CS276972B6 - Peptides, process of their preparation and pharmaceutical containing thereof - Google Patents
Peptides, process of their preparation and pharmaceutical containing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CS276972B6 CS276972B6 CS846901A CS690184A CS276972B6 CS 276972 B6 CS276972 B6 CS 276972B6 CS 846901 A CS846901 A CS 846901A CS 690184 A CS690184 A CS 690184A CS 276972 B6 CS276972 B6 CS 276972B6
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- arg
- leu
- glu
- gln
- ala
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 124
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- -1 Asp Chemical compound 0.000 claims abstract description 30
- ROHFNLRQFUQHCH-RXMQYKEDSA-N D-leucine Chemical group CC(C)C[C@@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims abstract description 30
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Chemical group OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims abstract description 13
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical group C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 8
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims abstract description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-Serine Chemical group OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 4
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 claims abstract 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 69
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 69
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 65
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 24
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 19
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 12
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims description 3
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 125000001145 hydrido group Chemical group *[H] 0.000 claims description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N Arg-Gln Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims 1
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- MFJAPSYJQJCQDN-BQBZGAKWSA-N Gln-Gly-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFJAPSYJQJCQDN-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims 1
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- JYOAXOMPIXKMKK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 claims 1
- RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 claims 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 claims 1
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 claims 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 claims 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract description 8
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 abstract description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N D-Asparagine Chemical group OC(=O)[C@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N 0.000 abstract description 3
- SGCGMORCWLEJNZ-UWVGGRQHSA-N His-His Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C([O-])=O)C1=CN=CN1 SGCGMORCWLEJNZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 abstract description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N D-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N 0.000 abstract 1
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 abstract 1
- 102220067365 rs143592561 Human genes 0.000 abstract 1
- 102220012898 rs397516346 Human genes 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 34
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 22
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 22
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical group CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 18
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- SCIFESDRCALIIM-VIFPVBQESA-N N-methyl-L-phenylalanine Chemical compound C[NH2+][C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 SCIFESDRCALIIM-VIFPVBQESA-N 0.000 description 8
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 101000825738 Rattus norvegicus Somatoliberin Proteins 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 229940073584 methylene chloride Drugs 0.000 description 5
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- XJODGRWDFZVTKW-LURJTMIESA-N (2s)-4-methyl-2-(methylamino)pentanoic acid Chemical compound CN[C@H](C(O)=O)CC(C)C XJODGRWDFZVTKW-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanoic acid Chemical compound CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 3
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 3
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- UHUSDOQQWJGJQS-UHFFFAOYSA-N glycerol 1,2-dioctadecanoate Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC UHUSDOQQWJGJQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 108010036509 somatotropin releasing factor 40 Proteins 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical class OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N di-isopropyl sulphide Natural products CC(C)SC(C)C XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylethane Chemical compound CCSC WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N (2s)-5-[amino-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- NXJOFTRBTBDSHB-UHFFFAOYSA-N (4-methyl-1,4-diazepane-1-carbothioyl)sulfanyl 4-methyl-1,4-diazepane-1-carbodithioate Chemical compound C1CN(C)CCCN1C(=S)SSC(=S)N1CCN(C)CCC1 NXJOFTRBTBDSHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIGWMJHCCYYCSF-QMMMGPOBSA-N 4-chloro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 NIGWMJHCCYYCSF-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229910018509 Al—N Inorganic materials 0.000 description 1
- NNMUHYLAYUSTTN-FXQIFTODSA-N Asn-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O NNMUHYLAYUSTTN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 125000006847 BOC protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 125000002237 D-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)[C@]([H])(N([H])[H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000296 D-methionine group Chemical group [H]N([H])[C@@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])SC([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002849 D-tyrosine group Chemical group [H]N([H])[C@@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical class OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical class Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 102000006877 Pituitary Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010047386 Pituitary Hormones Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Chemical class [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000270666 Testudines Species 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CNC=N1 Chemical group [N].C1=CNC=N1 GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001558 benzoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;triethylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.CCN(CC)CC UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003754 ethoxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC)* 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- 150000002688 maleic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical compound [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- ORNDKVCWLUZAQL-FOWIMTFFSA-N rgrf 43 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CN=CN1 ORNDKVCWLUZAQL-FOWIMTFFSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Chemical class 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Peptidy, způsob jejich výroby a farmaceutické prostředky s jejich obsahem Oblast vynálezu
Vynález se týká peptidů, které ovlivňují funkci hypofýzy u lidí i jiných živočichů. Jde zvláště o peptidy, které podporují uvolnění růstového hormonu z hypofýzy. Vynález se také týká způsobu výroby těchto peptidů a farmaceutických prostředků s jejich obsahem.
Dosavadní stav techniky
Fysiologové dlouho věděli, že hypothalamus řídí sekreční funkci adenohypofýzy tak, že produkuje zvláštní látky, které podporují nebo brzdí vyměšování jednotlivých hormonů hypofýzy. V roce 1982 byl izolován z extraktů nádoru lidské slinivky břišní faktor, který uvolňuje růstový hormon (hpGRF), tato látka byla čištěna, charakterizována, syntetizována a vyzkoušena a bylo prokázáno, že podporuje uvolňování růstového hormonu hypofýzou. Mimoto byly syntetizovány a charakterizovány také další obdobné faktory, a to krysí faktor, uvolňující růstový hormon (rGRF) a odpovídající faktor z vepře (pGRF).
Nyní byly syntetizovány nové polypeptidy, které uvolňují růstový hormon z baněk hypofýzy, pěstovaných v tkáňové kultuře, tyto peptidy alespoň částečně odolávají rozkladu enzymu v živočišném organismu. Uvedené peptidy splňují alespoň jeden z následujících požadavků:
a) zbytek v poloze 1 je substituován bud způsobem Nal^aMe, nebo Cal^aMe,
b) D-Leu je v poloze 17 a/nebo v poloze 23 a/nebo
c) D-Glu nebo D-Asp se nachází v poloze 25.
Peptidy mohou splňovat větší počet těchto požadavků, musí však splňovat alespoň jeden z nich. Zbytkem v poloze 1 může být Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His a D-His (tento zbytek může nést methylovou skupinu bud v poloze alfa na uhlíkovém atomu, nebo na alfa-aminoskupině). Peptidy obvykle obsahují D-Alfa v poloze 2 a/nebo D-Asp v poloze 3 a/nebo D-Arg nebo D-Sex v poloze 8 a/nebo D-Tyr v poloze 10 a/nebo D-Alfa v poloze
15. Peptidy s výhodou jsou substituovány také skupinami D-Met, Nle nebo Nve místo Met v poloze 27.
Farmaceutické prostředky mohou obsahovat analogy, vyrobené způsobem podle vynálezu o délce 28 až 44 zbytků aminokyselin nebo netoxické soli těchto zbytků ve formě disperze v kapalině, přijatelné z farmaceutického nebo veterinárního hlediska nebo v pevném nosiči. Takto získaný prostředek je možno použít v klinickém lékařství, a to v lidském a veterinárním lékařství k léčebným účelům a také k účelům diagnostickým. Sloučeniny je možno užít k urychlení růstu teplokrevných živočichů včetně drůbeže a v zemědělství i k urychlení růstu studenokrevných živočichů, například ryb a podobně.
