CS270119B1 - Sposob izolácie imunoglobulínov z plazmatic- kých materiálov - Google Patents

Abstract

Riešenie možno využit v imunologicko- biologiokej výrobě pri izolácii imunoglo ­ bulínov z materiálov vznikajúcich pri frakcionácii ludskej plazmy. Rieženie sa týká aktuálnej otázky zavádzania šetrněj ­ ších technologii pri frakcionácii ludskej plazmy použitím materiálov obsahujúcich imunoglobulíny . Navrhnutý technologický postup je svojím technickým převedením jed ­ noduchý a nenáročný na spotřebu energií a surovin.Zvýšenie účinnosti sa dosahuje tým, že sa získává výrobok o kvalitativně vyš ­ ších parametroch ako doteraz komerčně při ­ pravovaný imunoglobulín, hlavně sa to tý ­ ká kvantitativného zastúpenia jednotlivých tried a poměrně nizkej antikomplementárnej aktivity izolovaných imunoglobulínov. Vý ­ znamná je aj ekonomická otázka, pretože riešenie problému prispieva k zvýšeniu produkcie výrobkov bez nároku na základ ­ ná surovinu ludskú plazmu.

Description

Vynález sa týká spdsobu izolácle imunoglobulínov z materiálov vznikajúcich pri spracovaní ludskej plazmy a to tým spósobom. že za vhodných podmienok pH a koncentrácie bielkovín pomocou bentonitu sa vypréoipitujú vysokomolekulárne balastné bielkoviny a Imunoglobulíny s častou dalších plazmatických blelkovín ostávajú v roztoku. Roztok obsahujúci v prevážnej miere Imunoglobulíny sa potom purifikuje pomocou chloroformu a koncentruje bežne používanými technologickými postupami.

Pri frakcionácii a spraeovaní ludskej plazmy sú izolovaná plazmatické bielkovinné materiály obsahujúce imunoglobulíny. V súčasnom období tieto sú oddělované a Sálej purifikované nízkochladovou etanolovou frakcionáoiou (Cohn E.J.jstrongb.E., Hughes W.L., Mulford D.J.; Ashworth J., Melin Μ., Taylor H.L.i J. Amer. Chern. Soc., 68, 459, 1946; Hořejší J.; Cas. lék. českých, 39, 1067, 1953; Nitschmann H., Kistler Ρ., Lergie W.: Helv. Chim. Acta, 37, 866, 1954). Nevýhodou týchto technologických postupov je vysoká spotřeba energií, práca za stažených podmienok v ohladených priestorech.rozptyl izolován·j bielkoviny do delších frskcií a konečne aj znížená kvalita hotového přípravku.

Frakcionácia rivanolom (Hořejší J., Smetana R.: Chem. listy, 48, 758, 1954;

Škvařil F.iCsl. farmácia, 9, 522, 1957; Salfer A., Lipkin L.E.t Proc. soc. exp. Biol. Med., 102, 1, 220 - 222, 1959; Rejnek J., Bednařík T., Mašek J.» Cal. farmácia, 10, 407, 1961; . Stelnbuch M: Vox. Sanguinis 23, 91 - 106, 1972) je sice šetrnejšia a teoreticky bola by aj realizovatelná, avšak pre velké objemy a problémy pri odstráňovaní farbiva je uvedená metoda v priemyselných podmienkach tažko zvládnutelná.

Aj dalšie frakoionačné postupy izolácie imunoglobulínov ako aj napr. frakcionácia polyethylenglykolom (Falksveden I.; Patent Švédsko,348 - 942, 1972; Polson A,, Ruiz Bravo C.í Vox. Sanguinis 23, 107 - 118, 1972), popřípadě frakoionáoia kovml (Cohn E.J.i et. al.t J. Am. Chem. Soc., 72, 465 - 474, 1950; Rejnek J., Škvařil F.t Chem.'listy 51, 6, 1190 - 1193, 1957) v priemyselnom měřítku prlnášajú určité problémy, hlavně do do dlžky a členitosti technologických postupov, nevynímajúo ani prácne odatránenie reaktívnyoh elementov.

Oproti vyššie uvedeným navrhnutý technologický postup izolácie imunoglobulínov z materiálov vznikajúcich pri frakcionácii ludskej plazmy vyznačuje sa jednoduchostou, technickou nenáročnostou, nízkou spotřebou energií a malými finančnými nákladem! na příslušné suroviny. Prispieva k reallzácii bezodpadových technologií,k zhodnocovaniu východzích surovin ludskej plazmy a k zabezpečeniu zdravotnického terénu potřebnými liečebnými přípravkami.

