CS271306B2 - Method of 99m technetium's lipophile macrocyclic complexes production - Google Patents

Description

ve kterém n znamená 2 nebo 3 a R, které mohou být totožné nebo odlišné znamenají případně substituovanou uhlovodíkovou skupinu s 1 až 22 atomy uhlíku, aminovou skupinu, amidovou skupinu, karboxylovou skupinu, karboxylovou esterovou skupinu, hydroxy lovou skupinu, alkoxylovou skupinu nebo elektronoakceptorovou skudnu, které .jsou použitelné jako diagnostická radiofarmaceutika. se připraví reakcí technecia-99= a komplexotvornvm činidlem zvoleným ze skupiny zahrnující alkylenamir.ové oxiny obsahující 2 nebo 3 atomy uhlíku v alkyler.ové skupině.

271	3 06 z
(11)
(13)	B2
(51)	Int. Cl? C 01 0 57/00. A 61 К 49/02

Techneclum-99m (Tc-99m) je výhodným radionuklidem к zobrazování orgánů a dalších partií při diagnóze (in vivo). Komplexů Tc-99 ae používá к vyšetřování většiny částí těla.

Tento vynález ее*týká komplexů technecia, například komplexů technecia-99m, použitelných ve formě diagnostických farmaceutických přípravků a zejména komplexů, které jsou schopné pronikat bariérou krev - mozek a které jsou udržovány v mozku po dobu potřebnou к provedení diagnózy·

Tc-99m se získává z generátoru technecia jako technecistanový (pertechnetátový) iont TcO^, s techneoiem v 7* mocenství, obvykle v roztoku soli· Protože techneciatan nevytváří snadno komplexy, používá se obvykle techniky míšení techneciatanu se vhodným ligandem za redukčních podmínek, čímž technecium je redukováno na nižší mocenství, obvykle 3*, 4* nebo 5+, při kterém vytváří požadovaný komplex· Problémem je, že tyto komplexy nesou obvykle povrohový náboji všechny Tc-99m komplexy mají povrchové kladné nebo záporné náboje· Je známo, že látky s nábojem nepronikají snadno bariérou krev - mozek (označované v odborné literatuře zkratkou BBB) a nelze je tudíž snadno zavést _ч do mozku·

Sloučeniny značkované emitory positronů o krátké životnosti (například C-ll, 0-15 a P-18) ae používají úspěšně ke směrování regionálního cerebrálního.průtoku krve (fCBP) u normální a nemocné mozkové tkáně za použití transsxiální tomografie s emisí positronů v omezeném počtu laboratoří nukleární medicíny· Náklady na výrobu těchto látek (včetně lékařského cyklotronu) jsou na překážku širokému využití· Z provedených studií v denní lékařské praxi vyplývá, že je velioe žádoucí vývoj látek schopných hodnotit rCBP, avšak značených snadněji dostupnými a méně nákladnými radionuklidy emitujícími jediný foton (tj· gamma-záření), například Tc-99m.

Pro sledování hodnot průtoku krve mozkem u lidí ae využívá dvou druhů diagnostických látek emitujících jediný foton· Jako prvá se nejlépe příkladně uvádí Xe-133» netečný vzácný plyn, který pasivně difunduje přes BBB a znázorňuje tkáně proporcionálně к průtoku krve tkání· Hodnoty rCBP se stanoví sledování stupně znázornění xenonem Xe-133 jako funkcí času na různých místech mozku za použití buň specializovaného fotony emitujícího počítačem ovládaného tomografiokého zařízení (SPÉCT) nebo multldetektorového systému· Do druhé třídy patří ty látky, které pasivně difundují BBB (s vysokou extrakční účinností do mozku) a lze je zachytit v mozkové tkáni· Zachycení umožňuje dobu ke stanovení hodnot rCBP obvyklejšími SPÉCT zobrazujícími zařízeními· Dvě nejcastěji používaná jednotlivá fotonová činidla pronikající mozkem tohoto posledního typu jsou:

J-l23-N, N,N*-trimethy 1-N *-(2-0H-3-methy 1-5-jodbenzy 1)1,3-propandiamin (J-123-HJPDM) a J-123-jodamfetamin (J-123-JMP). 5

Protože Tc-99m má vyšší zobrazovací vlastnosti a je snadněji dostupný a méně nákladný, kterékoliv nové Te-99m značkované látky s podobnými nabo dokonce lepšími schopnostmi pro příjem mozkem (a/nabo vymývání) například Xe-133, J-123-JMP nebo J-123-HJPDM by nalezly široko klinickou použitelnost·

Kromě rCBP studií tyto neutrálně-lipofilní Tc-99m-cheláty by byly žádoucí i к zobrazeni plic· J-123-jodantlpyren jo hydrofobní sloučenina, která distribuuje následující injekci plicní vodou a bylo jí použito к hodnocení extravaskulární plicní vody (EVIN) u zdravých a nemocných· Toto činidlo pasivně difunduje do plicního parenohymu a je vymýváno průtokem krve plícemi. Zobrazování plic bylo provedeno i za použití

J-123-JPM. J-123-JMP je přijímáno plicní tkání a pomalu uvolňováno.

Je jasné, že činidla Tc-99m, která mají podobné vlastnosti podobné J-123-Jodantipyrenu by byla cenná při hodnocení regionálního EWLM zobrazování (zejména u pacientů s akutním reepiračním stresovým syndromem). Podobně, Tc-99m sloučenina, která se váže na receptory aminů v plicích by měla být použitelná při provádění zobrazování plic.

Zobrazování srdečního svalu u pacientů s poškozením myokardu za použití mastných kyselin nebo analogů mastných kyselin, značených emitory positronu nebo J-123 se ukázalo jako slibná diagnostická pomůcka. Jak je ukázáno dříve, vysoké náklady na výrobu sloučenin značených emitory positronu vylučuje jejich rozšíření v blízké budoucnosti.

Za normálních podmínek energetické požadavky srdečního svalu jsou kryty oxidací mastných kyselin a tudíž extrakce volných mastných kyselin normálního myokardu je vysoká. V oblastech poškození srdečního oválu, kde dochází к lokálnímu snížení pO^ (například při isehemii) je oxidace mastných kyselin (tj. beta-oxidace) i příjem volných mastných kyselin snížen· Regionální metabolismus mastných kyselin by mohl být měřen hodnocením zychlosti vyčarování značkované mastné kyseliny z myokardu· Alternativně, /analog mastné kyseliny, který nastupuje cestu metabolismu, prochází parciálním metabolismem a jehož radioaktivní hladina je zachycena v myokardu, by mohl rovněž odrážet regionální metabolickou aktivitu /tj· podobnou 18-P-fluordesoxyglukoze při zobrazování metabolismu mozku· Potom lne zobrazit lokalizovanou zachycenou aktivitu· Analoga mastných kyselin značkovaných různým způsobem pomocí J-123 jeou přijímány normálním srdečním svalem a v závislosti na struktuře specifické sloučeniny budou buč vyčeřovat rychle následující beta-oxidaci (podobnou C-ll značkovaným mastným kyselinám) nebo je lze strukturně modifikovat, aby byly zachyceny myokardiální tkání· J-123 lze připojit přímo к omega-konci (tj· konec opačný ke karboxylové skupině) alkylového řetězce nebo připojen к omega-konci alkylového řetězce pomocí J-123-fenylové skupiny· Obou typů derivátů bylo e úspěchem využito jako činidel zobrazujících myokard· Skutečnost, že dobrý myokardiální příjem byl pozorován u analog mastných kyselin, kde je připojena objemná hydrofobní J-123-fenylová skupina к omega-konci ukazuje, že další lipofilní skupiny podobně připojená budou mít malý vliv na jejich extrakci normálním srdečním svalem· Karesh se spol· (J· Pharm. Chem·, 66, 225, 1977) a Schneider se spol· (L· Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 19, 1326-1327, 1982) neuspěli v pokusech vyrobit Tc-99m-analog mastná kyseliny, který je lokalizován v srdečním svalu· Oba badatelé připojili ligandy к omega-koncům analog mastných kyselin, která vytvářely negativně nabitá Tc-99m cheláty a uzavřeli, že chelát β nábojem na konci alkyového řetězce zabránil jejich intracelulárnímu transportu· Očekává se, že neutrální hydrofobní Tc-99m-chelát připojený к omega-konci analog mastnýoh kyselin nebude zabraňovat normálnímu příjmu myokardiálními buňkami (tyto typy sloučenin by měly být strukturně podobné analogům J-123-feuyl-omega-mastnýeh kyselin)·

3yly připraveny a popsány nejméně tři neutrální Tc-99m-komplexy, viz Burns se spol·, J· Nucl· Med·, 20, 841, 19791 Kramer se spol·, J· Labe Hed Compounds and Radiopharmaceuticals. 19, 1598-1599, 1982< Yokohama se spol·, J· Nud· Med·, 17, 816-819. 1976· Žádný z těchto Tc-99m komplexů nebyl vypracován к rutinnímu diagnostickému používání· Tyto neutrální ligandy nesplňovaly všechny nezbytné požadavky: například neutrální komplexy Yokohamy se spol· se mimořádně nesnadno připravují včetně použití -SH skupin ke komplexaci s Tc-99m jako u neutrálních komplexů Bumse se spol· Ligandy používající SH-ekupiny к chelataci Tc-99m vytvářejí stabilní komplexy, nesnadno ee však skladují· Neutrální chelát Kramera se epol· nemá požadované charakteristiky stability. Pokud je známo, žádný z těchto ligand nevykazuje vysokou extrakční účinnost v mozku.

Ligandy, které používají v chelataci Tc-99m jenom dusíkaté atomy, tvoří snadno ve vodném prostředí komplexy. Теtrazaligandy a zejména makrocyklické tetrazaligandy tvoří velice stabilní Tc-99m komplexy. Viz Troutner se spol., J. Nucl. Med. 21, 443-448,

СЗ 271306 В2 (19Θ0), který popisuje tvorbu komplexu ТсО^-ЭЭт в такгосуkličkým tetrazaligandem, сукlemem· Pokud je známo, jediná studie ukazující dokonalou charakterizaci takového makrocyklického ligandového komplexu Tc byla publikována v roce 1981 Zuckmanem ee epol., Inorg· Chem·, 20, 2386-2389. 0 komplexu a cyklamem (1,4,8,11-tetraazacyklotetradekanem) za redukčních podmínek bylo prokázáno, že tvoří TcOg+l jádro a získaný komplex měl náboj *1.

