CS270119B1

CS270119B1 - Method of immunoglobulines insulation from plasmatic materials

Info

Publication number: CS270119B1
Application number: CS872600A
Authority: CS
Inventors: Jozef Ing Csc Bulik
Original assignee: Bulik Jozef
Priority date: 1987-04-13
Filing date: 1987-04-13
Publication date: 1990-06-13
Also published as: CS260087A1

Abstract

Riešenie možno využit v imunologicko- biologiokej výrobě pri izolácii imunoglo bulínov z materiálov vznikajúcich pri frakcionácii ludskej plazmy. Rieženie sa týká aktuálnej otázky zavádzania šetrněj ších technologii pri frakcionácii ludskej plazmy použitím materiálov obsahujúcich imunoglobulíny . Navrhnutý technologický postup je svojím technickým převedením jed noduchý a nenáročný na spotřebu energií a surovin.Zvýšenie účinnosti sa dosahuje tým, že sa získává výrobok o kvalitativně vyš ších parametroch ako doteraz komerčně při pravovaný imunoglobulín, hlavně sa to tý ká kvantitativného zastúpenia jednotlivých tried a poměrně nizkej antikomplementárnej aktivity izolovaných imunoglobulínov. Vý znamná je aj ekonomická otázka, pretože riešenie problému prispieva k zvýšeniu produkcie výrobkov bez nároku na základ ná surovinu ludskú plazmu.solution perhaps used in the immunological biologiokoho production at isolation immunoglobulins Bulin from materials emerging at fractionated human plasma. Riezen the relates to current issues deployment thrifty Ších technology at fractionated human plasma using the materials containing immunoglobulins . suggested technological approach is a his technical converting poison single- and unassuming on the consumption energy and surovin.Zvýšenie effectiveness the reaches by that the gains product about qualitatively vyš Ších parameters than up to now commercially at pravovaný immunoglobulin mainly the it th ka quantitative representations each classes and relatively small anticomplementary activities isolated immunoglobulins. Elevator nificant is a and Economics question, because solution the problem contributed to increase production products without claim on the basis on the raw material humanly plasma.

Description

Vynález sa týká spdsobu izolácle imunoglobulínov z materiálov vznikajúcich pri spracovaní ludskej plazmy a to tým spósobom. že za vhodných podmienok pH a koncentrácie bielkovín pomocou bentonitu sa vypréoipitujú vysokomolekulárne balastné bielkoviny a Imunoglobulíny s častou dalších plazmatických blelkovín ostávajú v roztoku. Roztok obsahujúci v prevážnej miere Imunoglobulíny sa potom purifikuje pomocou chloroformu a koncentruje bežne používanými technologickými postupami.The present invention relates to a method for isolating immunoglobulins from materials derived from the processing of human plasma in this manner. that under suitable conditions of pH and protein concentration by means of bentonite, high molecular weight ballast proteins are precipitated and Immunoglobulins with a number of other plasma proteins remain in solution. The solution containing predominantly immunoglobulins is then purified using chloroform and concentrated by conventional techniques.

Pri frakcionácii a spraeovaní ludskej plazmy sú izolovaná plazmatické bielkovinné materiály obsahujúce imunoglobulíny. V súčasnom období tieto sú oddělované a Sálej purifikované nízkochladovou etanolovou frakcionáoiou (Cohn E.J.jstrongb.E., Hughes W.L., Mulford D.J.; Ashworth J., Melin Μ., Taylor H.L.i J. Amer. Chern. Soc., 68, 459, 1946; Hořejší J.; Cas. lék. českých, 39, 1067, 1953; Nitschmann H., Kistler Ρ., Lergie W.: Helv. Chim. Acta, 37, 866, 1954). Nevýhodou týchto technologických postupov je vysoká spotřeba energií, práca za stažených podmienok v ohladených priestorech.rozptyl izolován·j bielkoviny do delších frskcií a konečne aj znížená kvalita hotového přípravku.Immunoglobulin-containing plasma protein materials are isolated from the fractionation and processing of human plasma. At present, these are separated and further purified by low-cold ethanol fractionation (Cohn EJjstrongb.E., Hughes WL, Mulford DJ; Ashworth J., Melin,., Taylor HLi J. Amer. Chern. Soc., 68, 459, 1946 ; Hořejší J .; Cas. Lék. Českých, 39, 1067, 1953; Nitschmann H., Kistler Ρ., Lergie W .: Helv. Chim. Acta, 37, 866, 1954). The disadvantages of these technological processes are high energy consumption, work under tightened conditions in refrigerated spaces. Dispersion of isolated protein into longer fractions and finally reduced quality of the finished product.