Nomenklatura pro nové peptidy byla užita podle publikace Schroder a Lubke The Peptides, Academie Press (1965) tak, že v souladu s běžným názvoslovím se aminoskupina na N-terminálním zakončení nachází na levé straně a karboxylová skupina na C-terminálním zakončení se nachází na pravé straně. U přírodních aminokyselin se rozumí těmito kyselinami přirozeně se vyskytující látky, které se nacházejí v bílkovinách, a to Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Nle znamená norleucin a Nva znamená norvalin. V případě, že zbytek aminokyseliny má isomerní formy, rozumí se vždy L-forma, není-li výslovně uvedeno jinak.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou peptidy obecného vzorce I RlR2’R3“Ala”Ile”Rhe“Thr”R8~Ser“R10Ar^R12“R13“Leu“R15‘’Gln“R17” Rig-Ala-Arg-Lys-LeU“R23R24R25“Ile“R27R28“Arg_Gln“Gln'*G1Y“Glu·Rg 4 —Asn—Gin—Glu—R3 θ -R3 g “^4 o Arg—R4 2 “^4 3 “^4 4 (I) kde
| R1 | znamená Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His nebo | ||||
| D-His, při substituci bez substituce, | typu | calfaMe nebo | NalfaMe | nebo | |
| R2 | znamená Ala nebo D-Ala, | ||||
| R3 | znamená Asp nebo D-Asp, | ||||
| Rg | znamená Ser, Asn, D-Ser, | nebo | D-Asn, | ||
| R10 | znamená Tyr nebo D-Tyr, | ||||
| R12 | znamená Arg nebo Lys, | ||||
| R13 | znamená Ile nebo Val, | ||||
| R15 | znamená Gly nebo D-Alfa, | ||||
| R17 | znamená Leu nebo D-Leu, | ||||
| R18 | znamená Tyr nebo Ser, | ||||
| R23 | znamená Leu nebo D-Leu, | ||||
| R24 | znamená His nebo Gin, | ||||
| R25 | znamená Glu, Asp, D-Glu | nebo | D-Asp, | ||
| R27 | znamená Met, D-Met, Ala, | Nle, | Ile, Leu, Nva nebo Val, |
| R28 | znamená | Asn | nebo | Ser, |
| R34 | znamená | Arg | nebo | Ser, |
| R38 | znamená | Gin | nebo Arg, | |
| R39 | znamená | Arg | nebo | Gly, |
| R40 | znamená | Ser | nebo | Ala, |
| R42 | znamená | Phe | , Ala | nebo Val |
| R43 | znamená | Asn | nebo | Arg, |
| R44 | znamená | Val | nebo | Leu, |
za předpokladu, že buď
a) R-j. má substituci typu Cal^aMe, nebo Nal^aMe nebo
b) R17 a/nebo R23 znamená D-Leu nebo
c) R25 znamená D-Glu nebo D-Asp, přičemž navíc je možno vynechat některý ze zbytků R44!
R43R44' R42-R43~R44'
Arg-R42-R4 3-^44/
R40“Arg“R42“R43“R44z R39“R40Arg R42™R43”R44' R3 8“R39”R4 0”Ar9”R42”R4 3~R4 4'
Glu-R3g-R39“R4Q-Arg-R42-R43-R44,
Gln-Glu-R3g“R3 9R4 o-Arg-R4 2-R4 3-R4 4,
Asn—Gln-Glu-R3θ-R3 g-R4 θ-Arg-R4 2-R4 3-R4 4, R3 4“Asn-Gln-GlU”R3 θ“R3 9”R4 0“Ar1R42”R43“R44·
G1u-R3 4-Asn-Gln-Glu-R3 g-R3 g-R4Q-Arg-R4 2~R4 3“R44,
Gly-Glu-R3 4-Asn-Gln-Glu-R3 8-R3 g-R4 0-Arg-R4 2-R43“R44, Gln-Gly-Glu-R3 4-Asn-Gln-Glu-R3 g-R3 g-R4 θ-Arg-R4 2~R4 3-R4 4, Gln-Gln-Gly-Glu-R3 4-Asn-Gln-Glu-R3 8-R3g-R4 Q-Arg-R4 2-R43-R4 4·
Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby těchto peptidů, který spočívá v tom, že se
i) naváže N-terminální aminokyselina, chráněná terc.butoxykarbonylovou skupinou na -NH- benzhydrylaminové pryskyřici nebo se ii) ochranná terč. butoxykarbonylová skupina odštěpí a postupně se naváží jednotlivé aminokyseliny v množství 1 až 2 mmoly aminokyseliny, chráněné terč. butoxykarbonylovou skupinou, na 1 gram pryskyřice v methylenchloridu, dimethylformamidu nebo ve směsi těchto rozpouštědel za vzniku sloučeniny obecného vzorce II s alespoň jednou ochrannou skupinou
XlmRL(X nebo X2-R2-R3(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(R4)-R8(X4 nebo X5)-Ser(X4)-R10(X2)-Arg(X6)-R12(X6 nebo X7)-R13-Leu-R15-Gln(X5)“r17r18(χ2)”Ala’Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-R23-R24-(X nebo X5)-R25(X3)-Ile-R27-R2g(X4 nebo X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 nebo X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R3g(X5 nebo X6)-R39(X6)-R40(X4)-Arg(X6)-R42-R43(X5 nebo X6)-R44-NH-pryskyřice, (II) kde
X1 znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na <<-aminoskupině,
| X2 | znamená atom vodíku hydroskupině Tyr, | nebo | ochrannou skupinu | na fenolové |
| X3 | znamená atom vodíku skupině Asp nebo Glu, | nebo | ochrannou skupinu na karboxylové | |
| X4 | znamená atom vodíku hydroskupině Thr, | nebo | ochrannou skupinu | na alkoholové |
| X5 | znamená atom vodíku hydroskupině Ser, | nebo | ochrannou skupinu | na alkoholové |
| X6 | znamená atom vodíku | nebo | ochrannou skupinu na guanidinové |
skupině Arg,
X7 znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na aminoskupině Lys postranního řetězce,
X znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na dusíkovém atomu imidazolové skupiny His, iii) odštěpí se ochranná skupina nebo ochranné skupiny za sloučeniny obecného vzorce II za vzniku peptidu obecného vzorce I nebo jeho biologicky aktivního fragmentu a popřípadě se iv) převede výsledný peptid na svou netoxickou adiční sůl.
Dále budou probrány možné a výhodné významy jednotlivých ochranných skupin.