Předmětem vynálezu je způsob výroby lipofilních makrocyklických komplexů technecia-99m obecného vzorce

U .....- - I-.- - - — ve kterém n znamená 2 noho 3 a

R které mohou být totožné nebo odlišné, znamenají vodík, uhlovodíkovou ekupinu obsahující 1 až 22 atomů uhlíku ze skupiny zahrnující alkylovou skupinu, alkarylovou skupinu, aralkylovou skupinu nebo arylovou skupinu, primární aminovou skupinu, sekundární aminovou skupinu, terciární aminovou skupinu, primární amidovou skupinu, sekundární amidovou skupinu nebo terciární amidovou skupinu* karboxylovou skupinu, karboxylovou esterovou skupinu, hydroxylovou ekupinu, alkoxylovou ekupinu nebo elektronoakceptorovou ekupinu s množiny zahrnující isokyanldovou skupinu* substituovanou fosflnovou skupinu, arsinovou ekupinu, stilbinovou skupinu, sulfidovou skupinu s pyridinovou a polycyklickou pyridinovou skupinu, která může být případně substituována skupinou obecného vzorce

ve kterém m, o a p každé znamená celé číslo od O do 22

X, Y a Z, které mohou být totožné nebo odlišné, znamenají vodík, uhlovodíkovou skupinu s celkovým počtem atomů uhlíku 1 aŽ 22 zvolenou ze skupiny zahrnující alkylovou skupinu, alenylovou skupinu, alkarylovou skupinu, aralkylovou skupinu nebo arylovou skupinu, primární aminovou skupinu, sekundární aminovou skupinu nebo terciární aminovou skupinu, primární amidovou skupinu, sekundární amidovou skupinu nebo terciární amidovou skupinu, karboxylovou skupinu, karboxylovou esterovou skupinu, hydroxylovou skupinu nebo elektronce kceptořovou skupinu zvolenou z množiny zahrnující isokyanidovou skupinu, substituovanou fosfinovou skupinu, arsinovou skupinu, stilbinovou skupinu a sulfidovou skupinu a pyridinovou a polycyklickou pyridinovou skupinu, použitelných jako diagnostická radiofarmaceutika, jehož podetata spočívá v tom, že se uvede v reakci technecium-99m в komplexotvorným činidlem pro technecium zvoleným ze skupiny zahrnující alkylenaminové oximy obsahující 2 nebo 3 atomy uhlíku a alky lenové akupi nč a mající obecný vzorec

ve kterém n a R mají výše uvedený význam,

Výrazem elektronoakceptorová alcuplna Je zde míněna alcupina, která může přijmout elektrony do níže ležících prázdných orbita lil.

Pokud Je známo, ligand specificky zmíněný v této přihlášce Jako propylenaminový oxim (PnAO), nebyl použit к připraví komplexu Tc-99m« Tímto ligandem Je 4,3-diaza-3,39,9~tetramethylundekan~2,10-dionbieoxim a Jo zde označován jako PnAO. Způsoby přípravy PnAO jsou dobře známy při tvorbě komplexů kovových iontů· Viz např· Vassian a spol·, (Inorg. Chem., 6, 2043-2046, 1967). Tvorba komplexů PnAO s kovovými ionty probíhá pomocí 4 atomů dusíku a vede к tvorbě ligaudů cyklické struktury kolem chelatovaného kovu (Murmann a apol., Inorg. Chem. 12, 2625-2631, 1973). Strukturní vzorec PnAO je:

c:-:,

.. У

-··

Příslušným ethylene minovým oximern (EnAO) je 4,7-diaza-3,3,8,8-tetramethylundekan-2,9-dionbisoxim· vynález je založen zčásti na zjištění. Ze technecium-99m lze uvádět do komplexu (redukcí Tc-99m technecistanu ve vodném prostředí) propylenaminovým oximem za vzniku stabilního llpofilního komplexu· Tento komplex a deriváty představují použitelná diagnostická zobrazovací činidla· Pravděpodobně se jedná o obecnou tvorbu komplexů a tímto typem aminového ozimového ligandu. neboí jiná forma bázického tetradentátového aminového ozimového ligandu, ethylenaminový ozim (EnAO) rovněž tvoří ve vodném prostředí neutrální hydrofobní Tc-99m chelátu· Komplexy mají nulový čistý náboj a snadno ee připravují· Tc-99m EnAO a PnAO jsou schopné procházet bariérou krev-mozek, přičemž procházejí stěnami buněk a jsou dostatečně vázány plicní tkání, čímž rozšiřují svůj rozsah využitelnosti jako radiofarmatika· Dále, komplexy jsou dostatečně stabilní, dokonce v přítomnosti atomu kyslíku, což umožňuje jejich přípravu a patenterální aplikaci pro zobrazování· Makrocyklický PnAO kruh so uzavírá během vzniku komplexu pomocí 0—H—-0-vazby, která slouží к dokončení kruhu a kontroly náboje komplexu·

Struktura Tc-99 PnAO byla určena a ukázána vzorcem (3) níže, kde R¹, R⁴ a R³ jsou methylová skupina a R² a R³ značí atom vodíku· Očekává ee, že struktury Tc-99 EnAO, analog Tc-99 a Tc-99 EnAO a příslušných Tc-99m komplexů jsou v podstatě takové, jaké jsou ukázány ve vzorci (1) a (2)·

V jednom aspektu vynález přináší komplex technecia-99m popsaného druhu a zahrnující strukturu

6· (I).

kde η je 2 nebo 3«

Jak je uvedeno, techneclové jádro je ve formě Tc(P*.

Tvrzení, že komplexy techneclum-99m podle vynálezu mají nulový čistý náboj, potřebuje určité vysvětlení· Jádro komplexu, jak je ukázáno například na (1), vpředu nemá žádny celkový náboj, což je rozdíl od jiných podobných Tc-99m komplexů. Napojení nabitých nebo lonlzovateIných skupin na ukázané uhlíkové atony vede ke komplexům, které vcelku, alespoň za určitých podmínek* nemají nulový náboj. Takové komplexy nemající celkový nulový náboj v důsledku nabitých lonlzovatelných skupin připojených к jádru mají značný význam při lokalizaci jednotlivých oblastí těla a jsou zahrnuty do rozsahu tohoto vynálezu· Výraz nulový čistý náboj se týká makrocykllcké struktury jádra a Ignoruje potenciálně nabité nebo lonlzovatelné substituční skupiny· Pro zobrazování těla lze vytvářet komplexy technecia-99m ke speciálním účelům pomocí připojení vhodných obecně llpofllních skupin к některému nebo ke věem uhlíkovým atomům ukázaným na (1)· Takové tvarování molekul patří dnes ke standardní praxi výzkumných laboratoří· Připojení vhodných skupin za účelem lokalizace komplexu v přísluSné oblasti nebo orgánu, například v mozku savce, kterému je komplex podáván, nebude vyžadovat více než rutinní výzkumnou práci ve světle obecných znalostí z oboru vzatých z této přihlášky. Komplexy Izotopů technecla jiných než Tc-99m jsou použitelné к určení chemických vlastností komplexů·

Komplexy uvažované к zobrazování těla mají obecně vzorec

... н... o kde n je 2 nebo 3 a skupiny R mohou být stejné a jednotlivě značí atom vodíku, uhlovovík β 1 až 22 atomy uhlíku, které nohou být alkylové, alkenylové, alkarylové nebo arylové prinární, sekundární nebo terciární aminové, primární, sekundární nebo terciární amidové skupiny, karboxylová skupina nebo ester kyselina, hydroxylové nebo alkoxylové skupiny nebo akceptory kyselin a nohou být substituovány nebo nesubstituovány.

Výhodné komplexy mají obecný vzorec

(3).

kde jednotlivé R^ a R^ jsou atom vodíku nebo Cl až C12 alkylová skupina a jednotlivé R² a R^ jsou atom vodíku, hydroxylové skupina Cl až C12 alkoxylové skupina. Cl až C22 uhlovodík, kterým může být alkylová, alkenylové, alkarylové, aralkylová nebo azylová nebo terciární aminová skupina e 1 až 20 atomy uhlíku, nebo R² a R^ mohou tvořit spolu s atomem uhlíku, na kterém jsou vázány cykloalifatiokou skupinou, kterou může být amin substituován· Jednotlivé R² a R^ je atom vodíku nebo Cl až C4 alkylová skupina.

Jak je ukázáno níže, výhodné komplexy pro zobrazování mozku .mají rozdělovači koeficienty mezi lipidy a vodou a molekulární hmotnosti takové, že in vivo jsou schopné difundovat bariérou krev-mozek, přičemž jsou zadržovány v mozku po čas postačující, aby byly využity к diagnostickým účelům·

Vynález také zahrnuje způsob zobrazování těla vyznačující se podáním savcům komplexu technecium-99m» uvedeného výže, čímž dochází к lokalizaci komplexu v jedné nebo více oblastech savců a pozorováním radiace emitované z jedné nebo více oblastí.

Vynález zahrnuje i způsob tvorby komplexu technecia vymezeného vpředu stupni a/

Tvorbou komplexu Tc-99m technecistanu za redukčních podmínek a komplexotvorným činidlem pro technecium voleným z alkylenamlnových oximů obsahujících 2 nebo 3 atomy uhlíku v alkylenové skupině, kterážto skupina je substituovaná nebo nesubstituovaná, přičemž lze použít kteréhokoliv substituentu druhu použitelného к adaptaci radioaktivních nuklidových ligandů к použití při zobrazování těla a dalěích slaběích komplexotvornýeh činidel pro technecium.

b/

Jestliže ve stupni a/ bylo pro technecium použito slabšího komplexotvorného činidla, přičemž získaný komplex se uvádí do reakce e alkylenaminovým oximem, jak je uvedeno v a/.

za podmínek urychlujících výměnu ligandů, tím vzniká komplex a nulovým nábojem obsahujícím vazbu uzávěru kruhu O-H-O a Je dostatečně stabilní к parentorálnímu podání a zobrazovací pomocí scintilačního snímání·

Propylenaminový oxim-ligand, výchozí materiál pro přípravu komplexů podle vynálezu lze připravit známými synthetickými způsoby· Například PnAO (stejně jako EnAO) lze synthetizovat způsobem podle Vassiana se spol· Krátce popsáno, synthesa zahrnuje reakcí 1»3-propandlaminů (1,2-ethylendiaminu) a chloroximovým činidlem·

CH₃-C(CH₃)C1-C(CH₃)«NOH

CH₂(NH₂)-CH₂-CH₂(NH₂)

HON-C( CH₃ )-C (CH₃ ) 2-NHCH2· CHgNH-C (CH₃ )«NOH

Stejného reakčního schématu lze použít, když chloroximové činidlo má obecný vzorec

C1-CR⁴R⁵-CR¹«NOH kde R⁴, _a R¹ jsou alky lově skupiny. Taková činidla lze připravit reakcí NOCI в příslušným alkylenem podle následujícího schématu:

CR⁴R⁵ CR^XH + NOCI

C1-CR⁴R⁵-CR¹ - ROH

Když R⁴ a/nebo R^ je vodík, je výhodná jiná preparatlvní ceeta

l,

Propylénaminový osin nebo OnAO derivát, kde substituční skupiny jsou zaváděny na uhlík v poloze-2 propylenového zbytku lze připravit z diethylesteru kyseliny Balonové· Níže je připojeno obecné schéma syntheay tímto způsobem a zahrnuje alkylaci uhlíku v poloza-2, následované konversí dlesteru v diamid s následující redukcí na 1.3-propandiaminový derivát· Z diesteru na amin jsou možné jeětě jiné cesty, například přes diol· Diaminový produkt lze potom reagovat s chloroximovým činidlem za vzniku příslušného PnAO derivátu·

RX + StO₂C - CH₂ — CO₂St —► Et0₂C-CHR-C0₂Et

NH

Diborane :THF

H₂N-CH₂-CHR₂-NH₂ <--------—V h₂noc-chr-conh₂

Případné* analogioké deriváty lze připravit podobnou reakcí, kde 2-OH-dlethylmalonát se uvádí do reakce s RX· R skupina js v tomto případě napojena na C-2 propylenového uhlíku pomocí etherového řetězce místo přímo na C-2 propylenu:

EtO₂C-CHOH-CO₂Et * RX --S EtO₂C-CHOR-CO₂Et

NH, -5»

Diborane: THF

V

NH₂-CH₂-CHO3-CH₂NH₂

Jako dříve, esterové skupiny se převádějí na aminy a reagují a nadbytkem chloroximu za vzniku PnAO derivátu.

Alternativní cesta za vzniku 1,3-propandiaminových derivátů epočívá v připojení skupin na Cl а C3 uhlíkové atomy propylendiaminu. Deriváty lze připravovat reakcí alfa-gama-diektonů (například acetylacetonu) ae čpavkem, následuje redukce za vzniku následujícího 1,3-propandiaminového derivátu a následné reakci s chloroximovým činidlem.