Frakcionácia rivanolom (Hořejší J., Smetana R.: Chem. listy, 48, 758, 1954;Rivanol fractionation (Hořejší J., Smetana R .: Chem. Listy, 48, 758, 1954;

Škvařil F.iCsl. farmácia, 9, 522, 1957; Salfer A., Lipkin L.E.t Proc. soc. exp. Biol. Med., 102, 1, 220 - 222, 1959; Rejnek J., Bednařík T., Mašek J.» Cal. farmácia, 10, 407, 1961; . Stelnbuch M: Vox. Sanguinis 23, 91 - 106, 1972) je sice šetrnejšia a teoreticky bola by aj realizovatelná, avšak pre velké objemy a problémy pri odstráňovaní farbiva je uvedená metoda v priemyselných podmienkach tažko zvládnutelná.Škvařil F.iCsl. Pharmacy, 9, 522, 1957; Salfer A., Lipkin L.E.t Proc. soc. exp. Biol. Med., 102, 1, 220-222, 1959; Rejnek J., Bednarik T., Masek J. » Cal. Pharmacy, 10, 407, 1961; . Stelnbuch M: Vox. Sanguinis 23, 91-106, 1972) is more gentle and would theoretically be feasible, but due to the large volumes and problems of dye removal, this method is difficult to handle in industrial conditions.

Aj dalšie frakoionačné postupy izolácie imunoglobulínov ako aj napr. frakcionácia polyethylenglykolom (Falksveden I.; Patent Švédsko,348 - 942, 1972; Polson A,, Ruiz Bravo C.í Vox. Sanguinis 23, 107 - 118, 1972), popřípadě frakoionáoia kovml (Cohn E.J.i et. al.t J. Am. Chem. Soc., 72, 465 - 474, 1950; Rejnek J., Škvařil F.t Chem.'listy 51, 6, 1190 - 1193, 1957) v priemyselnom měřítku prlnášajú určité problémy, hlavně do do dlžky a členitosti technologických postupov, nevynímajúo ani prácne odatránenie reaktívnyoh elementov.Other fractionation procedures for the isolation of immunoglobulins as well as e.g. fractionation with polyethylene glycol (Falksveden I .; Patent Sweden, 348-942, 1972; Polson A., Ruiz Bravo C. Vox. Sanguinis 23, 107-118, 1972), or fractional metals (Cohn EJi et al., J. J. Am. Chem. Soc., 72, 465 - 474, 1950; Rejnek J., Škvařil Ft Chem. 'Sheets 51, 6, 1190 - 1193, 1957) on the industrial scale , they do not exclude the laborious removal of reactive elements.

Oproti vyššie uvedeným navrhnutý technologický postup izolácie imunoglobulínov z materiálov vznikajúcich pri frakcionácii ludskej plazmy vyznačuje sa jednoduchostou, technickou nenáročnostou, nízkou spotřebou energií a malými finančnými nákladem! na příslušné suroviny. Prispieva k reallzácii bezodpadových technologií,k zhodnocovaniu východzích surovin ludskej plazmy a k zabezpečeniu zdravotnického terénu potřebnými liečebnými přípravkami.In contrast to the above, the proposed technological process of isolation of immunoglobulins from materials formed during the fractionation of human plasma is characterized by simplicity, technical simplicity, low energy consumption and low financial costs! to the relevant raw materials. It contributes to the implementation of waste-free technologies, to the evaluation of the starting materials of human plasma and to the provision of medical care with the necessary therapeutic products.