X1 znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na <X -aminoskupině. Běží o ochranné skupiny, které se běžně užívají při postupné syntéze polypeptidů. Ochranné skupiny ve významu X1 je možno zařadit do několika skupin, a to
1) aromatické ochranné skupiny typu urethanu, například fluorenylmethyloxykarbonyl (FMOC), benzyloxykarbonyl (Z) a substituované Z, například p-chlorbenzyloxykarbonyl,p-nitrotrobenzyloxykarbonyl, p-brombenzyloxykarbonyl a p-methoxybenzyloxykarbonyl,
2) ochranné skupiny typu alifatického urethanu, například terb. butyloxykarbonyl (BOC), diisopropylmethyloxykarbonyl,isopropyloxykarbonyl, ethoxykarbonyl, allyloxykarbonyl a
3) ochranné skupiny typu cykloalkylurethanu, například cyklopentyloxykarbonyl, adamantyloxykarbonyl a cyklohexyloxykarbonyl ·
Výhodnou ochrannou skupinou na -aminoskupině je BOC, a to i v případě, že v poloze 1 se užije N * Me-substituovaného zbytku. ·-X znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu pro imidazolový dusíkový atom aminokyseliny His, například Tos.
X2 je ochranná skupina pro fenolovou hydroxylovou skupinu Tyr, například tetrahydropyranyl, terč. butyl, trityl, Bzl, CBZ, 4br-CBZ a 2,6-dichlorbenzyl (DCB). Výhodnou ochrannou skupinou je 2,6-dichlorbenzyl, X2 může také zmamenat atom vodíku, což znamená, že se na zbytku aminokyseliny v této poloze nenachází žádná ochranná skupina.
X3 znamená atom vodíku nebo vhodná ochranná skupina,vytvářející ester s karboxylovou skupinou Asp nebo Glu, napříkad benzyl (OBzl), 2,6-dichlorbenzyl, methyl a ethyl.
X4 je vhodná ochranná skupina pro hydroxylovou skupinu Thr nebo Ser, například acetyl, benzoyl, terc.butyl, trityl, tetrabvdropyranyl, Bzl, 2,6-dichlorbenzyl a CBZ.Výhodnou ochrannou skupinou je Bzl. X4 může znamenat také atom vodíku, v tomto případě se na hydroxylové skupině nenachází žádná ochranná skupina.
X5 znamená atom vodíku nebo vhodnou ochrannou skupinu na postranním řetězci amidoskupiny Asn nebo Gin. S výhodou běží o xanthyl (Xan).
X6 znamená vhodnou ochrannou skupinu pro guanidinovou skupinu . Arg, například nitroskupinu, skupinu Tos, CBZ, adamantyloxykarbonyl a BOC, nebo znamená vodík atom vodíku.
X7 znamená vodík nebo vhodnou ochrannou skupinu pro aminoskupinu Lys. Vhodnou aminoskupinu chránící ochrannou skupinu je například 2-chlorbenzyloxykarbonyl (2-C1-Z), Tos, t-amyloxykarbonyl a BOC.
X8 znamená atom vodíku nebo vhodnou ochrannou skupinu na postranním řetězci ve svrchu uvedeném významu.
Met může být popřípadě chráněn atomem kyslíku, s výhodou však chráněn není.
Volba ochranných skupin pro postranní řetězec není kritická až na to, že je zapotřebí volit takovou skupinu, která není odstraněna v průběhu odstraňování ochranné skupiny na c< -aminoskupině při syntéze. Pro některé aminokyseliny, například His, není zapotřebí obvykle užít po ukončeném navázání ochrannou skupinu nebo může jít o tutéž ochrannou skupinu.
X9 znamená vhodnou ochrannou skupinu na C-terminální karboxylové skupině, například skupinu X3, tvořící ester nebo běží o zakotvující vazbu při syntéze na pevné fázi, sloužící k vazbě na pryskyřici jako pevnou podložku, nebo běží o des-X9, v tomto případě má zbytek na C-terminálním zakončení karboxylovou skupinu Y, jak již bylo uvedeno. V případě, že se užije jako pevná podložka pryskyřice, je i tato pryskyřice v širším smyslu uvažována jako ochranná skupina a vzniká tedy seskupení -O-CH^-pryskyřice jako podložka, -NH-benzhydrylamin (BHA) pryskyřice jako podložka nebo -NH-paramethylbenzhydrylamin (MBHA)-pryskyřice jako podložka.
V případě, že je požadován nesubstituovaný amid, je výhodné použití BHA nebo MBHA pryskyřice, protože odštěpením vzniká přímo amid. V případě, že je požadován N-methylamid, je možno jej získat z N-methyl BHA-pryskyřice. V případě, že jsou požadovány jiné substituované amidy nebo jiné skupiny než volná kyselina na C-terminálním zakončení, může být výhodné syntetizovat peptid klasickým způsobem tak, jak je popsáno v publikaci Houben-Weylově.
Ve vzorci meziproduktu je alespoň jedna skupina X ochranná skupina nebo skupina X9 zahrnuje pryskyřici jako podložku. Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat peptid tak, že se
a) vytvoří meziprodukt peptidu s alespoň jednou ochrannou skupinou obecného vzorce II:
X1-R1(X nebo X2)-R2-R3(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Rg(X4 nebo
X5)-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X6)-R12(X6 nebo X7)-R13-Leu-Gly-Gln (X5) -Rx 7 -R-j_ 8 (X2) -Ala-Arg (X6) -Lys (X7) -Leu-R2 3 -R2 5 (X nebo X5)-R25(X3)-Ile-R27-R23(X4 nebo X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 nebo X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R38(X5 nebo X6)-R39(X6)-R40(X4)-Arg-(X6)-R42-R43(X5 nebo X6)7
-r44(x8)-x9 kde X, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 a X8 znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu a X9 znamená ochrannou skupinu nebo zakotvující skupinu pro pryskyřici jako podložku nebo des-X9, v tomto případě je zbytkem na C-terminálním zakončení karboxylová skupina Y,
b) odštěpí se ochranná skupina, ochranné skupiny nebo zakotvující vazba peptidů obecného vzorce II a
c) popřípadě se převede výsledný peptid na některou ze svých netoxických solí.
Při volbě určité ochranné skupiny na postranním řetězci při syntéze peptidů je zapotřebí zachovávat následující všeobecná pravidla:
a) ochranná skupina si má uchovávat své ochranné vlastnosti a nemá být odštěpena při vazbě dalšího zbytku,
b) ochranná skupina má být stálá k užitým reakčnim činidlům a s výjimkou Xan s výhodou stálá za reakčních podmínek, zvolených pro odstranění ochranné skupiny na <x, -aminoskupině v každém stupni postupu a
c) postranní ochranné skupiny musí být možno odstranit po ukončení postupu za získání výsledného peptidů s obsahem požadovaného sledu aminokyselin tak, že v průběhu odstraňování nedojde k nežádoucím změnám v peptidovém řetězci.
V případě, že se peptidy nepřipravují technologií s použitím rekombinantní DNA, připravují se s výhodou při použití syntézy na pevné fázi, například způsobem podle publikace Merrifield, J. Am. CHem. Soc., 85, str. 2149 (1963), přestože je možno užít také dalších ekvivalentních chemických způsobů tak, jak byly svrchu uvedeny.