Dalším základním výchozím materiálem je technecium-99m ve formě technecistanu (TcO^-99m). Technecistanové činidlo se připravuje čerstvé jako sterilní volný eluát ze standardního moly bděnu-99 (Mo-99): Tc-99m radioaktivní nuklidový generátor. V souhlase se standardní praxí ee Tc^-99m eluuje z kolony za použití vodného fyalologického roztoku, například lsotonického (0,9 M). Eluát bude obsahovat zředěný roztok technecistanu, například v molární koncentraci asi 1O⁶-1O”⁹.

Reakce tvorby komplexu mezi propyleneminovým oximem - ligandem a technecistanovým Činidlem lze provádět ve vodném roztoku nebo ve směsi rozpouštědel složených z izotonického roztoku a z rozpouštědla mísitelného в vodou za redukčních podmínek. Lze používat standardních redukčních činidel, například takových, kterých bylo použito dříve pro redakci a ligandů tvořících komplexy в Tc-99m v komerčních přípravcích kit typu. Vhodnými redukčními činidly jsou například: chlorid cínatý a další cínaté soli, dithioničitan Bodný nebo Sn či Zr elektrody atd. I když Tc-99m-PnAO lze připravit za rozličných redukčních podmínek (my jame připravili například Tc-99m-PnAO redukcí Tc^-99m ve fysiologickém roztoku při hodnotě pH 8 až 10 v přítomnosti 0,004 Μ PnAO в dithioničitanem sodným), cínaté aoli představují nejvhodnější způsob přípravy. Použití cínatých solí je zejména vhodné pro přípravu redukčního činidla v přeformulovaných radiofarmaceutických kits к rutinnímu použití u pacientů. V těchto kita jsou kombinovány lyofilizované obsahy sterilních, pyrogenů prostých lahviček obsahujících cínatou sůl, komplexotvorný ligand a další chemikálie, potenciálně pufr a stabilizátor, s eluátem z Mo-99-Tc-99m generátoru obsahujícího TcO^-99m. Získaný Tc-99m chelát lze potom podat injekčně do krevního řečiště pacienta.

Ačkoliv komplexy podle tohoto vynálezu obsahují spíše pevnou Tc-99m vazbu, lze je připravit rovněž způsobem výměny ligandů. Je třeba uvést, že technecistan lze redukovat nejprve v přítomnosti některého odlišného ligandu, který váže technecium poměrně slabě. Když se získaný Tc-99m-ligandový komplex následně smíchá s PnAO Tc-99m se přenáší na PnAO a vytváří se komplex podle tohoto vynálezu.

Komplexotvorná reakce Tc-99m není příliš citlivá na pH, pokud se zamezí vysoce kyselým nebo vysoce bázickým podmínkám. Komplexotvomou reakci lze například provádět při hodnotě pH 5 až 10. Výtěžek tvorby komplexu je v tomto rozmezí hodnoty pH vyšší než 95 %· přičemž redukce Tc0^-99m se provádí cínatým iontem s nadbytečným PnAO v roztoku chloridu sodného. Koncentrace ligandu v solném roztoku v době přidání TcOj-99m může být nižší než 10^μ. Nastavení hodnoty pH lze provést řadou činidel, například hydrogenuhli či taném sodným, octanem sodným, boritanem sodným nebo jinými solemi vhodnými к pufrování v tomto rozmezí hodnoty pH. Reakční teplota není kritická a reakci lze provádět při teplotě místnosti. Je-li to žádoucí, reakční rychlost lze zvýšit použitím teploty vyšší než 90 °C.

Požadovaná komplexotvorná reakce probíhá rychle a obvykle je skončena v rozmezí 10 minut. Je-li to žádoucí, dokončení reakce lze stanovit vhodnou zkouškou, například papírovou ohromatografií, elektroforesou, tenkovretevnou chromátografií nebo vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

Chování těchto komplexů u zvířat in vivo ukazuje jejich potenciální šířku využití při výrobě nových a použitelných radiofarmaceutik. Intravenozní injekce Tc-99m PnAO u laboratorních zvířat (tj. myší, krys, králíků, opic a psů) vedla к vysokému příjmu do mozku a plic několik málo sekund po injekci. Aktivita v mozku rychlá klesá a stává se relativně nízkou po 15ti minutách. Příjem a vymytí Tc-99m PnAO z mozku psů, králíků a krys bylo hodnoceno vizuálně využitím standardní scintilační komory a přenášeno přímo na počítač· Obrazy byly převáděny v digitální systém a zpracovány počítačem· Aktivita vyjádřená jako funkce času Tc-99m-PnAO v mozku byla hodnocena vynášením aktivity z oblasti zájmu (ROI) mozku ve srovnání s ROI nemozkové tkáně proti času· Rychlost vymývání Tc-99m PnAO u psa byla obdobná vyčeřování Xe-133 z mozku lidí· Údaje dokazují, že mozkový příjem Tc-99m-PnAO je účinný a že měření rychlosti vymývání tohoto chelátu z různých oblastí mozku s příslušnou přístrojovou technikou je vskutku proveditelné· Dále, specifické SPÉCT přístrojová technika (1) systémy multianímačů (2) běžně používané ke sledování rychlosti vyčeřování Xe-133 z mozku lze použít rovnčž ke stanovení oblastního vyčeřování Tc-99m-PnAO z mozku a stanovení rCBP údajů u pacientů·

I když méně dostatečně, plenárním zobrazením Tc-99m příjmu v mozku lze rovněž získat diagnostickou informaci·

Extrakční účinnost Tc-99m-PnAO z plasmy mozkem krys a králíků byla hodnocena použitím ayatému detekce externím gama-zářením u jednotlivého vzorku· Extrakční účinnost u . těchto zvířat za předpokladu normálního oběhu krve byla stanovena jako aai 70 až 90 %. Extrakční účinnost byla měřena i u opic za použití externího ayatému ae vzorky a bylo zjištěno, že při normálním oběhu krve je 80 %· Pokud je známo, tato extrakční účinnost je vyšší ve srovnání a kterýmkoliv neutrálním nebo nabitým známým lipofilním Tc-99m komplexem· Schopnost tohoto komplexu snadno difundovat intaktními buněčnými membránami byla potvrzena pozorováním, že Tc-99m-PnAO umístěného do vzorku osikové krve (Het 45) dosáhne rovnováhu koncentrace asi 70 % uvnitř červených krvinek méně než v 5ti minutách· Výoházejíce z těchto výsledků, Tc-99m-PnAO a různé deriváty nebo další tatradentátaminové ozimy (například deriváty EnAO) podržují maximální potenciál kterýchkoliv známých Tc-99m-chelátů, kterých by mohlo být použito jako radiofarmak ke zjištění regionálního cerebrálního průtoku krve (rCBP) u lidí·

Tc-99m-PnAO (nebo Tc-99m*EnAO) by mohlo být použito к hodnocení rCBP za použití komerčně dostupných zařízení jaderné medicíny, která mají schopnost sledovat rychlost vymývání aktivity (například Xe-133) různých oblastí mozku· Například. SPÉCT zobrazení lze získat za použití specializované torno grafické Jednotky (tomomatický model 64 Medimatic Corp·, Irvine CA) zatímco systém pro více vzorků (Novo oerebrograf vyráběny Novo Laboratories, lne·, Wilton, CT) lze použít pro sladování údajů o vymývání lokalizovaných mozkových oblastí· Alternativním typem klinicky použitelného rCBP činidla je takové, které bude pasivně difundovat intaktní BBB z plasmy a bude zadržován intracelulárně· Intracelulární retence by měla být postačujíoí, aby dovolovala zobrazení obvyklým SPÉCT zařízením· Tcr99m-PnAO navrhovaná к tomuto použití jsou strukturní analoga J-123-jodřeny laiky lamino vých derivátů· Specificky látky А а В byly nalezeny jako použitelná rCBP zobrazující činidla (J v každé struktuře J-123)·

Látka A

I

Tc-99m-PnA0 cheláty, které budou použitelné к tomuto účelu mohou být v podstatě označeny jako náhrada J-123*fenylového aubatltuentu neutrálním lipoflíním Тс-99ш-РпАО (nebo PnAO analoga) substituentem za použití stejných nebo podobných postranních řetězců připojených, jak je ukázáno u látek A a B« Nejvhodnější způsoby к připojení substituentů к PnAO (nebo jednomu z jeho analog) jo připojení řetězce к C-2 propylenu diethylmalonátovou synthetickou cestou popsanou dříve* Substituent připojený buS přímo nebo etherovým řetězcem na C-2 propylen bude alkylaminovým nebo polyaminovým řetězcem/ který může obsahovat od 4 do 10 uhlíků. Jestliže póly aminové a alkylaminové řetězce, které jsou připojeny к fenylovému kruhu sloučenina A a B, se připojují к PnAO (nebo vhodnému analogu), by měly vést к velice požadovanému rCBP zobrazujícímu činidlu. Avěak jiné alkylamino a polyaminové skupiny připojené к PnAO mohou být. výhodnější. Příklady takových postranních řetězců viz Winchell se apol., (J. Nucl. Med*, 20, 940-946, 1980)·

Dva příklady syntheey používající diethylmalonátovou synthetickou cestu jsou následující:

PnAO analog podobné struktury jako látka A lze připravit reakcí 2-(kyanoethyl)diethylmalonátu s amoniakem a následující redukcí borohydridem sodným za vzniku 2-(ethylamin)malondiamidu* Tuto látku lze potom reagovat s ClCH^CH^CH^nřCH^J^.HCl a potom redukovat diboranem za vzniku 1,3-propandiaminového derivátu* Jeden díl tohoto propandiaminového derivátu se potom uvádí do reakce se dvěma díly chlor ozimového činidla za vzniku požadovaného PnAO derivátu* ‘

Druhý příklad zahrnuje reakci předem připravené Br-alky lamino v é soli (tj* BrCH^CH(CH^jNHCHÍCH^Jg.HBr s diethylmalonátem následované amidací redukcí diboranem a následující reakcí 1,3-diaminopropěnového derivátu s chloroximovým činidlem*

Činidla zobrazující myokard

Analoga mastných kyselin značená J-123 jsou účinná při zobrazování myokardu u lidí* Příjem myokardem a oxidační metabolismus těchto sloučenin není kriticky závislý na jemných strukturních rozdílech* Ve skutečnosti analoga mastných kyselin a dlouhým řetězcem, která mají objemné J-123-fenylové skupiny připojené na omega -konec pomocí různých řetězců . skupin jsou přijímány srdečním svalem* Z toho důvodu náhrada J-123-fenylového eubstituentu To-99m-PnAO (nebo Тс-PnAO analogem) by měly vést к Činidlu s podobným myokardiálním příjmem v důeledku mimořádné snadnosti, s níž toto neutrální hydrofobní chelátové činidlo prochází biologickými membránami. Analoga mastných kyselin a PnAO připojeným к omega-konci lze připravit diethylmalonátovou synthetickou cestou uvedenou dříve. Když se připraví deriváty 1,3-dlaminopropanu, PhAO nebo PnAO analogy lze připravit jejich reakcí s jedním z chloroxlmových činidel. Například Tc-99m-PnAO-hexaděkanové kyselina je exaktním analogem omega-J-123-fenylhexadekanové kyseliny, o níž Je známo, Že ae lokalizuje v myokardiální tkáni. Tento obecný typ sloučeniny je rychle přijímán srdečním svalem a vyčaruje se beta-oxldací. Sledováním rychlosti regionálního myokardlál ního vyčarování lze získat lokalizovaný oxidační nyokardiální metabolický index. Množství atomů nebo skupin lze použít к řetězení postranních řetězců analogů mastných kyselin a tetradentátaminoximovým chelatažním zbytkem. Bylo ukázáno, že připojení J-123-fenylové skupiny к omega-konci několika analog mastných kyselin s řetězci obsahujícími etherovou, amidovou, esterovou, thioetherovou, aminovou a sulfonimidovou skupinu nezměnilo významně jejich přijímání myokardem krys.