Podstata izolácie imunoglobulínov z materiálov vznikajúcich pri frakcionácii ludskej plazmy spočívá v tom, že frakoia obsahujúca imunoglobulíny sa suspenduje v apyrogénnej vodě na obsah 3 až 5 hmoťnostných % blelkovín. Pri hodnote pH 5,0 až 5,1 a teplote +4 až +10 °C za stálého miešania sa k roztoku přidává 0,1 až 0,5 hmotnostných % bentonitu. Po dokonale) homogenizácii roztoku sa vypréoipitujú vysokomolekulárne balastné bielkoviny, ktoré sa od supernátantu oddelujú centrifugáciou. Supernatant obsahujúoi imunoglobulíny a dalšie sprievodné plazmatické bielkoviny sa filtruje a pH roztoku sa upraví na hodnotu 5,5 až 5,9 a za účelom purifikácie sa přidává chloroform v koncentrácii 2 až 6 objemových % přepočítané na východzie množstvo frakcie obsahujúoej imunoglobulíny. Vypreclpitované bielkoviny sa od roztoku imunoglobulínov oddelujú' eentrifugáoiou. Supernatant sa filtruje cez čeriace vložky a přítomné Imunoglobulíny sa konoentrujú a do konečnej formy sa spracujý bežne používanými technologickými postupami. ।The essence of the isolation of immunoglobulins from materials resulting from the fractionation of human plasma is that the fraction containing immunoglobulins is suspended in pyrogen-free water to a content of 3 to 5% by weight of proteins. At a pH of 5.0 to 5.1 and a temperature of +4 to + 10 ° C, 0.1 to 0.5% by weight of bentonite is added to the solution with constant stirring. After complete homogenization of the solution, high molecular weight ballast proteins are precipitated and separated from the supernatant by centrifugation. The supernatant contains immunoglobulins and other accompanying plasma proteins are filtered and the pH of the solution is adjusted to 5.5 to 5.9, and for purification, chloroform is added at a concentration of 2 to 6% by volume, calculated on the starting amount of the immunoglobulin-containing fraction. The precipitated proteins are separated from the immunoglobulin solution by centrifugation. The supernatant is filtered through clarifying pads and the immunoglobulins present are concentrated and processed to the final form by commonly used techniques. ।

Výhodou uvedeného technologického postupu izolácie imunoglobulínov je aj to, že sa získá prípravok,ktorý mimo imunoglobulínov triedy IgG obsahuje vyššiu koncentráciu Imunoglobulínov dalších tried, najma IgA a IgM. Předpokládá sa, že tieto kvalitativně změny budú mat pre llečebnú prax svoj význam. Pre overenie navrhovaného technologického postupu izolácie imunoglobulínov boll převedené pokusy z odpadnej frakcie I + III.The advantage of said technological process of isolating immunoglobulins is also that a preparation is obtained which, in addition to immunoglobulins of the IgG class, contains a higher concentration of immunoglobulins of other classes, in particular IgA and IgM. It is assumed that these qualitative changes will be important for medical practice. Experiments from waste fraction I + III were performed to verify the proposed technological procedure for the isolation of immunoglobulins.

. i' ,i 'I. i ', i' I

II

CS 270 119 BlCS 270 119 Bl

Příklad 1Example 1

000 g frakcie I + III sa suspenduje v 10 000 ml apyrogénnej vody, pH roztoku sa upraví 0,5M NaOH na hodnotu 5,05 - 0,04 a potom sa k roztoku za stálého miešania přidává 14 g bentonitu. Po dokonalej homogenizácii sa balastné bielkoviny precipitujú po dobu 10 hodíma separujú centrifugáciou. pH supernatantu sa upraví 0,5M NaOH na hodnotu 5,6 i 0,1 a za stálého miešania sa přidá chloroform v množstva 90 ml. Po 2 hodinách homogenizácie a 2 hodinách precipitácie vyzrážaný sediment sa oddělí centrifugáciou. Supernatant sa filtruje cez čeriace vložky a vrstvu kremeliny. Filtrát sa Sálej koncentruje bežne používanými technologickými operáciami.000 g of fraction I + III are suspended in 10,000 ml of pyrogen-free water, the pH of the solution is adjusted to 5.05-0.04 with 0.5 M NaOH and then 14 g of bentonite are added to the solution with stirring. After complete homogenization, the ballast proteins are precipitated for 10 hours and separated by centrifugation. The pH of the supernatant was adjusted to 5.6 and 0.1 with 0.5 M NaOH, and 90 ml of chloroform was added with stirring. After 2 hours of homogenization and 2 hours of precipitation, the precipitated sediment is separated by centrifugation. The supernatant is filtered through pads and a pad of diatomaceous earth. The filtrate is concentrated by commonly used technological operations.