Syntéza na pevné fázi se začíná od C-terminálního zakončení peptidů tak, že se naváže chráněná o<-aminokyselina na vhodnou pryskyřici. Tento výchozí materiál je možno připravit tak, že se spojí chráněná -aminokyselina esterovou vazbou s chlormethylovanou pryskyřicí nebo hydroxymethylovanou pryskyřicí nebo amidovou vazbou na pryskyřici BHA nebo na pryskyřici MBHA. Výroba hydroxymethylované pryskyřice je popsána v publikaci Bodansky a další, CHem. Ind. (Londýn) 38, 1597-98 (1966). CHlormethylované pryskyřice se běžně dodávají (Bio Rad Laboratories, Richmond, California a Lab. Systems, lne.). Výroba pryskyřice tohoto typu je popsána v publikaci Stewart a další, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman a Co., San Francisco 1969, kapitola 1, strany 1 až 6. Pryskyřice BHA a MBHA se také běžně dodávají a obvykle se užívají pouze v tom případě, že požadovaný peptid má být syntetizován jako nesubstituovaný amid na C-terminálním zakončení.
C-terminální aminokyselina, tj. Asn, chráněná BOC a Xan, může být nejprve navázána na chlormethylovanou pryskyřici způsobem podle publikace Chemistry Letters, K. Horiki a další, 165 až 168 (1978), při použití KF v dimethylformamidu při teplotě 60°c po dobu 24 hodin za stálého míchání v případě, že má být získán peptid s 43 zbytky. Po navázání aminokyseliny, chráněné BOC na pryskyřici jako podložku, se odstraní ochranná skupina na -aminoskupině, například použitím kyseliny trifluoroctové (TFA) v methylenchloridu nebo samotné kyselině trifluoroctové. Odstranění ochranné skupiny se provádí při teplotě místnosti. K odštěpení je možno užít také jiných běžných činidel, například kyseliny chlorvodíkové v dioxanu, užívá se podmínek, specifických pro odstranění jednotlivých ochranných skupin na <*, -aminoskupině tak, jak byly popsány v publikaci Schroder a Lubke,The Peptides, 1, str. 72 až 75 (Academie Press 1965)·
Po odstranění ochranné skupiny na <X -aminoskupině se zbývající aminokyseliny, chráněné na -aminoskupině a na postranním řetězci postupně navazují v požadovaném sledu za vzniku svrchu uvedeného meziproduktu nebo je také možné postupovat tak, že se některé aminokyseliny naváží navzájem před přidáním celého kratšího řetězce k navázané části na pevné fázi. Volbu příslušného činidla může provést každý odborník. Zvláště vhodným reakčnim činidlem pro toto použití je N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (DCCI).
Aktivační činidlo, užívané při syntéze na pevné fázi, je možno volit z dobře známých činidel v chemii peptidů. Příkladem vhodných aktivačních reakčních činidel jsou karbodiimidy, například Ν,Ν'-diisopropylkarbodiimid a N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimid. Je možno užít také další aktivační reakční činidlo, tato činidla a jejich použití při vazbě peptidů byla popsána v publikaci Schroder a Lubke tak, jak byla svrchu uvedena, kapitola III a v publikaci Kapoor, J.Phar. Sci. 59 strany 1 až 27 (1970).
Každá chráněná aminokyselina nebo sled aminokyselin se přivádí k vazbě na pevnou fázi, ve čtyřnásobném nebo ještě větším přebytku, vazbu je možno provést v prostředí směsi dimethylformamidu a methylendichloridu v poměru 1 : 1 nebo v samotném dimethylformamidu nebo methylendichloridu. V případě, že dojde k neúplné vazbě, opakuje se postup před odstraněním ochranné skupiny na c<-aminoskupině a před navázáním následující aminoskupiny. Úspěch vazby v každém stupni syntézy, provádí-li se manuálně se s výhodou ověřuje, ninhydrinovou reakcí tak, jak byla popsána v publikaci E. Kaiser a další, Anal. Biochem. 34, 595 (1970). Vazbu je možno také provádět automaticky, například automatickým syntetizátorem (Beckman 990), způsob byl popsán v publikaci Rivier a další, Biopolymery, 1978, 17, strany 1927 až 1938.
Po získání úplného požadovaného sledu aminokyselin je možno peptid, získaný jako meziprodukt, odstranit z pryskyřice jako podložky působením činidla, například kapalného fluorovodíku, který nejen odštěpí peptid z pryskyřice, ale také odštěpí veškeré zbývající ochranné skupiny na postranním řetězci X, X2, X3, X4,
X5,X6, X7 a X8 a X8a X9 jako zakotvující vazbu, jakož i ochrannou skupinu X1 na o< -aminoskupině, v případě, že byla použita, čímž se získá výsledný peptid ve formě volné kyseliny. V případě že ve sledu se vyskytuje Met, odstraní se s výhodou nejprve ochranná skupina BOC použitím směsi kyseliny trifluoroctové a ethandithiolu před odštěpením peptidů z pryskyřice kyselinou fluorovodíkovou k vyloučení potenciální S-alkylace. V případě, že se k odštěpení užije fluorovodík, doplňuje se reakční směs anisolem a methylethysulfidem jako látkami, které na sebe váží vedlejší produkty.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady, které popisují výhodné způsoby provedení metody na pevné fázi za získání výsledného peptidů. Je samozřejmé, že syntéza odpovídajícího kratšího fragmentu peptidů se provádí stejným způsobem tak, že se prostě vynechají příslušné aminokyseliny, je však pravděpodobné, že biologicky aktivní fragmenty by měly obsahovat svrchu uvedený sled přiléhající k N-terminálnímu zakončení.
Příklad 1
Syntéza peptidů vzorce [N06 MeHis1]/rhGRF-(l-43)-0H, podrobněji vypsáno :
N^MeHis-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřici se substitucí přibližně 0,1 až 0,5 mmol/g pryskyřice. Navázání BOC-Asn(Xan) na pryskyřici se provádí způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Chemistry Letters při použití fluoridu draselného v dimethylformamidu při teplotě přibližně 60 °C po dobu 24 hodin za stálého míchání, výsledkem je substituce přibližně 0,35 mmol Asn na gram pryskyřice.
Po odstranění ochranných skupin a po neutralizaci se postupně buduje na pryskyřici peptidový řetězec. Odstranění ochranných skupin, neutralizace a přidání každé další aminokyseliny se provádí způsobem, který byl podrobně popsán v publikaci Rivier J. J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986 až 2992 (1974). Všechna použitá rozpouštědla se pečlivě zbaví plynů promytím inertním plynem, například heliem nebo dusíkem, aby byla jistá nepřítomnost kyslíku, při níž by mohlo dojít k nežádoucí oxidaci síry ve zbytku Met.
Odstranění ochranných skupin se s výhodou provádí podle následujícího schéma A.
Schéma A
Reakční činidla Doba míšení (min.)