Bylo připraveno několik strukturních modifikací s cílem zachytit analoga J-123 značených mastných Iqrselin v srdečním svalu, aby bylo umožněno planární a tornografické zobrazení po delší dobu. Podobné modifikace lze provádět s deriváty omega-PnAO mastných kyselin. Je například známo, že přidání methylové skupiny do beta-polohy analoga (tj. kyseliny omega-J-131-feny1-b-methyltetradekanové) vodo к derivátu, který so koncentruje v myokardu a má retenční Čas dostatečně dlouhý, aby umožnil obvyklé SPÉCT zobrazování. Značkovaný analog mastné kyseliny takový jako tento, ktorý je parciálně metabolizován v myokardu, by měl být velice použitelný к zobrazování regionálního metabolismu v srdci. Přidání postranního řetězce s nízkou alkylovou skupinou v beta-poloze inhibuje beta-oxidaci mastných kyselin, Tak omega-Tc-99m-PnAO derivát mastné kyseliny s alkylovou substitucí v poloze C-3 by se měl chovat, in vivo podobně jako derivát beta-methy1-omega-J-123-fenyl mastných kyselin a nalézt Široká použití při metaholickém zobrazování myokardu. Dále, jednu nebo dvě alkylové skupiny lzs přidat к uhlíku řetězce mastné kyseliny v jiné než beta-poloze, což povede к ovlivnění metabolismu. Aby beta-oxidace byla přerušena, alkylové skupiny se musí nacházet na uhlíkových atomech, které jsou multipletem 2 mimo beta-uhlík.

Esenciální je skutečnost, že analogy mastných kyselin mají omezenou rozpustnost ve vodných roztocích. Tudíž možnost přípravy vyrábět přípravky typu ”kit pro rutinní humánní použití vyžaduje, aby Tc-99m-chelatující skupina připojená к omega-konci těchto analog byla schopná tvořit stabilní chslát ve vysokých výtěžcích při nízkých koncentracích nebo blízko neutrálního pH, Lineární tetrsdentát aminoxim ligand (například PnAO) je schopný tvořit v > 95% výtěžcích při Зх-1О*5 M (viz příklad 14, tabulka 1), V důsledku těchto vlastností, tento typ ligand, pokud je známo, je jediným z těch, která umožní produkci velkého množství analog To-99m-značkovaných mastných kyselin se stabilním neutrálním, lipofilním ohelétem na omega-konci kit typu přípravku,

Činidla zobrazující plíce

To-99m značkované sloučeniny, které jsou extrahovány z plasmy plicních tkání mohou být použitelné к diagnose různých plicních chorob, Tc-99m-PnAO vykázal význačnou lokalizaci plicní tkáně,

Protože Tc-99m-PnAO vyčeřuje krev a nahromadí se význačně v srdečním svalu poměry plíce/kro v a plíce/srdce jsou oba zhruba 10/1 po 15ti sekundách po injekci (tyto poměry jsou dostatečně vysoké, aby umožnily dobré zobrazení plic), Všechny Tc-99m komplexy PnAO nebo deriváty (PnAO analogy), které byly uvedeny pro použití к zobrazování mozku,mohou být použity rovněž к diagnose plicních chorob, Alkylderiváty (používané к měření rOBP ., hodnot pomocí určení regionálního mozkového vyčeřování) lze používat к diagnose plicních chorob, kde se požaduje příjem a vymývání neutrálníoh-lipofilních Tc-99m-farnak (například ke stanovení rozdílů extravaskulární vody /6/), Tc-99m-PnAO ve své nederivované formě by měl být vhodný pro tyto studie.

Deriváty alkylaminů a polyalkylamini navržených pro zobrazování mozku, které jsou zadržovány dostatečně dlouho pro zobrazení konvenčním SPÉCT zařízením (například Tc-99m-chelátová analoga látek A a B), mohou být rovněž použity. Tyto poslední typy látek by měly prodlouženou retenci v plicích (podobnou látce B), v důsledku její zřejmé vazby na vysoce afinitní vazebná místa aminů lokalizovaná na membránách plicních endotheliálních buněk. Tento typ Tc-99m látky by měl poskytovat způsob pro rutinní hodnocení metabolické funkce plic, zejména vliv plic na koncentraci cirkulujících bioaminů. Jak je uvedeno dříve, tetradentátaminoxidový ligand má jedinečnou vlastnost vést к přípravkům kit typu Tc-99o-značкоváných látek pro zobrazování mozku i plic v klinické jaderné medicíně.

EnAO bude vytvářet rovněž neutrální lipofilní stabilní Tc-99m-komplex, který paeivně difunduje intaktní BBB a dalšími lipidními dvouvrstevnými membránami. Lze synthetizovat derivované formy EnAO 8 různými substituenty připojenými na tetradentátový ligandový komplex, podobný struktuře navržení pro PnAO derivaci. Jediný rozdíl by spočíval v tom, že substituenty jsou připojeny na jeden nebo oba ethylenové uhlíky míst propy lenových uhlíků PnAO. Tyto deriváty lze vyrábět tvorbou derivátů ethylendiaminu, jak je znázorněno níže:

nh₂

Ethylanediaminový derivát bude reagovat a chloroximovým činidlem za vzniku různě substituovaných EnAO ligandů. Například «11 může být analog mastné kyseliny s postranní* řetězcem od 6 do 22 atomů uhlíku řetězených různými skupinami (například amidy, ethery atd.) s ® ^14* fcteré jsou atomy vodíku nebo jednou nebo více malými (1 až 3 uhlíky) alkylovými skupinami. R^ a R^ mohou být postranní řetězce s malými alkylskupinami (1 až 5 uhlíků) s R^ a R^ odpovídající atomu vodíku a vzniklé za použití alfa-beta-diketonů. Případně R^ může být alkylový nebo polyaminový řetězec (jenom se sekundárními nebo terciárními aminy). Tc-99m komplexy EnAO derivátů by ee měly chovat in vivo analogicky Tc-99m-PnAO derivátům. PnAO se nezdá být toxický. Swiss-Webaterovy myěi po intravenózní aplikaci asi 1 000 - 1 500 anticipovaných mg/kg dávky u lidí byly bez měřitelných nebo viditelných akutních účinků (viz příklad 21). To vede к závěrům, že tyto typy ligandů, jejich deriváty a jejich Tc-99m-cheláty budou bezpečné při používání při postupech diagnostické jaderné medicíny.

Výnález je ilustrován následujícími příklady. Příklady 1 až 17 popisují přípravu EnAO, PnAO a derivátů PnAO majících strukturu

Příklad	R1	R2	R3	R4	R5
2	1 S | 1 1 1 1 1	H	H	CH3	CH3
3	C2H5	H	H	CH3	CH3
4	n”C4H9	H	H	CH3	CH3
5	Π*ΟθΗ^^	H	H	CH3	CH3
6	CH3	CH3	CH3	CH3	CH3
7	CH3	OH	H	CH3	CH3
8	CH3	morfolin	H	CH3	CH3	•
9	CH3	piperazin	H	CH3	CH3
10	CH3	morfoliny&thyl	H	CH3	CH3
11	n-C6H13	H	H	CH3	CH3
12	n-C8Hn	H	H	CH3	CH3
13	n-C3H?	H	H	CH3	CH3
14	ch3	Et(Ph)NCH2CH2-	H	CH3	CH3
15	ch3	H	H	CH3	H
16	CH3	c5Hn	H	CH3	CH3
17	CHj	hexaděkanové kyselina	H	CH3	CH3

Přikladl

Příprava 4, 7-Dia za-3,3,8,8-tetramethyldekan-2,9-dion-bisoxiinu (EnAO)

Synthesa tohoto ligandu používá způsobu R.K.Murmana (J.Amer.Chem.Soc. , 1958, 80,

4174).

a/ 3-Chlor-3~methyl-2-nitro8obutan

18,5 ml 2-methyl-2-butenu (175 mol) a 19,5 ml isoamylnitritu (131 mmol) byly smíchány při teplotě *10 °C ve trojhrdlá bance· К míchané směsi bylo přikapáno 17,5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové, přičemž teplota se udržuje pod 0 °C· Po přidání bylo ježtě po dobu 30 minut pokračováno v míchání· Vysrážená pevná látka byla odfiltro* vána a promyta 4 x 5 ml chladného ethanolu· Pevná látka byla suěena v proudu vzduchu, až zmizely poslední atopy modrého zbarvení· Sušení ve vakuu poslqrtlo krystalickou pevnou hmotu, a výtěžkem 8,63 g, tj· 36 %· Pře kry stal o vání z methanolu při teplotě -80 °C poskytlo ostrou teplotu tání 72,5 až 74 °C·

Ь/ EnAO '

485 mikrolitrů (7,25 mmol) ethylendiaminu bylo přidáno pomalu к míchané chlazené suspenzi 2*171 g (16 mmol) 3-chlor-3-msthyl-2-nitroaobutanu v 10 ml methanolu. Získaná směs byla míchána při teplotě místnosti přea noc* potom vařena po dobu 8 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a odparek rozpuštěn v minimálním množství studené vody. Roztok byl zfiltrován a zpracován s malým množstvím pevného hydrogenuhliČitanu sodného. Po odstavení při teplotě 2 °C po dobu 72 hodin se vyloučila bezbarvá krystalická pevná látka. Pevná látka byla odfiltrována* promyta ledovou vodou a sušena ve vakuu.

Výtěžek: 272 mg (70*3 %) Teplota tání: 180 - 181 °C

Příklad 2

Příprava 4*8-diaza-3* 3.9,9-te trama thylundekan-2* 10-dion bis ozimu <PnA0)

Sloučenina byla připravena podle E.G.Vassiana a R.K.Murmana (Inorg.Chem.* 6, 2043» 1967).

3»8 g (28 mmol) 3-chlor-3-methyl-2-nitrosobutanu bylo na suspendováno v 10 ml suchého methanolu a ochlazeno na teplotu О °C. К míchané suspenzi bylo přikapáno 1*05 ml (12*5 mmol). Teplota vystoupila za míchání na teplotu místnosti a potom vařena pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin. Methanol byl odstraněn ve vakuu a pevná hmota byla suspendována v malém množství vody. Sraženina byla odfiltrována* promyta malým množstvím vody a sušena ve vakuu za vzniku produktu ve formě pevné bezbarvé látlqr.

Výtěžek: 2*2 g* 58 %. Překrystalování z minimálního množství methanolu poskytlo čistý vzorek.

Výtěžek: 1*68 g* 44 %

Teplota tání: 177 až 179 °C

Příklad 3

Příprava 5»9-diaza-4*4* 10* 10-tetramathyltradekan-3*ll-dion bisoximu

Tato sloučenina hýla připravena z 1,3-propandiaminu a 2-chlor-2-methyl-3-nitrosopentanu způsobem popsaným v příkladu 2.

Výtěžek: 3*43 g* 46 %

Vzorek byl překrystalován ze směsi ethylacetát/petroether.

Teplota tání: 140 až 141 °C (200 MHz, DMSO-dg, /ррш): 1,0 (t, €H), 1,5 (β, 12H), 2,15-2,36 (m, 8H), 3,2 (бе, 2Ю, 10.35 <β, 2H).