Příklad 2Example 2

000 g frakcie I + III sa suspenduje v 18 000 ml apyrogénnej vody pH roztoku sa upraví000 g of fraction I + III are suspended in 18,000 ml of pyrogen-free water and the pH of the solution is adjusted

J.J.

0,5M NaOH na hodnotu 5,07 - 0,03 a potom sa k roztoku za stálého miešania přidává 30 g bentonitu. Po dokonalej homogenizácii sa balastné bielkoviny precipitujú po dobu 12 hodin ^s a separujú centrifugáciou. pH supernatantu sa upraví 0,5M NaOH na hodnotu 5,7 i 0,1 a za stálého miešania sa přidá chloroform v množstve 150 ml. Po 2 hodinách homogenizácie a 2 hodinách precipitácie vyzrážaný sediment sa oddělí centrifugáciou. Supernatant sa filtruje cez čeriace vložky a vrstvu kremeliny. Filtrát sa Sálej koncentruje bežne používanými technologickými operáciami.0.5M NaOH to 5.07-0.03 and then 30 g of bentonite are added to the stirred solution. After thorough homogenization, the ballast protein precipitated for 12 h ^with and separated by centrifugation. The pH of the supernatant was adjusted to 5.7 and 0.1 with 0.5 M NaOH, and 150 ml of chloroform was added with stirring. After 2 hours of homogenization and 2 hours of precipitation, the precipitated sediment is separated by centrifugation. The supernatant is filtered through pads and a pad of diatomaceous earth. The filtrate is concentrated by commonly used technological operations.

Porovnanie niektorých kvalitatívnych parametrov přípravkuComparison of some qualitative parameters of the product

prípravok preparation antikomplem. aktivita v j/mg bielk. anticomplex. activity in j / mg protein. obsah IgG mg/ml IgG content mg / ml obsah IgA mg/ml IgA content mg / ml obsah . IgG mg/ml Contents . IgG mg / ml Komerčný imunoglob. Norga Commercial immunoglob. Norway nad 10 over 10 45,5 45.5 2,77 2.77 0,51 0.51 Komerčný imunoglob. Ivega Commercial immunoglob. Ivega 0,8 0.8 51,77 51.77 2,74 2.74 0,66 0.66 Imunoglobulín podlá vynálezu The immunoglobulin of the invention 0,9 0.9 34,66 34.66 9,61 9.61 .3,78 .3,78

Z uvedenej tabulky a porovnania niektorých kvalitatívnych kritérii imunoglobulínov izolovaných z íudskej plazmy a to komerčně připravovaných imunoglobulínov Norga, Ivega a imunoglobulínov izolovaných podlá vynálezu je vidiet, že antikomplementárna aktivita u imunoglobulínov izolovaných podlá vynálezu je viac ako desafnásobne nižšia ako u komerčně připravovaného imunoglobulínu Norga a přibližuje sa k hodnotám stanoveným u imunoglobulínu pre i. v. aplikáciu Ivega. Obsahové zastupenie jednotlivých tried imunoglobulínov u imunoglobulínu Izolovaného podlá vynálezu sa posúva v prospěch imunogloblínov triedy IgA a IgM, čím sa zvyšuje kvalita přípravku rozšířením palety titru protilátok. Nižšie hodnoty imunoglobulínov triedy IgG sú zdávodnené převedenou dvojnásobnou extrakciou týchto z frakcie I + III. .From the above table and a comparison of some qualitative criteria of immunoglobulins isolated from human plasma, namely commercially prepared immunoglobulins Norga, Ivega and immunoglobulins isolated according to the invention, it can be seen that the anticomplementary activity of immunoglobulins isolated according to the invention is more than ten times lower than to the values determined for the immunoglobulin for i. in. Ivega application. The content representation of the individual classes of immunoglobulins in the immunoglobulin isolated according to the invention is shifted in favor of immunoglobulins of the IgA and IgM classes, thus increasing the quality of the preparation by expanding the range of antibody titers. Lower values of IgG class immunoglobulins are due to the converted double extraction of these from fraction I + III. .

Claims

Process for the isolation of immunoglobulins from plasma materials resulting from the fractionation of human plasma, characterized in that 0.1 to 0.5% by weight of % bentonite, whereby the ballast proteins are precipitated, separated by separation and the immunoglobulins contained in the supernatant are purified with chloroform at a concentration of 2 to 6% by volume, at pH 5.5 to 5.9. ¹