CS272934B1 - Method of hind ii and hind iii enzymes purifications for genic handlings - Google Patents
Method of hind ii and hind iii enzymes purifications for genic handlings Download PDFInfo
- Publication number
- CS272934B1 CS272934B1 CS69789A CS69789A CS272934B1 CS 272934 B1 CS272934 B1 CS 272934B1 CS 69789 A CS69789 A CS 69789A CS 69789 A CS69789 A CS 69789A CS 272934 B1 CS272934 B1 CS 272934B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- hind
- cellulose
- hind iii
- column
- columns
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title description 18
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 17
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 abstract 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 241001235200 Haemophilus influenzae Rd KW20 Species 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
(57) Způsob purifikace restrikčních endonukleas Hind II a Hind III pomocí sloupcové kapalinové chromatografie tak, že se obě aktivity dělí na kolonách fosfocelulosy nebo Blue-celulosy nebo heparin-celulosy, s výhodou kombinacemi těchto kolon a popřípadě s kolonou OEAE-celulosy, čímž se docílí vyšší účinnosti dělení než na samotné koloně DEAEcelulosy.
CS 272934 Bl
CS 272 934 Bl
Vynález se ťýká využití sorbentů Blue-celulosy, heparin-celulosy a fosfocelulosy, ‘případně v kombinaci s DEAE-celulosou při puriřikaci enzymů restrikčních endonukleáz Hind II a Hind III z kmene Haemophilus'influenzae Rd.
Aktivity obou enzymů se nacházejí v kmeni společně. Pro jejich využití v molekulární biologii je důležité co nejlepší rozdělení obou aktivit. Obecný způsob purifikace enzymů využívá kroků jako desintegrace buněk, centrifugace a sloupcová kapalinová chromatografie.
K dělení obou aktivit se používá v publikovaných pracech výhradně kolona DEAE celulosy (např. Old, Murray, Boises, 3. Mol. Biol. 92, p. 33, 1975). Jiné purifikační kroky slouží k oddělení nespecifických nečistot, nikoliv k dělení obou aktivit. Na většinu sorbentů se totiž vážou oba enzymy přibližně stejně silně a neumožní efektivní rozdělení. Za vhodných podmínek se na koloně DEAE-celulosy zachytí jen enzym Hind II a enzym Hind III proteče.
Hind III je zachycen další kolonou, např. fosfocelulosou, která ale neodstraní zbytky aktivity Hind II kontaminující Hind III. Enzymy jsou potom vymyty gradientem iontové síly a převedeny do vhodného skladovacího roztoku. Takto připravený enzym vyhovuje pro řadu prací, ale v některých případech, kdy je třeba použít nadbytek enzymu, jsou i malé kontaminace druhou aktivitou na závadu. Předmět vynálezu řeší tento problém tak, že používá pro dělení aktivit další nové kolony.
Nový postup využívá kromě DEAE-celulosy těchto sorbentů:
Fosfocelulosa: Obě aktivity se eluují blízko sebe, což lze využít pro předčištění, ale nelze využít pro zbavení se stop druhé aktivity.
Blue-celulosa: Zachytí většinu Hind III, nezachytí se Hind II.
Heparin-celulosa: Zachytl Hind II a malou část Hind III, většina Hind III se nezachytí. Při eluci se stopy Hind III uvolní dříve a nekontaminují Hind II.
Izolační roztoky jsou obvykle roztoky fosforečnanu draselného s koncentrací kolem 10 mM nebo Trisu s koncentrací kolem 20 mM . Dále obsahují obvyklé ImM EDTA a7 mM 2-merkaptoetanol. Koncentrace NaCl je proměnlivá, při adsorpci enzymu na kolonu se 'pohybuje v rozmezí 0 až 0,1 M a na konci gradientu v rozmezí 0,5 až 1,0 M. pH roztoků se pohybuje v rozmezí 7 až 8. Tyto podmínky lze měnit v poměrně širokém rozmezí. Skladovací roztok obsahuje navíc 50 procent glycerolu. Objem gradientu bývá asi desetinásobek objemu kolony a průtok bývá asi půl objemu kolony za hodinu.
Příklad 1
Z 50 g buněčné pasty (Haemophilus influenzae Rd) bylo připraveno 200 ml buněčného extraktu. Z něho byly odstraněny nukleové kyseliny srážením l,3procentním streptomycinsulfátem a oddělena frakce proteinů mezi 50 a 70 procenty nasycení síranem amonným. Tato síranová frakce byla dialyzována proti izolačnímu pufru a nanesena na kolonu fosfocelulosy (200 ml). Enzymové aktivity byly eluovány gradientem NaCl a spojily se frakce s převládající aktivitou Hind II a Hind III odděleně. Spojené frakce Hind III byly naneseny na kolonu DEAE-celulosy (BOml). Tam se zachytil Hind II, ale Hind III se nezachytil. Proteklý roztok s Hind III byl nanesen na kolonu Blue-celulosy, kde se zachytil Hind III a poslední stopy Hind II se nezachytily. Enzym Hind III byl eluován gradientem NaCl a přěVéden do skladovacího roztoku. Spojené frakce Hind II byly naneseny na tutéž kolonu DEAE-celulosy a zbytky Hind III se nezachytily. Hind II byl eluován gradientem NaCl a nanesen na kolonu heparin-celulosy (40 ml). Hind II zbavený stop Hind III byl eluován gradientem NaCl a převeden do skladovacího roztoku. Oba enzymy je možno dále čistit na dalších kolonách, např. na hydroxylapatitu.