¹³C NMR (EKSO-dg) 10,9, 17,2, 25,8, 31,4, 41,2, 57,0 a 163,8 ррш.

IČ (KBr dle) 3300, 3190, 3050, 2990. 2060, 2930, 2870, 1650, 1460, 1390, 1380, 1365. 1180, 1140, 1070, 1045, 1000, 950, 830, 780 a 650 cm“¹.

V těchto i následujících příkladech jeou údaje KMR v ррш a údaje IČ v oa'\

Příklad 4

Příprava 7,ll-diaza-6,6,12,12»tetramethylheptadekan-5,13-dion bisoximu

Sloučenina byla připravena reakcí 1,3-propandiaminu в 2-chlor-2-methyl-3-nltroso~ haptánu způsobem podobným jako je popsán v příkladu 2.

Výtěžek: 60 %

Teplota tání: 170 až 172 °C (ve formě dihydrochlorldové soli). ^lH NMR (volná báze, 200 MHz, CDClp ďppm) 0,96 (t, ЭН), 1,2б (о, 12H), 1,21 - 1,70 (m, 12H), 2,27 (m, 4H), 2,45 (t, 2H).

Příklad 5

Příprava 12,16-diaza-*ll,ll,17,17-tetramethylheptakosa-10,18-dion bleoximu

Tato látka byla synthstlzována z 1,3-propandiaminu a 2-chlor-2-methyl-3-nitrosodekanu způsobem popsaným v příkladu 2.

Výtěžek: 37 %

Teplota tání: 185 až 186 °C (ve formě dihydroohlorldové soli) ¹H NMR (volná báze, 60 MHz, CDC1₃, /ppm): 2,55 (4H), 2,25 (m, 4H), 1,0 - 2,0 (m, 44H), 0,9 (dt, 6H).

Příklad 6

Příprava 4,8-diaza-3,3_t6,6,9,9-hexamethylundekan-2,lO-dion biaoximu

Ligand byl připraven v 44% výtěžku reakcí 2,2-dimethyl-l,3-propandiaminu a 2-chlor2-methyl-3-nitroaobutanu za použití způsobu popsaného v příkladu 2.

Teplota tání: 151 až 152 °C

Příklad 7

Příprava 4,8-diaza-6-hydroxy-3,3,9,9-tetramethyl~2,10-dion bleoximu

Sloučenina byla připravena ze 2-hydroxy-l,3-propandiaminu a 2-chlor-2-raethyl-3-nitroaobutanu způsobem popsaným v příkladu 2.

Výtěžek: 37 %

Teplota tání: 139 až 140 °C, ^XH HMR (60 MHz, DMSO-dg /ppm): 3,7 (m 1H), 2,35 (m, 4H), 1,8 (a, 6H), 1,2 (в, 12H).

Příklad 8

Příprava 4,8-diaza-6-N-morfolyl-3,3»9»9-tetramethylundekan-2, 10-dion bisoximu a/ Diethylmorfolylmalonát

К míchanému roztoku 19»7 g (0,22 mol) morfolinu v suchém acetonitrilu při teplotě místnosti bylo přidáno 23»9 g dlethylbromnalonátu (0,1 mol)· Když bylo skončeno přidání byla reakční směs vařena pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin· Po chlazení byla odsáta vysrážená sůl a promyta dlchlormethanem· Filtrát byl zkoncentrován, přidána voda a dichlormethan a hodnota pH roztoku byla nastavena na hodnotu 10· Organická vrstva byla promyta vodou, suSena a koncentrována. Získaný oranžový olej byl deatilován za vzniku požadovaného produktu ve formě světlého oleje.

Výtěžek: 18,40 g, 75 %

Teplota varu: 99 až 104 °C/0,04 - 0,06 ona Hg ^XH NMR (6o MHZ, CDClj, <fppn): 1,0 - 1,7 (t, 6H), 2,6 - 2,98 (ш, 4H), 3,6 - 3,9 (m, 4H), 4,0 (а, 1H) a 4,05 - 4,4 (q, 4H).

IČ (film) 2980, 2880, 1750, 1445, 1300, 1265, 1225, 1160, 1120, 1040 a 860 cm¹.

b/ Morfolylmalonamid

К míchanému roztoku 24,5 g (0,1 mol) diethylmorfolylmalonátu ve 250 ml suchého methanolu nasyceného suchým amoniakem bylo přidáno katalytické (50 mg) množství sodíku. Po míchání reakční směsi přes noc byl roztok znovu nasycen amoniakem a ponechán stát po dobu 3 dní. Získané bezbarvé krystaly byly odfiltrovány a pronyty methanolem a etherem a sušeny ve vakuu·

Výtěžekz 17,40 g, 93 % Teplota tání: 231 až 235 °C

Po překryatalování z methanolu teplota tání 234 až 238 °C.

^XH NMR (360 MHz, DMSO-dg, íppm): 2,58 (m, 4H), 3,65 (m, 5H) a 7,4 (m, 4H).

Ifi (KBr dlec) 3400-3180, 1710, 1680, 1610, 1375, 1285, 1270, 1150, 1110 a 885 cm“¹ c/ 2-Morfolyl-l,3-propandlamin ml (0,8 mol) bortrifluoridetherátu ve 150 ml tetrahydrofuranu bylo přikapáno к ochlazené (0 °C) míchané suspenzi Jemně rozmělněného borohydridu sodného (22,7 g, 0,5 mol) ve 200 ml tetrahydrofuranu. Po míchání pod duaíkem při teplotě místnosti po dobu 2 hodin bylo přidáno po malých dávkách 31,6 g (0,17 mol) jemně rozetřeného morfolylmalonamidu· Reakční a mše byla míchána přes noc a vařena pod zpětným chladičem po dobu 8 hodin· Reakční aměs byla zpracována opatrným přidáním směai tetrahydrofuranu a 1M kyseliny chlorovodíkové (50 ml aměai v poměru 1 : 1) a 10 ml 1M kyseliny chlorovodíkové· Po míchání po dobu 3o minut byla reakční srnče odpařena к suchu a borduaíkatý komplex byl rozrušen varem a 250 ml 5M kyseliny chlorovodíkové po dobu 6 hodin· Neutralizace pecičkami hydroxidu sodného s nasycení vodné fáze solí a hydroxidem sodným poskytlo bezbarvou sraženinu. Ta byla odfiltrována a pečlivě pronyta etherem a nasycená vodná fáze byla extrahována 10 x 30 ml etheru· Organické vrstvy byly spojeny, sušeny síranem sodným a koncentrovány za vzniku 4,73 g oranžového oleje. Olej byl čištěn krátkocestnou destilací (120 - 150 °C /0,03 - 0,05 mm Hg) za vzniku avětlého oleje·

Výtěžek: 2,75 g, 10 % ^XH NMR (60 MHz, M.OH-d₄, dppa): 2,4-2,8 (в, 9H) a 3,5-3,8 (в, 4H).

Ιδ (film) 3460, 2950, 2850, 1600, 1450, 1290 a 1115 cm”¹.

d/ 4,8-diaza-6-N-morfolyl-3,3,9·9-tetramethylundekan-2,10-dion bisoximu

Příprava ligandu byla uskutečněna reakcí 2-morfolyl-1,3-propandiaminu a 2-chlor-2-methyl-3*nitrosobutanu způsobem popsaným v příkladu 2.

Výtěžek! 19 %

Teplota tání: 167 až 169 °C ¹H NMR (200 MHz, DMSO-dg, <Гррш): 1,12 (а. 12H), 1,68 (а, 6H), 2,1-2,5 (m, 9H), 3,33 (а, 4H), 3,53 (а, 2H) a 10,39 (а, 2H).

I.Č. (KBr diac) 3420, 2970, 2930, 2850, 1450, 1380, 1370, 1140, 1125, 1010 a 935 c=^_1

Příklad 9 , 8-dlaza-6-N-piperIdy 1-3 , 3 · 9»9-tetramethylundekan-2,10-dion bia oximu a/ diethylpiperidylmalonát

Byl připraven podobně jako ethylmorfolylmalonát za vzniku oleje v Q3% výtěžku. Teplota varu: 84 - 68 °C / 0,06 - 0,07 nim Hg.

^гН NMR (60 MHz, CDCly <Tppm). 1,1-1,3 (t, 6H), 1,3-2,0 (m, 6H), 2,6-3,0 (m, 4H),

4,1 (β, 1H) a 4,15-4,5 (q, 4H). Ι.δ. (film) 2990, 2940, 1750, 1300, 1240, 1170, 1125, 1035 cm”¹

Piperidylmalonamid

V kryatalické formě byl připraven stejně jako morfolylxnalonamid. «*

Výtěžek: 90 %

Teplota tání: 259 - 260 °C (z methanolu) ^XH NMR Обо MHz, DMSO-dg, Jppm). 1,45 (Ъа, 4H), 3,3 (а, 1H) a 7,25 (d, 4H). Ι.δ. (KBr disk) 3395, 3195, 1670, 1375, 1140 a 690 cm’¹.

c/ 2-piperidyl-l,3-propandiamin

Byl připraven podobně jako morfolyl-1,3-propandiamin. Krátkoceatá destilace (teplota 60 °C / 0,06 mm Hg) poskytla v 6% výtěžku bezbarvý olej· ^XH NMR (200 MHz, Me0H-d₄, (Tppm): 1,3-1,6 (m, 6H) a 2,3-2,8 (m, 9H). 1.8. (film) 3360, 3280, 2915, 2850, 2800, 1600, 1460, 1455, 1445, 1150 a 1100 cm¹.

d/ 4,8-dlaza-6-(N-piperidyl)-3»3»9,9-tetramethylundekan-2_t10-dion biaoxim

Byl připraven podobně jako 5-morfolylderivát. Surový materiál krystaloval ze aměai vodná báze/dichlormethan a byl překryatálován z methanolu/voda.

Výtěžek: 16 %

Teplota tání: 168 až 169 °C .

^XH NMR (250 MHz, MeOH-d₄, ďppm)i 1,1 (d, 12H), 1,4 (b.a. 6H), 1,7 (а. 6H) a 2,0-2,5 (m, 9H).

Ι.δ. (KBr) 3400, 2930, 2850, 1330, 1140, 1020 a 935 cm¹.

Příklad 10 • a

Příprava 4,8-diaza-6-(N-Dorfolinoethyl)-3,3,9,9-tetramathylundekan-2,10-dion biaoximu a/ Morfolinoethyl-diethylmalonát 5,0 g (217 mmol) sodíku bylo naváženo do trojhrdlé banky opatřená zpětným chladičem a kapací nálevkou· 125 ml bezvodého aodíku bylo přidáno к rozpuštění sodíku. Bylo přidáno 33»0 ml (217 mmol) diethylmalonátu a reakční směs byla vařena pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin. Bylo přidáno 32,6 g (217 mmol) morfolinoethylchloridu a amea byla vařena pod zpětným chladičem po dobu 4,5 hodiny.

Po ochlazení na teplotu místnosti byla všechna rozpouštědla odstraněna ve vakuu a odparek rozdělen mezi vodnou zředěnou kyselinu chlorovodíkovou a ether. Kyselá vrstva byla promyta etherem a hodnota pH byla upravena na 14 pecičkami hydroxidu aodného. Vodná vratva byla extrahována 3 x 50 ml etheru. Spojené etherové extrakty byly auSeny bezCS 271306 B2 vodým síranem hořečnatým a zkoncentrovány ve vakuu. Vakuová destilace odparku poskytla produkt ve formě bezbarvého oleje.

Výtěžek: 6,6 g, 11 %

Teplota varu: 110 °C / 0,15 mm Hg b/ 2-Morfolinoethy1-malonamid

14,3 g (53 mmol) výše uvedeného eeteru bylo rozpučtěno ve 35 ml methanolu a naeyceno amoniakem. Bylo přidáno 5 mg kovového sodíku a baňka byla uzavřena a odstavena.