Podstata izolácie imunoglobulínov z materiálov vznikajúcich pri frakcionácii ludskej plazmy spočívá v tom, že frakoia obsahujúca imunoglobulíny sa suspenduje v apyrogénnej vodě na obsah 3 až 5 hmoťnostných % blelkovín. Pri hodnote pH 5,0 až 5,1 a teplote +4 až +10 °C za stálého miešania sa k roztoku přidává 0,1 až 0,5 hmotnostných % bentonitu. Po dokonale) homogenizácii roztoku sa vypréoipitujú vysokomolekulárne balastné bielkoviny, ktoré sa od supernátantu oddelujú centrifugáciou. Supernatant obsahujúoi imunoglobulíny a dalšie sprievodné plazmatické bielkoviny sa filtruje a pH roztoku sa upraví na hodnotu 5,5 až 5,9 a za účelom purifikácie sa přidává chloroform v koncentrácii 2 až 6 objemových % přepočítané na východzie množstvo frakcie obsahujúoej imunoglobulíny. Vypreclpitované bielkoviny sa od roztoku imunoglobulínov oddelujú' eentrifugáoiou. Supernatant sa filtruje cez čeriace vložky a přítomné Imunoglobulíny sa konoentrujú a do konečnej formy sa spracujý bežne používanými technologickými postupami. ।

Výhodou uvedeného technologického postupu izolácie imunoglobulínov je aj to, že sa získá prípravok,ktorý mimo imunoglobulínov triedy IgG obsahuje vyššiu koncentráciu Imunoglobulínov dalších tried, najma IgA a IgM. Předpokládá sa, že tieto kvalitativně změny budú mat pre llečebnú prax svoj význam. Pre overenie navrhovaného technologického postupu izolácie imunoglobulínov boll převedené pokusy z odpadnej frakcie I + III.

. i' ,i 'I

I

CS 270 119 Bl

Příklad 1

000 g frakcie I + III sa suspenduje v 10 000 ml apyrogénnej vody, pH roztoku sa upraví 0,5M NaOH na hodnotu 5,05 - 0,04 a potom sa k roztoku za stálého miešania přidává 14 g bentonitu. Po dokonalej homogenizácii sa balastné bielkoviny precipitujú po dobu 10 hodíma separujú centrifugáciou. pH supernatantu sa upraví 0,5M NaOH na hodnotu 5,6 i 0,1 a za stálého miešania sa přidá chloroform v množstva 90 ml. Po 2 hodinách homogenizácie a 2 hodinách precipitácie vyzrážaný sediment sa oddělí centrifugáciou. Supernatant sa filtruje cez čeriace vložky a vrstvu kremeliny. Filtrát sa Sálej koncentruje bežne používanými technologickými operáciami.

Příklad 2

000 g frakcie I + III sa suspenduje v 18 000 ml apyrogénnej vody pH roztoku sa upraví

J.

0,5M NaOH na hodnotu 5,07 - 0,03 a potom sa k roztoku za stálého miešania přidává 30 g bentonitu. Po dokonalej homogenizácii sa balastné bielkoviny precipitujú po dobu 12 hodin ^s a separujú centrifugáciou. pH supernatantu sa upraví 0,5M NaOH na hodnotu 5,7 i 0,1 a za stálého miešania sa přidá chloroform v množstve 150 ml. Po 2 hodinách homogenizácie a 2 hodinách precipitácie vyzrážaný sediment sa oddělí centrifugáciou. Supernatant sa filtruje cez čeriace vložky a vrstvu kremeliny. Filtrát sa Sálej koncentruje bežne používanými technologickými operáciami.

Porovnanie niektorých kvalitatívnych parametrov přípravku

prípravok	antikomplem. aktivita v j/mg bielk.	obsah IgG mg/ml	obsah IgA mg/ml	obsah . IgG mg/ml
Komerčný imunoglob. Norga	nad 10	45,5	2,77	0,51
Komerčný imunoglob. Ivega	0,8	51,77	2,74	0,66
Imunoglobulín podlá vynálezu	0,9	34,66	9,61	.3,78

Z uvedenej tabulky a porovnania niektorých kvalitatívnych kritérii imunoglobulínov izolovaných z íudskej plazmy a to komerčně připravovaných imunoglobulínov Norga, Ivega a imunoglobulínov izolovaných podlá vynálezu je vidiet, že antikomplementárna aktivita u imunoglobulínov izolovaných podlá vynálezu je viac ako desafnásobne nižšia ako u komerčně připravovaného imunoglobulínu Norga a přibližuje sa k hodnotám stanoveným u imunoglobulínu pre i. v. aplikáciu Ivega. Obsahové zastupenie jednotlivých tried imunoglobulínov u imunoglobulínu Izolovaného podlá vynálezu sa posúva v prospěch imunogloblínov triedy IgA a IgM, čím sa zvyšuje kvalita přípravku rozšířením palety titru protilátok. Nižšie hodnoty imunoglobulínov triedy IgG sú zdávodnené převedenou dvojnásobnou extrakciou týchto z frakcie I + III. .

Claims (1)

1. Spžsob izolácie imunoglobulínov z plazmatických materiálov vznikájúcich pri frakcionácii Íudskej plazmy.vyznačujúci sa tým, že k roztbku frakcie obsahujúcej imunoglobulíny o koncentrácii 3 až 5 hmotnostných % bielkovín, pri pH 5,0 až 5,1 sa přidává 0,1 až 0,5 hmotnostných % bentonitu, čím sa balastné bielkoviny vyprecipitujú, separáciou oddeíujú a imunoglobulíny obsiahnuté v supernatante sa purifikujú chloroformem ó koncentrácii 2 až 6 * objemových %, pri pH 5,5 až 5,9. ¹