A method of culturing bacteria of the genus Rhizobium hlízkových Azotobacter and sterilized by irradiation on a substrate which allows sterile inoculation of each vaccine dose, when reaching a titre of bacteria grown on the order of 10 ⁹ live cells per 1 g of the titre and maintain for more than 12 months.

Claims

PATENT CLAIMS

A method of culturing Rhizobium and Azotobacter bacteria on a peat substrate, characterized in that said bacteria are inoculated into a hermetically sealed peat substrate which has been sterilized by ionizing radiation at a dose of 20 to 50 kGy.