Po uplynutí doby 3 až 4 dní byla sraženina odfiltrována, promyta 3 x 10 ml etheru a sušena ve vakuu za vzniku produktu ve formě bezbarvé krystalické pevné látky.

Výtěžek: 7*3 g, 64 % ** с/ 2-Morfolinoethy1-1,3-propandiamin

899 mg (4,2 mmol) 2-morfolinoethyl-malonamidu bylo nasuspendováno do 20 ml bezvodé- ho tetrahydrofuranu a uveden argon. Během 30ti minut bylo přikapáno 27 ml 1M roztoku boran-tetrahydrofuranového komplexu к míchané na 0 °C chlazené reakční směsi. Teplota reakční směsi byla zvýšena na teplotu místnosti a potom vařena pod zpětným chladičem po dobu 3*5 hodiny. Roztok byl ochlazen na teplotu 0 °C a stříkačkou bylo přidáno 6 ml vodné 5M kyseliny chlorovodíkové. Po stání při teplotě místnosti přes noc byl tetrahydrofuran odstraněn ve vakuu. Zfiltrovaný vodný roztok byl nasycen hydroxidem sodným a extrahován 3 x 50 ml etheru. Spojené etherové extrakty byly sušeny bezvodým síranem hořečnatým a koncentrovány ve vakuu. Krátkocestnou destilací odparku byl získán produkt ve formě bezbarvé kapaliny.

Výtěžek: 353 mg, 45 %

Teplota varu: 75 °C / 0,2 mm Hg d/ 4,8-Diaza-N-(N-morfolinoethyl)-3,3.9,9*tetramethylundekan-2,10-dion bisoxim

Ligand byl připraven reakcí 2-morfolinoethy1-1*3-propandiaminu a 2-chlor-2-methyl-3-nitrosobutanu, jak je popsáno v příkladu 2.

Teplota tání: 103 až 105 °C

Ligandy příkladů 11 až 14 byly synthetizovány způsoby uvedenými v příkladech 2 až

10. .

Příklad 11

9,13-Diaza-8,8,14.14-tetramethylhenikoean-7,15-dion bieoxim ¹ Byl připraven ve formě dihydrochloridu.

Teplota tání: 197 až 198 °C ‘a·

Příklad 12 ll,15-Diaza-10,10,16,16-tetramethylpentakosan-9,17-dion bisoxim

Byl připraven ve formě dihydrochloridu.

Teplota tání: 198 °C (rozklad)

Příklad 13

6,10-Diaza-5,5.11.11-tetramethylpentadekan-4,12-dion bieoxim

Byl připraven ve formě volné báze.

Teplota tání: 89 až 91 °C

Příklad 14

4,8-Dia za-6- (6-ethy 1-N-fenylaminoethy 1 )-3.3,9.9-tetramě thylunděkan-2,10-dion bieoxim

Připraven ve formě volné báze.

Teplota tání: 165 až 170 °C (rozklad)

Příklad 15

4,Θ-Dlaza-3,9-dlmethylundekan-2,10-dion bieoxim a/ 2-butanon-3.3^-(1,3-propandiyldinitriolo)bisoxim

4.14 g (41 mmol) 2,3-Butandion monooximu bylo rozpuštěno v 11 ml ethanolu při teplotě 70 °C. Ze stříkačky bylo přlkapáno 1,7 ml (20 mml) propandiaminu a roztok byl míchán po dobu 5 minut· Roztok byl míchán po dobu 4 hodin a ponechán ochladit na teplotu místnosti· Po ochlazení na teplotu O °C zadala krystalizace· Bezbarvá pevná látka byla odfiltrována a promyta 3 x 10 ml etheru a sušena ve vakuu za vzniku produktu ve formě bezbarvé pevné hmoty·

Výtěžek: 2,50 g, 51 % Teplota tání: 89 až 90 °C

Další překrystálování z ethanolu poskytlo materiál větší čistoty. Teplota tání: 91 až 92 °C b/ 4,8-Diaza-3.9-dimathylundekan-2_t10-bisoxim

2,5 g (12,1 mmol) 2-butanon-3.3¹·(1,3-propandiyldinitriolo)bisoximu bylo nasuspendováno ve 28 ml 95% vodného ethanolu při teplotě 0 °C· Během 30ti minut bylo přidáno 0,93 g (25 mmol) borohydridu sodného po částech a po přidání bylo ještě dalších 30 minut pokračováno v míchání· Bylo přidáno 8 ml vody a reakční směs byla míchána po dobu 30 minut· Ethanol byl odatraněn ve vakuu a vodný roztok byl zředěn více vody. Po nastavení nodnoty pH na asi 10,5 za použití zředěné kyseliny chlorovodíkové byl roztok extrahován 7 x 30 ml methylenchloridu· Spojené organické extrakty byly koncentrovány ve vakuu za vzniku produktu ve formě bezbarvého oleje (930 mg), který krystaloval stáním· Pevná látka byla nasuapendována do horkého methylenchloridu (4 ml), promyta 3 x 5 ml etheru a sušena ve vakuu· Byl získán produkt ve formě bezbarvé krystalické látky·

Výtěžek: 450 mg, 18 %

Teplota tání: 119 až 122 °C ^XH HMR (200 MHa, DMSO-dg, /ppn) 10,2 (2H, β, 0-H), 3,2 (2H, q, CH), 2,3 (4H, t, CHgN),

1,65 (6H, β, N-CMe), 1,44 (2H, m, CHj). 1,04 (6H, d, CH^)

Příklad 16

Příprava 4,8-Dla«a-6-pantyl-3,3,9,9-tetramethylundekan-2,10-dion biaoximu a/ 2-Pentyl-dlethylmalonát

1,0 g sodíku bylo rozpuštěno v 10 ml čerstvě destilovaného absolutního ethanolu· К tomuto roztoku bylo přidáno 7 ml čerstvě destilovaného diethylmalonátu· Tato suspenze byla zahřívána po dobu dvou hodin na teplotu 70 °C· К suspenzi bylo přidáno 5,5 ml čerstvě destilovaného brompentanu· Získaná směs byla pomalu zahřívána přes noc к bodu varu pod zpětným chladičem· Z reakční směei byl oddeatilován ethanol a produkt byl získán vakuovou destilací·

Teplota varu: 78 °C až 86 °C / 4,5 mm Hg

Výtěžek; 4,5 ml

Hmotové spektrum, m/e · 230 (Ы+)

NMR (60 MHz, CDCip, 0,8 (t, 3H). 1,1 (t, 12H), 1,7 (široký signál, 2H), 3,1 (t, 1H), 4,1 (9, 4H)· b/ 2-Pentylmalondiamid (II)

5,0 g výše uvedeného esteru (I) bylo rozpuštěno ve 25 ml methanolu a roztoku amoniaku v methanolu (50 ml roztoku nasyceného při teplotě 0 °C obsahujícího methylát sodný (z 50 mg sodíku)· Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 90 hodin· Bezbarvá sraženina byla odfiltrována а p гощу ta horkým methanolem·

Výtěžek: 70 %

Teplota tání: 185 °C

Hmotové spektrum m/e-173 (M+).

IČ, 3450, 3374, (N-H); 1690 (C-0), 1600 (N-H)

NMR (60 MHz, IMS0-d₆), 0,8 (t, 3H), 1,1 (m, 6H), 1,6 (široký signál, 2H), 7,2 (s, široký, 2H)· с/ 2-Pentylpropandiamin (IV)

2,0 g (II) byly suspendovány do 40 ml čerstvě destilovaného tetrahydroíuranu· Suspenze byla ochlazena na teplotu 0 °C a 40 ml diboranu THP-komplex byl přidáván postupně· Suspenze byla míchána při teplotě místnosti po dobu asi 20 hodin a teplota byla potom zvýšena na teplotu varu· Po době 1 hodiny varu pod zpětným chladičem byla získaná suspenze ochlazena na teplotu místnosti a bylo přidáno 10 ml 5N kyseliny chlorovodíkové· Tetrahydrofuran byl odstraněn destilací· Zbylý hustý odparek byl nasycen pecičkami hydroxidu sodného a suspenze byla extrahována petroletherem· Etherové extrakty byly pronyty vodou a sušeny síranem sodným· Produkt byl hodnocen pomocí tenkovrstevné chromá tografie a desky byly vyvíjeny směsí methanol/hydroxid amonný a vybarveny síranem mě Sňatým· Po mírném záhřevu se objevovala jediná skvrna·

Ι·δ· 3400, 3300 (N-H). 1670. 1600 (N-H)

NMR (60 MHz. CDCip, 0.8 (t, br. 3H). 1,1 (a, sr. ΘΗ). 1,6 (br, 1H). 2.5 (br. 4H). 3,5 (br. 4H)· d/ 4,8-Diaza-6-pentyl-3,3,9,9-tetramethylundekan-2,10-dion bisoxim (V)

140 mg (IV) bylo rozpuštěno v 5 ml čerstvě destilovaného methanolu a bylo přidáno

290 mg 3-chlor-3—methy1-2-nitrosobutanu· Získaná reakční aměs byla udržována při teplotě 0 °C po dobu 2 hodin a potom přivedena na teplotu místnosti. Po dvou hodinách při teplotě místnosti byla reakční směs zahřívána к varu pod zpětným chladičem přes noc·

Získaný roztok byl koncentrován za sníženého tlaku a suspendován v chloroformu. Tato suspenze byla filtrována a filtrát byl sledován tenkovrštevnou chromátografií jako vpředu· Byla získána jedna zelená skvrna a R^ větším než u (IV).

IR 3250 (O-H), 1675 (ON), 1600 (N-H).

NMR (60 MHz, CDC1₃), 0,8 (t), 1,1 (e, br), 1,3 (я, br), 1,8 (e, br), 2,3 (m, br), 3,0 (br), 3,5 (n>, br), 9 (d, br).

Příklad 17

Příprava 4,8-Diaza-6-(15-karboxy-n-pentadeeyl)3,3,9,9-tetramethylundekan-2,10-dion bisoximu a/ 16-bromhexaděkanové kyselina

16,0 g kyseliny 16-hydroxydekanové bylo rozpuštěno ve 100 ml 30% kyseliny bromovodíkové v koncentrované kyselině octové a reakční směs byla sušena za sníženého tlaku a konečně destilována ve vakuu při teplotě 100 °C / 4,8 mm Hg. Destilát zkryetaloval z petroletheru·

Výtěžek: 90 %

Teplota tání: 69 až 69,5 °C

Ι·δ· (film) 1675 (C-0) mm (60 MHz, ODC1₃), 1,5 (a, br, 0¾). 2,3 (m, CHg-OO), 3,4 (t, 0Η₂·Βτ), 9 (br COOH).

b/ 2-(15-karboxy-n-pentadecyl)-diethylmalonát (VII)

1,0 g kovového sodíku bylo rozpuštěno v 15 ml čerstvě destilovaného absolutního ethanolu. Potom bylo přidáno 7,0 g diethylmalonátu к ochlazenému roztoku ethylátu sodného. Získaná suspenze byla vařena pod zpčtným chladičem po dobu 1 hodiny a ochlazena na teplotu místnosti· Potom byly přidány 2,0 g kyseliny 16-bromhexadekanové a suspenze byla vařena pod zpětným chladičem přes noc. Suspenze byla ochlazena a většina ethanolu byla odpařena· Získaná bezbarvá sraženina byla důkladně promyta studeným ethanolem·

Ι·δ· 11750 (-0-0), ester), 1710 (-00, kyselina) mm (60 MHz, CdClj), 1,2 až 1,5 (a, br, CHg), 2,3 (m, CHg-OO), 3,2 (m, O-C-CH-OO),

3,4 (m, CHg-Br), 4,1 (g, -CH₂-0-00).