1. 60 % kyselina trifluoroctová 10 s 2 % ethandithiolu
2. 60 % kyselina trifluoroctová 15 s 2 % ethandithiolu
3. IPA s 1 % etandithiolu 0,5
4. 10 % Et3N v methylendichloridu 0,5
| 5. methanol | 0,5 |
| 6. 10 % Et3N v methylendichloridu | 0,5 |
| 7. methanol (dvakrát) | 0,5 |
| 8. methylendichlorid (dvakrát) | 0,5 |
| Navázání dalších aminokyselin schématu B: | se provádí podle následujícího |
| Schéma B | |
| Reakční činidla | Doba míšení (min.) |
| 9. DCCI | .. - |
| 10. Boc-aminokyselina | 50 až 90 |
| 11. methanol (dvakrát) | 0,5 |
| 12. methylendichlorid (dvakrát) | 0,5 |
| 13. 3M Ac20 v methylendichloridu | 15,0 |
| 14. methylendichlorid | 0,5 |
| 15. methanol | 0,5 |
| 16. methylendichlorid (dvakrát) | 0,5 |
| Užívá se 1 až 2 mmol aminokyseliny, chráněné BOC-v methylen- | |
| chloridu na 1 g pryskyřice a | mimoto 1 ekvivalent 1,OM DCCI . Po navázání BOC-Arg (TOS) se |
| v methylenchloridu po dobu 2 hodin | |
| užije směs 50 % dimthylformamidu < | a 50 % methylenchloridu. Bzl ve |
formě etheru se užije jako ochranná skupina pro hydroxylovou skupinu postranního řetězce Ser a Thr. Amidoskupina Asn nebo Gin se chrání Xan v případě, že se užije dicyklohexylkarbodiimidu jako činidla pro vazbu. Je také možno užít P-nitrofenylester (ONp) k aktivaci karboxylového zakončení Asn nebo Gin, a například je možno přes noc navázat BOC-ASn (ONp) při použití jednoho ekvivalentu HOBt v 50 % směsi dimethylformamidu a methylenchloridu v tomto případě není zapotřebí přidávat dicyklohexykarbodiimid. 2-chlorbenzyloxykarbonyl (2C1-Z) se užije jako ochranná skupina pro postranní řetězec Lys. TOS se užije k ochraně guanidinové skupiny Arg a k ochraně dusíkového atomu imidazolového zbytku His a karboxylová skupina postranního řetězce Glu nebo Asp se chrání OBzl. Fenolová hydroxylové skupina Tyr se chrání 2,6-dichlorbenzylovou skupinou (DCB). Na konci syntézy se získá následující sloučenina:
BOC-N * MeHis(X)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Ser(X4)-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Arg(X6)-Ile-Leu-Gly-Gln(X5)-Leu-Tyr(X2)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-His(X)-Glu(X3)-Ile-Met-Asn(X5)-Arg(X6)11
-Gin(X5)-Gin(X5)-Gly-Glu(X3)-Arg(X6)-Asn(X5)-Gin(X5)-Glu(X3) -Gin(X5)-Arg(X6)-Ser(X4)-Arg(X6)-Phe-Asn(X5)-X9 kde
X'
X'
X'
Xznamená znamená znamená znamená znamená znamená znamená znamená
Tos,
DCB
Obzl,
BZl,
Xan,
Tos
2C1-Z a
-O-CH2-pryskyřice jako podložka.
Xan je možno částečně nebo úplně odstranit působením kyseliny trifluoroctové, která se užije k odstranění ochranné skupiny na c<. -aminoskupině.
K odštěpení peptidu z pryskyřice a k odstranění ochranných skupin se užije směsi 1,5 ml anisolu, 0,5 ml methylethylsulfidu a 15 ml kyseliny fluorovodíkové na 1 g komplexu peptidu a pryskyřice při teplotě -20 °C po dobu 1/2 hodiny a potom při teplotě 0 °C 1/2 hodiny. Po odstranění fluorovodíku ve vysokém vakuu se zbytek pryskyřice a peptidu promývá střídavě bezvodým diethyletherem a chloroformem a potom se peptid extrahuje 2N vodným roztokem kyseliny octové, zbaveným plynů a oddělí se od pryskyřice filtrací.
Odštěpený peptid, zbavený ochranných skupin se potom rozpustí v O až 5 % kyselině octové a čistí se například filtrací na gelu Sephadex G-50.
Potom se peptid dále čistí preparativní nebo semi-preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografii způsobem podle publikace Rvivier a další, Peptides: Structure and Biological Function (1979), strany 125 až 128 a Marki a další, J. Am. CHem. Soc. 103, 3178 (1981). Sloupce (Waters Associates prep LC-500) se plní 15 až 20 C18-kysličníkem křemičitým (Vydac 300A). Gradient CH3CN v TEAP se vytvoří přístrojem (Eldex) tak, jak bylo popsáno v publikaci Rivier J., J. Lig. CHromatography 1, 343-367 (1978). CHromatografické frakce se pečlivě sledují vysokotlakou kapalinovou chromatografii a spojují se pouze frakce s dostatečnou čistotou. Odstranění solí z čištěných frakcí se dosahuje použitím gradientu CH3CN v 0,1 % kyselině trifluoroctové. Střední část se potom lyofilizuje, čímž se získá požadovaný peptid, jehož čistota může být vyšší než 98 %.
Syntéza se opakuje při použití pryskyřice MBHA, čímž se získá stejný peptid s amidovaným C-terminálním zakončením, postupuje se způsobem, popsaným v publikaci Vale a další, US patentový spis č. 4 292 313, čímž se naváže Asn na pryskyřici MBHA.
Příklad 2
Syntéza peptidů o 40 zbytcích o vzorci H-C* MeHis-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-GLy-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Scer-NHg se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidu (Beckman 990) a pryskyřice MBHA způsobem který byl obecně popsán Valem a dalšími v US patentovém spisu č. 4 292 313. Při provádění chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografii bylo prokázáno, že se získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 3
Syntéza analogu rhGRF, to jest:
[N^ Me-Met1,Leu27]~rhGRF(l-43)“OH vzorce
N* MeMet-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) a chlormethylované pryskyřice způsobem, který byl obecně popsán v příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 4
Syntéza fragmentu analogu hpGRF, tj.
[C MePhe(4Cl)1]-hpGRF(1-32)-NH2 vzorce
H-C MePhe(4C1)-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie je tento analog v podstatě čistý.
Syntéza se ještě dvakrát opakuje, čímž je možno získat [4Cl-Phe1]-hpGRF(l-32)-NH2 a [N *· MePhe1]/hpGRF(1-32)-NH2.
Příklad 5
Syntéza fragmentu analogu hpGRF, tj. [N 06 MeTyr1]-hpGRF(1-29)-NH2 vzorce:
N MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-N^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem podle příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatograf ie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 6
Syntéza fragmentu rhGRF, tj.
[N 06 MePhe1]-rhGRF(l-29)-NH2 vzorce:
N 06 MePhe-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem podle příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 7
Syntéza [Ν'* MeLeu1,Ile27]-hpGRF(l-32)-NH2 vzorce:
N 06 MeLeu-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) a pryskyřice MBHA způsobem podle příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 8
Syntéza fragmentu analogu rhGRF,tj.
[C* Me(4Cl)1]-rhGRF(l-29)-NH2 vzorce:
H-C MePhe(4C1)-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-nh2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 9
Syntéza fragmentu analogu rhGRF,tj.