Příklad 2
200 ml buněčného extraktu z 50 g bakterií bylo naneseno na kolonu fosfocelulosy (200 ml) a enzymové aktivity byly eluovány gradientem NaCl. Spojily se frakce s převládající aktivitou Hind II a Hind III odděleně. Spojené frakce Hind III byly naneseny na kolonu Blue-celuCS 272 934 Bl t
«?
losy (60 ml), kde se zachytil Hind III, ale Hind II protekl. Tento roztok i spojené frakce s Hind II byly naneseny na kolonu heparin-celulosy (60 ml). Oba enzymy na obou kolonách by ly eluovány gradienty NaCl a převedeny do skladovacího roztoku.
Příklad 3
Síranová frakce, podle příkladu 1, byla nanesena na kolonu Blue-celulosy (100 ml) a za ní připojenou kolonu heparin-celulosy (100 ml). Hind III se zachytil na první koloně a Hind II na druhé. Oba enzymy na obou kolonách byly eluovány gradienty NaCl a převedeny do skladovacího toztoku.
Příklad 4
Buněčný extrakt byl nanesen na kolonu Blue-celulosy (100 ml). Hind II se nezachytil a byl v přeteklém roztoku. Hind III byl eluován gradientem NaCl. Oba enzymy byly převedeny do skladovacího roztoku. Oba enzymy je možno přečistit na dalších kolonách.
Předchozí příklady provedení způsob podle vynálezu dokládají, ale neomezují.
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZUZpůsob purifikace restrikčních endonukleas Hind II a Hind III pomocí sloupcové kapalinové chromatografie, vyznačující se tím, že obě aktivity dělí na kolonách fosfocelulosy nebo Blue-celulosy nebo heparin-celulosy, s výhodou kombinacemi těchto kolon a popřípadě s kolonou DEAE-celulosy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS69789A CS272934B1 (en) | 1989-02-01 | 1989-02-01 | Method of hind ii and hind iii enzymes purifications for genic handlings |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS69789A CS272934B1 (en) | 1989-02-01 | 1989-02-01 | Method of hind ii and hind iii enzymes purifications for genic handlings |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS69789A1 CS69789A1 (en) | 1990-06-13 |
| CS272934B1 true CS272934B1 (en) | 1991-02-12 |
Family
ID=5339562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS69789A CS272934B1 (en) | 1989-02-01 | 1989-02-01 | Method of hind ii and hind iii enzymes purifications for genic handlings |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS272934B1 (cs) |
-
1989
- 1989-02-01 CS CS69789A patent/CS272934B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS69789A1 (en) | 1990-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ogasawara et al. | Isozymes of rat AMP deaminase | |
| CA2469815A1 (en) | Methods for purifying protein | |
| DE68915675D1 (de) | Verfahren zur Reinigung von Vitamin K-abhängigen Proteinen. | |
| Porath | Fractionation of polypeptides and proteins on dextran gels | |
| Levine et al. | Immuno-electrophoretic and chemical analyses of human parotid saliva | |
| Scopes | Multiple enzyme purifications from muscle extracts by using affinity-elution-chromatographic procedures | |
| Bruton et al. | The binding of aminoacyl-tRNA synthetases to triazine dye conjugates | |
| Hotta et al. | Isolation and properties of a new type of sialopolysaccharide-protein complex from the jelly coat of sea urchin eggs | |
| EP0733104B1 (en) | Purification of vitamin-k dependent proteins by membrane chromatography | |
| JPH0279995A (ja) | 酵素的精製方法 | |
| Børresen et al. | Purification and characterisation of tyrosine decar☐ ylase and aromatic-l-amino-acid decar☐ ylase | |
| JPH03501085A (ja) | 化学的プロセス | |
| CS272934B1 (en) | Method of hind ii and hind iii enzymes purifications for genic handlings | |
| ATE166062T1 (de) | Verfahren zur reinigung des big-endothelin proteins | |
| EP0310719B1 (en) | Method for purification of antibodies | |
| Baran et al. | Cell sorting using a universally applicable affinity chromatography matrix: solid-phase anti-fluorescein isothiocyanate antibody | |
| US4841024A (en) | Purification of antibodies | |
| Habeeb | A study of the soluble antigens of Clostridium perfringens type D | |
| BRODELIUS et al. | The determination of dissociation constants by affinity chromatography on an immobilized adenosine monophosphate analogue | |
| Schutyser et al. | The isolation of proteins from whey with a new strongly acidic silica-based ion exchanger | |
| Pick et al. | Purification of the proteinaceous α-amylase inhibitor from Phaseolus vulgaris by affinity chromatography with immobilized enzyme or antibody | |
| Dalen | Proteolytic degradation of staphylococcal α‐toxin | |
| Edwards et al. | Method for improved protein separation in human and animal sera | |
| SU721449A1 (ru) | Способ получени сорбента дл выделени и очистки сериновых протеаз | |
| Noguchi et al. | A simple procedure for regeneration of an organomercurial agarose column |