с/ Amonná sůl kyseliny 17,17-bis(aminokarbonyl)heptadekánové (VIII)

2,65 g 2·(hexaděkanové tyselina)diethylmalonátu bylo suspendováno ve 100. ml čerstvě destilovaného methanolu nasyceného amoniakem při teplotě 0 °C. К této suspenzi bylo přidáno 200 mg sodíku v roztoku methanolu a získaná směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 18 hodin· Produkt byl získán z vroucího methanolu filtrací.

Teplota tání: 225 až 230 °C

Ι·δ· (nujol), 3400, 3200 (NH), 1700 (0-C-H), 1575 (0-C-0-)

NMR (60 MHz, DMSO-d^), 1,2 až 1,5 (CH₂), 2,3 (m, -CH^OO), 6,8 až 7,2 (s, br, ^OO). Tento dublet zmizel po okyselení.

Po olqrselení výše uvedené amonné soli se absorpce IČ z 1575 změní na 1675 a teplota tání se změnila na 184 až 186 °C.

d/ Amoniová sůl kyseliny 18-amino-17-aminomethyloktadekanové (IX)

500 mg VIII bylo suspendováno do destilovaného tetrahydrofuranu a mícháno po dobu hodiny při teplotě varu pod zpětným chladičem. Suspenze byla ochlazena a postupně bylo injekční stříkačkou přidáno 8 ml 1M komplexu diboran : tetrahydrofuran. Mléčná suspenze byla míchána po dobu 1 hodiny a potom vařena pod zpětným chladičem. Všechny operace byly prováděny v dusíkové atmosféře. Po uplynutí doby 3 hodin byla reakční směs ochlazena a přidán led. Získaná suspenze byla okyselena 5N kyselinou chlorovodíkovou a tetrahydrofuran byl oddestilován. Hodnota pH byla upravena na 12 hydroxidem amonným a suspenze byla za horka zfiltrována· Po několikerem promytí vodou byla získána bezbarvá sraženina. Teplota tání: 117 až 120 °C

IČ (nujol) 34CO, 3200 (NH), 1675 (0-C-0-), 1600 (NH).

NMR (60 MHz, DMSO-d^), podobné jako u III s výjimkou ztrátu dubletu 6,8, 7,2 .

e/ 4,8-Dia za-6- (15-karboxy-n-pentadecy 1 )-3,3,9,9-te tramě thy lundekan-2,10-dion bisoxim bude připraven přidáním 2-chlor-2-methyl-3-butanon oxim к IX jako v příkladu 16.

Příklady 18 až 21 popisují přípravu a chemické vlastnosti techneciových komplexů EnAO_t PnAO a PnAO derivátů.

Příklad 18 _w Příprava roztoků Тс-PnAO z Tc-99m •

2,0 mg PnAO byly rozpuštěny v 0,1 ml 10*^ až 10** M HC1 (tj. pH 3-4) a hodnota pH byla potom upravena na 8 přikapáním 0,1 M hydroxidem sodným. К tomuto roztoku bylo přidáno 0,7 ml Tc-99m (7 až 30 mCi ve formě NaTcO^) následované přidáním 0,1 ml SnC^H^O^ (10*^M) (vínanu cínatého).

To vede ke koncentraci ligandu 3,5 x 10*^ M. Roztok byl pro tře pán a ponechán stát po dobu 10 až 30 minut· V některých pokusech ředění roztokem chloridu sodného, octanu nebo hydrogenuhliČitanu bylo použito ke studiu vlivu změn na koncentraci ligandu nebo pH· К přípravě Tc-99-PnAO bylo použito rovněž Tc-99 (5 x 10“? M nebo 5 x 10®M NH^TcO^)

Jako alternativní způsob byly nasuspendovány 2 mg PnAO do 0,9 ml Tc-99m a 0,1 ml SnC^H^O^ a směs byla udržována po dobu 20 minut při teplotě 80 °C< SmSs byla ochlazena a filtrována.

Příprava pevného Тс-PnAO z Tc-99

Připravený roztok nebo 10 ml 10^ PnAO v 1O^IC1, 1 ml NaTcO^ připraveného generátorem (lmCi Tc-99m) jako 2 ml 1M NaHCO^ byly smíchány a zahřívány na teplotu 80 °C· Те 2Otlminutových intervalech byly přidány tři 0,2 ml části 10“¹ chloridu cínatého· Byl získán oranžově hnědý roztok a pevná hmota·

Pevná hmota byla extrahována methanolem· Ke dvěma ml tohoto extraktu byly přidány dvě kapky vody a ponecháno odpařovat· Po uplynutí doby čtyř dní se objevily oranžově červené kxy staly a jeden byl vybrán ke strukturní studii pomocí difтаксе X-papraky·

Příklad 19 j Komplexy příkladu 18 byly podrobeny hodnocení, které zahrnovalo vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC), vzestupnou papírovou chromatografií (PC), elektroforesu a extrakcí rozpouštědly· Krystalová struktura pevného Тс-PnAO byla stanovena pomocí difrakce X-paprsky.

HPLC separace

HPLC separace byly provedena na Hamiltonově PRP-1 koloně в Beckmanovou sérií 332 gradientovým chromátografickým systémem s dvojitým čerpadlem· Radioaktivita v rozpouštěd le byla detegovaná pomocí NaJ scitilačního detektoru napojeného na měřič intenzity. Signál z měřiče byl směrován na registrační přístroj B-5000 (Houston Instrument Co.) a na integrátor Hewlett-Packardův model 339OA.

Kapalná fáze počínájící separace byla 0,02 M Na^PO^ obsahující 2% methanol· 30 sekund po injekci lOtimililitrového vzorku byl přidáván gradientově tetrahydrofuran, takže jeho objem % byl 25 ve 3»5 minutách· Eluce pokračovala v koncentraci po 8,0 minut, ve které byla kapalná fáze upravena na 2% methanolem к ekvilibraci kolony pro další separaci· Průtok byl 2 ml/min pro všechny fáze separace· Redukovaný hydrolyzovaný Tc se eluoval při 0,7 minutách TcO^ při 1,1 minuté a komplex při 6,5 minutách· Procenta výtěžku komplexu byla hodnocena z oblastí pod píky měřenými integrátory· Hydrofobnost komplexu je ukázána nezbytností použití organického rozpouštědla к jeho eluci·

Papírová chromatografie a elektroforesa

Alternativní způsob analýzy využíval výsledků papírové chromátografie a elektroforeey·

Na papírové proužky (5 x 120 mm, nastříhané z Gelmanových saturačnich polštářků) bylo naneseno 5 mikrolistů vzorku 1 cm na dolní díl proužku a proužek byl vyvíjen acetonem a roztokem chloridu sodného· Selo rozpouštědla bylo ponecháno vzlínat na vršek proužku· Proužek byl nastříhán na 6 dvoucentimetrových dílků a Tc-99 v jednotlivém dílku bylo stanoveno počítáním na počítači s jodidem sodným· Elektroforesa byla prováděna ae zdrojem proudu Gelman Delux Power Supply a komůrce za použití 0,1 M hydrogenuhličitanového pufru při hodnotě pH 8,5 a Beckmanových 4F320046 elektroforetických proužků při 300 voltech po dobu 45 nebo 60 minut·

Proužky byly snímány snímačem Technical Asaociates nebo rozstříhány na úseky jako uvedeno výše·

Procento techneciatanu a redukovaného Tc-99m lze atanovit z aktivity píku na elektroforetické anodě, popř· počátečního úseku papírové chromatografie v solném roztoku· Velký elektroforetický pík na začátku v nepřítomnosti redukovaného Tc je důkazem neutrálního komplexu·

Separace v systémech oktano/ohlorid sodný a chloroform/chlorid sodný mikrolitrů Tc-99m-PnA0 komplexu připraveného jedním z výše uvedených způsobů bylo přidáno к 5 ml normálního solného roztoku a roztok byl důkladně promíchán· .1 ml tohoto roztoku byl přidán к 1 ml oktanolu a míchán po dobu 1 minuty a potom centrifugován po dobu 5 minut· Z každé vrstvy byly odebrány alikvotní 10-mililitrové podíly a vyhodnoceny na scintilačním počítači s nádobkami NaJ· 0,8 ml alikvotní podíl oktanolové vrstvy byl odebrán a přidán ke stejnému objemu solného roztoku a jako vpředu byla provedena extrakce a hodnocení· Výsledky této zpětné extrakce byly použity к vypočtení poměru oktanol/solný roztok· Podobné pokusy byly provedeny se směsí chloroform/solný roztok jako přibližné hodnocení výtěžku komplexu· Vysoký extrakční poměr u těchto rozpouštědel ukazuje na hydrofobnost komplexu·

Výsledky

Vliv koncentrací technecistanu PnAO a SnC^H^Og na výtěžek komplexu jsou ukázána v tabulce 1·

Tabulka 1

Vliv koncentrací na výtěžek komplexu

Technecistan	(PnAO)	(SnC4H4O6)	Výtěžek (%)
Tc-99m	3	x 10”3	1 x 105	98
Tc-99m	3	x 104	1 x 105	99
Tc-99m	3	x 105	1 x 105	95
Tc-99m	3	xlO-6	1 x 10“5	93
Tc-99m	5	x 10’5	1 x Ю6	98
X5 x 10~7	5	x 105	5 X 10”6	97
X5 x 10~6		a	2 x ΙΟ3	98

Tc-99m koncentrace byly v rozmezí (0,4-2)xl0~⁷ M.

X pro tyto studie bylo použito Tc-99m Výtěžky komplexu byly měřeny po 30ti minutách po preparaci za použití HPLC a/ Nasycený roztok PnAO při 50 °C.

To dokazuje, že komplex lze vytvořit ve vysokém výtěžku při technecistanových koncentracích ekvivalentních těm, se kterými se obvykle setkáváme u komerčních generátorů Mo-99-Tc-99 a nízkých koncentracích PnAO a redukčního činidla.

Vliv pH na tvorbu komplexu je ukázán v tabulce 2. Výtěžky byly měřeny 30 minut po tvorbě komplexu.

Tabulka 2 .

Výtěžek komplexu v závislosti na hodnotě pH *

pH	Výtěžek ( % )	pH	Výtěžek ( % )
3,2	76	8,5	98
4,0	85	10,0	98
5.5	92	11,0	91
7,0	98 .	12,0	80

Vliv hodnoty pH na stabilitu komplexu skladovaného na vzduchu je ukázáno na tabulce 3. Komplexy byly připraveny při pH 8,5 a potom upraveny na ukázané pH. Věechny byly nejméně z 98 % ve formě komplexu v době tvorby.

Tabulka 3

Vliv hodnoty pH na stabilitu komplexu

pH		Výtěžek komplexu ( % )
	1 hod.	2 hod.	24 hod.
3.2	96	81	59
4.0	92	80	53
5.5	98	97	98
7,0	99	—	—
8.5	100	98	95	4
10,0	99	97	95	-
11,0	71	34	0	*
12,0	14	0	0

Komplex lze vytvořit ve vysokém výtěžku v rozmezí hodnoty pH 5·5 až 10 a je stabilní až 24 hodin při tomto pH· Bylo rovněž nalezeno, Že komplexy připravené při hodnotě pH 8,5 a ředěné faktorem 1000 normálním solným roztokem byly rovněž stabilní po dobu 24 hodin·

Tvrzení, ze komplex je neutrální a vzniká ve vyeokém výtěžku, je ukázán výsledky tabulky 4·

Tabulka 4

Papírová chromatografie a elektroforesa Te-PnAO, ТсОд a redukovaného hydrolyžovaného Tc· (Тс-oba Tc-99 a Tc-99m)

	Tc-PnAO	tco;	red. Tc
% aktivity na začátku papírové
chromátografie
Aceton	~2	<1	~100
solný roztok	<1	<1	^100	A
Vzdálenost migrace při elektroforesa, cm
Anoda	0	ώ'θ	0
Katoda	0	-	0
% aktivity na začátku elektroforesy	>97	1	100.