[N00 MeTyr1]-rhGRF(1-29)-NH2 vzorce:
H-N ** MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-LeU”Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) a pryskyřice MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 10
Syntéza [C^ MeLeu1]-rhGRF-[Val44-NH2] vzorce:
H-C MeLeu-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Val-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 11 - ,
Syntéza peptidu [Ν’* MeTyr1, D-Le23]-rGRF(l-43)-OH vzorce:
N 06 MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřici se substitucí přibližně 0,1 až 0,5 mmol/g pryskyřice způsobem, popsaným v příkladu 1.
Na konci syntézy se získá sloučenina vzorce:
BOC-N 06 MeTyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Ser(x4) -Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Arg(X6)-Ile-Leu-Gly-Gln(X5)-Leu-Tyr(X 2) —
-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-D-Leu-His(X)-Glu(X3)Ile-Met-Asn(X5)-Arg(X6)Gin(X5)-Gin(X5)-Gly-Glu(X3)-Arg(X6)-Asn(X5)-Gin(X5)-Glu(X3)-Gin(X5)-Arg(X6)-Ser-(X4)-Arg(X6)-Phe-Asn(X5)-X9 kde znamená DCB,
| X3 | znamená OBzl, |
| X4 | znamená Bzl, |
| X5 | znamená Xan, |
| X6 | znamená Tos, |
| X7 | 2C1-Z a |
| X9 | znamená -Ó-CH2-pryskyřice jako podložka. |
ochranných skupin Z čištěných frakXan je možno částečně nebo úplně odstranit kyselinou trifluoroctovou, která se užije k odstranění ochranné skupiny z <*> -aminoskupiny.
Chráněný peptíd se odštěpí, zbaví se a čistí se obdobným způsobem jako v příkladu 1.
cí je možno odstranit soli použitím gradientu CH^CN v 0,1 % kyselině trifluoroctové. Střední část se potom lyofilizuje, čímž se získá výsledný peptíd, jehož čistota je vyšší než 98 %.
Syntéza se opakuje při použití pryskyřice MBHA, čímž se získá stejný peptíd s amidovaným C-terminálním zakončením způsobem, který byl obecně popsán Valem a dalšími v US patentovém spisu 4 292 313 pro navázání Asn na pryskyřici MBHA.
Příklad 12
Syntéza amidového peptidů o 40 zbytcích [C0^ MeHis1, D-Leu23]-hpGRF(1-40)-NH2 vzorce:
H-C MeHis-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným Valem a dalšími v US patentovém spisu 4 292 313. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptíd.
Příklad 13
Syntéza [N Me-Met1, D-Leu23,Nle27]-rGRF-(1-43)-OH vzorce:
N MeMet-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřici způsobem, který byl popsán v příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptíd.
Příklad 14 v
Syntéza fragmentu analogu, t j. [D-Leu23]-hpGRF(1-32)-NH2 vzorce:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln
-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý analog.
Uvedený způsob se ještě dvakrát opakuje, čímž se získá [D-Leu23,D-Glu25]-hpGRF(1-32)-NH2 a [D-Leu23,Nle27]-hpGRF(1-32)-nh2.
Příklad 15
Syntéza fragmentu analogu hpGRF, tj.
[D-Leu23,D-Asp25,Nle27]/hpGRF(1-29)-NH2 vzorce:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-D-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 16
Syntéza [D-Leu23,Nle-27]-rGRF(1-29)-NH2 vzorce:
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly“Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladů 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Syntéza se opakuje, čímž se získá [D-Leu17.Nle27]-rGRF(1-29)-NH2.
Příklad 17
Syntéza [D-Glu25,Nle27]-hpGRF(1-29)-NH2 vzorce:
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-D-Glu-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké chromatograf ie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 18
Syntéza [D-Glu25,Nle27]-rGRF(l-29)-NH2 vzorce:
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-IXe-Leu-GXy-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-N^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 19
Syntéza [D-Tyr1, D-Leu23]pGRF(l-44)-NH2 vzorce:
H-D-Tyr-AXa-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-GlyGln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Xle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln“Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Árg-LeU-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, obecně popsaným Valem a dalšími v US patentovém spisu č.4 292 313. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 20
Syntéza [D-His1, D-Leu17'23,D-Glu25,Nle27]-rGRF(1-43)-OH vzorce:
H-D-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-The-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-GlyD-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-D-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřici způsobem, který byl popsán v příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 21
Syntéza [D-Ala2, D-Leu17'23,D-Asp25]-hpGRF(1-32)-NH2 vzorce:
H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-D-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-D-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý analog.
Příklad 22
Syntéza [D-Tyr1,D-Ala2,D-Asp3,D-Asn8,D-Tyr10,D-Ala15,
D-Leu17'23,D-Asp25,D-Met27]-hpGRF-(1-29)-NH2 vzorce:
H-D-Tyr-D-Ala-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-ValLeu-D-Ala-Gln-D-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-D-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) a pryskyřice MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý analog.
Příklad 23
Syntéza [D-His1,D-Ser8,D-Leu23,Nle27]-rGRF(1-43)-OH vzorce:
H-D-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřici způsobem, popsaným v příkladu
1. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 24
Syntéza fragmentu analogu rGRF, tj. „ [N o6MeTyr1,D-Glu25-rhGRF(l-29)-NH2 vzorce:
N MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-nh2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBH způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 25
Syntéza [C00 MeLeu1,D-Leu23,D-GLu25,Nle27]-rGRF-[Val44]-Nh2 vzorce:
H-C MeLeu-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-D-Glu-Ilě-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn“Val-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle chromatografie na tenké vrstvě a podle vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Různé syntetické peptidy připravené způsobem podle jednotlivých příkladů byly srovnány se syntetickým hpGRF (1-40)-OH in vitro a bylo prokázáno, že všechny něly větší schopnost podporovat sekreci růstového hormonu a další podobné účinky.
Aby bylo možno stanovit účinnost některých syntetických peptidů na uvolňování růstového hormonu, byly prováděny pokusy in vitro při použití syntetického hpGRF(1-40)-OH jako standardu a ekvimolámích koncentrací různých jiných analogů a fragmentů. Byly užity kultury krysích hypofyzílních buněk ze žláz, odebraných před 3 až 5 dny. Kultury, které byly pro toto sledování optimální, byly užity pro srovnávací zkoušky způsobem, popsaným v publikaci Vale a další, Endocrinology,91, 562-572 (1972) a ještě podrobněji v publikaci Vale a další, Endocrinology (1983) v tisku. Inkubace se sledovanými látkami se provádí 3 áž 4 hodiny, potom se odeberou podíly živného prostředí a zpracovávají se tak, že se měří obsah imunoreaktivního růstového hormonu (ir GH) běžnou radioimunologickou zkouškou s použitím destiček.
Výsledky tohoto srovnání pro ekvimolární koncentrace jsou uvedeny χ následující tabulce I.