Na začátku elektroforesy se tvoří význačný pík, který není redukovaným Tc-99m (dokázáno papírovou chromátogrsfií) a jedná se tudíž o komplex, který musí být neutrální.

Dále, průkaz hydrofobnosti spočívá v tom, že extrakční poměr oktano/solný roztok pro

Tc-PnAO (průměr z 5ti pokusů) je lit 3 a extrakční poměr chloroform/solný roztok je 29 i í 5.

Тс-EnAO komplex в Tc-99m

Výše uvedeným způsobem byl rovněž připraven komplex EnAO. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 5.

Tabulka 5

Výtěžky a extrakční poměry komplexů Tc-99m 8 EnAO a PnAO

	Procento Výtěžek	Oktanol/solný roztok, extrakční poměr	Chloroform/solný roztok, extrakční poměr
	Tc-99m-EnAO	95	3,4	21
	Tc-99m-PnAO	95	11 i 3	29 t 5

a a Připraveno, jak je popsáno vpředu při hodnotě pH 8,1 a ligandových koncentrací pohybu jí cích se od ΙΟ*⁴ do 5 x 10”² M.

Struktura pevného Тс-PnAO 8 Tc-99

Struktura pevného Тс-PnAO byla stanovena pomocí difrakce X-paprsky za použití údajů získaných na Enraf-Noniově CAD4 dlfraktometru. Rozřešení struktury bylo provedeno za použití Enraf-Koniova programu na PDP 11/34 počítači a bylo docíleno běžného souhlasného faktoru 2,8 %.

Struktura popsaná vpředu odpovídá chemické struktuře ^7с^1з^2з^4°з nebo /TcO(PnAO-3H)/°, kde -3H znamená ztrátu tří atomů vodíku z PnAO ligandu, jednoho z kyslíku oximu a dvou z dusíkových atomů aminů. Tc je ve stavu +5 oxidačního stavu rezultující v čistém nulovém náboji pro ligand. ’

Vzorek pevné látky byl rozpuštěn v methanolu a podroben elektroforese a papírové chromatografli. Výsledky ukazují výtěžek komplexu vyšší než 95 % konsistentní 8 tím u komplexů vytvořených s Tc-99m.

Příklad 20

Příprava Tc-99m komplexů EnAO, PnAO a PnAO derivátů

Pro přípravu Tc-99m byl použit následující obecný způsob. Prvý stupeň zahrnuje přípravu roztoku ligandu v rozmezí hodnoty pH 7,5 až 8,5« Obě fyzikální forny a povaha ligandu ovlivní výhodný způsob přípravy roztoku.

1/ Ligand jako sůl rozpustná ve vodě (například mono, di a trihydr o chloridová sůl) 2 až 3 g ligandu se rozpustí v 0,5 ml solného roztoku a hodnota pH roztoku se nastaví na požadované rozmezí přidáním 0,2 ml 0,02N hydrogenuhliČitanu sodného v solném roztoku.

11/ Volná báze rozpustná ve vodě.

Asi 2 mg ligandu se rozpustí v 0,5 ml 10*^ MHC1 a hodnota pH se upraví na hodnotu

7,6 až 8,5 přidáním 0,5 ml 0,02 M roztoku hydrogenuhliČitanu sodného v solném roztoku.

111/ Volná báze nebo sůl ligandu s malou rozpustností ve vodě.

až 3 mg ligandu se rozpustí v 0,5 ml ethanolu a 0,5 ml 0,02 M hydrogenuhliČitanu sodného v solném roztoku ee přidá к upravení hodnoty pH na požadovanou hodnotu.

К roztoku ligandu ее při požadovaném pH přidá 0,2 ml nasyceného roztoku vínanu cínatého v solném roztoku a 0,5 ml až 1,5 ml Tc-99 teehnecistanu získaného z generátorového systému Mo-99/Tc-99m. Analýza zíekané směsi ukázala, že redukce teehnecistanu (na nižěí oxidační atupen technecia) tvorba komplexu redukovaného technecia e ligandem se dokončí stáním po dobu 10 minut při teplotě místnosti.

Analýza komplexů Tc-99m tenkovratavnou chromatografií

1/ Proužky skleněných vláken impregnovaných silikagelem vytvářejí stacionární fázi rychlého a přesného analytického eyetému pro To-99m-komplexy EnAO, PnAO e PnAO deriváty. Dva proužky, každý měřící 20 cm x 2 cm byly použity pro jednotlivou analýzu. Zhruba 5 ml roztoku obsahujícího komplex bylo naneseno 1 cm od základny proužku a jeden proužek byl vyvoláván solným roztokem ethylmethylketon (MEK)·

Stanovení a distribuce radioaktivity podél jednotlivého proužku byla prováděna pomocí 100 kanálového analytického systému předávaného počítači Nova programovaného na integraci píků· Tabulka níže ukazuje hodnoty hlavních složek roztoků Tc-99m. Rádiochemická čistota komplexů pozorovaná u všech ligandů byla větší než 80 % a obecně větší než 95 %·

Chromátografie na skleněných vláknech se silikagelem

Tc-99m koloid	Pozorované R^ hodnoty
Eluční činidlo: MEK 0	solný roztok 0
Tc-99 techneciatan	1.0	1.0
Tc-99m komplex	0,0,2	0,9 - 1,0

2/ HPLC analýza

HPLC analýza byla prováděna na 150 x 4,1 mm kolonce z nerezové oceli plněné divinylbenzenovým kopolymerem, pryskyřici v reverzní fázi. Kolona byla napojena na komerční čerpadlo^ gradientový chromátografický systém· Radioaktivita v elučním činidle byla detegována pomocí NaJ scintilačního detektoru napojeného na méřič intenzity· Vývod z měřiče byl nasměrován na zapisovač s papírem a mikropočítač programovaný к integraci píků·

Při HPLC analýze byla použita dvě rozpouštědla: 0,02M NaHgPO^ ve vodě upravený na hodnotu pH 7*0 obsahující 2 % methanolu (rozpouštědlo A) a tetrahydrofuran pro HPLC (rozpouštědlo B)« Byly vyvinuty následující dva gradientově eluční systémy:

Claims (2)

1. Rychlost toku 100% rozpouštědla A byla určena jako ryohlost 2 ml/min před injekcí 10 mikrolitrů vzorku· V době injekce byl zaveden lineární rozpouštědlový gradient, kterým byl 6 minut po injekci zvýšen podíl rozpouštědla В na 25 %· Podíl rozpouštědla В byl udržován na 25 % po dobu dalších 12 minuti potom byl redukován na 0 % během dvou minut·

   Systém 2

   Rychlost toku 100% rozpouštědla a při rychlosti 2 ml/min byla stanovena před injekcí 10 mikrolitrů vzorku· V době injekce byl zaveden lineární rozpouŠtědlový gradient, který zvyšoval podíl rozpouštědla В během 12ti minut na 75 %. Podíl rozpouštědla byl udržován po dobu dalších 5 minut, potom redukován během doby tří minut na 0 %.

   Systém 1 byl užíván ve všech případech e výjimkou těch. kde vysoká lipofilnost komplexu Tc-99m vyžadovala vyšší obsah organického rozpouštědla systému 2, aby se umožnila eluce komplexu z kolony· Tabulka 6 uvádí pozorovanou zadrž radioaktivních složek·

   Tabulka 6

   Tc-99m Komplex Eluční systém Pozorovaná retence čas (minuty) R¹ R² R³ * CH^ H H 1 12,6 CH₃ H H 2 9,9 Et H H 2 12,3 n-butyl H H 2 14,5 n-nonyl H H 2 16,5 CH^ morfolyl H 1 9,0 CH^ hydroxyl H 1 9,1 CH₃ piperazinyl H 1 11,0 CHj morfolylethyl H 1 9,6

   Když ligand V z příkladu 16 byl uváděn v komplex s Tc-99m, komplex byl získán ve výtěžku 90 t 5 % a během HPLC analýzy byl získán jediný hydrořobní pík· Retenční objem tohoto Tc—99-n-penty1—PnAO derivátu je vetší než Tc-99m-PnAO za použití gradientově

   HPLC ukazující, že tento derivát jak je očekáváno, je hydrofobnější než Tc-99m-PnAO.

   Příklad 21

   Příprava Tc-99m-PnAO pomocí výměny ligandu

   Tc-99m-citrát byl získán redukcí 0,1 ml Tc-99m technecistanu v 1 ml 0.5M citrátu při hodnotě pH 6,5 a 0,1 ml vínanu cínatého (nasycený vodný roztok).

   % vytvořeného chelátu bylo >93 %♦

   Tc-99m-oxalát byl připraven redukcí 0,1 ml Tc-99m-technecistanu v 1 ml 0.5M oxalátu při hodnotě pH 6,5 a 0,2 ml vínanu cínatého (nasycený vodný roztok)· Procento vzniklého chelátu bylo 85 %· Méně než 1 % bylo ve formě technecistanu (stanoveno za použití rozpouštědla acetonu pomocí papírové chromatografie) stanoveno za použití solného roztoku jako elučního činidla při papírové chromátografii·

   Tvorba Tc-99mPnAO pomocí výměny ligandu byla uskutečněna:

   1/ Přidáním 0,1 ml roztoku 7c-99m-citrátu к 1 ml solného roztoku pufrovaného 0.01 M hydrogenuhličitenem sodným při hodnotě pH 9 obsahujícím 1 mg PnAO. Vzorek byl smíchán a£ ponechán stát po dobu 20 minut před injekcí do HPLC. Po uplynutí doby 20 minut bylo 91,3 % Tc-99m aktivity spojeno s PnAO ve formě Tc-99m-PnA0 komplexu· Zhruba 8,5 %>

   zůstalo ve formě Tc-99m-citrátu·
2. 2/ Přidání 0.1 ml Tc-99m oxalátového roztoku к 1 ml solného roztoku pufrovaného 0.01M hydrogenuhličitanu sodného, při hodnotě pH 9 obsahujícího 1 mg PnAO· Vzorek byl smíchán a ponechán stát po dobu 20 minut· Tc-99m aktivity spojené s Tc-99m-PnAO bylo 85 %· žádná aktivita nezůstala ve formě Tc-99m-oxalátu a 15 % zůstalo neovlivněno ve formě hydrolyovaného Tc-99m-formy.

   Vzorky 22 až 2 popisují in vivo vlastnosti komplexů připravených a charakterizovaných v předchozích příkladech·

   Příklad 22

   In vivo biodiatribuce Tc-99m PnAO a derivátů PnAO

   0,1 ml roztoku Tc-99 komplexu podaného intravenosní injekcí (do boční žíly ocasu) každé kryse (140 až 220 g). Podaná dávka je ekvivalentní zhruba 200 yuCi Tc-99m· Krysy byly 2 minuty po injekci usmrceny a dvě krysy dvě hodiny po injekci· Vzorky orgánů a tkání ukázané v následující tabulce byly použity ke stanovení radioaktivity. Příjem v Jednotlivém orgánu nebo tkáni je vypočten jako procento celkové nalezené aktivity. Výtěžky jsou uvedeny v tabulce 7·