Tabulka I
Peptid srovnání v %
| hpGRF(1-40)-OH | |
| (standard) | 100 |
| [D“Glu25,Nle27]-rGRF(1-29)-NH2 | 125 |
| [D-Leu23,Nle27]-rGRF(1-29)-NH2 | 160 |
| [D-Leu17,Nle27]-rGRF(1-29)-NH2 | 138 |
| [N Me Phe1(4Cl)]-hpGRF(1-32)-NH2 | 12 |
| [C Me Phe1(4C1)]-hpGRF(1-32)-NH2 | 4 |
| [401-Phe1]hpGRF(1-32)-NH2 | 2 |
In vitro pokusy s těmito syntetickými peptidy ukazují, že každý z nich má plnou biologickou účinnost hpGRF(1-40)-OH-. Maximální účinná koncentrace pro [D-Leu23, Nle27]-hpGRF(1-29)-NH2 je
CS 273972 B6 přibližně 1 nanomol.
Kromě testů in vitro na sekreci růstového hormonu byly prováděny také pokusy in vitro tak, že byly syntetické peptidy podány injekčně krysím samcům po předběžném ošetření FLA-63, inhibitorem hydroxylózy dopaminu, který potlačuje samovolnou sekreci růstového hormonu, aniž by ovlivňoval odpověď na zevně přiváděný GRF. Krevní vzorky byly odebírány katetrem těsně před injekcí a 5 a 20 minut po injekci. Hladiny růstového hormonu v krvi, měřeno radioimunologicky ukazují, že syntetický [D-Leu23,Nle27] -rGRF (1“29)-NH2 další D-Leu17 a D-Glu2 -analogy rGRF a svrchu identifikované N^Me a C 50 Me-analogy hpGRF(l-32)-NH2 jsou účinnými stimulátory sekrece hypofyzálního růstového hormonu a daleko delší dobu účinku než rGRF(1-29)-NH2 a hpGRF (l-32)-NH2. Další známé GRF in vivo, které jsou účinné při sekreci růstového hormonu potvrdily tyto výsledky. Dávky se pohybují v rozmezí 100 nanogramů až 50 mikrogramů peptidů na 1 kg hmotnosti.
Syntetické analogy hpGRF a pravděpodobně také analogy rGRF a pGRF by měly být použitelné v lidské medicině v případě, že je zapotřebí zvýšit produkci růstového hormonu. Stimulace sekrece růstového hormonu těmito analogy spadá v úvahu zejména u nemocných s úplným chyběním nebo nedostatečnou sekrecí růstového hormonu, a to v důsledku toho, že se tento hormon nevyrábí z toho důvodu, že chybí faktor, který jeho uvolňování podporuje. Mimoto je pravděpodobné, že zvýšená sekrece růstového hormonu a vliv této sekrece na zrychlený růst může příznivě ovlivnit i vývoj lidí nebo zvířat s normálními hladinami růstového hormonu. Mimoto je možné, že by tímto způsobem bylo možno ovlivnit tukové buňky v těle a pozměnit další metabolické, imunologické a vývojové pochody, které závisí na produkci růstového hormonu. Tyto analogy by tedy mohly být použitelné k podpoře anabolických pochodů u lidí například při těžkých popáleninách. Také by mohlo padat v úvahu podávání těchto analogů u hospodářských zvířat, například kuřat, krocanů, vepřů, koz, skotu a ovcí, a také u studenokrevných zvířat, například ryb a dalších mořských zvířat, například želv, popřípadě u obojživelníků k urychlení jejich růstu a ke zvýšení poměru bílkovin k tukům, což by současně mělo vést i k dokonalejšímu využití bílkovin, které jsou těmto živočichům zadávány v krmivu.
Při podávání shora uvedených látek lidem by syntetické peptidy měly mít čistotu alespoň 93 %, s výhodou alespoň 98 %. Čistota v tomto případě znamená hmotnostní procento požadovaného peptidů ve směsi ostatních peptidů a jejich fragmentů. Při podávání syntetických peptidů hospodářským zvířatům a jiným zvířatům k urychlení jejich růstu a ke snížení tuku stačí daleko nižší čistota, například pouze 5 %, v některých případech je přípustná čistota 0,01 %.
Syntetické peptidy nebo jejich netoxické soli je možno zpracovávat na farmaceutické prostředky spolu s běžnými nosiči, přijatelnými z farmaceutického nebo veterinárního hlediska. Takto získané prostředky je možno podávat živočichům včetně lidí, obvyklým způsobem podání je podání nitrožilní, podkožní, nitrosvalové, kožní a popřípadě intranasální nebo perorální. K podání peptidů, vyrobených způsobem podle vynálezu, se může rozhodnout lé21 kar v případě, že je zapotřebí zvýšit uvolňování růstového hormonu v zájmu jeho nemocného. Požadovaná dávka peptidů se může měnit podle podmínek, a to zejména v nezávislosti na závažnosti stavu nemocného a na požadované době léčení.
Peptidy, vyrobené způsobem podle vynálezu, je často možno podávat ve formě jejich netoxických solí, například adičních solí s kyselinami nebo ve formě jejich komplexů s kovy, například zinkem, železem a podobně. Tyto komplexy se považují s hlediska přihlášky pro jednoduchost také za soli. Jako příklad vhodných adičních solí s kyselinami je možno uvést hydrochloridy, hydrobromidy, sírany, fosforečnany, maleáty, citronany, octany, jantaraný, jablečnany, benzoáty, soli kyseliny askorbové, kyseliny vinné a podobně. V případě, že účinná látka má být podávána perorálně ve formě tablet, může tableta obsahovat také pojivo, například tragakant, kukuřičný škrob nebo želatinu, dále plnidlo, které napomáhá rozpadu tablety, například kyselinu alginovou, kluznou látku, například stearan hořečnatý a podobně. V případě, že se požaduje podání v kapalné formě, může prostředek obsahovat sladidlo a/nebo chuťovou látku, při nitrožilním podání bude prostředek obsahovat zejména isotonický roztok chloridu sodného, fosfátový pufr a podobně.
Peptidy, vyrobené způsobem podle vynálezu, je zapotřebí podávat lidem pod dohledem lékaře, farmaceutické prostředky budou obvykle obsahovat příslušný peptid spolu s běžným pevným nebo kapalným nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska. Při parenterálním podání se bude účinná látka pohybovat obvykle v rozmezí 100 nanogramů až 50 mikrogramů peptidů na 1 kg tělesné hmotnosti. „
Přestože vynález byl popsán v souvislosti s některými výhodnými provedeními, která představují v současné době nejlepší způsob provedení, který je znám, je samozřejmé, že bude možno provádět různé změny a modifikace, které může běžně provést každý odborník, aniž by přitom došlo k odchylkám od předmětu vynálezu. Je například možno provádět nejrůznější modifikace v základním peptidovém řetězci, a to zejména vynechat některé zbytky nebo skupiny zbytků od C-terminálního zakončení peptidového řetězce V souladu s běžnými způsoby, které se v současné době používají k získávání peptidů nebo peptidových fragmentů, které si uchovávají veškerou účinnost původní látky nebo podstatnou část biologické účinnosti základního peptidů. Všechny takto získané látky také spadají do oboru vynálezu. Mimoto je možno na obou koncích peptidů nebo na některém z těchto konců zbytky přidat a/nebo je možno užít místo přírodně se vyskytujících zbytků zbytky, které se obvykle pokládají za zbytky ekvivalentní tak, jak je to známo v chemii peptidů za vzniku analogů, které mají alespoň podstatnou část biologická účinnosti polypeptidú, aniž by přitom došlo k odchýlení od oboru vynálezu.
Claims (7)
1. Peptidy obecného vzorce
R1“R2“R3“Ala”Ile-Phe-ThrR8”Ser-R10-Arg~R12“R13“Leu-R15Gln-R17-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-R23-R24-R25Ile-R27”R28”Arg-Gln Gln-Gly-GlU“R3 4-Asn“Gln-GlU“R3 8-R3 g-R4 0Arg~R4 2”R4 3 ~R4 4, kde
Rj znamená Tyr,D-Tyr,Met,Phe,D-Phe,pCl“Phe-LeU“His.
nebo D-His, při substituci typu CalfaMe nebo Na^faMe nebo bez substituce, (I)
R43 znamená Asn nebo Arg,
R44 znamená Val nebo Leu, za předpokladu, že bud
a) R-j_ má substituci typu CalfaMe,nebo NalfaMe nebo
b) R17 a/nebo R23 znamená D-Leu nebo
c) R25 znamená D-Glu nebo D-Asp, přičemž navíc je možno vynechat některý za zbytků r44' r43_R44' R42“R43“R44'
Arg-R42-R4g-R44, R10”Ar^“R42_R43'R44' R39R40Arg“R42“R43”R44· R3 8“R3 9R4 0Ar9”R4 2R4 3”R4 4'
Glu-Rg θ R3 9 **R4 0 ~Arg~R4 2 R4 3 R4 4 '
Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43“R44,
Asn-Gln-Glu-Rg θ ~Rg g ”R4 0 ~árg-°R4 2 “’R4 3 *”R4 4 '
R34„Asn-Gin—Glu-Rgg-Rg 9—R4q—Arg—R42—R4g—R44,
Glu—Rg 4 —Asn—Fln—Glu—Rg g“^3g”R4 q“Arg—R4 2—R4 3“R4 4/
Gly-Glu-Rg 4-Asn-Gln-Glu-Rg g-Rg 9-R40-Arg-R4 2-R4 3—R4 4,
Gln-Gly-Glu-Rg 4-Asn-Gln-Glu-Rgg—Rg g“R4 Q“Arg—R4 2—R4g“R44/
Gin—Gin—Gly—Glu—Rg 4”Asn—Gin—Glu—Rg g—Rg 9—R4θ —Arg—R4 2—R4 g—R4 4·
2. Způsob výroby peptidů obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačující se tím, že se
i) naváže N-terminální aminokyselina, chráněná terč. butoxykarbonyl o vou skupinou na -NH- benzhydrylaminové pryskyřici nebo se ii) ochranná terč.butoxykarbonylová skupina odštěpí a postupně se naváží jednotlivé aminokyseliny v množství 1 až 2 mmoly aminokyseliny, chráněné terč. butoxykarbonylovou skupinou, na 1 gram pryskyřice v methylenchloridu, dimethylformamidu nebo ve směsi těchto rozpouštědel za vzniku sloučeniny obecného vzorce II s alespoň jednou ochrannou skupinou
X1-^ (X nebo X2-R2-R3-(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Rg(X4 nebo X5)-Ser(X4)-R10(X2)“Arg(X6)-R12(X6 nebo X7)-R13-Leu-R15Gln(X5)-R17R18(X2)Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-R23-R24(X nebo X5)-R25(X3)-Ile-R27-R28(X4 neb0 X5)-Arg(X6)“Gln(X5)-Gln» (X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 nebo X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)R3g(X5 nebo X6)-R39(X6)-R40(X4)-Arg(X6)-R42-R43(X5 nebo X6)-R44-NH-pryskyřice, (II) kde
XJ znamená atom vodíku nebo aminoskupině, ochrannou skupinu na alfa-X' znamená atom vodíku hydroskupině Tyr, nebo ochrannou skupinu na fenolové
X' znamená atom vodíku nebo ochrannou lové skupině Asp nebo Glu, skupinu na karboxyX'
X' znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na alkoholové hydroskupině Thr, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na alkoholové hydroxyskupině Ser, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na guanidinové skupině Arg, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na amino skupině Lys postranního řetězce, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na dusíkovém atomu imidazolové skupiny His, iii)odštěpí se ochranná skupina nebo ochranné skupiny z sloučeniny obecného vzorce II za vzniku peptidů obecného vzorce I nebo jeho biologicky aktivního fragmentu a popřípadě se iv) převede výsledný peptid na svou netoxickou adiční sůl.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačující ze tím, že se na místě R25 naváže D-Glu.
4. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se na místě R25 naváže D-Asp.
5. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se na místě R23 naváže D-Leu.
R1 naváže Cal^aMe nebo Nall'aMe.
9. Způsob podle bodu 7, vyznačující se tím, že se jako ochranné skupiny X' zavede terč. butoxykarbonyl, jako X2 se zavede 2,6-dichlorbenzyl, jako X3 se zavede benzyl, jako X6 se zavede tosyl a jako X7 2-chlorbenzyloxykarbonylová skupina.
10. Farmaceutický prostředek pro stimulaci uvolňování růstového hormonu u živočichů, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje peptid obecného vzorce I podle bodu 1 nebo jeho netoxickou sůl a nosič, přijatelný z farmaceutického hlediska.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/545,094 US4518586A (en) | 1983-01-13 | 1983-10-25 | GRF Analogs III |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS690184A3 CS690184A3 (en) | 1992-04-15 |
| CS276972B6 true CS276972B6 (en) | 1992-11-18 |
Family
ID=24174872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS846901A CS276972B6 (en) | 1983-10-25 | 1984-09-13 | Peptides, process of their preparation and pharmaceutical containing thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS276972B6 (cs) |
-
1984
- 1984-09-13 CS CS846901A patent/CS276972B6/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS690184A3 (en) | 1992-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI88402C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara grf-analoger | |
| US4528190A (en) | GRF Analogs IV | |
| CA1243016A (en) | Human grf peptide analogs | |
| US4529595A (en) | GRF Analogs | |
| US4626523A (en) | GRF analogs II | |
| KR0138907B1 (ko) | 합성 펩티드 | |
| EP0117034B1 (en) | Grf analogs | |
| US5262519A (en) | GRF analogs XI | |
| US4595676A (en) | Rat hypothalamic GRF | |
| US4728726A (en) | GRF analogs IIIb | |
| JP2758901B2 (ja) | Ｇｒｆ類似体▲ｖｉｉ▼ | |
| FI94356B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi | |
| US4703035A (en) | Human pancreatic GRF amidated fragments | |
| CS276972B6 (en) | Peptides, process of their preparation and pharmaceutical containing thereof | |
| CZ3004U1 (cs) | Peptidy a farmaceutické prostředky s jejich obsahem |